Forschungsartikel

Assoziation der MPO-Expression mit dem immunologischen Mikromilieu bei Brustkrebs: Erkenntnisse aus bioinformatischen und Einzelzell-Analysen

38 Ansichten

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DOI:

10.3791/71189

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14. August 2026

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1Department of Traditional Chinese Medicine, Aerospace Center Hospital, 2Third Affiliated Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 5College of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt einen reproduzierbaren Bioinformatik- und Einzelzell-Workflow zur Untersuchung der Zusammenhänge zwischen der Expression von Myeloperoxidase (MPO) und immunen/myeloiden Merkmalen beim Brustkrebs vor. Da die Analysen auf öffentlich zugänglichen Datensätzen und In-silico-Methoden basieren, werden die Ergebnisse als explorativ und hypothesengenerierend interpretiert.

Zusammenfassung

Brustkrebs bleibt eine wesentliche Ursache krebsbedingter Mortalität, und explorative computergestützte Arbeitsabläufe können dabei helfen, immunassoziierte Marker für weitere Untersuchungen zu priorisieren. In der vorliegenden Arbeit verwendeten wir die Bulk-Transkriptomdaten des Cancer Genome Atlas zum infiltrierenden Mammakarzinom (TCGA-BRCA) sowie den öffentlich zugänglichen Single-Cell-Datensatz GSE161529, um Zusammenhänge zwischen der Expression von Myeloperoxidase (MPO), klinischen Ergebnissen, Immuninfiltration, Methylierung, Annotationen upstream regulierender Faktoren, Expressionsmustern auf Einzelzellniveau, Ergebnissen zur virtuellen Knockdown-Sensitivität, der Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln und Genen sowie ADMET-Anmerkungen (Absorption, Verteilung, Stoffwechsel, Ausscheidung und Toxizität) zu untersuchen. Die MPO-Expression war in Brustkrebsgeweben niedriger als in angrenzendem nicht-tumösem Gewebe. Eine höhere MPO-Expression war mit einem längeren progressionsfreien Intervall assoziiert, während ihre Zusammenhänge mit Gesamtüberleben und tumorspezifischem Überleben statistisch nicht signifikant waren. Eine ROC-Analyse (Receiver Operating Characteristic) deutete eine Trennung zwischen Tumor- und Normalgewebe innerhalb des analysierten öffentlichen Datensatzes an, dies sollte jedoch nicht als klinische diagnostische Validierung interpretiert werden. Analysen zur Immunentmischung und Anreicherung ergaben, dass die MPO-Expression hauptsächlich mit immun- und myeloidassoziierten transkriptionellen Merkmalen korrelierte, anstatt eine tumorintrinsische Regulation des immunologischen Mikromilieus nachzuweisen. Auf Einzelzellebene war das MPO-Signal spärlich, wobei vor der Erweiterung basierend auf der k-nächsten-Nachbarn-Methode (KNN) lediglich 85 MPO-positive Zellen detektiert wurden. Nachweisbare MPO-Signale und MPO-assoziierte Scores wurden vorsichtig interpretiert, da sie durch geringe Expression, Unsicherheiten in der Zelltypzuordnung, Dropout-Ereignisse, Doubletts oder umgebende RNA beeinflusst sein können. In silico Eine virtuelle Genunterdrückung wies auf kandidatenhafte immun- und entzündungsbezogene transkriptionelle Veränderungen hin, doch diese Ergebnisse wurden als explorativ eingestuft und bedürfen einer Validierung. Die auf der Drug-gene interaction database (DGIdb) basierende Gen-Drogen-Abfrage sowie die ADMET-Anmerkung wurden lediglich als vorläufige chemische Annotationen verwendet und nicht als therapeutischer Nachweis interpretiert. Insgesamt liefert diese Studie einen reproduzierbaren in-silico-Arbeitsablauf zur Hypothesengenerierung bezüglich MPO-assoziierter immuner/myeloider Merkmale beim Brustkrebs, die eine Validierung in externen Kohorten sowie experimentelle Bestätigung erfordern.

Einleitung

Brustkrebs ist eine hochgradig heterogene immunassoziierte Malignität1. Der Krankheitsverlauf, das Rezidiv- und Metastasierungsrisiko sowie die Therapieantwort stehen in engem Zusammenhang mit der Zusammensetzung und funktionellen Situation der tumorimmunologischen Mikroumgebung (TIME, tumor immune microenvironment)2. Trotz fortlaufender Optimierung umfassender Behandlungsstrategien erleben einige Patienten weiterhin ein Fortschreiten der Erkrankung oder ein Rezidiv, was die dringende Notwendigkeit unterstreicht, molekulare Biomarker zu identifizieren, die den Zustand der TIME charakterisieren und die Risikostratifizierung unterstützen, sowie deren zugrundeliegende Mechanismen aufzuklären.

Myeloperoxidase (MPO) ist eine Häm-enthaltende Peroxidase, die vorwiegend in Neutrophilen und in geringerem Maße in Monozyten und Makrophagen exprimiert wird. Durch die Bildung von Hypochloriger Säure und anderen reaktiven Oxidationsmitteln trägt MPO zur antimikrobiellen Abwehr bei, kann jedoch auch oxidative Gewebeschäden und chronische Entzündungen fördern. Bei Krebserkrankungen scheint die biologische Bedeutung von MPO kontextabhängig zu sein3. Einerseits wurde MPO-vermittelter oxidativer Stress im Zusammenhang mit der Karzinogenese und Tumorprogression durch DNA-Schäden, Lipid- und Proteinoxidation, entzündliche Signalwege sowie die Umgestaltung der Tumormikroumgebung vermutet4,5,6. Andererseits wurde eine Infiltration durch MPO-positive angeborene Immunzellen oder myeloide Zellen mit einem günstigen Prognoseverlauf oder antitumoraler Immunaktivität in bestimmten Tumorkontexten assoziiert7,8,9. Diese scheinbar widersprüchlichen Befunde deuten darauf hin, dass die klinische und biologische Bedeutung von MPO von Tumortyp, Krankheitsstadium, zellulärer Herkunft von MPO sowie der immunologischen Zusammensetzung der Tumormikroumgebung abhängen könnte. Die Expressionsmuster und prognostische Relevanz von MPO beim Mammakarzinom, insbesondere auf Einzelzell-Ebene, sind jedoch noch unvollständig charakterisiert.

Das tumorassoziierte immunologische Mikromilieu (TIME) enthält heterogene myeloide, lymphoide, stromale und epitheliale Kompartimente10. MPO ist klassisch mit Neutrophilen und anderen Zellen der myeloiden Linie assoziiert, und MPO-bezogene Signale in Gesamttumorprofilen spiegeln daher möglicherweise die Zusammensetzung der Immunzellen wider, nicht jedoch eine intrinsische Aktivität der Tumorzellen10. Bei Brustkrebs sind die Verteilung des MPO-Signals in Gesamt- und Einzelzell-Datensätzen, seine Assoziation mit Schätzungen der Immuninfiltration sowie die Reproduzierbarkeitsgrenzen nachgeschalteter bioinformatischer Analysen bisher unzureichend charakterisiert. Diese Studie betrachtet MPO daher als immunassoziierten Marker zur Entwicklung eines explorativen Arbeitsablaufs, nicht jedoch als nachgewiesenen kausalen Regulator des TIME oder als validiertes therapeutisches Ziel. Im Vergleich zu differentiellen Expressionsanalysen einzelner Kohorten oder Schätzungen der Immuninfiltration mittels einzelner Plattformen kann ein integrierter Arbeitsablauf, der Gesamttranskriptomik, Immunentmischung, Methylierungsannotierung, Einzelzellzuordnung und computergestützte Störungsanalysen kombiniert, einen umfassenderen explorativen Einblick in den immunologischen Kontext assoziierter Gene bieten. Dieser Ansatz eignet sich zur Priorisierung von Kandidatenmarkern und zur Generierung überprüfbarer Hypothesen, insbesondere wenn experimentelle Datensätze noch nicht verfügbar sind. Solch eine rechnergestützte Integration allein kann jedoch weder die zelluläre Herkunft, Kausalität, pharmakologische Aktivität noch klinische Nützlichkeit bestimmen. Mit der Weiterentwicklung großer öffentlicher Krebskohorten und der Einzelzell-Transkriptomik-Technologien können bioinformatische Ansätze genutzt werden, um Assoziationen zwischen Genexpression, klinischen Ergebnissen, Zusammensetzung der Immunzellen und transkriptionellen Zuständen auf Populationsebene sowie auf Einzelzellebene zu untersuchen11. Auf Einzelzell-Genregulationsnetzwerken basierende Methoden der computergestützten Störungsanalyse können darüber hinaus hypothetische Informationen über die transkriptionelle Empfindlichkeit im Zusammenhang mit Genen liefern12,13. Ziel dieser Studie war daher, den Expressionsverlauf, die Überlebensassoziation, den immunologischen/myeloiden Kontext, das Methylierungsmuster, die Einzelzellverteilung sowie das explorative Profil der computergestützten Störungsanalyse von MPO beim Brustkrebs zu charakterisieren. Der gesamte Arbeitsablauf ist in Abbildung 1 dargestellt.

Protokoll

Erwerb aus der TCGA-Datenbank

RNA-Sequenzierungsdaten und klinische Informationen für die TCGA-Brust-invasiven-Karzinom-Kohorte (TCGA-BRCA) wurden vom Genomic Data Commons-Portal bezogen14. STAR-Workflow-RNA-Seq-Daten im Format Transkripte pro Million (TPM) wurden zusammen mit den passenden klinischen Annotationen extrahiert. RNA-Seq-Proben ohne entsprechende klinische Informationen wurden ausgeschlossen. Für expressionsbasierte Analysen wurden die TPM-Werte als log2(TPM + 1) transformiert. Die MPO-Expression wurde mithilfe des Gen-Symbols MPO und der Ensembl-Gen-ID ENSG00000005381.8 extrahiert. Für Analysen, die eine Einteilung in MPO-hoch und MPO-niedrig erforderten, wurden ausschließlich TCGA-BRCA-Tumorproben einbezogen, während benachbarte normale Proben von der Gruppeneinteilung ausgeschlossen wurden. Die Tumorproben wurden anhand des Medianwerts der log2(TPM + 1)-transformierten MPO-Expression unter den TCGA-BRCA-Tumorproben aufgeteilt. Proben mit einer MPO-Expression größer oder gleich dem Medianwert wurden der MPO-hoch-Gruppe zugeordnet, während Proben unterhalb des Medians der MPO-niedrig-Gruppe zugeordnet wurden. Diese medianbasierte Gruppierungsmethode wurde für die Überlebensanalyse, differentielle Expressionsanalyse, Anreicherungsanalyse, Methylierungsgruppierung und Vergleiche der Immunzellanreicherung verwendet, sofern nicht anders angegeben. Klinisch-pathologische Merkmale, einschließlich Geschlecht, Alter, ethnische Zugehörigkeit, pathologischer T-Stadium, histologischer Grad, PAM50-Subtyp, pathologisches Stadium, Tumorstatus und Überlebensendpunkte wie Gesamtüberleben (OS), progressionsfreies Intervall (PFI) und krankheitsspezifisches Überleben (DSS), wurden mit R-Version 4.2.1 analysiert.

