Bewertung der Transduktionseffizienz und der Zelltargetierung durch zellpenetrierende Peptide in der Mauslunge

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen integrierten Arbeitsablauf zur Bewertung der Transduktionseffizienz und Zellspezifität zellpenetrierender Peptide, wobei das lungenzielorientierte Peptid cyclisiert R11A (cR11A; KAPWHLSSQYSAT) als Beispiel. Der Workflow kombiniert gepaarte Fraktions-FACS gefolgt von Einzelzell-RNA-Sequenzierung, Durchflusszytometrie in AT2-Reportermäusen und konfokaler Z-Stack-Bildgebung, um die AT2-assoziierte Peptid-Zielbindung zu bestätigen.

Zusammenfassung

Zellpenetrierende Peptide (CPPs) sind kurze Peptide (5–30 Aminosäuren), die in der Lage sind, Zellmembranen zu durchqueren und makromolekulare Ladungen ohne Transfektionsreagenzien zu transportieren. Die Definition der zellulären Selektivität in vivo erfordert jedoch eine Validierung auf Zelltypebene. Ein integrierter Arbeitsablauf wird präsentiert, um die Transduktionseffizienz eines Cy5.5-markierten cyclisierten CPP, cR11A, in alveolaren epithelialen Typ-II-(AT2)-Zellen nach retro-orbitaler intravenöser Injektion bei Mäusen zu bewerten. Die Lungen wurden 15 oder 60 Minuten nach der Injektion entnommen und mit komplementären Messungen analysiert, einschließlich gepaarter Fraktion fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) zur Isolierung von Cy5,5⁺- und Cy5,5⁻-Lungen-Einzelzellsuspensionen, gefolgt von Einzelzell-RNA-Sequenzierung, Durchflusszytometrie der Lungeneinzelzellen aus Sftpc-CreERT2^(+/−); LSL-GFP^(+/−) AT2-Reportermäuse zur Quantifizierung von GFP⁺/Cy5.5⁺-Ereignissen sowie konfokale Z-Stack-Bildgebung von Lungenkryosektionen zur Bestätigung der Kolokalisation von cR11A-Cy5.5 mit AT2-assoziiertem Signal. Dieses Protokoll liefert übereinstimmende Belege für die Zelltyp-Beteiligung durch mehrere komplementäre Auslesungen und bietet einen reproduzierbaren Rahmen zur Bewertung der zellspezifischen Zielerfassung von CPPs mit Modifikationen für verschiedene Zielorgane.

Einleitung

Zellpenetrierende Peptide (CPPs) sind 5–30 Aminosäurepeptide, die Zellmembranen durchqueren und die intrazelluläre Abgabe makromolekularer Ladungen in intakter, voll funktionsfähiger Form ermöglichen können, ohne dass Transfektionsreagenzien ^1,2 erforderlich sind. Frühere Arbeiten mit in vitro und in vivo Phage-Display-Methodologien identifizierten ein 12-Aminosäure-kardialzieles Peptid (APWHLSSQYSRT), das speziell von Kardiomyozyten bereits nach 5 Minuten ^3,4 aufgenommen wird. Um den Transduktionsmechanismus zu untersuchen, wurde ein Alanin-Scan durchgeführt, der zur Entdeckung zweier Varianten, S7A und R11A (APWHLSSQYSAT), führte, die unerwartet eine Lungenanreicherung in vivo zeigten. und wurden daher als lungenzielende Peptide (LTPs^{) bezeichnet}. Darüber hinaus erzeugte die N-terminale Lysinaddition und die Kopf-zu-Schwanz-Zyklisierung eine zyklische Version von R11A (cR11A) mit deutlich verbesserter Serumstabilität und deutlich erhöhter intrazellulärer Aufnahme im Vergleich zum linearen^{Gegenstück 5}.

LTPs haben das Potenzial, Therapeutika präzise an distale Lungenepithelpopulationen zu verabreichen, einschließlich alveolärer Epithelzellen Typ II (AT2). Diese Zellen sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Tensidhomöostase und dienen als Vorläufer der alveolären Regeneration⁶. Eine große Herausforderung bei der Entwicklung von LTP ist jedoch die rigorose Bewertung der zellulären Selektivität in vivo. Allein die Biodistribution auf Organebene kann die echte zelluläre Transduktion nicht von vaskulärem Signal, extrazellulärer Retention oder phagozytischer Clearance unterscheiden und muss daher durch einzelzellige Messungen⁷ ergänzt werden. Um diese Einschränkung zu beheben, integriert dieser Workflow Einzelzell-Transkriptom-Zuweisung, reporterbasierte Durchflusszytometrie und konfokale Z-Stack-Bildgebung, um Nachweise auf Zelltypebene für Peptidengagement jenseits der Organ-Fluoreszenz- oder Bioverteilungsanzeigen ^8,9 zu erzeugen.

