Eine einzelne intravenöse Dosis der indolproduzierenden abgeschwächten Brucella bei NOD-Mäusen: Beurteilung des Typ-1-Diabetes-Auftretens und Immunremodellierung der Inseln

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die intravenöse Verabreichung eines indolproduzierenden, abgeschwächten Brucella-melitensis-Stamms an NOD/ShiLtJ-Mäuse, gefolgt von longitudinaler Diabetesüberwachung, Pankreas-Histologie sowie optionaler High-Plex-Raumproteomik und Einzelzell-RNA-Sequenzierung zur Bewertung der Immunreprogrammierung der Inseln.

Zusammenfassung

Typ-1-Diabetes (Typ-1D) entsteht durch die Autoimmunzerstörung der Bauchspeicheldrüsen-β-Zellen, und die aktuellen Therapien schaffen es nicht, dauerhafte Immuntoleranz wiederherzustellen. Metabolisch veränderte Bakterien, die immunmodulatorische Metaboliten produzieren, stellen eine vielversprechende Einzeldosis-Therapie dar. Hier präsentiert diese Arbeit ein umfassendes Protokoll, bei dem eine einzelne intravenöse Verabreichung eines indol-produzierenden, abgeschwächten Brucella-melitensis-Stamms BmΔvjbR::tnaA verwendet wird, um die Auswirkungen auf den Beginn von Autoimmundiabetes bei prädiabetischen weiblichen NOD/ShiLtJ-Mäusen zu bewerten.

Das Protokoll beginnt mit der Herstellung von BmΔvjbR::tnaA aus gefrorenen Glycerollagern, dem Wachstum in selektiven Medien bis zur mittleren Logaritam-Phase und der Berechnung der koloniebildenden Einheiten basierend auf der optischen Dichte. Weibliche NOD-Mäuse, <5 Wochen alt, werden ohne Betäubung fixiert und intravenös über die laterale Schwanzvene injiziert, mit einer definierten bakteriellen Dosis in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, während sie auf Wärmepads gehalten werden. Der Blutzucker wird nach einem 2-stündigen Fasten über 70–105 Tage zweimal wöchentlich überwacht, wobei Diabetes als Glukose ≥250 mg/dL bei zwei aufeinanderfolgenden Messwerten definiert ist. An experimentellen Endpunkten werden die entnommenen Bauchspeicheldrüse 72 Stunden in neutral-gepuffertem Formalin fixiert, paraffin-eingebettet und für Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen, Insulin-Immunhistochemie und Quantifizierung der gesamten Inselfläche aufgeschnitten. Formalinfixierte, paraffin-eingebettete Schnitte werden zur räumlichen Proteomik mit einem 25-Marker-Antikörperpanel eingereicht, um regulatorische und Effektor-Immunpopulationen zu visualisieren. Abschließend wird frisches Bauchspeicheldrüsengewebe einer Einzelzellisolierung, 3′-Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung und einer Seurat-basierten bioinformatischen Analyse unterzogen, um transkriptionelle Veränderungen in immunen und stromalen Populationen zu analysieren.

Dieses integrierte Protokoll ermöglicht reproduzierbare Einzeldosis-Bakterientherapieabgabe und multimodale Charakterisierung der Inselimmunremodellierung und bietet einen Rahmen für die Erforschung metabolit-manipulierter Mikroben in Autoimmunmodellen und zur Analyse gewebespezifischer Immunmechanismen bei Einzelzellauflösung.

Einleitung

Typ-1-Diabetes (Typ-1D) ist eine chronische Autoimmunerkrankung, die durch immunvermittelte Zerstörung der insulinproduzierenden Bauchspeicheldrüsenzellen β gekennzeichnet ist, was zu lebenslanger Insulinabhängigkeit und einem erhöhten Risiko für Gefäßkomplikationen führt. Die NOD/ShiLtJ-Maus wiederholt zentrale Merkmale des menschlichen Autoimmun-Diabetes, darunter spontane Insulitis und das Fortschreiten von offensichtlichem Diabetes, und wird häufig als präklinisches Modell für mechanistische und therapeutische Studien^{verwendet 1,2,3}. Aktuelle T1D-Therapien – einschließlich immunsuppressiver Medikamente, monoklonale Antikörper und adoptive regulatorische T-Zell-(Treg)-Therapien – können den Krankheitsprogression vorübergehend verlangsamen, aber oft scheitern, eine dauerhafte Wiederherstellung der Immuntoleranz oder die nachhaltige Erhaltung der β-Zellmasse 1,2,4,5,6,7,8,9,10^{, 11}.