Öffentliche Immunhistochemie-Bildabfrage

Repräsentative MPO-Immunhistochemie-(IHC-)Bilder benachbarter normale Brustgewebe und Brustkrebsgewebe wurden als qualitative Referenzen auf Proteinebene verwendet. Diese Bilder wurden nicht in quantitative morphometrische oder statistische Analysen einbezogen. Die markierten Felder zeigen Bereiche, die in höherer Vergrößerung dargestellt sind. Maßstabsbalken entsprechen 100 µm in den 20×-Bildern und 50 µm in den 40×-Bildern.

Expressionskorrelationsanalyse

Der TCGA-BRCA-Datensatz wurde verwendet, um Gene zu untersuchen, die gemeinsam mit der MPO-Expression im Brustkrebs variieren. Genomweite Pearson-Korrelationskoeffizienten wurden zwischen MPO und protein-kodierenden Genen berechnet, und die 30 am stärksten positiv sowie die 30 am stärksten negativ korrelierten Gene wurden zur Visualisierung ausgewählt. Bei Korrelationsanalysen, an denen mehrere Gene getestet wurden, wurden die nominalen p-Werte mittels der False-Discovery-Rate-Methode nach Benjamini-Hochberg korrigiert. Das MPO-assoziierte Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) wurde mithilfe der Suchplattform für die Rückgewinnung interagierender Gene/Proteine (STRING-Datenbank) erstellt, wobei Proteinpaare mit Interaktionsscores über 0,40 für die Visualisierung beibehalten wurden15.

Funktionelle Anreicherungsanalyse

Differenziell exprimierte Gene (DEGs) wurden durch den Vergleich der MPO-hohen und MPO-niedrigen TCGA-BRCA-Tumorgruppen unter Verwendung der Schwellenwerte |log2FC| > 1 und ein nach Benjamini-Hochberg adjustierter p-Wert < 0,05 identifiziert. Die funktionelle Anreicherungsanalyse der DEGs wurde mit dem R-Paket clusterProfiler Version 4.4.4 durchgeführt, einschließlich Analysen der genetischen Ontologie (GO) für biologische Prozesse, zelluläre Komponenten, molekulare Funktionen sowie Analysen des Kyoto-Encyclopedia-of-Genes-and-Genomes-(KEGG)-Signalwegs16,17,18,19,20. Angereicherte GO- und KEGG-Terme galten als signifikant, wenn der adjustierte p-Wert < 0,05 war.

Die Gen-Set-Enrichment-Analyse (GSEA) wurde unter Verwendung einer vorab sortierten Genliste basierend auf Differenzialexpressionsstatistiken zwischen MPO-hohen und MPO-niedrigen Gruppen durchgeführt. Die MSigDB C2 Canonical Pathways-Sammlung c2.cp.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt, die MSigDB v2022.1.Hs entspricht und 3.050 Gensätze enthält, wurde verwendet21,22. Bereicherte Terme wurden als signifikant betrachtet gemäß Benjamini–Hochberg-angepasstem p-Wert < 0,05, FDR q-Wert < 0,25 und |normalisierter Enrichment-Score| > 1. Gegebenenfalls wurden Z-Scores für signifikant angereicherte Terme mithilfe des GOplot-Pakets zur Visualisierung berechnet.

Analyse der Anreicherung von Immunzellen in Tumoren

Immun- und stromale Komponenten im TCGA-BRCA-Kollektiv wurden mithilfe des ESTIMATE-Algorithmus bewertet, der im R-Paket estimate Version 1.0.13 implementiert ist. Als Eingabedaten dienten log2(TPM + 1)-transformierte Expressionsdaten, und für jede Tumorprobe wurden der Immun-Score, der stromale Score sowie der ESTIMATE-Score berechnet. TIMER/TIMER2.0 wurde verwendet, um Zusammenhänge zwischen der MPO-Expression und den geschätzten Infiltrationsniveaus der wichtigsten Immunzellpopulationen im TCGA-BRCA-Kollektiv zu untersuchen, einschließlich B-Zellen, CD8+ T-Zellen, CD4+ T-Zellen, Makrophagen, Neutrophilen und dendritischen Zellen23,24,25. Die auf TIMER basierenden Ergebnisse wurden als Schätzungen der Immuninfiltration interpretiert, die aus der entsprechenden Online-Ressource stammen. Für die Analyse der Anreicherung von Immunzellen über 24 Immunzelltypen hinweg wurde eine single-sample Gen-Satz-Anreicherungsanalyse (ssGSEA) mithilfe des R-Pakets GSVA Version 1.46.026 durchgeführt. Die LM22-Immunzell-Signaturmatrix, die für die CIBERSORT-basierte Dekonvolution von 22 Immunzelltypen verwendet wurde, ist in Supplementärer Tabelle 1 enthalten. Die Korrelationen zwischen MPO-Expression und Anreicherungsscores der Immunzellen wurden mittels Spearman-Rangkorrelation bewertet. Unterschiede in den Anreicherungsscores der Immunzellen zwischen den medianbasiert definierten MPO-hohen und MPO-niedrigen Tumorgruppen wurden mit dem Wilcoxon-Rangsummentest verglichen. Bei Analysen, die mehrere Immunzelltypen umfassten, wurden die p-Werte mittels der Benjamini–Hochberg-Methode zur Fehlentdeckungsrate angepasst.

DNA-Methylierung des MPO-Gens

DNA-Methylierungsmuster innerhalb des MPO-Lokus wurden mithilfe von MethSurv analysiert. CpG-Methylierungs-Beta-Werte und Überlebensassoziationen für TCGA-BRCA wurden von der MethSurv-Plattform bezogen. Ausgewählte MPO-bezogene CpG-Stellen wurden visualisiert, und ihre Assoziationen mit Überlebensergebnissen wurden anhand der von MethSurv bereitgestellten Ergebnisse der Überlebensanalyse bewertet27. Bei Analysen, die mehrere CpG-Stellen umfassten, wurden die p-Werte über die getesteten MPO-bezogenen CpG-Stellen hinweg mittels der Benjamini-Hochberg-Methode zur Kontrolle der falschen Entdeckungsrate angepasst. Diese Methylierungsanalysen wurden als explorative epigenetische Annotationen interpretiert.

Konstruktion des PPI-Netzwerks und Korrelationsanalyse neutrophiler verwandter Gene

Um die Assoziation zwischen MPO und neutrophilenbezogener Biologie zu untersuchen, wurde eine systematische Netzwerkanalyse durchgeführt. Ein Gen-Set, bestehend aus etablierten Mediatoren der Neutrophilenaktivierung und assoziierten entzündlichen Prozessen, wurde aus der aktuellen Literatur zusammengestellt. Die vollständige Liste neutrophilenbezogener Gene ist in Supplementär-Tabelle 2 enthalten. Die Gensymbole wurden auf offizielle Gensymbole harmonisiert, doppelte Einträge entfernt, und verfügbare Gene mit der TCGA-BRCA-Expressionsmatrix geschnitten, bevor die STRING/PPI-Analyse, die Hub-Gen-Priorisierung und die MPO–Hub-Gen-Korrelationsanalyse durchgeführt wurden. Das PPI-Netzwerk zwischen diesen Genen wurde mithilfe der STRING-Datenbank (Version 11.5) mit einer mittleren Konfidenzschwelle für Interaktionen (>0.40) erstellt. Hub-Gene innerhalb dieses Netzwerks wurden algorithmisch basierend auf der Gradzentralität priorisiert, die die Anzahl direkter Interaktionen pro Knoten quantifiziert. Die 20 Gene mit den höchsten Gradwerten wurden für die nachgeschaltete Korrelationsanalyse ausgewählt.

Anschließend wurden die Expressionsprofile dieser Hub-Gene und von MPO aus dem transkriptomischen Datensatz TCGA-BRCA extrahiert. Die Assoziation zwischen MPO und jedem Hub-Gen wurde statistisch mittels Spearman-Rangkorrelation bewertet. Um die Korrelationsmuster zwischen den Hub-Genen selbst zu charakterisieren, wurde eine paarweise Spearman-Korrelationsmatrix über alle Tumorproben berechnet. Diese Korrelationsanalysen bildeten die quantitative Grundlage für nachfolgende Visualisierungen, darunter das Lollipop-Diagramm der MPO-Hub-Gen-Korrelationen sowie das Chord-Diagramm beziehungsweise die Heatmap zur Darstellung der Korrelationsmuster unter den Hub-Genen.

Vorhersage upstreamliegender Transkriptionsfaktoren und miRNAs mit MPO als Zielgen

Die KnockTF-Datenbank (https://bio.liclab.net/KnockTF/index.php)28,29, die ChIP-Datenbank (http://chip-atlas.org/)30,31 und die GTRD-Datenbank32,33 (https://gtrd.biouml.org/#!) wurden zur Vorhersage der Ziel-Transkriptionsfaktoren von MPO verwendet. Zusätzlich wurde die TargetScan-Datenbank (https://www.targetscan.org/vert_80/) genutzt, um potenzielle miRNA-Bindungsstellen, die MPO targeten, vorherzusagen. Venn-Diagramme wurden mithilfe der MicroBioinformatik-Website (https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html)34 erstellt.