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einen reproduzierbaren, mehrfachen Workflow zur Validierung der in-vivo-Transduktionseffizienz und Zellspezifität von Cy5.5-markiertem cR11A in der distalen Lunge bereitzustellen, mit Schwerpunkt auf AT2-Zellen nach der retroorbitalen Injektion. Das Protokoll definiert die peptidassoziierte Zellidentität mithilfe komplementärer und unabhängiger Messungen, einschließlich der Sortierung von gepaarten Fraktionen mit fluoreszenzaktivierter Zelle (FACS) (Cy5,5⁺ vs Cy5,5⁻), gefolgt von Einzelzell-RNA-Sequenzierung zur Kartierung peptidassoziierter Populationen, quantitativer Aufnahmebewertung in AT2-Reporterlungen mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Z-Stack-Bildgebung von Lungenkryosektionen zur Bestätigung der Kolokalisation von cR11A-Cy5.5 mit AT2-assoziiertem Signal. Dieses Protokoll kann leicht an andere LTPs oder Verabreichungsvektoren angepasst und auf die Lunge oder andere Organsysteme angewendet werden, um die Zellspezifität der sich entwickelnden CPPs zu bewerten. Sie eignet sich besonders für Anwendungen, die eine Zelltyp-Validierung der CPP-Zielsetzung in vivo erfordern, anstatt nur die Ansammlung auf Organebene zu bewerten.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Mayo Clinic durchgeführt und unter Protokollnummer A00006842-22-R25 genehmigt. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um Tierleiden zu minimieren und eine ethische Behandlung im Einklang mit den relevanten nationalen und institutionellen Vorschriften sicherzustellen. Die für dieses Protokoll verwendeten Forschungswerkzeuge sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Tiere

1. Verwenden Sie erwachsene gemischte C57BL/6J-Mäuse (6–8 Wochen alt), die aus The Jackson Laboratory stammen (Stamm #000664).
2. Für die AT2-spezifische Quantifizierung verwenden Sie Sftpc-CreERT2^(+/+) (Jax-Zerrung #028054) gekreuzt mit LSL-GFP^(+/+) (Jax-Belastung #007906), um Sftpc-CreERT2^(+/−) zu erzeugen; LSL-GFP^(+/−) AT2-Reportermäuse.
3. Hausmäuse in einzeln belüfteten Käfigen. Stellen Sie sicher, dass alle Tierprotokolle vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt werden.
4. Durchführung von Tamoxifen-Induktion in Sftpc-CreERT2^(+/−); LSL-GFP^(+/−) -Mäuse. Wenn Mäuse ≥6 Wochen alt sind, verabreichen Sie 100 mg/kg Tamoxifen, gelöst in Maisöl, über orale Gavage in drei Dosen über 7 Tage. Führen Sie Experimente mindestens 2 Wochen nach der Enddosis durch, um eine maximale Rekombinationseffizienz zu gewährleisten.

2. Vorbereitung von Reagenzen und Ausrüstung

1. Bereite eine Anästhesie vor (Ketamin/Xylazin Arbeitsmischung).
   1. Bereiten Sie eine 5 mL Arbeitslösung vor: Ketamin (1 mL 50 mg/mL), Xylazin (50 μL 100 mg/mL) und sterile Kochsalzlösung (3,95 mL).
   2. Verabreichen Sie 1 μL/g Körpergewicht über .Intraperitoneale Injektion (Enddosis: 10 mg/kg Ketamin und 1 mg/kg Xylazin).
2. Peptid (cR11A-Cy5.5) bereiten.
   1. Beziehen Sie sich CPPs als lyophilisierte Pulver. Lagern Sie Pulver bei −20 °C bis zu 2 Jahre oder als Standardlösungen in DMSO bei −80 °C für bis zu 6 Monate in lichtgeschützten Röhren. Vermeiden Sie Frost-Tau-Zyklen und minimieren Sie die Lichteinwirkung. Bereiten Sie eine 10 mM große Serienlösung von cR11A-Cy5.5 in DMSO vor.
   2. Wiegen Sie die Maus, berechnen Sie die Dosis und verdünnen Sie den Vorrat auf 1 mg/kg in nukleasefreiem Wasser auf ein Endvolumen von 100 μL pro Maus.
3. Bereite einen Verdauungspuffer vor (frisch; auf Eis legen).
   1. Bereiten Sie einen Verdauungspuffer vor, der 2 mg/mL Dispase II, 0,1 mg/mL DNase I, DMEM/F12 und 1 % (v/v) Penicillin-Streptomycin enthält.
   2. Verwende 3 ml pro Maus.
4. Bereite einen unspezifischen Protease-Enzym-Waschpuffer vor (auf Eis lassen).
   1. DMEM/F12 enthält 0,05 mg/mL DNase I und 1 % (v/v) Penicillin-Streptomycin.
   2. Verwende 10 ml pro Maus.
5. Bereite einen Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen vor (auf Eis lassen).
   1. Verdünne den Lysepuffer um 10× auf 1× mit PBS.
   2. Verwenden Sie 2 ml pro Probe.
6. Bereite einen Perfusionspuffer vor.
   1. Verwende eiskalte DMEM/F12 (10 ml pro Maus).
7. Waschpuffer vorbereiten.
   1. Verwende DMEM/F12 mit 2% FBS.
8. Zentrifugen auf 4 °C vorkühlen.

