Quantitative Mikro-CT-Analyse der Lungenparenchym- und Atemwegsremodellierung in einem Frettchenmodell der Lungenfibrose

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Verwendung von Mikro-CT, um die Merkmale der durch Bleomycin induzierten Lungenfibrose in einem Frettchenmodell quantitativ zu bewerten. Dieses Frettchenmodell zeigt ein starkes translationelles Potenzial zum Verständnis der Lungenfibrose und zur Erprobung neuer Therapien.

Zusammenfassung

Lungenfibrose (PF) ist eine chronische und fortschreitende Lungenerkrankung, die durch wiederholte Alveolarverletzungen gekennzeichnet ist, die zu Parenchymalverdickung, Narbenbildung und Atemwegsstörungen führt. Aktuelle Nagetiermodelle, insbesondere solche, die Bleomycin (BLEO) verwenden, haben aufgrund anatomischer Unterschiede wie dem Fehlen von respiratorischen Bronchiolen nur begrenzte translationale Relevanz für die humane idiopathische Lungenfibrose (IPF). Um diese Einschränkung zu beheben, entwickelten wir ein Großtiermodell der Lungenfibrose bei Frettchen, die respiratorische Bronchiolen besitzen, die denen des Menschen ähneln. Drei Monate alte Wildtyp-Frettchen erhielten eine intratracheale Instillation von BLEO. Die Lungen wurden 8 Wochen nach der Behandlung für Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) und histologische Begutachtung entnommen. Aufgrund der begrenzten räumlichen Auflösung der Multidetektor-CT (MDCT) bei der Visualisierung der kleinen Atemwege des Frettchens wurden entfernte Lungen ex vivo mit einem Mikro-CT-Scanner bei kontrollierten Atemwegsdrücken (0 cmH₂O und 25 cmH₂O) abgebildet, um ausatmende und inspiratorische Bedingungen zu simulieren.

Die Mikro-CT-Bildgebung zeigte deutliche strukturelle Unterschiede zwischen normalen und BLEO-behandelten Frettchenlungen. Normale Lungen zeigten eine geringe Abschwächung und erhaltene Architektur, während BLEO-behandelte Lungen eine deutlich erhöhte Abschwächung zeigten, die mit Fibrose übereinstimmt. Merkmale, die für eine fibrotische Lungenerkrankung beim Menschen charakteristisch sind, darunter Wabenbildung mit zystischen Räumen, verdickte Interlobularsepta und Glasopazitäten, die auf frühe fibrotische oder entzündliche Veränderungen hindeuten, waren erkennbar. Mit quantitativer Mikro-CT-Analyse wurde beobachtet, dass die Atemwege in BLEO-behandelten Frettchenlungen bei beiden angelegten Luftdrücken signifikant reduzierte radiale Expansion, longitudinale Dehnung und Volumenänderung aufwiesen. Darüber hinaus zeigte die generationsangepasste Analyse eine signifikante Verdickung der Atemwegswände in Bereichen mit sichtbarer Fibrose. Histologische Untersuchungen, einschließlich der Masson-Trichrom-Färbung, bestätigten umfangreiche Kollagenablagerungen und Fibrose.

Diese Studie zeigt, dass mit BLEO behandelte Frettchen radiologische, mechanische und histopathologische Merkmale entwickeln, die der menschlichen Lungenfibrose ähneln. Darüber hinaus ermöglicht Micro-CT eine hochauflösende Beurteilung der fibrotischen Verteilung, der Atemwegsdynamik und der Veränderungen des Lungenvolumens. Diese Ergebnisse unterstreichen das Potenzial des Frettchens als translationales Modell zur Untersuchung der PF-Pathogenese und zur Bewertung neuartiger therapeutischer Strategien.

Einleitung

Lungenfibrose (PF) ist eine chronische und fortschreitende interstitielle Lungenerkrankung, bei der wiederholte alveoläre Verletzungen eine Parenchymverdickung, Fibrose und fortschreitende Atemwegsstörungen^{verursachen 1}. Lungenfibrose kann durch verschiedene Expositionen ausgelöst werden, darunter Medikamente, Umweltgifte, Infektionen, zugrunde liegende Autoimmunerkrankungen oder sie kann idiopathisch^sein. Obwohl Medikamente entwickelt wurden, um das Fortschreiten der Krankheit zu verlangsamen, insbesondere bei Patienten mit idiopathischer Lungenfibrose (IPF), bleibt die Lungenfibrose unheilbar, mit einer Überlebensrate von 3–5 Jahren nach^{der Diagnose 1,2}. In den meisten Fällen ist die einzige endgültige Behandlung eine Lungentransplantation; Daher besteht ein dringender Bedarf, neue und wirksamere therapeutische Optionen zu entwickeln.