Einzelzell-Analyse von MPO

Der spezifische Datensatz GSE161529 stammt aus dem Gene Expression Omnibus (GEO). Bei der Datenpräprozessierung wurde zunächst eine Filterung auf Zellebene durchgeführt, um Zellen von geringer Qualität auszuschließen – also solche, die eines der folgenden Kriterien erfüllten: mitochondriale Genexpression über 25 %, Gesamtanzahl eindeutiger molekularer Identifikatoren (UMI) unter 5000 oder weniger als 2500 nachgewiesene Gene. Anschließend wurden Kontaminationen durch umgebende RNA sowie technische Batch-Effekte korrigiert35. Zur Dimensionsreduktion und Beurteilung der zellulären Ähnlichkeit wurde eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) durchgeführt, gefolgt von UMAP zur Zellclustern und Visualisierung. Danach wurden die verschiedenen Cluster anhand der typischen Markergene den entsprechenden Zelltypen zugeordnet11. Der für die Signaturbewertung auf Einzelzellniveau verwendete MPO-assozierte Gen-Satz ist in Zusatzdatei 1 enthalten. Vor der Bewertung wurden die Gensymbole auf offizielle Gensymbole harmonisiert, doppelte Einträge entfernt und die verfügbaren Gene mit der Expressionsmatrix von GSE161529 abgeglichen. AUCell, Seurat AddModuleScore und ssGSEA wurden verwendet, um MPO-assozierte Scores pro Zelle zu berechnen. Die aus den drei Methoden resultierenden Scores wurden mittels Z-Score normalisiert, in einen vergleichbaren Wertebereich skaliert und kombiniert, um einen zusammengesetzten MPO-assozierten Score für nachfolgende deskriptive Analysen zu erzeugen. Zell-Zell-Interaktionsnetzwerke wurden untersucht, um abgeleitete Ligand-Rezeptor-Kommunikationsmuster zwischen epithelialen Tumorzellen, die nach MPO-assoziertem Signal stratifiziert waren, und verschiedenen Partnerzelltypen zu vergleichen. Diese Ergebnisse wurden als deskriptive Kommunikationsmuster interpretiert, nicht jedoch als Beleg dafür, dass MPO-exprimierende Zellen die interzelluläre Kommunikation direkt vermitteln.

Virtueller Knockdown einzelner Zellen von MPO und Pfadbereicherungsanalyse unter Verwendung von scTenifoldKnk

Der virtuelle Knockdown von MPO auf Einzelzellniveau wurde durch Integration von Seurat und scTenifoldKnk durchgeführt. Nach standardmäßiger Qualitätskontrolle (200–6.000 Gene pro Zelle; mitochondriale Fraktion < 10 %) wurden die Daten log-normalisiert und 2.000 hochvariable Gene zur Dimensionsreduktion und zum Clustering ausgewählt. Um MPO-relevante Kontexte anzureichern, wurden Zellen beibehalten, die innerhalb der oberen 50 % für ein myeloisches/Neutrophil-Genmodul lagen. Aus diesen Zellen wurde ein MPO-Nachbarschafts-Teilensemble definiert, indem ausgehend von MPO-positiven Ausgangszellen mittels k = 40 nächstgelegenen Nachbarn im PCA-Raum erweitert wurde. Das erweiterte Teilensemble wurde nicht als reine MPO-positive Population betrachtet, und aus diesem KNN-Erweiterungsschritt wurden keine Schlussfolgerungen über Zelltyp-Proportionen gezogen. Dieses Teilensemble wurde einer virtuellen Knockdown-Analyse mittels scTenifoldKnk unter Verwendung der Vereinigung aus hochvariablen Genen und MPO (in ≥25 Zellen exprimiert) als Genmenge unterzogen. Signifikant gestörte Gene wurden identifiziert (FDR < 0,05, BH-angepasst). Die resultierenden Gene wurden anschließend hinsichtlich funktioneller Anreicherung in GO-Biologischen Prozessen und KEGG-Wegen analysiert (q < 0,05).

Explorative Arzneimittel-Gen-Rückgewinnung und ADMET-Anmerkung

DGIdb wurde abgefragt, um vorläufige MPO-assoziierte Wechselwirkungseinträge zwischen Arzneistoffen und Genen bzw. chemischen Substanzen und Genen zu erhalten. Da aus Datenbanken stammende Interaktionslisten Einträge enthalten können, die durch heterogene Evidenztypen gestützt werden und möglicherweise nicht direkt klinisch relevante therapeutische Wirkstoffe darstellen, wurden die abgerufenen Verbindungen als explorative Annotationen und nicht als priorisierte Behandlungskandidaten behandelt. Anschließend wurden SwissADME und ADMETlab verwendet, um vorhergesagte physikochemische, pharmakokinetische und toxikologische Eigenschaften zusammenzufassen. Diese in-silico-Annotationen dienten dazu, einen vorläufigen Kontext für die Interpretation auf Ebene der Verbindungen bereitzustellen und darauf hinzuweisen, dass eine weitere pharmakologische, toxikologische und klinische Aufbereitung erforderlich ist, bevor eine therapeutische Relevanz in Betracht gezogen werden kann36.

Ergebnisse

Expressionsmuster von MPO und explorative Überlebensassoziationen beim Brustkrebs

Um die MPO-Expressionsmuster in Krebsdatensätzen zu beschreiben, analysierten wir MPO-RNA-seq-Daten aus dem TCGA-Pankrebs-Datensatz und beobachteten eine niedrigere MPO-Expression in Tumorgeweben von Blasenurothelkarzinom (BLCA), invasivem Brustkarzinom (BRCA), Glioblastom multiforme (GBM), Plattenepithelkarzinom des Kopf- und Halsbereichs (HNSC), chromophobem Nierenzellkarzinom (KICH), hepatozellulärem Karzinom der Leber (LIHC), Lungenadenokarzinom (LUAD), Plattenepithelkarzinom der Lunge (LUSC), Pankreaskarzinom (PAAD), Prostataadenokarzinom (PRAD) und Schilddrüsenkarzinom (THCA) sowie eine höhere MPO-Expression in Kolonadenokarzinom (COAD), papillärem Nierenzellkarzinom (KIRP) und anderen Geweben (Abbildung 2A). Anschließend untersuchten wir die Assoziationen zwischen MPO-Expression und klinischen Ergebnissen für jeden Krebstyp. In der TCGA-BRCA-Kohorte zeigten sowohl ungepaarte als auch gepaarte Vergleiche eine niedrigere MPO-Expression im Tumorgewebe im Vergleich zum normalen/benachbarten Gewebe (Abbildung 2B,C). Nach Aufteilung der TCGA-BRCA-Tumorproben anhand des medianen MPO-Expressionswerts im Tumor ergab die Kaplan-Meier-Analyse, dass Patientinnen mit höherer MPO-Expression ein längeres progressionsfreies Intervall aufwiesen (Hazard Ratio (HR) = 0,67, p = 0,028) (Abbildung 2D). Die Gesamtüberlebenszeit (OS) (p = 0,296; ergänzende Abbildung 1A) und die krankheitsspezifische Überlebenszeit (DSS) (p = 0,18; ergänzende Abbildung 1B) waren nicht statistisch signifikant. Die ROC-Kurve für Tumor im Vergleich zu Normalgewebe deutete auf eine Trennung zwischen den Gewebegruppen in diesem Datensatz hin (Abbildung 2E), diese Analyse sollte jedoch nicht als klinische diagnostische Validierung interpretiert werden. Diese explorative Unterscheidung könnte durch die Herkunft der Normalproben, Batch-Effekte, Tumorreinheit und Unterschiede in der Gewebestruktur beeinflusst sein. Die MPO-Expression war außerdem mit dem pathologischen T-Stadium (Abbildung 2F) und der Verteilung der PAM50-Subtypen assoziiert (Abbildung 2G). Repräsentative Immunhistochemie-Bilder (IHC) von benachbartem normalem Brustgewebe und Brustkrebsgewebe wurden als qualitative Referenzen auf Proteinebene hinzugefügt (Abbildung 2H). Die markierten Kästen zeigen die Bereiche mit höherer Vergrößerung an. Die Übersichtsbilder mit 20× zeigen Maßstäbe von 100 µm, während die 40×-Bilder mit höherer Vergrößerung Maßstäbe von 50 µm enthalten.

Korrelations- und Anreicherungsanalyse von MPO im TCGA-BRCA-Kohorten

Die Pearson-Korrelationsanalyse identifizierte die 30 Gene mit der stärksten positiven Korrelation zu MPO, die eine koordinierte Hochregulation entlang des MPO-Expressionsgradienten zeigten (Abbildung 3A), während die 30 am stärksten negativ korrelierten Gene ein inverses Expressionsmuster aufwiesen (Abbildung 3B). Auf der Ebene der Signalwege war die MPO-Expression signifikant und positiv mit mehreren tumorspezifischen Signatur-Scores assoziiert, einschließlich der Signatur für entzündliche Reaktion (r = 0,41; Abbildung 3C), EMT-Markern (r = 0,264; Abbildung 3D) und dem Score für die reaktive Sauerstoffspezies (ROS)-bezogene Gen-Gruppe (r = 0,415; Abbildung 3E), was darauf hindeutet, dass die MPO-Expression mit entzündlichen/oxidativen und mesenchymalen Transkriptionszuständen in der TCGA-BRCA-Kohorte korreliert.

Die unbeaufsichtigte Clusterung von MPO-assoziierten Genen unterteilte Tumore weiter in Expressionsmuster, die mit klinischen Annotationen übereinstimmten, einschließlich des pathologischen T-Stadiums und der PAM50-intrinsischen Subtypen (Abbildung 3F). Um mögliche Zusammenhänge zwischen MPO-assoziierten Genen zu untersuchen, erstellten wir ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) mithilfe von STRING, das ein vernetztes Modul mehrerer mit MPO korrelierter Gene aufzeigte (Abbildung 3G). Im PPI-Netzwerk wiesen ESR1, FOXA1, XBP1, GATA3 und KRT18 eine hohe Netzwerkverknüpfung innerhalb dieses aus der Korrelation abgeleiteten Moduls auf. Diese Ergebnisse identifizieren Gene, die gemeinsam mit der MPO-Expression variieren, belegen jedoch weder eine MPO-bezogene Pathogenese noch eine Richtung der Beziehung. Die differentielle Expressionsanalyse zwischen der MPO-hohen und der MPO-niedrigen Gruppe ergab transkriptomische Unterschiede, die im Volcano-Plot zusammengefasst sind (Abbildung 3H). Insgesamt wurden 1.159 hochregulierte und 854 herunterregulierte Gene identifiziert, die als Eingabedaten für nachfolgende Anreicherungsanalysen dienten.

Als Nächstes untersuchten wir die funktionelle Relevanz der differentiell exprimierten Gene (DEGs) zwischen den MPO-hohen und MPO-niedrigen Gruppen mithilfe des clusterProfiler-Pakets in R. Die Genontologie (GO)-Anreicherungsanalyse zeigte, dass diese DEGs vorwiegend an immunbezogenen biologischen Prozessen beteiligt waren, einschließlich der Regulation der zellulären Oberflächenrezeptorsignalgebung im Zusammenhang mit Immunantwort und der lymphozytenvermittelten Immunität, wobei eine Anreicherung ebenfalls in zellulären Komponenten wie dem T-Zell-Rezeptorkomplex sowie in molekularen Funktionen im Zusammenhang mit Rezeptoraktivatoraktivität beobachtet wurde (Abbildung 4A). In Übereinstimmung damit wiesen die KEGG-Pfadanalysen auf immun- und entzündungsassoziierte Signalwege hin, darunter Zytokin–Zytokinrezeptor-Interaktion, Chemokin-Signalgebung, T-Zell-Rezeptor-Signalgebung, natürliche Killerzell-vermittelte Zytotoxizität, Th1/Th2- und Th17-Differenzierung, NF-κB-Signalgebung, primäre Immundefizienz sowie das intestinale Immunnetzwerk für die IgA-Produktion (Abbildung 4B).