3. Retro-orbitale Verwaltung von cR11A-Cy5.5

1. Betäuben Sie die Maus mit der Ketamin/Xylazin-Arbeitslösung. Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesie durch das Ausbleiben eines Gliedmaßenrückzugs als Reaktion auf den Zehenkniff.
2. Injizieren Sie 100 μL cR11A-Cy5,5 (1 mg/kg) per retro-orbitaler intravenöser Injektion mit einer Insulinspritze.
3. Starte den Timer und halte die Maus 15 oder 60 Minuten lang auf einem Heizkissen unter entsprechender Überwachung.

4. Lungenentnahme und -durchströmung

1. Euthanasiere die Maus gemäß zugelassenen Protokollen (z. B. CO₂-Inhalation gefolgt von zervikaler Verrenkung). Setze die Maus in eine Rückenposition und sprühe den Thorax mit 70 % Ethanol ein.
2. Öffnen Sie die Brusthöhle, um Herz und Lunge freizulegen.
3. Machen Sie einen Schnitt im rechten Vorhof, um den Abfluss während der Durchströmung zu ermöglichen.
4. Führe eine 26-G-Nadel, die an eine 10-ml-Spritze mit eiskaltem DMEM/F12 angeschlossen ist, in den rechten Ventrikel ein. Lassen Sie den rechten Vorhofschnitt während der gesamten Durchflussphase offen, um den Abfluss zu ermöglichen.
5. Manuell ohne Spritzenpumpe perfundieren, indem man langsam und stetig 10 ml DMEM/F12 über etwa 1-2 Minuten injiziert. Halten Sie während der Injektion einen niedrigen Druck und vermeiden Sie sichtbare Lungenüberinflation oder Austritt an der Ventrikelwand. Machen Sie weiter, bis die Lungen gleichmäßig blass sind.

5. Lungeninflation und -verdauung

1. Kanüle die Luftröhre mit einem 20G-IV-Katheter und sichern Sie mit 3-0 Seidennaht. Gib 1 ml Verdauungspuffer über eine 1 ml-Spritze, um die Lunge aufzublasen.
2. Zerlege die Lunge als eine einzige intakte Einheit und übergib sie sofort in eine vorgekühlte 100-mm-Schale auf Eis.
3. Lungenläppchen werden getrennt und in ein 15 ml konisches Rohr mit 2 ml kaltem Verdauungspuffer (eine Lunge pro Schlauch) übertragen.
4. Inkubieren Sie bei 4 °C für 20 Stunden auf einer rotierenden Kippe (10–15 U/min).
   HINWEIS: Siehe Janas PP. et ^al.10 für die detaillierte Methodik.

6. Gewebedissoziation

1. Lege ein 100 μm Zellsieb über ein 50 ml konisches Rohr und befeuchte es mit 1 ml unspezifischem Protease-Enzym-Waschpuffer.
2. Übertragen Sie das Lungengewebe auf das Sieb und dissoziieren Sie vorsichtig mit einem sterilen Spritzenpümpel.
3. Spülen Sie mit 10 ml unspezifischem Protease-Enzym-Waschpuffer.
4. Zentrifugiere bei 130 × g für 15 Minuten bei 4 °C.
5. Suspendieren Sie das Pellet in einem 2-mL 1× RBC-Lysepuffer für 90 Sekunden bei Raumtemperatur.
6. Abschrecken Sie die Lyse mit 10 ml Waschpuffer.
7. Filtern Sie durch ein 40 μm Sieb und spülen Sie es mit einem Waschpuffer.
8. Zentrifugiere bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
9. Resuspendiere die Zellen in 500–1.000 μL PBS + 2 % FBS (≥1 × 10⁶ Zellen/mL).
10. Führen Sie durch eine 35 μm Filterkappe in ein FACS-Rohr.
    HINWEIS: Siehe Konishi S. et ^al.11 für detaillierte Methodik.

7. Gepaarte Fraktions-FACS-Sortierung

1. Führen Sie die Sortierung mit einem Durchflusszytometer durch.
2. Verwenden Sie PBS-injizierte Lungen als Negativkontrolle, um das Cy5.5-Gate zu definieren.
3. Wenden Sie Standard-Gating an: Debris Exclusion, Singlets und Cy5,5⁺-Zellen.
4. Sortiere die Populationen von Cy5.5⁺ und Cy5.5⁻ in separate Röhren.