Bleomycin ist ein Medikament, das häufig beim Menschen zur Behandlung von Bösartigkeit verwendet wird; seine Anwendung ist jedoch durch pulmonale Toxizität begrenzt, die sich schnell zu Lungenfibrose³ entwickeln kann. Nach der Entdeckung dieser Nebenwirkung wurde Bleomycin in der Forschung zur Entwicklung von Tiermodellen der Lungenfibrose eingesetzt. Mäuse wurden häufig für diesen Zweck verwendet ^4,5,6 mit verschiedenen Methoden der Bleomycin-Verabreichung, darunter IV und intratracheale Instillation ^7,8. Obwohl sich in diesen Modellen Fibrose entwickelt, umfasst keines von ihnen alle kardinalen Merkmale der Lungenfibrose, wie sie beim Menschen beobachtet^werden. Nagetiermodelle der Lungenfibrose spiegeln keine wesentlichen Merkmale fortgeschrittener Erkrankungen wider, darunter die Bildung von Wabenzysten und die Bronchiolisierung der distalen Alveolen⁹. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass eine durch Bleomycin induzierte Lungenschädigung bei Nagetieren etwa 28 Tage nach der Bleomycin-Behandlung¹⁰ Tage spontan abklingt. Außerdem hatte keiner der in diesen Modellen gezeigten Hemmung der Fibrose eine vergleichbare Wirkung beim Menschen, was unsere therapeutischen Optionen¹¹ einschränkt.

Hausfrettchen (Mustela putorius furo) werden zunehmend in der respiratorischen biomedizinischen Forschung eingesetzt, da sie anatomisch ähnlich dem menschlichen Atemsystem^{12 sind}. Außerdem sind sie anfällig für ähnliche Atemwegskrankheitserreger, die Menschen infizieren, darunter das respiratorische Synzytialvirus (RSV) und die Influenza, was ihre physiologischen Ähnlichkeiten zeigt¹². Frettchenmodelle von Bleomycin zeigen Bronchiolisierung, die Bildung fibrotischer Foci und das Vorhandensein abweichender, basaloidartiger (KRT7⁺/KRT17⁺/KRT5^–/TP63⁺) Zellen⁹. Eine Einzeldosis Bleomycin verursachte anhaltende Lungenfibrose bei Frettchen, wobei restriktive Physiologie und fibrotische Lungenauffälligkeiten mindestens 22^Wochen anhielten. Dieser Befund unterscheidet sich erheblich vom weit verbreiteten Maus-Bleomycin-Modell, bei dem die Fibrose im Allgemeinen selbstlimitierend ist und sich nach etwa 28 Tagen zu bessern beginnt, mit einer erheblichen Regression nach 6–8 Wochen, was darauf hindeutet, dass das Frettchenmodell die chronische und fortschreitende Natur der menschlichen Lungenfibrose besser wiederholen kann. Darüber hinaus wurden Frettchen kürzlich in der Mukoviszidose-Forschung eingesetzt, einer systemischen Erkrankung, die am häufigsten das Atmungssystem betrifft, aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit dem Menschen¹⁴. Daher könnten diese Tiere als bessere Modelle für PF dienen als frühere Nagetiermodelle.

Diese aktuelle Studie zielte darauf ab, ein Tiermodell der Lungenfibrose zu entwickeln, das dem menschlichen Zustand näher kommt. Wir haben Hausfrettchen intratracheales Bleomycin verabreicht. Nach 8 Wochen zeigten diese Frettchen radiografische und histologische Veränderungen, die denen beim Menschen mit Lungenfibrose ähneln.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden gemäß den Richtlinien und Vorschriften des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Michigan State University durchgeführt (Genehmigung für Tierprotokolle Nr. PROTO202300066). Tierpflege- und experimentelle Protokolle wurden von der Michigan State University genehmigt und in Übereinstimmung mit institutionellen Standards für den ethischen Umgang mit Tieren in der Forschung durchgeführt.