Um die Expressionsrichtung weiter mit funktionellen Begriffen zu verknüpfen, wurde das GO-Diagramm verwendet, um termbezogene Z-Werte basierend auf den |log2FC|-Werten der DEG zu berechnen, wodurch erneut immunverstärkte transkriptionelle Programme hervorgehoben wurden, wie beispielsweise die humorale Immunantwort, die von Leukozyten/Lymphozyten vermittelte Immunität, die Aktivierung der Immunantwort und die Signaltransduktion (Abbildung 4C). Eine Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) basierend auf der sortierten Genliste zeigte ebenfalls eine Anreicherung von Immunsystemwegen, einschließlich des adaptiven Immunsystems, der Interaktion von Zytokin–Zytokinrezeptor und der Neutrophilendegranulation (Abbildung 4D–G). Da MPO ein myeloide/Neutrophil-assoziiertes Gen ist, werden diese Anreicherungen als Hinweis darauf interpretiert, dass MPO-reiche Proben stärkere immun/myeloide transkriptionelle Signale aufweisen, und nicht als Hinweis darauf, dass MPO selbst die immunologische Mikroumgebung umgestaltet.

Korrelation zwischen MPO-Expression und Immunzellinfiltration bei Brustkrebs

Wir untersuchten den Zusammenhang zwischen der MPO-Expression und den Merkmalen der Tumormikroumgebung im TCGA-BRCA-Kollektiv. Die Anwendung des ESTIMATE-Algorithmus ergab signifikante positive Korrelationen zwischen der MPO-Expression und dem ESTIMATE-Score (R = 0,347, p < 0,001), dem Immun-Score (R = 0,361, p < 0,001) sowie dem stromalen Score (R = 0,232, p < 0,001) (Abbildung 5A). Die Verteilung dieser Scores über die Proben hinweg ist in Abbildung 5B dargestellt. Eine Analyse mit Hilfe der TIMER/TIMER2.0-Ressource zeigte, dass die MPO-Expression mit den geschätzten Infiltrationsniveaus wichtiger Immunzellpopulationen assoziiert war, darunter B-Zellen, CD8+ T-Zellen, Neutrophile, CD4+ T-Zellen, Makrophagen und dendritische Zellen im TCGA-BRCA-Kollektiv (Abbildung 5C). Dieses Assoziationsmuster wurde weitergehend anhand von ssGSEA-basierten Anreicherungsscores für 24 Immunzelltypen überprüft. Nach Korrektur der Falsch-Entdeckungsrate nach Benjamini–Hochberg zeigte die MPO-Expression positive Assoziationen mit mehreren Anreicherungsscores für Immunzellen, darunter T-Zellen, B-Zellen, zytotoxische Zellen, Subpopulationen dendritischer Zellen, Makrophagen, T-Helfer-Subpopulationen, regulatorische T-Zellen, CD8+ T-Zellen, NK-Zellen, Mastzellen und Neutrophile (Abbildung 5D). Diese Befunde werden als Hinweise auf Assoziationen mit der immunologischen Zusammensetzung interpretiert, nicht jedoch als Beleg dafür, dass MPO die Infiltration von Immunzellen direkt steuert. Ein Heatmap wurde erstellt, um die Musterverteilung der Immunzellanreicherung auf Ebene einzelner Proben im TCGA-BRCA-Kollektiv zu visualisieren (Abbildung 5E). Anschließend verglichen wir die mittels ssGSEA geschätzten Anreicherungsscores für Immunzellen zwischen medianbasiert definierten MPO-hohen und MPO-niedrigen Tumorgruppen. Mehrere Anreicherungsscores für Immunzellen unterschieden sich zwischen den beiden Gruppen, darunter aktivierten dendritischen Zellen (aDC), B-Zellen, CD8+ T-Zellen, zytotoxischen Zellen, Neutrophilen, T-Zellen, Tregs, Th1-Zellen, Th2-Zellen, Th17-Zellen, γδ T-Zellen, follikulären Helfer-T-Zellen (TFH), Zellen mit hoher Genexpression-Variabilität (HVG), effektorischen Gedächtnis-T-Zellen, zentralen Gedächtnis-T-Zellen und T-Helferzellen (Abbildung 5F,G). Zusätzlich wurde eine mittels CIBERSORT durchgeführte Dekonvolution unter Verwendung der LM22-Signaturmatrix durchgeführt, um die relativen Anteile von 22 Immunzelltypen abzuschätzen; die resultierenden Muster der Immunzellzusammensetzung sind in Abbildung 5H dargestellt.

Analyse der DNA-Methylierung von MPO in der TCGA-BRCA-Kohorte

Unter Verwendung derselben medianen MPO-Expressions-Schwellenwerte für Tumore wurden die TCGA-BRCA-Proben in MPO-hohe und MPO-niedrige Gruppen eingeteilt, und die DNA-Methylierungsmuster wurden für jede Gruppe visualisiert (Abbildung 6A). Ausgewählte CpG-Stellen innerhalb des MPO-Lokus zeigten Überlebensassoziationen in der MethSurv-Analyse, darunter cg22331200, cg14619064 und cg11151395 (Abbildung 6B–G). Diese methylierungsbezogenen Ergebnisse wurden als explorative epigenetische Annotationen interpretiert und erfordern eine unabhängige Validierung, bevor prognostische oder mechanistische Schlussfolgerungen gezogen werden können.

Zusammenhang zwischen MPO-Expression und neutrophilen-verwandten Gen-Netzwerken beim Brustkrebs

Die TCGA-BRCA-Kohorte wurde verwendet, um die Assoziation zwischen MPO-Expression und neutrophilen-assoziierten Genen zu untersuchen. Ein auf STRING basierendes PPI-Netzwerk wurde für neutrophile-assoziierte Gene erstellt, und Hub-Gene wurden entsprechend der Netzwerktopologie priorisiert (Abbildung 7A). Die 20 wichtigsten Hub-Gene wurden anschließend hinsichtlich ihrer Korrelation mit der MPO-Expression bewertet. Wie im Lollipop-Diagramm dargestellt, zeigte MPO vorwiegend positive Korrelationen mit mehreren neutrophilen-assoziierten Mediatoren, wobei stärkere Assoziationen für Komponenten der Chemokin-/angeborenen Immunsignalkaskade wie CCL5, CCL2 und TLR2 sowie TLR4, CXCR4, TNF und MMP9 beobachtet wurden (Abbildung 7B).

Um das Koregulationsmuster unter diesen Hub-Genen weiter zu charakterisieren, visualisierten wir ihre paarweisen Beziehungen mithilfe eines Sehnendiagramms und einer Korrelations-Heatmap, wodurch umfangreiche positive Inter-Gen-Korrelationen innerhalb des Hub-Moduls sichtbar wurden, was mit einem koordinierten inflammatorischen/neutrophilenassoziierten transkriptionellen Programm übereinstimmt (Abbildung 7C,D). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass eine höhere MPO-Expression von einer koordinierten Expression eines neutrophilenassoziierten Gen-Netzwerks im Brustkrebs begleitet wird.

Anmerkung der kandidaten Transkriptionsfaktoren für MPO

Um mögliche Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, die potenziell mit MPO assoziiert sind, wurden öffentliche Ressourcen zu Transkriptionsfaktoren, einschließlich KnockTF, ChIP-Atlas und GTRD, abgefragt und miteinander verglichen. Die identifizierten Kandidaten wurden anschließend mittels netzwerkbasierter Priorisierung und Korrelationsanalyse zusammengefasst. Eine grafische Übersicht ist in Abbildung 2, Zusatzmaterial dargestellt, die vollständigen tabellarischen Ergebnisse finden sich in Datei 2, Zusatzmaterial. Da diese Datenbanken Belege aus heterogenen experimentellen Kontexten integrieren, dienten Überlappungen zwischen den Datenbanken sowie der Netzwerkgrad lediglich der Annotation und Priorisierung der Kandidaten. Diese Ergebnisse wurden nicht als funktioneller Nachweis einer direkten transkriptionellen Regulation von MPO im Brustkrebs interpretiert. Kandidatenfaktoren wie MYC werden daher als ergänzende explorative Annotationen und nicht als validierte upstream-Regulatoren präsentiert.

Einzelzell-Clustering und beschreibende Analyse der Zell-Zell-Kommunikation, stratifiziert nach MPO-Signal

Zur Annotation der Zelltypen führten wir zunächst eine cluster-spezifische Expressionsanalyse basierend auf kanonischen Markern für jede Linie durch. Die durchschnittlichen Expressionsniveaus und der Anteil der Zellen, die diese Schlüsselgene in den Clustern exprimieren, sind dargestellt und unterstützen die anschließende Annotation (Abbildung 8A). Entsprechend werden die annotierten Zellcluster in einem Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP)-Plot visualisiert, wobei jede Population farblich nach ihrem identifizierten Typ codiert ist, einschließlich plasmazytoider dendritischer Zellen, endothelialer Zellen, myoepithelialer Zellen, proliferierender epithelialer Zellen, Plasmazellen, zytotoxischer T-Zellen, epithelialer Tumorzellen, B-Zellen, aktivierter CD4+ T-Zellen, Monozyten–Makrophagen, Fibroblasten und konventioneller T-Zellen (Abbildung 8B). Die Heatmap zeigt die Expressionsniveaus ausgewählter Gene über die Zellcluster (C1–C8). Jede Zeile repräsentiert ein Gen, jede Spalte einen Zellcluster. Der Farbverlauf kennzeichnet die Expressionsniveaus, wobei Rot hohe und Blau niedrige Expression anzeigt. Die linke Dendrogramm-Struktur gruppiert Gene mit ähnlichen Expressionsmustern (Abbildung 8C). Die MPO-assozierte Bewertung wurde pro Zelle unter Verwendung des in Zusatzdatei 1 bereitgestellten MPO-assozierten Gen-Sets berechnet. AUCell, Seurat AddModuleScore und die single-sample Gen-Set-Enrichment-Analyse (ssGSEA) wurden verwendet, um die Bewertungen pro Zelle zu berechnen. Die Bewertungen aus den drei Methoden wurden mittels Z-Score normalisiert, in einen vergleichbaren Bereich skaliert und kombiniert, um eine zusammengesetzte MPO-assozierte Bewertung für die nachfolgende beschreibende Analyse zu erhalten (Abbildung 8D).