8. scRNA-seq Probenvorbereitung

1. Bewahre sortierte Proben auf Eis auf.
2. Zentrifugiere bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C und suspendiere sie in 500 μL Puffer.
3. Fahren Sie nur fort, wenn die Tragfähigkeit ≥80 % besteht.
4. Bereite Bibliotheken und Sequenzierungen nach Bedarf vor.

9. Durchflusszytometrie bei AT2-Meldermäusen

1. Bereite Lungen-Einzelzell-Suspensionen wie in den Abschnitten 5–6 beschrieben vor.
2. Beize mit einem reparierbaren lebenden/toten Farbstoff (1:1.000) 30 Minuten lang (Schutz vor Licht).
3. Waschen und zentrifugieren Sie bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
4. Filtere und bewahre die Proben auf Eis auf.
5. Erfahle Daten auf einem Durchflusszytometer.
6. Führen Sie Gating durch, um Zellen zu identifizieren, Singlets auszuwählen, tote Zellen auszuschließen und GFP- und Cy5.5-Populationen zu definieren.
   1. GFP⁺/Cy5,5⁺-Ereignisse als Prozentsatz der GFP⁺-Zellen quantifizieren.

10. Fixierung und Kryoschutz

1. Blasen Sie die Lunge mit 1 ml 4 % PFA auf und sichern Sie die Luftröhre.
2. Über Nacht 10 ml 4 % PFA bei 4 °C fixieren.
3. Waschen mit PBS (3×).
4. Inkubieren Sie über Nacht in 15 % Saccharose.
5. Wechsel auf 30 % Saccharose für ~48 Stunden.

11. Einbettung und Kryosektion

1. Bereite Kryo-Formen mit OCT vor, positioniere die Lunge und setze sie in OCT ein.
2. Mit flüssigem Stickstoff einfrieren. Kaufen Sie bei ˗80 °C.
3. Schnitt bei 10 μm nach dem Gleichgewicht Lufttrocknungsrutschen über Nacht.

12. Bildgebung und Analyse

1. Waschen Sie Abschnitte mit PBS (3×).
2. Haltere mit DAPI-Medium.
3. Erhalten Sie konfokale Z-Stacks.
4. Verwenden Sie geeignete Bildeinstellungen.
5. Führe 3D-Rekonstruktion durch.
6. Quantifizieren Sie die Kolokalisierung mit konsistenten Schwellenwerten.
   Optionale Methoden:
   Diese optionalen Methoden sind nicht Teil des repräsentativen Arbeitsablaufs, können aber integriert werden, um die Depletion oder Analyse der CD45⁺-Immunzellpopulation zu ermöglichen, die einen großen Anteil der Lungenzellen¹² ausmacht.
   HINWEIS: Verwenden Sie CD45⁺-Depletion oder -Ausschluss, wenn die Analyse auf nicht-immune Lungenpopulationen fokussiert ist, da diese Schritte die Aufnahmesignale der Immunzellen entfernen oder trennen und die zelluläre Zusammensetzung der Probe verändern. Die CD45-Färbung kann auch verwendet werden, um die CD45⁺-Immunzellpopulation separat zu analysieren.

13. Depleierte CD45^+- Zellpopulation

1. Nach der Gewebedissoziation (Schritt 6) verwenden Sie entweder einen CD45-Antikörper, der an eine magnetische Perle konjugiert ist (Miltenyi Biotech 130-052-301), oder einen CD45-Antikörper, der mit einem Fluorophor konjugiert ist, der mit Cy5.5, GFP und der leben/toten Färbung kompatibel ist, zum Beispiel CD45-BV605 (BioLegend #103140). 20 Minuten lang bei 4°C im Dunkeln beizen.
2. Bei CD45-magnetischer Perlenentleerung folgen Sie den Herstelleranweisungen zur Verwendung der Lineage Depletion (LD)-Säule (Miltenyi Biotech 130-042-901) und fahren Sie mit der magnetischen Zelltrennung (MACS) (Miltenyi Biotech) fort. Dann geht es mit der gepaarten Fraktions-FACS-Sortierung fort (Schritt 7).
3. Wenn CD45-Depletion mit einem fluoreszierend konjugierten Antikörper durchgeführt wird, wird die Zellsuspension zunächst mit einem Waschpuffer gewaschen, um überschüssige Antikörper zu entfernen. Dann geht es mit Schritt 7 weiter. Nachdem Gatter zum Ausschluss von Doublets und Trümmern (Schritt 7.3) eingerichtet wurden, fügen Sie ein zusätzliches Gate ein, um die CD45^+- Population auszuschließen. Dann gehe ich zu Schritt 7.4 fort.