1. Bronchoskopische Instillation von Bleomycin bei Frettchen

1. Erwerben Sie männliche Frettchen im Alter von 3–4 Monaten. Das durchschnittliche Gewicht eines männlichen Frettchens in diesem Alter sollte etwa 0,9–1,6 kg betragen. Halten Sie die Tiere bei 21 °C bei 40–50% Luftfeuchtigkeit.
2. Geben Sie dem Frettchen mit einer Präzisionsverdampfer-Anästhesiemaschine 3–5 % Isoflurangas.
3. Halten Sie die Anästhesie aufrecht, indem Sie die Nase des Frettchens mit einem Nasenkegel abdecken und weiterhin Isoflurangas in einer Konzentration von 3%–5 % verabreichen.
4. Wenn das Frettchen ausreichend sediert und liegend ist, beginnt die Bronchoskopie mit einem 2,7 mm breiten Bronchoskop.
5. Geben Sie eine Mischung aus Bleomycin (2 U/kg Körpergewicht) und Kochsalzlösung über den Arbeitskanal in die distale Luftröhre, um eine diffuse Dispersion des Bleomycins zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass das gesamte zugeführte Volumen 1 ml nicht überschreitet. Bringen Sie die Frettchen in ihre jeweiligen Unterkünfte zurück und überwachen Sie sie 8 Wochen lang.
   HINWEIS: Die Installation sollte nicht länger als zwei Minuten dauern.
6. Geben Sie Isofluran mit einer Präzisions-Verdampfer-Gas-Anästhesiemaschine. Decken Sie die Nase des Frettchens mit einem Nasenkegel ab und geben Sie 1–5 % Isofluran, bis das Frettchen liegt. Setzen Sie die Gasexposition fort, bis ein scheinbarer klinischer Tod bestätigt werden kann. Geben Sie eine intravenöse Euthanasielösung in einer Dosis von 90 mg/kg und überwachen Sie die Vitalwerte, bis der Tod bestätigt ist.
7. Entnahme der Lunge acht Wochen nach der Behandlung für Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) und histologische Untersuchung.

2. Hochauflösende Mikro-CT-Bildgebung der Frettchenlungen

1. Bereiten Sie entferntes Lungengewebe für die Bildgebung vor, indem Sie überflüssiges Gewebe und Blut über den Inzision der unteren Vena cava entfernen, um den Blutabfluss zu ermöglichen. Führen Sie die CT sofort nach der Lungenvorbereitung durch.
2. Erhalten Sie tomographische Mikro-CT-Bilder mit einem Mikro-CT-System mit folgenden Bildaufnahmeeinstellungen: 90 keV, 88 μA, Leistungseinstellung mit einem 60 μm Kupfer- und 500 μm Aluminium-Röntgenkollimatorfilter, unter Verwendung eines 72 mm Sichtfelds (FOV) bei 144 μm isotroper Bildauflösung.
3. Insgesamt 5 Bilder bei 18 Sekunden Standard-Gantry-Zeiten mit einem automatisierten Stitching-Protokoll zu erfassen, um doppelte Schnitte zu überlappen, zu nähen und abzulehnen, um ein endgültiges zusammengesticktes Bild für die Analyse der Atemwegspipeline zu erstellen; dies führt zu einem zylindrischen Sichtfeld mit 68 mm Durchmesser und 186 mm Gesamt-Nahtbildtiefe (Z-Ebene) bei einer Voxel-Auflösung von 144 μm, was die vollständige Erfassung des gesamten ex-vivo-Frettchen-Lungenblocks ermöglicht.
   1. Wiederholen Sie dieses Bildgebungsprotokoll für jede Gruppe von ex vivo Frettchenlungen bei Lungendrücken von 0 cmH₂O und 25 cmH₂O.
   2. Verwenden Sie ein Drucküberwachungssystem, das direkt mit der Lunge verbunden ist, um den Atemwegsdruck während der Bildgebung präzise zu steuern und aufrechtzuerhalten.
   3. Koppeln Sie das Druckmessgerät an eine geregelte Luftstromquelle, um eine kontinuierliche Anpassung des intrapulmonalen Drucks zu ermöglichen.
   4. Vor der Bildgebung stellen Sie das System auf den gewünschten Druckwert ein (entweder 0 cmH₂O oder 25 cmH₂O) und pumpen Sie die Lunge mit einem gleichmäßigen Luftstrom auf.
   5. Während der Bildgebung verwenden Sie das Druckmessgerät, um in Echtzeit Rückmeldungen zum Luftstromdruck zu liefern und kleinere Druckschwankungen mit Hilfe der Luftstromquelle auszugleichen.