Diese Analyse der Zell-Zell-Interaktion verglich abgeleitete Muster der Ligand-Rezeptor-Kommunikation zwischen Zellgruppen, die nach MPO-assoziiertem Signal stratifiziert wurden, einschließlich des Interaktionsnetzwerks, der Heatmaps zur Signalverteilung sowie der Blasendiagramme für ausgehende und eingehende Signale (Abbildung 8E–H). Da das MPO-Signal auf Einzelzell-Ebene spärlich war und die scheinbare Verteilung über annotierte Zelltypen durch Dropouts, umgebende RNA, Doppelzellen und Unsicherheiten in der Annotation beeinflusst sein könnte, sollten diese Kommunikationsdarstellungen als beschreibende Ergebnisse des Workflows interpretiert werden. Sie belegen nicht, dass MPO-exprimierende Zellen die interzelluläre Kommunikation vermitteln oder steuern. Ein nachweisbares MPO-Signal wurde in einer begrenzten Anzahl von Zellen beobachtet, darunter annotierte epitheliale Tumorzellen und Monozyten–Makrophagen (Abbildung 8I). Angesichts der kanonischen Assoziation von MPO mit neutrophilen/myeloischen Linien erfordert dieses Muster eine Validierung in unabhängigen Einzelzell-Datensätzen oder durch orthogonale experimentelle Methoden.

Explorative scTenifoldKnk-Empfindlichkeitsanalyse basierend auf spärlichen MPO-positiven Zellen

Mehrere 10x Genomics-Proben wurden integriert, gefolgt von Normalisierung und Auswahl hochvariabler Gene (HVG), dimensionalitätsreduzierender Analyse mittels PCA, Erstellung eines k-nächste-Nachbarn-Graphen und Louvain-Clustering. Die kanonischen Muster der Marker-Gen-Expression über die Cluster hinweg wurden mittels eines DotPlot zusammengefasst, was die anschließende Zelltyp-Annotation unterstützt (Abbildung 9A). Die UMAP-Visualisierung zeigt die annotierten Einzelzell-Populationen im integrierten Datensatz (Abbildung 9B). Kanonische Linien-Marker (z. B. EPCAM und KRT8/KRT18 für epitheliale Zellen; PTPRC für Immunzellen; MS4A1 für B-Zellen; LST1/S100A8/S100A9 für myeloide Zellen; PECAM1 für endotheliale Zellen; sowie COL1A1 für Fibroblasten-/glattmuskuläre Linien) zeigten spezifische Expressionsmuster in den einzelnen Clustern, was die Zelltyp-Annotation stützt (Abbildung 9C). Stichprobenstratifizierte gestapelte Balkendiagramme zeigten, dass jede Probe mehrere Cluster enthält und nur geringe Unterschiede zwischen den einzelnen Proben (Batch-Effekte) aufweist (Abbildung 9D).

Der MPO-Ausdruck war im Einzelzell-Datensatz relativ gering, wobei anfänglich nur 85 MPO-positive Zellen detektiert wurden (Abbildung 9E). Angesichts dieser begrenzten Anzahl wurde eine KNN-basierte Nachbarschaftserweiterung lediglich verwendet, um eine lokale MPO-Nachbarschaftsteilmenge für eine explorative Sensitivitätsanalyse zu definieren. Diese erweiterte Teilmenge sollte nicht als reine MPO-positive Population interpretiert werden, da sie benachbarte Zellen mit niedrigem oder nicht nachweisbarem MPO-Ausdruck enthalten kann. Innerhalb dieser MPO-Nachbarschaftsteilmenge wurde ein virtueller Knockdown von MPO mittels scTenifoldKnk als rechnergestützte Sensitivitätsanalyse durchgeführt. Die resultierende Volcano-Plot-Darstellung, die Analyse der Mannigfaltigkeitsverschiebung, die Visualisierung der Mannigfaltigkeitsausrichtung, die GO/KEGG-Anreicherungsergebnisse sowie die Gene mit stärkster Verschiebung (Abbildung 9F-N) wiesen auf kandidatenhafte transkriptionelle Programme hin, die mit Antigenpräsentation, Aktivierung von myeloischen Zellen/Lymphozyten, Zytokinproduktion und phagosomenbezogenen Signalwegen assoziiert sind. Diese Ergebnisse sollten als explorative transkriptionelle Sensitivitätsausgaben interpretiert werden und nicht als direkter Beleg dafür, dass MPO diese Signalwege in Brustkrebs mechanistisch reguliert. Unabhängige Einzelzell-Datensätze sowie orthogonale experimentelle Validierungen, wie Immunhistochemie, Durchflusszytometrie, qPCR oder funktionelle Assays, werden erforderlich sein, um diese Beobachtungen zu bestätigen.

Explorative Abruf von Arzneimittel-Gen-Wechselwirkungen und ADMET-Anmerkung

Als explorative Erweiterung der MPO-zentrierten Analyse wurden Informationen zu Arzneimittel-Gen-Wechselwirkungen aus dem DGIdb abgerufen. Eine grafische Übersicht ist in Zusätzliche Abbildung 3 dargestellt, und Ergebnisse auf Ebene der Verbindungen werden in Zusätzliche Tabelle 3 bereitgestellt. Die DGIdb-Anfrage ergab eine heterogene Menge an chemischen Einträgen, die mit MPO assoziiert waren, einschließlich Verbindungen mit eingeschränkter klinischer Plausibilität oder ungünstigen toxikologischen Profilen. Daher wurden diese aus der Datenbank abgeleiteten Verbindungen angesichts der vorliegenden Analyse nicht als therapeutische Kandidaten für Brustkrebs betrachtet. ADMET-bezogene Informationen wurden zusammengefasst, um eine vorläufige Annotation vorhergesagter physikochemischer, pharmakokinetischer und toxikologischer Eigenschaften bereitzustellen. Die datenbankbasierte Rückgewinnung von Verbindungen und die ADMET-Anmerkung entsprechen nicht einer klinisch geprüften Arzneimittel-Priorisierung. Diese Ergebnisse dienen daher lediglich als chemische Annotationen auf Screening-Ebene und verdeutlichen die Notwendigkeit sorgfältiger pharmakologischer, toxikologischer und klinischer Filterung, bevor eine Verbindung für therapeutische Untersuchungen in Betracht gezogen werden kann. Die Hauptbefunde dieser Studie konzentrieren sich auf den Zusammenhang zwischen der MPO-Expression und immunen/myeloid-assoziierten transkriptionellen Merkmalen.

VERFÜGBARKEIT VON DATEN:

Transkriptomische und klinische Daten von TCGA-BRCA wurden über das Genomic Data Commons-Portal (https://portal.gdc.cancer.gov; heruntergeladen am 26. August 2025; Datenfreigabe/-version 202208) bezogen. Der Einzelzell-Datensatz GSE161529 wurde aus der Gene Expression Omnibus-Datenbank bezogen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161529). In dieser Studie wurden keine neuen Sequenzierungsdaten generiert. Analyse-Skripte sind öffentlich verfügbar unter https://github.com/tengfeitcm/MPO.