Die Zielsetzung von Tregs und anderen regulatorischen Populationen ist ein Hauptfokus aufkommender T1D-Therapien, darunter autologe polyklonale Treg-Infusionen, konstruierte antigenspezifische Tregs und IL-2-basierte Regime 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11 . Eine pro-inflammatoriske Mikroumgebung innerhalb der Bauchspeicheldrüseninseln kann jedoch die Wirksamkeit dieser Ansätze untergraben, was die Notwendigkeit unterstreicht, lokal gewebebasierte Immunnetzwerke^{umzuprogrammieren 2,7}. Mikrobiell abgeleitete Tryptophanmetabolite, insbesondere Indole und verwandte Verbindungen, können sowohl die angeborene als auch die adaptive Immunität modulieren, indem sie die regulatorische T-Zell-Differenzierung fördern, antiinflammatoriske Makrophagenpolarisation induzieren und Th17-Reaktionen unterdrücken^12,13. Lebende mikrobielle Therapeutika und metabolisch veränderte Bakterien stellen daher eine vielversprechende Strategie dar, um immunmodulatorische Metaboliten in situ zu liefern und die Gewebeimmunität umzugestalten 12,13,14,15,16,17,18.

Wir haben zuvor einen metabolisch veränderten Brucella melitensis-Stamm entwickelt, BmΔvjbR::tnaA, der konstitutiv Indol produziert und Autoimmunarthritis kontrolliert, indem er Tregs erweitert und entzündliche Mikroumgebungen umgestaltet 14,15,16. Attenuierte Brucella-Stämme wie BmΔvjbR wurden umfassend als Impfstoffplattformen charakterisiert und können genetisch modifiziert werden, um immunregulatorische Nutzlasten zu tragen 14,15,16.

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Bewertung einer einzelnen intravenösen Dosis von BmΔvjbR::tnaA im NOD/ShiLtJ-Modell, einschließlich bakterieller Präparation, standardisierter intravenöser Verabreichung, Diabetesüberwachung und multimodaler Analyse des Bauchspeicheldrüsengewebes mittels Histologie, High-Plex-Spatial Proteomics und Single-Cell RNA-Seq. Dieser Workflow bietet einen praktischen Rahmen für die Erprobung metabolit-manipulierter Mikroben als Einzeldosis-Immuntherapien bei organspezifischer Autoimmunität. Eine vorherige Dosis-Wirkungs-Analyse zeigte Sicherheit und Verträglichkeit bis zu 1 × 10¹⁰ CFU des abgeschwächten Stamms.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit ethischen Richtlinien durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Texas A&M University genehmigt (Protokollnummer: 2021-0123).