14. Analyse der CD45^+- Zellpopulation während der Durchflusszytometrie

1. Nach Schritt 9.3 verwenden Sie einen CD45-Antikörper, der mit einem Fluorophor konjugiert ist und mit Cy5.5, GFP und der Live/Dead-Färbung kompatibel ist, zum Beispiel CD45-BV605 (BioLegend #103140). 20 Minuten lang bei 4°C im Dunkeln beizen.
2. Waschen Sie die Zellsuspension mit einem Waschpuffer, um überschüssige Antikörper zu entfernen. Dann gehe ich zu Schritt 9.4 fort. Nachdem Gates zum Ausschluss von Doublets und Trümmern (Schritt 9.6) eingerichtet wurden, fügen Sie vor dem Gating ein zusätzliches Gate ein, um die CD45^+- Population auszuschließen, bevor Sie die GFP^+- und Cy5.5⁺ -Populationen¹² festlegen.

Ergebnisse

Eine erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls sollte aus drei komplementären Auslesungen konkordierende Belege liefern: gepaarte Fraktion scRNA-seq, reporterbasierte Durchflusszytometrie und konfokale Z-Stack-Bildgebung.

In der gepaarten ScRNA-seq-Analyse wurden Cy5,5⁻- und Cy5,5⁺-Lungeneinzelzellfraktionen nach systemischer Verabreichung von cR11A-Cy5.5 gefunden und separat analysiert. Die UMAP-Visualisierung identifizierte wichtige Lungenzellpopulationen, darunter immune, endotheliale, epitheliale und mesenchymale Kompartimente (Abbildung 1A, B). Obwohl Immunzellen in beiden sortierten Fraktionen die dominante Population darstellten, zeigte der Cy5,5⁺-Anteil eine relative Anreicherung nicht-immuner Kompartimente, einschließlich Epithelzellen (Abbildung 1C). Die Epithel-Subset-Analyse zeigte eine größere Repräsentation von AT2-Zellen im Cy5,5⁺-Anteil als im Cy5,5⁻-Bruch, während AT1-Zellen in beiden Fraktionen niedrig blieben (Abbildung 1D). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die gepaarte Fraktion scRNA-seq die Anreicherung von AT2-Zellen innerhalb der cR11A-Cy5.5–positiven Lungenzellfraktion identifizieren kann.

Die Flowzytometrie wurde verwendet, um das cR11A-Cy5.5-Signal innerhalb von Reporter-definierten AT2-Zellen zu quantifizieren. Das repräsentative Gating umfasste die Auswahl der Gesamtzellen durch FSC-A/SSC-A, zwei sequentielle Singlet-Gates, Live-Cell-Gating und das finale GFP-Versus. Cy5.5-Analyse (Abbildung 2A–E). In der Kontrollprobe waren GFP⁺/Cy5,5⁺-Ereignisse minimal und stellten die Hintergrundfluoreszenzschwelle fest. Nach der Verabreichung von cR11A-Cy5.5 stiegen die positiven Ereignisse von GFP⁺/Cy5.5⁺ AT2 in diesem repräsentativen Datensatz auf 7,99 % bei 15 Minuten und auf 7,41 % nach 60 Minuten nach der Injektion (Abbildung 2E). Diese Ergebnisse unterstützen ein nachweisbares cR11A-Cy5.5-Signal in AT2-Reporter-positiven Zellen in vivo.

Die konfokale Z-Stack-Bildgebung liefert eine räumliche Validierung der peptidassoziierten Fluoreszenz in Lungengewebeschnitten. Eine Nicht-Reporter-Kontrolle wurde eingeschlossen, um die Hintergrundfluoreszenz zu beurteilen, und zeigte minimales Signal in den GFP- und Cy5.5-Kanälen. In cR11A-Cy5.5-behandelten AT2-Reporterlungen wurde Cy5.5-Fluoreszenz in der Nähe von GFP⁺-AT2-Reporter-positiven Zellen nachgewiesen, und der von Imaris erzeugte Kolokalisationskanal identifizierte Überschneidungen zwischen GFP- und Cy5.5-Signalen (Abbildung 3A). Die repräsentative Imaris-Kolokalisationsanalyse zeigte 89,6 % bzw. 86,8 % Kolokalisation im GFP⁺ AT2-Kompartiment bei 15 Minuten bzw. 60 Minuten (Abbildung 3B).

Suboptimale Ergebnisse können hohe Cy5.5-Fluoreszenz im Hintergrund in Kontrollproben, eine schlechte Erholung von Epithelzellen, geringe Zellviabilität oder eine schwache Trennung von GFP⁺/Cy5.5⁺-Ereignissen umfassen. Diese Probleme deuten typischerweise auf eine unvollständige Perfusion, übermäßige Gewebestörungen, unzureichende Kompensation oder inkonsistente bildgebende Schwellenwerte hin.