Flussdiagramm der Multi-Omics-Analyse, Zellkommunikation, MPO-Expression und Integration klinischer Daten
Abbildung 1: Flussdiagramm des Datensammel- und Analyseprozesses. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Forschung zum Brustkrebs; Balkendiagramme der MPO-Expression, Überlebenskurve, ROC, Analyse von Histologiebildern.
Abbildung 2: MPO-Expressionsmuster und explorative Überlebensassoziationen beim Brustkrebs. (A) MPO-Expressionswerte wurden in 33 verschiedenen Krebstypen und den jeweils angrenzenden Normalgeweben anhand der TCGA-Datenbank analysiert. (B) Ungepaarte Proben wurden aus dem TCGA-BRCA-Datensatz ausgewählt, um die MPO-mRNA-Expression in Brustkrebs- und Normalgeweben zu analysieren. (C) Gepaarte Proben wurden aus dem TCGA-BRCA-Datensatz ausgewählt, um die MPO-mRNA-Expression in Brustkrebs- und Normalgeweben zu analysieren. (D) Kaplan-Meier-Analyse des PFI bei Patientinnen, stratifiziert nach dem medianen Tumor-MPO-Expressionscutoff in der TCGA-BRCA-Kohorte. (E) Explorative ROC-Kurve zur Bewertung der Unterscheidung zwischen Tumor und Normalgewebe basierend auf der MPO-Expression im analysierten öffentlichen transkriptomischen Datensatz. (F) MPO-Expression über verschiedene pathologische T-Stadien hinweg. (G) MPO-Expression über die PAM50-molekularen Subtypen, mit angegebenen Subtyp-Bezeichnungen. (H) Repräsentative Bilder der MPO-Immunhistochemie (IHC) von angrenzendem normalem Brustgewebe und Brustkrebsgewebe. Die markierten Bereiche zeigen Ausschnitte mit höherer Vergrößerung. Die Übersichtsbilder mit 20× enthalten Maßstäbe von 100 µm, während die vergrößerten Bilder mit 40× Maßstäbe von 50 µm enthalten. Diese Bilder dienen als qualitative Referenzen auf Proteinebene und wurden nicht für quantitative morphometrische oder statistische Analysen verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Diagramme zur Genexpressionsanalyse und Netzwerkdiagramm, Heatmaps, Streu- und Volcanoplots.
Abbildung 3: Korrelations- und differentielle Expressionsanalyse im Zusammenhang mit MPO beim Brustkrebs. (A) Die 30 am stärksten kodierenden Gene, die positiv mit der MPO-Expression auf mRNA-Ebene korrelieren, basierend auf den Pearsonschen Korrelationskoeffizienten aus der TCGA-Datenbank. (B) Die 30 am stärksten kodierenden Gene, die negativ mit der MPO-Expression auf mRNA-Ebene korrelieren, basierend auf den Pearsonschen Korrelationskoeffizienten. (C) Streudiagramme, die die Spearman-Korrelationen zwischen MPO und Genen darstellen, die durch entzündliche Reaktionen hochreguliert werden. (D) Streudiagramme, die die Spearman-Korrelationen zwischen MPO und Genen darstellen, die durch EMT-Marker hochreguliert werden. (E) Streudiagramme, die die Spearman-Korrelationen zwischen MPO und Genen darstellen, die durch ROS hochreguliert werden. (F) Heatmap der MPO-assoziierten Gencluster basierend auf klinischer Signifikanz (T-Stadium und PAM50). (G) PPI-Netzwerk, vorhergesagt mithilfe der STRING-Datenbank für MPO-assoziierte Proteine. (H) Volcanoplot der differentiell exprimierten Gene zwischen medianbasiert als MPO-hoch und MPO-niedrig definierten Tumorgruppen in der TCGA-BRCA-Kohorte. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Diagramme der Genanreicherungsanalyse mit Wegen und Ontologie-Kategorien; Balkendiagramme und Liniengraphen.
Abbildung 4: Anreicherungsanalyse von MPO beim Brustkrebs. (A) Genontologie-Anreicherungsanalyse der 2.013 differentiell exprimierten Gene zwischen der MPO-hohen und der MPO-niedrigen Gruppe. (B) Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome (KEGG)-Pfad-Anreicherungsanalyse der 2.013 differentiell exprimierten Gene. (C) Kombinierte Visualisierung der Genontologie-Anreicherung unter Integration angereicherter Terme mit der Richtung der differentiellen Expression und |log2FC|-Werten. (D) Repräsentatives GSEA-Anreicherungsdiagramm für einen MPO-assoziierten, immunbezogenen Gen-Satz; im Diagramm angezeigt sind der Name des Gen-Satzes, der normalisierte Anreicherungsscore und der FDR-q-Wert. (E) Repräsentatives GSEA-Anreicherungsdiagramm für einen weiteren MPO-assoziierten, immunbezogenen Gen-Satz; im Diagramm angezeigt sind der Name des Gen-Satzes, der normalisierte Anreicherungsscore und der FDR-q-Wert. (F) Repräsentatives GSEA-Anreicherungsdiagramm für einen weiteren MPO-assoziierten, immunbezogenen Gen-Satz; im Diagramm angezeigt sind der Name des Gen-Satzes, der normalisierte Anreicherungsscore und der FDR-q-Wert. (G) Repräsentatives GSEA-Anreicherungsdiagramm für einen weiteren MPO-assoziierten, immunbezogenen Gen-Satz; im Diagramm angezeigt sind der Name des Gen-Satzes, der normalisierte Anreicherungsscore und der FDR-q-Wert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diagramme zur Genexpression, Rolle von MPO bei der Immunzellinfiltration, Korrelation und Datenvisualisierung.
Abbildung 5: Korrelation zwischen Anreicherung von Immunzellen und MPO-Expression beim Brustkrebs. (A) Streudiagramme zur Darstellung der Korrelationen zwischen der MPO-Expression und dem ESTIMATE-Score, dem Immunscore sowie dem stromalen Score. (B) Boxplots zur Veranschaulichung der Unterschiede im ESTIMATE-Score, Immunscore und stromalen Score zwischen medianbasiert definierten MPO-hohen und MPO-niedrigen Tumorgruppen. (C) Analyse basierend auf TIMER/TIMER2.0, die die Assoziationen zwischen der MPO-Expression und der geschätzten Infiltration der wichtigsten Immunzellpopulationen zeigt. (D) Lollipop-Diagramm zur Darstellung der Spearman-Korrelationen zwischen der MPO-Expression und den mittels ssGSEA geschätzten Anreicherungsscores für 24 Immunzelltypen. Die p-Werte aus mehrfachen Korrelationen mit Immunzellen wurden mittels der Benjamini–Hochberg-False-Discovery-Rate-Methode angepasst. (E) Heatmap zur Veranschaulichung der Musterverteilung der Immunzellanreicherung auf Ebene einzelner Proben in der TCGA-BRCA-Kohorte. (F) Boxplots zur Darstellung des ersten Satzes von mittels ssGSEA geschätzten Unterschieden in den Anreicherungsscores von Immunzellen zwischen medianbasiert definierten MPO-hohen und MPO-niedrigen Tumorgruppen; die Gruppenvergleiche wurden mittels des Wilcoxon-Rangsummentests mit Benjamini–Hochberg-Korrektur durchgeführt. (G) Boxplots zur Darstellung des zweiten Satzes von mittels ssGSEA geschätzten Unterschieden in den Anreicherungsscores von Immunzellen zwischen medianbasiert definierten MPO-hohen und MPO-niedrigen Tumorgruppen; die Gruppenvergleiche wurden mittels des Wilcoxon-Rangsummentests mit Benjamini–Hochberg-Korrektur durchgeführt. (H) Gestapeltes Balkendiagramm zur Darstellung der mittels CIBERSORT geschätzten Anteile von Immunzellen basierend auf der LM22-Signaturmatrix für 22 Immunzelltypen in medianbasiert definierten MPO-niedrigen und MPO-hohen Tumorgruppen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Heatmap der DNA-Methylierungsmuster und Überlebensanalysegrafiken für die Genexpressionsstudie.
Abbildung 6: DNA-Methylierungsanalyse des MPO-Gens bei Brustkrebs. (A) Heatmap, die MPO-Methylierungsmuster in medianbasierten MPO-hohen und MPO-niedrigen Gruppen zeigt. (B) Kaplan-Meier-Überlebenskurve, die die prognostische Bedeutung der Methylierung an der Stelle cg27456487 veranschaulicht. (C) Kaplan-Meier-Überlebenskurve, die die prognostische Bedeutung der Methylierung an der Stelle cg02668773 veranschaulicht. (D) Kaplan-Meier-Überlebenskurve, die die prognostische Bedeutung der Methylierung an der Stelle cg07110356 veranschaulicht. (E) Kaplan-Meier-Überlebenskurve, die die prognostische Bedeutung der Methylierung an der Stelle cg11151395 veranschaulicht. (F) Kaplan-Meier-Überlebenskurve, die die prognostische Bedeutung der Methylierung an der Stelle cg14619064 veranschaulicht. (G) Kaplan-Meier-Überlebenskurve, die die prognostische Bedeutung der Methylierung an der Stelle cg22331200 veranschaulicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Analyse des Genexpressionsnetzwerks; Diagramm, Schaubild, Korrelationsergebnisse; Proteininteraktionsdaten.
Abbildung 7: Analyse der Korrelationen zwischen MPO und neutrophilen-assoziierten Genen auf mRNA-Ebene unter Verwendung der TCGA-Datenbank. (A) Visualisierung des Proteininteraktionsnetzwerks, das Wechselwirkungen zwischen dem Kernprotein und anderen Proteinen darstellt. (B) Korrelationsanalyse der 20 am stärksten mit Neutrophilen assoziierten Gene in Bezug auf MPO, mit Darstellung der Korrelationskoeffizienten und Verteilung der P-Werte für verschiedene Gene. (C) Sehnendiagramm der Korrelationen unter den 20 am stärksten neutrophilen-assoziierten Genen, das visuell Stärke und Richtung der Genassoziationen repräsentiert. (D) Wärmekarte der Korrelationen der 20 am stärksten neutrophilen-assoziierten Gene, die Korrelationskoeffizienten und Signifikanzniveaus durch Farbverläufe und statistische Markierungen anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Zelluläre Cluster und Expressionsanalyse; Graphen, Heatmaps und Netzwerkdiagramm; RNA-Sequenzierungsdaten.
Abbildung 8: Einzelzell-Clustering und Analyse der MPO-assoziierten Zell-Zell-Kommunikation im Einzelzell-Datensatz von Brustkrebs. (A) DotPlot kanonischer Marker-Gene über die Cluster hinweg zur Zelltyp-Annotierung. (B) UMAP-Darstellung annotierter Zellpopulationen. (C) Heatmap ausgewählter Marker-Gene über die Zellcluster. (D) DotPlot zur Zusammenfassung der MPO-assoziierten Scores über annotierte Zelltypen, berechnet mittels AUCell, ssGSEA und Seurat AddModuleScore basierend auf dem in Zusatzdatei 1 bereitgestellten Gen-Satz. (E) Netzwerk der Zell-Zell-Interaktionen, das die Kommunikation zwischen epithelialen Tumorzellen, unterteilt nach MPO-assoziiertem Signal, und anderen Zelltypen darstellt; die Kantenbreite repräsentiert die Interaktionsstärke und die Knotengröße die gesamte Interaktionsaktivität. (F) Heatmaps, die die ausgehenden und eingehenden Signalisierungsmuster über die Zelltypen zeigen. (G) Blasendiagramm der ausgehenden Signalwege von epithelialen Tumorzellen, unterteilt nach MPO-assoziiertem Signal, an andere Zelltypen. (H) Blasendiagramm der eingehenden Signalwege von anderen Zelltypen zu epithelialen Tumorzellen, unterteilt nach MPO-assoziiertem Signal. (I) Verteilung der MPO-Expression über die annotierten Zelltypen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