1. Vorbereitung und Charakterisierung von BmΔvjbR::tnaA

1. Bakterienstamm-Hintergrund und Lagerung
   HINWEIS: BmΔvjbR::tnaA stammt aus Brucella melitensis 16M ab, mit Teilung des vjbR-Virulenzregulators und Einfügung des Escherichia coli tnaA-Gens zur konstitutiven Indolproduktion, wie zuvor beschrieben 14,15,16.
   1. Halten Sie die Glycerolvorräte bei −80 °C in 20 % Glycerol.
2. Bakterienkultur auf selektivem Agar
   1. Holen Sie einen gefrorenen Glycerolfond aus −80 °C Lager. 10–20 μL auf tryptische Sojaagarplatten (TSA) mit Chloramphenicol ergänzt (25–30 μg/mL).
   2. Inkubieren Sie Platten bei 37 °C unter Umgebungs-CO₂-Bedingungen für 48–72 Stunden, bis einzelne Kolonien (2–3 mm Durchmesser) sichtbar sind.
      VORSICHT: Die Arbeit mit Brucella-Stämmen erfordert entsprechende Biosicherheitsstandards (mindestens BSL2). Befolgen Sie die institutionellen Biosicherheitsprotokolle und die erforderlichen Zulassungen.
3. Herstellung von Flüssigkulturen
   1. Wählen Sie ein frisches TSA-Kennzeichen (≤1 Woche alt). Wählen Sie 2–3 isolierte Kolonien mit einer sterilen Schleife aus.
   2. Inokulieren Sie in 10 mL tryptischer Sojabrühe (TSB), ergänzt mit Chloramphenicol (25–30 μg/mL) in einem sterilen 15-mL-Rohr. Inkubieren bei 37 °C mit Schütteln bei 250 U/min unter Umgebungs-CO₂-Bedingungen.
      HINWEIS: Für die Vergrößerung verwenden Sie eine 250-mL gebaffelte Erlenmeyer-Flasche.
4. Wachstumsüberwachung und Ernte
   1. Blenden Sie das Spektrophotometer mit sterilem TSB, ergänzt mit Chloramphenicol.
   2. Messen Sie OD₆₀₀ alle 2–3 Stunden.
   3. Die Brutzeit wird fortgesetzt, bis OD₆₀₀ 2,0 ± 0,2 (ca. 18–24 Stunden) erreicht.
      KRITISCHER SCHRITT: Ernte bei OD₆₀₀ = 2,0 ± 0,2 für eine konstante bakterielle Konzentration und Lebensfähigkeit.
      HINWEIS: Unter diesen Bedingungen entspricht OD₆₀₀₀ ≈ 2,0 der mittleren bis späten Logaritma-Phase.
5. CFU-Schätzung
   1. Schätzung der Bakterienkonzentration anhand der Beziehung:
      OD₆₀₀ = 1 entspricht 5 × 10⁹ CFU/mL.
      HINWEIS: Eine 10-mL-Kultur bei OD₆₀₀ = 2,0 enthält etwa 1 × 10¹¹ CFU.
   2. OPTIONAL: Bereiten Sie 10-fache Serienverdünnungen (10⁻⁶ bis 10⁻⁹) in sterilem PBS vor. Platte 100 μL auf TSA, ergänzt mit Chloramphenicol. Inkubieren bei 37 °C für 48–72 Stunden. Zähle die Kolonien, um CFU zu bestätigen.
6. Bakterienernte und -konzentration
   1. Übertragen Sie die 10-mL-Kultur in ein steriles 15-mL-konisches Rohr.
   2. Zentrifugiere bei 3.000–4.000 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
   3. Saugen Sie vorsichtig ein und entsorgen Sie das Überlagermittel, ohne das Pellet zu stören.
7. Nachaufhängung für Einspritzung
   1. Fügen Sie 1 ml steriles, endotoxinfreies 1× phosphatgepuffertes Kochsalzlösungsmittel (PBS, pH 7,4) zum bakteriellen Pellet hinzu. Vorsichtig durch 10–15-faches Pipettern wieder aufhängen, bis eine homogene Suspension ohne sichtbare Klumpen erreicht ist.
      HINWEIS: Die Endkonzentration beträgt etwa 1 × 10¹¹ CFU/mL.
8. Lagerung und Nutzung
   1. Bewahren Sie die bakterielle Suspension in einem geschlossenen Rohr auf Eis auf. Verwenden Sie die Suspension für intravenöse Injektionen innerhalb von 4 Stunden nach der Zubereitung.
      HINWEIS: Nicht einfrieren oder über Nacht lagern, da die bakterielle Lebensfähigkeit abnimmt.
      PAUSENPUNKT: Bakterien können bis zu 4 Stunden auf Eis gehalten werden; Die Anwendung am selben Tag wird empfohlen.