Abbildung 1: Die gepaarte Fraktion scRNA-seq identifiziert die Anreicherung des alveolaren Epithels in der cR11A-Cy5.5–positiven Lungenfraktion. Lungen-Einzelzell-Suspensionen wurden nach der retro-orbitalen Injektion von cR11A-Cy5.5 und Cy5,5⁺ in Fraktionen sortiert, und jede Fraktion wurde mittels einzelzelliger RNA-Sequenzierung analysiert. (A) UMAP-Diagramme zeigen Zelltyp-Cluster in abgestimmten Bruchteilen einer repräsentativen Maus. (B) Die UMAP-Überlagerung zeigt die Verteilung der Cy5,5⁻- und Cy5,5⁺-Zellen. Die eingekreisten Bereiche in (A) und (B) zeigen das für die Analyse der epitheliale Teilmenge hervorgehobene Epithelkompartiment. (C) Immunpopulationen sind in beiden Fraktionen hochverbreitet und machen jeweils über 80 % aus. Im Vergleich zum Cy5,5⁻-Anteil enthält der Cy5,5⁺-Anteil einen größeren Anteil an endothelialen, epithelialen und mesenchymalen Populationen, was auf eine Aufnahme von cR11A innerhalb dieser Populationen hinweist. (D) Innerhalb der epithelialen Population sind AT2-Zellen im Cy5,5⁺-Anteil stärker vertreten als im Cy5,5⁻-Anteil, während AT1-Zellen in beiden Fraktionen niedrig bleiben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Durchflusszytometrievalidierung der cR11A-Cy5.5-Aufnahme in AT2-Reporterlungen. AT2-Reportermäuse erhielten cR11A-Cy5.5 per retro-orbitaler intravenöser Injektion, und die Lungen wurden 15 oder 60 Minuten nach der Injektion zur Einzelzellpräparation entnommen. Repräsentatives Gating zeigt sich für eine PBS-Fahrzeugkontrolle (Ctrl) und cR11A-Cy5.5-behandelte Proben: (A) Zellen wurden durch FSC-A/SSC-A ausgewählt, (B, C) Singlets wurden durch streubasierte Doublet-Ausschluss gegartet, (D) lebende Zellen wurden durch den Ausschluss von Viabilitätsfarbstoffen identifiziert und (E) GFP (AT2-Reporter) versus. Cy5.5 wurde verwendet, um GFP⁺/Cy5.5⁺-Ereignisse zu quantifizieren. In diesem repräsentativen Datensatz lagen GFP⁺/Cy5.5⁺ AT2-Ereignisse bei etwa 8 % sowohl nach 15 Minuten als auch 60 Minuten nach der Verabreichung von cR11A-Cy5.5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Konfokale Bildgebung und Imaris-Kolokalisationsanalyse der cR11A-Cy5.5-Aufnahme in AT2-Reporterlungen. (A) Repräsentative Felder für eine Nicht-Reporter-Kontrolle (Ctrl) und cR11A-Cy5.5-behandelte AT2-Reporterlungen werden 15 oder 60 Minuten nach der Injektion für Kryosektion und konfokale Z-Stack-Bildgebung entnommen. GFP-Signal (grün) markiert AT2-Zellen, und cR11A-Cy5.5-Fluoreszenz (rot) zeigt ein peptidassoziiertes Signal an. Das "Coloc"-Panel zeigt Pixel oder Objekte an, die von Imaris als colokalisiert klassifiziert sind (gelb), und zusammengefügte Bilder zeigen räumliche Überlappungen zwischen den beiden Kanälen. Die Nicht-Reporter-Kontrolle wurde einbezogen, um die Hintergrundfluoreszenz in den GFP- und Cy5.5-Kanälen zu beurteilen. (B) Die Quantifizierung der Kolokalisierung innerhalb des GFP⁺ AT2-Kompartments zeigt, dass 89,6 % bzw. 86,8 % des GFP-Signals mit cR11A-Cy5.5 nach 15 Minuten bzw. 60 Minuten kolokalisiert wurden. Diese Daten zeigen eine robuste Überschneidung mit GFP⁺-AT2-Zellen an beiden Zeitpunkten und unterstützen eine bevorzugte Bindung des AT2-Kompartments in vivo. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Dieses Protokoll identifiziert die Peptid-Zielsetzung spezifischer Zellpopulationen mithilfe mehrerer unabhängiger Auslesungen, die mit komplementären Auflösungen arbeiten: Transkriptom-Level-Mapping (paarige Fraktion scRNA-seq), quantitative ereignisbasierte Messung (Reporter-Flow-Cytometrie) und räumliche Bestätigung (konfokale Z-Stacks). Zusammen reduzieren diese Ansätze häufige Mehrdeutigkeiten, die bei fluoreszenz- oder bulkbasierten Biodistributionsstudien auf Organebene innewohnen, wie etwa die verwirrende vaskuläre Fluoreszenz oder extrazelluläre Retention, sowie die Unfähigkeit, peptidassoziierte Signale bestimmten Lungenzellpopulationen zuzuweisen⁷.