UMAP-Clustering-Diagramme, Genexpressions-Heatmap, Balkendiagramme und Volcano-Plot zur Datenanalyse.
Abbildung 9: Analyse des Einzelzell-Atlas und explorative virtuelle Knockdown-Analyse der MPO-Sensitivitätsausgabe. (A) DotPlot, der die Expression kanonischer Marker-Gene über Einzelzell-Clustern zeigt; die Punktgröße repräsentiert den Prozentsatz der Zellen, die jeden Marker exprimieren, und die Farbintensität steht für die durchschnittliche Expressionsstärke. (B) UMAP-Visualisierung annotierter Einzelzellpopulationen, wobei jede Farbe einen unterschiedlichen Zelltyp oder Cluster darstellt. (C) UMAP-Visualisierung der Expression wichtiger Marker-Gene, die die Expressionsverteilung von Marker-Genen für Zelltypen einschließlich myeloischer Zellen zeigt. (D) Gestapeltes Balkendiagramm der Anteile der Zellcluster über die Proben hinweg. (E) UMAP-Visualisierung der MPO-Genexpression. (F) Violin-Plot, der QC-Metriken der Einzelzell-Sequenzierung anzeigt. (G) Clustering-Plot wichtiger Marker-Gene. (H) DotPlot kanonischer Marker-Gene auf Ebene der Cluster. (I) Volcano-Plot der Gene, die sich in der virtuellen Knockdown-Sensitivitätsanalyse verändert haben. (J) Streudiagramm der Verschiebung gegenüber der Signifikanz. (K) Pfeilplot zur Manifold-Alignment. (L) GO-BP-Anreicherungsanalyse der Gene aus der virtuellen Knockdown-Ausgabe. (M) KEGG-Pfad-Anreicherungsanalyse der Gene aus der virtuellen Knockdown-Ausgabe. (N) Die 20 Gene mit der höchsten Manifold-Verschiebung nach Ausschluss von MPO. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Zusatzabbildung 1: Zusätzliche Überlebensanalysen für MPO in der TCGA-BRCA-Kohorte. (A,B) Diese Datei enthält ergänzende Kaplan-Meier-Überlebensanalysen für (A) das Gesamtüberleben und (B) das krankheitsspezifische Überleben, aufgeteilt nach dem medianen Cutoff für die MPO-Expression im Tumor. Diese Analysen werden als zusätzliche Ergebnisanalysen zu Abbildung 2D bereitgestellt und waren in der vorliegenden Kohorte statistisch nicht signifikant.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Erweiterte Abbildung 2: Explorative annotierte Kandidaten-Transkriptionsfaktoren für MPO. (A) Venn-Diagramm, das den Durchschnitt der Kandidaten-Transkriptionsfaktoren aus drei öffentlichen Transkriptionsfaktor-Ressourcen zeigt. (B) Ergebnis des MYC-Expressionsvergleichs. (C) Wärmekarte der Transkriptionsfaktor-Korrelation mit Zeilen- und Spaltenbeschriftungen. (D) Ergebnis der MPO–MYC-Korrelation. (E) Ergebnis der MYC-Überlebensanalyse. (F) Ergebnis der MYC-ROC-Analyse. MYC-bezogene Ergebnisse werden nur als ergänzende annotierte Kandidaten-Transkriptionsfaktoren dargestellt und nicht zur Unterstützung mechanistischer Schlussfolgerungen über upstream liegende Regulatoren herangezogen.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung 3, Zusatzmaterial: Ergebnis der explorativen Abfrage der DGIdb-Datenbank nach Arzneimitteln und Genen für MPO. Graue Knoten stellen das MPO-Gen dar, orangefarbene Knoten repräsentieren gefundene niedermolekulare Wirkstoffe, und Verbindungslinien zeigen vorausgesagte Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln und Genen gemäß der Datenbank an.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Erweiterte Tabelle 1: Die LM22-Immunzell-Signaturmatrix, die für die CIBERSORT-basierte Entmischungsanalyse von 22 Immunzelltypen verwendet wurde. Gen-Symbole wurden harmonisiert, doppelte Einträge entfernt, und verfügbare Gene wurden vor der nachgeschalteten Analyse mit den entsprechenden Expressionsmatrizen von TCGA-BRCA oder GSE161529 abgeglichen.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Erweiterte Tabelle 2: Die Neutrophilen-bezogene Genliste, die für die STRING/PPI-Analyse, die Priorisierung von Hub-Genen und die MPO–Hub-Gen-Korrelationsanalyse verwendet wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungstabelle 3: Explorative DGIdb-Abrufergebnisse zu Arzneimittel-Gen-Interaktionen und ADMET-Anmerkungen für MPO. Diese Datei enthält von DGIdb abgerufene, mit MPO assoziierte Datensätze chemischer Gen-Interaktionen sowie vorhergesagte physikochemische, pharmakokinetische und toxikologische Annotationen auf Verbindungsebene. Diese Ergebnisse werden ausschließlich als vorläufige chemische Anmerkungen bereitgestellt und dürfen nicht als Liste therapeutischer Kandidaten interpretiert werden. Sie belegen weder eine Hemmung von MPO, Zielstrukturengagement, Liganden-Spezifität, Selektivität, Sicherheit, therapeutische Wirksamkeit noch klinische Eignung. Die Werte in dieser Tabelle repräsentieren vorhergesagte physikochemische Parameter und drugähnliche Eigenschaften der aufgelisteten Verbindungen. Die molare Masse ist in Gramm pro Mol (g/mol) angegeben. Die Werte für Wasserstoffbrücken-Akzeptoren und Wasserstoffbrücken-Donatoren geben die vorhergesagte Anzahl der jeweiligen Akzeptoren beziehungsweise Donatoren an. Der Moriguchi-Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizient zeigt die vorhergesagte Lipophilie an. Lipinski-Verstöße geben die Anzahl der Lipinski-Regel-der-fünf-Kriterien an, die von jeder Verbindung nicht erfüllt werden. Die Bioverfügbarkeitsbewertung stellt die vorhergesagte Bewertung im Hinblick auf orale Bioverfügbarkeit dar, und die topologische Oberfläche bezieht sich auf die vorhergesagte topologische polare Oberfläche.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 1: Die MPO-assozierte Genliste, die für die Single-Cell-Signaturbewertung mit AUCell, Seurat AddModuleScore und ssGSEA verwendet wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 2: Ergebnisse explorativer Annotationen für potenzielle Transkriptionsfaktoren und miRNAs für MPO. Diese Datei enthält aus Datenbanken abgeleitete Ergebnisse zu potenziellen Transkriptionsfaktoren und miRNA-Annotationen, die auf öffentlich zugänglichen Ressourcen wie KnockTF, ChIP-Atlas, GTRD und TargetScan basieren. Diese Annotationen dienen ausschließlich der explorativen Priorisierung von Kandidaten und sollten nicht als funktioneller Nachweis einer upstream-Regulation von MPO im Brustkrebs interpretiert werden.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Diese Studie stellt einen explorativen öffentlichen Datensatz und einen In-silico-Arbeitsablauf zur Untersuchung der Zusammenhänge zwischen MPO-Expression und immunen/myeloiden Merkmalen beim Brustkrebs vor. Die Analysen von TCGA-BRCA zeigten, dass die MPO-Expression in Tumorgeweben niedriger war als in angrenzendem Nicht-Tumorgewebe und dass eine höhere MPO-Expression mit einem längeren progressionsfreien Intervall assoziiert war. Allerdings waren Gesamtüberleben und krankheitsspezifisches Überleben nicht statistisch signifikant. Daher sollte MPO angesichts der vorliegenden Evidenz nicht als robuster oder etablierter prognostischer Biomarker interpretiert werden. Künftige Studien sollten MPO mittels multivariater Cox-Regressionsmodelle bewerten, die auf etablierte klinisch-pathologische Variablen adjustiert, unabhängige Validierungskohorten einbeziehen und analysen nach Subtypen stratifizieren.

Im Vergleich zur herkömmlichen differentiellen Expressionsanalyse mit einem einzelnen Kohortenansatz oder der Schätzung der Immuninfiltration auf einer einzelnen Plattform integriert dieser MPO-zentrierte Arbeitsablauf Bulk-Transkriptomik, Immunanreicherung, Methylierungsannotierung, Einzelzellzuordnung und virtuelle Perturbation, um einen umfassenderen explorativen Einblick in MPO-assoziierte immunologische/myeloide Merkmale zu ermöglichen. Dieser Arbeitsablauf ergänzt jedoch externe Kohortenvalidierungen, räumliche oder proteinbasierte Validierungen sowie experimentelle Perturbationsassays, ersetzt sie jedoch nicht.

Die Ergebnisse zur Immuninfiltration und Anreicherung sollten als MPO-assoziierte Immunumgebung und nicht als MPO-getriebene Immunremodellierung interpretiert werden. MPO wird vorwiegend in Neutrophilen und anderen Zellen der myeloischen Linie exprimiert37. Daher sind positive Korrelationen zwischen der MPO-Expression und ESTIMATE-Scores, Immunscores, Anreicherungsscores für Immunzellen, neutrophilenassoziierten Genen, Zytokinwegen, Antigenpräsentations-Signaturen oder Wegen der Neutrophilendegranulation biologisch plausibel und spiegeln möglicherweise weitgehend Unterschiede in der Häufigkeit von Immun- bzw. myeloischen Zellen in Gesamttumorproben wider. Diese Interpretation steht im Einklang mit früheren Studien, die gezeigt haben, dass die Infiltration durch MPO-positive Neutrophile mit einer günstigen Prognose beim Mammakarzinom assoziiert ist und dass MPO an der Funktion dendritischer Zellen sowie an der T-Zell-vermittelten Gewebeentzündung beteiligt ist38,39. Bulk-RNA-seq-Daten können nicht bestimmen, ob MPO eine intrinsische Aktivität in Tumorzellen besitzt oder ob das beobachtete Signal hauptsächlich infiltrierende Immunzellen widerspiegelt. Unabhängige Einzelzell-Datensätze, räumliche Profilierungen, Immunhistochemie, Durchflusszytometrie oder experimentelle Modelle auf der Grundlage von Störungen wären erforderlich, um die zelluläre Herkunft und Funktion zu klären.

Die Einzelzellanalyse liefert zusätzliche beschreibende Informationen, ist jedoch durch die spärliche Detektion von MPO eingeschränkt. Vor der KNN-basierten Nachbarschaftserweiterung wurden zunächst lediglich 85 MPO-positive Zellen detektiert. Obwohl die KNN-Erweiterung eine Sensitivitätsanalyse von Zellen in der lokalen transkriptionellen Umgebung der MPO-positiven Zellen ermöglichte, könnte dieses Verfahren Zellen einschließen, die MPO nicht direkt exprimieren. Demzufolge sollte die Ausgabe des virtuellen Knockdowns mittels scTenifoldKnk eher als explorative rechnergestützte Sensitivitätsanalyse denn als Beleg für eine MPO-vermittelte Pfadregulation angesehen werden40. Eine Validierung an unabhängigen Einzelzell-Datensätzen des Brustkrebses sowie durch orthogonale experimentelle Assays wird erforderlich sein, bevor mechanistische Schlussfolgerungen gezogen werden können.

Die Analyse der Transkriptionsfaktoren sollte ebenfalls mit Vorsicht interpretiert werden. Die Überlappung der Vorhersagen aus KnockTF, GTRD und ChIP-Atlas, gefolgt von einer gradbasierten Priorisierung, kann Kandidaten-Transkriptionsfaktoren vorschlagen, jedoch keine funktionelle transkriptionelle Regulation von MPO im Brustkrebs belegen. MYC und andere Kandidatenfaktoren wurden daher nur als explorative Annotationen beibehalten. Da die Aktivität von Transkriptionsfaktoren stark kontextabhängig ist und je nach Tumorsubtyp, zellulärer Zusammensetzung, Testplattform und Vorverarbeitungsstrategie variieren kann, wäre eine kontextspezifische Validierung erforderlich, bevor einem Kandidatenfaktor eine upstream-regulatorische Rolle zugeschrieben werden kann. Eine solche Validierung sollte ChIP-qPCR oder ChIP-seq, Promotor-Reportergen-Assays sowie die Störung des Transkriptionsfaktors mit anschließender Messung der MPO-Expression umfassen.

Die Rückgewinnung von Arzneimittel-Gen-Beziehungen und die ADMET-Anmerkung sollten ebenfalls mit Vorsicht interpretiert werden. DGIdb kann heterogene chemisch-genetische Assoziationen zurückgeben, einschließlich Verbindungen, die keine selektiven MPO-Liganden sind und eine begrenzte klinische Plausibilität oder ungünstige toxikologische Eigenschaften aufweisen können36. ADMET-Vorhersagen liefern vorläufige chemische Annotationen, belegen jedoch weder Targetbindung, Potenz, Selektivität, Sicherheit noch therapeutische Wirksamkeit41. Daher sollten die derzeitigen ergebnisse auf Ebene der Verbindungen nicht zur Ableitung eines therapeutischen Potenzials herangezogen werden. Eine aussagekräftige translationale Bewertung würde einen kurierten Satz pharmakologisch relevanter MPO-Hemmkörper oder Sonden, einen Vergleich mit etablierten MPO-gerichteten Verbindungen sowie eine Validierung mittels biochemischer, zellulärer und pharmakologischer Assays erfordern. Die kontextabhängige und möglicherweise doppelte Rolle von MPO bei Krebserkrankungen sollte ebenfalls bei der Interpretation arzneimittelbezogener Befunde berücksichtigt werden. MPO kann durch oxidativen Stress, Bildung reaktiver Oxidationsmittel, DNA-Schäden, chronische Entzündungen und Umbildung des Tumormikromilieus tumorfördernde Prozesse unterstützen. Gleichzeitig kann der MPO-Ausdruck in umfassenden Tumordatensätzen eine Infiltration durch Neutrophile oder andere myeloide Immunzellen widerspiegeln, die in bestimmten Kontexten mit einem immunaktivierten Mikromilieu und günstigeren klinischen Ergebnissen assoziiert sein können39,42. Die biologische Interpretation von MPO hängt daher von Tumortyp, zellulärer Herkunft, Krankheitsstadium und Zusammensetzung der Immunzellen ab.