2. NOD/ShiLtJ-Mausbeschaffung, Unterbringung und Vorbereitung

1. Besorge weibliche NOD/ShiLtJ-Mäuse. Akklimatisieren Sie die Mäuse mindestens 7 Tage vor dem Experiment.
   HINWEIS: Verwenden Sie weibliche Mäuse aufgrund einer höheren und konstanteren Diabetesinzidenz.
2. Hausmäuse in einzeln belüfteten Käfigen unter bestimmten krankheitserregerfreien Bedingungen. Halten Sie bis zu fünf Mäuse pro Box.
3. Stellen Sie Bettzeug, Umweltbereicherung, Nahrung und Wasser ad libitum bereit. Halten Sie die Temperatur bei 20–24 °C, die Luftfeuchtigkeit bei 40–60 % und einen 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus.
4. Verwenden Sie Mäuse unter 5 Wochen. Erfassen Sie die Grundgewichte des Körpers.
5. Randomisieren Sie Mäuse auf Käfigebene in Behandlungs- und Kontrollgruppen. Weisen Sie jeder Maus eindeutige Kennungen (Ohrenanhänger oder Schwanz-Tattoo) zu.
   HINWEIS: Führen Sie ein Masterprotokoll aller Mäuse und Gruppenzuweisungen.
6. Bringen Sie die Käfige mindestens 30 Minuten vor der Injektion in den Behandlungsraum. Platzieren Sie die Käfige auf Heizmatten mit 37–40 °C, um die Erweiterung der Schwanzvene zu fördern.

3. Intravenöse Verabreichung über die laterale Schwanzvene

1. Mit steriler Technik entnehmen Sie 100 μL der bakteriellen Suspension in sterile Insulinspritzen (29G–30G). Beschrifte jede Spritze mit der entsprechenden Maus-ID.
2. Bereiten Sie Kontrollspritzen mit 100 μL sterilem PBS vor.
   HINWEIS: Bereiten Sie die Spritzen unmittelbar vor der Injektion vor.
3. Platziere jede Maus in einen Sperrer, der Zugang zum Schwanz ermöglicht.
   HINWEIS: Verwenden Sie keine Anästhesie bei Injektionen in die Schwanzvene.
4. Wische den Schwanz mit 70 % Ethanol ab und lass ihn an der Luft trocknen.
5. Visualisieren Sie die seitlichen Schwanzvenen bei ausreichender Beleuchtung.
   TIPP: Erwärmen Sie den Schwanz, wenn die Venen nicht sichtbar sind.
6. Halte das distale Drittel des Schwanzes mit sanfter Spannung. Führen Sie die Nadel abgeschrägt in einem flachen Winkel (10–15°) in die Seitenvene ein.
7. Injizieren Sie 100 μL langsam über 5–10 Sekunden. Ziehen Sie die Nadel heraus und üben Sie sanften Druck mit steriler Mull aus.
   KRITISCHER SCHRITT: Bestätigen Sie eine erfolgreiche intravenöse Injektion durch Abwesenheit von Widerstand, Schwellung oder Blanchieren.
8. Bring die Maus auf ein Heizkissen zurück in ihren Käfig. Beobachten Sie 5–10 Minuten auf Anzeichen von Stress. Notieren Sie alle unerwünschten Ereignisse.
9. Führen Sie Injektionen für alle Mäuse in zufälliger Reihenfolge innerhalb eines 2-Stunden-Fensters durch.

4. Blutzuckermessung und Definition von Diabetes

1. Beginnen Sie 7 Tage nach der Injektion mit der Blutzuckerüberwachung. Messen Sie den Blutzucker zweimal wöchentlich bis zum Endpunkt der Studie.
2. Entferne das Futter 2 Stunden vor der Messung, während du den Zugang zu Wasser beibehältst.
3. Fessel die Maus. Reinigen Sie die Endspitze mit 70% Ethanol.
4. Schneiden Sie den Schwanz mit einer sterilen Lanzette oder Nadel. Werfen Sie den ersten Bluttropfen weg. Sammeln Sie den zweiten Tropfen auf einem Blutzuckerteststreifen. Zeichnen Sie Blutzuckerwerte zusammen mit Maus-ID und Datum auf.
   HINWEIS: Verwenden Sie eine neue Seite, wenn die Schwanzspitze vernarbt.
5. Definieren Sie Diabetes als Blutzucker ≥ 250 mg/dL bei zwei aufeinanderfolgenden Messungen, die mindestens 24 Stunden voneinander entfernt sind.
6. Euthanasiere Mäuse mit schweren Krankheitsanzeichen gemäß den institutionellen Richtlinien.