Mehrere Schritte erfordern besondere Aufmerksamkeit. Die Perfusionsqualität beeinflusst stark die Hintergrundfluoreszenz und die nachgelagerte Sortierleistung; ausreichende Durchfluss ist durch ein einheitliches, elfenbeinweißes Erscheinungsbild aller Lungenlappen gekennzeichnet, während unvollständige Perfusion das Cy5.5-Signal in nicht-Ziel-Kompartimenten erhöhen kann. Für die Gewebedissoziation wird die verlängerte Kälteverdauung (4 °C, 20 H) anstelle typischer Verdauungsbedingungen (37 °C, 1–2 H) verwendet, um Epithelpopulationen zu erhalten und die Erholung empfindlicher Zellen, insbesondere der alveolaren Typ-I (AT1)^-Zellen, zu verbessern. AT1-Zellen gehen während der Isolation leicht verloren, da ihre große, dünne Morphologie sie sehr empfindlich für mechanische Verdauung macht. Über die Standardlaborpraktiken hinaus, einschließlich konsistenter Verdauung, Kompensation, Gating und Schwellenwertung, hilft die 3D-Kolokalisationsanalyse, festzustellen, ob das Peptidsignal mit dem AT2-Reportersignal überlappt, anstatt sich ausschließlich auf zweidimensionale Fluoreszenzüberlappung^{zu verlassen 13}.

Ein CD45⁺-Immunzell-Depletionsschritt kann vor der scRNA-seq oder Quantifizierung der Durchflusszytometrie in Betracht gezogen werden. Immunzellen machen einen großen Anteil der Lungenzellen aus und können CPPs im Rahmen einer typischen Immunantwort auf fremde Partikel aufnehmen. Um die CPP-Aufnahme in nicht-immunen Populationen, einschließlich Endothel-, Epithel- und mesenchymalen Kompartimenten, genauer zu quantifizieren, kann CD45⁺-Zelldepletion die Sensitivität verbessern. Dies kann durch perlenbasierte Depletion vor der Sortierung oder durch Ausschluss von CD45⁺-Zellen während der Durchflusszytometrieanalyse¹² erreicht werden. Diese Modifikation sollte jedoch selektiv verwendet werden, da sie Informationen zur Aufnahme von Immunzellen entfernt und die zelluläre Zusammensetzung der analysierten Probe verändert.

Mehrere Einschränkungen dieses Arbeitsablaufs sollten berücksichtigt werden. Die Cy5.5-Fluoreszenz identifiziert peptidassoziierte Signale, unterscheidet jedoch nicht allein internalisiertes Peptid von membranadhärenten oder perizellulären Signalen. Der gepaarte Bruch scRNA-seq wird ebenfalls durch Gewebedissoziation, Zellrecuperation, Sortierschwellenwerte und die relative Häufigkeit jeder Lungenzellpopulation beeinflusst. Daher können seltene Populationen wie Basalzellen oder Ionozyten unterrepräsentiert oder übersehen werden. Die Flowzytometrie der Reporter-Maus bietet eine stärkere Zelltypzuweisung, erfordert jedoch eine geeignete Reporterlinie oder ein validiertes Antikörperpanel. Darüber hinaus würde eine Fahrzeugkontrolle mit Reportermäusen die Hintergrundkolokalisierung innerhalb von GFP⁺-AT2-Zellen in bildgebenden Assays besser definieren. Die Interpretation sollte daher auf konkordanten Evidenzen über scRNA-seq, Flowzytometrie und konfokale Bildgebung basieren und nicht auf einer einzelnen Anzeige.