DNA-Methylierungsbefunde innerhalb des MPO-Lokus wurden ebenfalls als explorativ betrachtet. Ausgewählte CpG-Stellen zeigten Assoziationen mit dem Überleben in der MethSurv-Analyse, doch diese Ergebnisse bedürfen einer unabhängigen Validierung, bevor prognostische oder mechanistische Schlussfolgerungen gezogen werden können. Eine epigenetische Regulation von MPO könnte mit der Bindung von Transkriptionsfaktoren und der Regulation auf Chromatinebene interagieren, doch solche Wechselwirkungen bleiben spekulativ, solange keine funktionellen Chromatin- oder Störungsdaten vorliegen43.

Die klinischen Implikationen der MPO-Expression sollten vorsichtig interpretiert werden. Die vorliegenden Ergebnisse etablieren MPO nicht als klinisch handhabbaren Biomarker oder als Marker, der derzeit Entscheidungen zur Immuntherapie beim Brustkrebs leiten könnte. Vielmehr könnte MPO einen myeloiden/neutrophilen-assoziierten immunologischen Kontext innerhalb des Tumormikromilieus widerspiegeln. In zukünftigen Studien könnte die MPO-Expression gemeinsam mit etablierten, immuntherapierelevanten Markern evaluiert werden, einschließlich tumorinfiltrierender Lymphozyten, PD-L1-Expression, Expression von Immuncheckpoint-Genen, molekularem Subtyp und validierten Immunsignaturen. Solche Analysen sollten unabhängige Kohorten, multivariable Modelle und Datensätze zur Behandlungsreaktion umfassen, bevor MPO für die Patientenstratifizierung oder Therapieentscheidungen in der Immuntherapie in Betracht gezogen werden kann.

Mehrere Arbeitsschritte sind entscheidend für die Reproduzierbarkeit, darunter eine konsistente Vorverarbeitung der TCGA-BRCA-Daten, die Einteilung in MPO-hoch/MPO-niedrig basierend auf dem Medianwert bei Tumoren ohne Normalgewebevergleich, vordefinierte statistische Schwellenwerte und Korrektur für Mehrfachvergleiche, Algorithmen zur Anreicherung von Immunzellen und entsprechende Signatur-Sets, Qualitätskontrolle und Annotation von Einzelzellen, die KNN-basierte Erweiterung des MPO-Nachbarschaftsbereichs sowie die explorative Auswertung der Ergebnisse zu virtuellem Knockdown und DGIdb/ADMET. Änderungen dieser Parameter können die nachfolgenden Ergebnisse und deren Interpretation beeinflussen; daher sollten sie sorgfältig dokumentiert und reproduziert werden. Bei Problemlösungen sollten inkonsistente Ergebnisse überprüft werden, indem die Herkunft der Proben, die Expressionnormalisierung, der Gruppierungsschwellenwert, die Korrektur für Mehrfachvergleiche, die verwendeten Immunzellen-Signaturen, die Qualitätskontrolle und Annotation der Einzelzellen, die Definition des KNN-Nachbarschaftsbereichs, die Schwellenwerte für den virtuellen Knockdown, die Anreicherungsschwellenwerte sowie heterogene Einträge zu Wirkstoffen in DGIdb/ADMET überprüft werden.

Mehrere Einschränkungen dieser Studie sollten berücksichtigt werden. Erstens basierte diese Studie auf retrospektiven Analysen öffentlicher Datenbanken unter Verwendung von TCGA-BRCA und öffentlich verfügbaren Einzelzell-Daten und könnte daher durch Kohortenheterogenität, Unterschiede in der Probenherkunft, Batch-Effekte, unvollständige klinische Annotationen sowie Unterschiede in der Tumorzusammensetzung beeinflusst sein. Zweitens leiten sich die vorliegenden Ergebnisse hauptsächlich aus transkriptomischen Assoziationen und In-silico-Analysen ab und weisen keinen direkten experimentellen Nachweis auf. Daher sollten die beobachteten Assoziationen zwischen MPO-Expression, immunen/myeloischen Merkmalen, Methylierungsannotationen, Kandidaten für Transkriptionsfaktoren und virtuellen Knockdown-Ergebnissen nicht als kausale Mechanismen interpretiert werden. Drittens war der Nachweis von MPO im Einzelzell-Datensatz spärlich, wobei vor der KNN-basierten Nachbarschaftserweiterung lediglich 85 MPO-positive Zellen detektiert wurden. Die erweiterte Teilmenge der MPO-Nachbarschaft könnte Zellen mit niedriger oder nicht nachweisbarer MPO-Expression enthalten und sollte nicht als reine MPO-positive Population betrachtet werden. Viertens können MPO-bezogene Signale in Bulk-RNA-seq-Daten, da MPO vorwiegend mit Neutrophilen und anderen myeloischen Zelllinien assoziiert ist, durch die Häufigkeit von Immunzellen, Tumorreinheit und zelluläre Zusammensetzung verfälscht sein, anstatt tumorzellintrinsische Aktivität widerzuspiegeln. Schließlich stellten die auf DGIdb basierende Arzneimittel-Gen-Rückgewinnung und die ADMET-Anmerkung lediglich explorative chemische Annotationen dar. Diese Ergebnisse belegen weder eine MPO-Hemmung, Zielstrukturnbindung, Selektivität, Sicherheit, therapeutische Wirksamkeit noch klinische Eignung. Zukünftige Studien unter Verwendung unabhängiger Kohorten, räumlicher oder proteinebener Validierung sowie funktioneller Experimente sind erforderlich, um die biologische und klinische Relevanz dieser Ergebnisse zu bestätigen.

Zusammenfassend unterstützen die Analysen aktueller öffentlicher Datensätze eine Assoziation zwischen der Expression von MPO und immunen/myeloiden transkriptionellen Merkmalen beim Brustkrebs, wobei eine höhere MPO-Expression mit einem längeren progressionsfreien Intervall in der analysierten Kohorte verbunden ist. Die Ergebnisse bleiben explorativ und hypothesengenerierend. Sie belegen nicht, dass MPO den tumorimmunologischen Mikromilieu kausal reguliert, dass MYC funktionell MPO reguliert oder dass die identifizierten Verbindungen therapeutische Relevanz besitzen. Die Hauptbeiträge dieser Studie sind ein reproduzierbarer computergestützter Workflow sowie ein Satz überprüfbarer Hypothesen, die eine Validierung an externen Kohorten und experimentelle Bestätigung erfordern.

Offenlegungen

Die Autoren geben an, dass in dieser Arbeit keine Interessenkonflikte bestehen. Ein auf KI basierendes Sprachkorrekturtool wurde ausschließlich zur Unterstützung bei der sprachlichen Überarbeitung und Verbesserung der Lesbarkeit während der Manuskriptrevision verwendet. Das Tool wurde nicht für die Studiendesignplanung, Datenanalyse, Erstellung von Abbildungen, Interpretation der Ergebnisse, Auswahl von Referenzen oder für die Ableitung wissenschaftlicher Schlussfolgerungen eingesetzt. Alle Analysen, Ergebnisse, Interpretationen, Referenzen und der endgültige Text wurden sorgfältig geprüft, revidiert und von den Autoren genehmigt, die die vollständige Verantwortung für den Inhalt des Manuskripts übernehmen.

Danksagungen

Die Autoren danken für die finanzielle Unterstützung durch den Fonds für wissenschaftliche Forschung des Aerospace Center Hospitals (YN202530).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CellChatR-Paket/Open Sourcehttps://github.com/sqjin/CellChatAnalyse der Zell-Zell-Kommunikation
ChIP-AtlasÖffentliche Datenbankhttps://chip-atlas.org/Screening von Transkriptionsfaktor-Zielen; Update 2021 
clusterProfilerBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/GO/KEGG-Enrichment-Analyse; v4.4.4
CytoscapeCytoscape-Konsortiumhttps://cytoscape.org/Netzwerkvisualisierung und Topologieanalyse
DGIdbWashington University/Öffentliche Datenbankhttps://www.dgidb.org/Abruf von Arzneimittel-Gen-Interaktionen
GDC/TCGA-BRCANational Cancer Institutehttps://portal.gdc.cancer.gov/Quelle für transkriptomische Bulkdaten und klinische Daten
Gene Expression Omnibus: GSE161529NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/Quelle für Einzelzell-Datensätze
GSEA/MSigDBBroad Institutehttps://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdbGen-Set-Enrichment-Analyse und Gen-Set-Referenz; Version 3.0 
GSVABioconductorhttps://bioconductor.org/packages/GSVA/Bewertung der Gen-Set-Variation/ssGSEA-bezogene Score-Erstellung; Version 1.46.0
GTRDÖffentliche Datenbankhttp://gtrd.biouml.org/Screening von Transkriptionsfaktor-Zielen; 2021 
KnockTFÖffentliche Datenbankhttp://www.licpathway.net/KnockTF/index.htmlRessource für Transkriptionsfaktor-Störungen; Version 2.0 
RR Foundation for Statistical Computinghttps://www.r-project.org/Statistische Rechenumgebung
scTenifoldKnkR-Paket/Open Sourcehttps://github.com/cailab-tamu/scTenifoldKnkVirtuelle Knockdown-Analyse
SeuratR-Paket/Open Sourcehttps://satijalab.org/seurat/Vorverarbeitung und Clustering von Einzelzell-Daten
STRINGELIXIR/Öffentliche Datenbankhttps://string-db.org/Protein-Protein-Interaktionsanalyse; v11 
SwissADMESIB Swiss Institute of Bioinformaticshttp://www.swissadme.ch/Bewertung der Arzneimitteltauglichkeit; Ausgabe 2017/Web-Tool 
TIMERÖffentliche Webressourcehttps://timer.cistrome.org/Analyse der Immuninfiltration; TIMER2.0 
UCSC Xena oder verknüpftes TCGA-PortalUCSChttps://xenabrowser.net/Explorative Datenzugriffs- und Validierungsmöglichkeit 

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