5. Bauchspeicheldrüsen, -fixierung und -verarbeitung

1. Euthanasiere Mäuse gemäß den genehmigten Protokollen. Sezieren und sammeln Sie die Bauchspeicheldrüse sorgfältig, einschließlich aller Lappen.
2. Geben Sie die Bauchspeicheldrüse in 10 % neutrales, gepuffertes Formalin mit einem mindestens 10:1 Fixativ-Gewebe-Volumen-Verhältnis. Fix auf 72 Stunden bei Raumtemperatur.
   VORSICHT: Formalin in einer chemischen Abzughaube mit geeigneter PSA behandeln.
3. Gewebe nach der Fixierung auf 70 % Ethanol übertragen.
4. Richten Sie fixierte Gewebe an eine Histologie-Kerneinrichtung für Paraffineinbettung, Schnitt mit 5 μm Dicke auf positiv geladenen Objektträgern, Hämatoxylin- und Eosinfärbung sowie Insulin-Immunhistochemie ein.
   HINWEIS: Bitte um ungefärbte Schnitte, falls weitere nachgelagerte Analysen geplant sind.

6. Histologische Bewertung und Quantifizierung der Inselfläche

1. Erfassen Sie Ganzobjektaufnahmen mit einem Dia-Scanner oder Mikroskop.
2. Öffnen Sie Bilder in der referenzierten Software. Annotiere Inselchen manuell mit geeigneten Werkzeugen.
3. Messen Sie die Inselfläche mit Annotationswerkzeugen.
4. Exportiere Messungen zur Analyse.
   HINWEIS: Die gesamte Inselfläche umfasst endokrine und infiltrierende Zellen.

7. Verschiedene nachgelagerte Analysen

1. Berechnen Sie die mittlere Inselfläche pro Maus. Vergleichen Sie Gruppen mit geeigneten statistischen Tests.
2. Optional: Räumliche Proteomik-Analyse (siehe Ergänzende Tabelle S1)
   1. Bereite FFPE-Abschnitte auf positiv geladenen Folien vor. Senden Sie Proben an einen Anbieter von räumlicher Proteomik. Geben Sie Antikörperpanel-Spezifikationen bereit.
3. Optional: Einzelzell-RNA-Sequenzierung (siehe Ergänzungstabelle S2)
   1. Entnehmen Sie die Bauchspeicheldrüse und legen Sie sie in ein kaltes Medium.
   2. Senden Sie Proben an eine Genomik-Kerneinrichtung zur Einzelzellisolierung und Bibliotheksvorbereitung.
   3. Verarbeitung von Sequenzierungsdaten mit geeigneten Pipelines (z. B. Cell Ranger, Seurat).
   4. Deponieren Sie Daten zur Sequenzierung in einem öffentlichen Repository vor der Veröffentlichung.

Ergebnisse

Während das in diesem Manuskript beschriebene breitere Protokoll inzwischen zu einem einmaligen Präventionsregime optimiert wurde, werden diese Pilotergebnisse hier ausschließlich präsentiert, um die erwarteten histologischen und glykämischen Werte mit diesem Workflow zu veranschaulichen.

Der allgemeine Krankheitskontext und der Kontrast zwischen gesunder und typ-1-diabetischer Bauchspeicheldrüse sind schematisch in Abbildung 1A d...