Dieser Arbeitsablauf ist modular und kann an alternative Fluorophore, Meldermauslinien, Dosierungsregime oder Erntezeitpunkte angepasst werden. Für Studien, die zusätzliche zell- oder organspezifische CPPs entwickeln, kann das gepaarte Fraktion scRNA-seq-Design mit Modifikationen auf andere Organe (z. B. Leber, Niere oder Gehirn) angewendet werden. Dieses Protokoll bietet einen effizienten Ansatz, um peptidassoziierte Populationen innerhalb eines einzelnen Organs desselben Tieres zu vergleichen und so die Interpretierbarkeit zu verbessern und gleichzeitig die Variabilität zwischen Tieren zu verringern. Zukünftige Anwendungen umfassen das Screening zusätzlicher CPPs, das Testen von CPP–Cargo-Konjugaten, den Vergleich linearer und zyklischer Peptiddesigns sowie die Anwendung des Arbeitsablaufs auf Krankheitsmodelle, bei denen die Gewebearchitektur oder die Häufigkeit der Zielzellen verändert wird.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-mouse CD45-BV605 antibody	BioLegend	103140	Zur Identifizierung oder Ausschluss von CD45+ Zellen verwendet
C57BL/6J Mäuse	The Jackson Laboratory	Stamm Nr. 000664	Wildtyp-Mäuse für Experimente
CD45 MicroBeads, Maus	Miltenyi Biotec	130-052-301	Zur magnetischen Depletion von CD45+ Zellen
Zellzähler	Invitrogen	Countess 3; AMQAX2000	Automatische Zellzählung
CO2 Inkubator	Thermo Scientific	Heracell VIOS 160i; TSH160IDS	Zellinkubation
Konfokalmikroskop	Zeiss	LSM 980; 1872-551	Zur Aufnahme von z-Stack-Bildern
cR11A-Cy5.5 Peptid	Mayo Clinic Proteomics Core	Benutzerdefinierte Synthese; keine Katalognummer	Fluoreszenzmarkiertes CPP zur in vivo-Lieferung
Kryostaten	Leica Biosystems	Leica CM1950	Zum Schneiden von Gewebe
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	Enzym zur Verdauung von Lungengewebe
DMEM/F12	Gibco	11330-032	Zelldissoziation und Waschpuffer
DNase I	Roche	10104159001	Reduzierung der DNA-vermittelten Zellverklumpung
FACS Zellsortierer	BD Biosciences	BD FACSAria II, 4-Laser-System	Zum Sortieren von Cy5.5+ und Cy5.5- Zellen
FBS	Gibco	A52567-01	Zur Verbesserung der Zelllebensfähigkeit in Puffern hinzugefügt
FlowJo Software	FlowJo	Version 10.10.0	Fluzytometrie-Datenanalyse
GraphPad Prism Software	GraphPad Software	Version 10	Statistische Analyse und Plotting
Imaris Software	Oxford Instruments	Version 9.9.1	3D-Visualisierung und Lokalisationsanalyse
Inkubierter orbitaler Schüttler	Thermo Scientific	Solaris; 01-258-086	Zur Gewebeverdauung
Ketamine	WestWard (Hikma)	NDC 0143-9508-01
LD Columns	Miltenyi Biotec	130-042-901	Zur magnetischen Zelltrennung (MACS)
LD Columns	Miltenyi Biotec	130-042-901
Live/Dead Fixable Gelber Totzell-Färbesatz	Invitrogen	L34968	Zur Lebensfähigkeitsfärbung in der Durchflusszytometrie
Live/Dead Fixable Gelber Totzell-Färbesatz	Invitrogen	L34968
LSL-GFP Reportermäuse	The Jackson Laboratory	Stamm Nr. 007906	Cre-induzible GFP-Reporterlinie
LSL-GFP Reportermäuse	The Jackson Laboratory	Stamm Nr. 007906
Mikrozentrifuge	Eppendorf	EPP-5427R	Zentrifugation von Proben
Mikrozentrifuge	Eppendorf	EPP-5427R
Einbettungsmittel mit DAPI	Abcam	AB104139	Kernkontrastierung für die Bildgebung
Einbettungsmittel mit DAPI	Abcam	AB104139
Nukleasenfreies Wasser	Qiagen	175034992
Orale Magensonde	Braintree Scientific	N-PK 020
PBS	Gibco	10010-023	Allgemeines Waschpuffer
PBS	Gibco	10010-023
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	Verhindert bakterielle Verunreinigung
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Kühlzentrifuge	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R	Zellpelletierung bei kontrollierter Temperatur
Kühlzentrifuge	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R
Salinlösung	Baxter	2F7124
Sftpc-CreERT2 Mäuse	The Jackson Laboratory	Stamm Nr. 028054	AT2-spezifische induzierbarer Cre-Linie
Sftpc-CreERT2 Mäuse	The Jackson Laboratory	Stamm Nr. 028054
Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) AT2 Reportermäuse	In-house Zucht	Erzeugt durch Kreuzung von Sftpc-CreERT2(+/+) Mäusen mit LSL-GFP(+/+) Mäusen	Zur AT2-spezifischen GFP-Markierung verwendet
Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) AT2 Reportermäuse	In-house Zucht	Erzeugt durch Kreuzung von Sftpc-CreERT2(+/+) Mäusen mit LSL-GFP(+/+) Mäusen
Seidenfaden	Look	SP117
Single-Cell RNA-Sequenzierungsdienst	Mayo Clinic Genome Analysis Core	https://www.mayo.edu/research/core-resources/genome-analysis-core/services	Bibliothekvorbereitung und Sequenzierung
Single-Cell RNA-Sequenzierungsdienst	Mayo Clinic Genome Analysis Core	https://www.mayo.edu/research/core-resources/genome-analysis-core/services
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648
Wasserbadinkubator	Fisherbrand	Isotemp GPD 28	Temperaturkontrollierte Inkubation
Wasserbadinkubator	Fisherbrand	Isotemp GPD 28
Xylazin (Rompun)	Dechra	NADA #047-956