Diskussion

Eine entscheidende Einschränkung der hier dargestellten repräsentativen Ergebnisse ist, dass die zur Veranschaulichung der analytischen Endpunkte bereitgestellten Daten (Abbildung 3) aus einer frühen Pilotkohorte mit einem Zwei-Dosis-Plan stammen. Da dieses Protokoll auf ein vorbeugendes Verfahren mit einer einmaligen Dosis verfeinert wurde, sind zukünftige groß angelegte Studien mit dem hier beschriebenen optimierten Einzeldosisprotokoll erforderlich, um ei...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 % neutrales gepuffertes Formalin (NBF)	VWR	10790-714
10x Genomics Chromium-Controller	TIGSS Molekulare Genomik-Arbeitsbereich, Texas A& M Universität
70 % Ethanol	VWR	89125-164
Klebemikroskop-Objektträger für FFPE	Leica Biosystems	3800084E
Akoya-Maus FFPE-Antikörperpanel (~25 Marker)	Akoya Biosciences	[Panel-ID/benutzerdefiniertes Panel]
Bioanalysator oder TapeStation mit DNA-HS-Kits	TIGSS Molekulare Genomik-Arbeitsbereich, Texas A& M/ Agilent
BMΔ vjbR::tnaA Bakterienstamm	Labormaterial (Song/de Figueiredo Labs)
Cell Ranger Pipeline	10x Genomik	v7.1
Chloramphenicol	Research Products International	56-75-7
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit	10-fache Genomik über den TIGSS-Kern
Kollagenase aus Clostridium histolyticum	Millipore Sigma	C7657-100MG
DAPI-Nuklearfleck	Akoya Biosciences	[Dienstleistung bereitgestellt]
FFPE-Einbettung, H& E-Färbung, Insulin-IHC und Objektträger-Scanning	VMBS Histologielabor, Texas A& M Universität	https://vetmed.tamu.edu/vmbs-histology-lab/
Glukoseteststreifen	EKF-Diagnostik / Fisher Scientific	22-022-649
Glukoseteststreifen (alternativ)	Ascensia-Diabetesversorgung	CONTOUR NEXT Teststreifen
Glycerol (Bulk, 500 ml)	Millipore Sigma	G7893-500ML
Glycerol (steril, 100 ml)	Sigma Aldrich (G Biosciences)	G5516-100ml
GraphPad Prism (oder R-Überlebenspaket)	GraphPad-Software / R	v10.2
Handgestütztes Blutzuckermessgerät	Ascensia-Diabetesversorgung	CONTOUR NEXT EZ
Illumina NextSeq 2000 Sequenzer	TIGSS Molekulare Genomik-Arbeitsbereich, Texas A& M Universität
Insulinspritzen, 29– 30 G (U-100)	VWR	10002-702
Lanzetten für Diabetestests	Becton, Dickinson und Company (BD)	366594
Liberase TL Forschungsgrad	Millipore Sigma	5401020001
Niedrigtemperatur-Heizpads	Führungswissenschaft	RWD-69025
Miltenyi-Kern-/Zell-Isolationsset	TIGSS Molekulare Genomik-Arbeitsbereich, Texas A& M/ Miltenyi Biotec
Maus-Heizkisse (alternativ)	Kent Scientific	RightTemp
Mausfesseln	Braintree Scientific	TV-RED 150-STD
NOD/ShiLtJ-Mäuse (weiblich, 5 Wochen)	Das Jackson-Labor	Strain #001976
P2 XLEAP 100-Zyklus-Durchflusszellen-Kit	Illumina über den TIGSS-Kern
PhenoCycler-Datenerfassung und Qualitätskontrolldienst	Akoya Biosciences
PhenoCycler-Reagenzien und Bildablauf	Akoya Biosciences	[Dienstleistung bereitgestellt]
PhenoCycler-Fusion-System	Akoya Biosciences
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1x	Thermo Fisher	10010023
Protektor-RNase-Inhibitor	Millipore Sigma	3335402001
Qubit-Fluorometer und dsDNA HS Assay Kit	TIGSS Molekulare Genomik-Arbeitsbereich, Texas A& M/ Thermo Fisher
QuPath	Open Source	v0.4.3
R-Software	R-Projekt	v4.0+
Seurat (R-Paket)	Satija Lab / CRAN	v4.3
StarDist	Open Source	v0.8.3
Trypton-Sojaagar (TSA)	VWR	CA90002-706