3. Bildverarbeitung und Segmentierung

1. Laden Sie die rekonstruierten Mikro-CT-Bildvolumina im DICOM-Format, die in ein Format der Neuroimaging Informatics Technology Initiative (NIfTI) konvertiert werden, in die Atemwegsegmentierungspipeline.
2. Definieren Sie die Interessenregion (ROI) im Mikro-CT-Bild, indem Sie axiale Schnitte am oberen Ende manuell beschneiden, um den Röhrchen und andere Trachealeinsätze auszuschließen (siehe Abbildung 1A).
3. Führen Sie die Atemwegsegmentierung mit dem automatisierten Freeze-and-Grow-Algorithmus^15,16 durch, der in den folgenden Hauptschritten beschrieben wird.
   1. Setzen Sie einen Samen in die Luftröhre auf die oberste axiale Bildscheibe innerhalb der ROI; ein leeres Bildarray mit Eingabebildgröße zu erstellen, um das anfängliche sichere Luftwegvolumen (CAV) darzustellen, wobei alle Voxel auf '0' abgewiesen sind; und den Seed-Voxel zu CAV hinzufügen, indem man seinen Wert auf '1' setzt.
   2. Setzen Sie eine anfängliche konservative Mikro-CT-Intensitätsschwelle t = -1000 HU für die Segmentierung des Atemwegslumens.
   3. Erstelle ein leeres Bildarray mit Eingabebildgröße, um das verbotene Volumen (FV) darzustellen, wobei alle Voxel auf '0' initialisiert sind.
   4. Wiederholen Sie die iterative Segmentierung, bis die Konvergenz der Luftwege-Lumensegmentierung, definiert durch eine der beiden Flaggen: 1) der gesamte Schwellenwert (-1000 bis -600 HU) überprüft ist, oder 2) alle '0'-Voxel, die an die '1'-Voxel im CAV-Bild angrenzen, sind im FV-Bild als '1' markiert.
      1. Berechnen Sie CAV-Mittellinienbaum¹⁷ und identifizieren Sie Endpunkte¹⁸ der Endpunkte.
      2. Wende binäre Schwellenwerte auf das Mikro-CT-Bild beim aktuellen Wert von t an und berechnen Sie das neue lumenverbundene Volumen¹⁸ mit CAV als Seed über dem Schwellenwert (Voxelwert ≤ t), wobei FV ausgeschlossen wird.
      3. Für jeden CAV-Endpunkt werden die zugehörigen Voxel innerhalb des neuen Lumenvolumens berechnet, wobei CAV ausgeschlossen wird, die näher an diesem Endpunkt liegen als an anderen CAV-Endpunkten.
      4. Detektieren Sie den CAV-Endpunkt mit einem großen Volumen zugehöriger Voxel (>150 Voxel, entsprechend 0,5 mm³) als potenzielle Leckstellen im neuen Lumenvolumen.
      5. Bestätigen Sie ein mögliches Lumen-Leck anhand der automatisierten Kriterien, die in Nadeem et ^al.15 definiert sind.
      6. Entfernen Sie etwaige Lecks im Lumenvolumen, indem Sie das Subbaumvolumen distal zu den Leckwurzeln entfernen und Voxel um die Leckwurzeln hinzufügen, um die FV mit den zuvor beschriebenen^{Algorithmen zu ergänzen (15}).
      7. Weisen Sie das undicht entfernte Lumenvolumen zu, um das CAV mit den zuvor beschriebenen^{Algorithmen 15} zu aktualisieren.
      8. Erhöhen Sie die Schwelle t um '1'.
      9. Gehe zu Schritt 3.3.4.
4. Führen Sie die Berechnung eines einvoxeldicken Luftwegmittellinienbaums unter Verwendung eines zuvor validierten automatisierten Algorithmus¹⁷ durch, der in den folgenden Hauptschritten beschrieben ist.
   1. Geben Sie den segmentierten Atemwegbaum als binäres NIfTI-Bild ein.
   2. Berechnen Sie den initialen Atemweg-Mittellinienbaum mit einem mittelweit bevorzugten Mindestkostenpfadansatz¹⁷ , der in den folgenden Hauptschritten beschrieben ist.
      1. Erstellen Sie ein leeres Skelettbild-Array mit Eingabebildgröße, bei dem alle Voxel auf '0' abgewiesen sind; Fügen Sie den automatisierten Seed von Schritt 3.3.1 als initiales Skelett-Voxel mit dem Wert '1' hinzu.
      2. Erstelle ein leeres Bildarray mit Eingabebildgröße, wobei alle Voxel auf '0' versehen sind, um das markierte Atemwegvolumenbild darzustellen.
      3. Identifizieren Sie den Voxel im unmarkierten Atemwegsvolumen, der am weitesten zum aktuellen Skelett liegt, und berechnen Sie den medial bevorzugten Mindestkostenpfad, der diesen Punkt mit dem aktuellen Skelett verbindet, mit dem zuvor beschriebenen^{Algorithmus 17}.
      4. Fügen Sie den resultierenden Pfad als neuen skelettartigen Ast zum Skelettbildarray hinzu und aktualisieren Sie das von Atemwegen markierte Volumen durch Anwendung lokaler skalenadaptiver Dilatation entlang des Zweigs, wie zuvor beschrieben¹⁷.
      5. Wiederholen Sie die Schritte 3.4.2.3–3.4.2.4, bis das markierte Atemwegvolumen gefüllt ist.
   3. Schneiden Sie unscheinbare topologische Zweige und erhalten Sie die wahren Mittellinien der Atemwege unter Verwendung einer lokalen skalbasierten Selektionsstrategie zur Astlänge, wie zuvor beschrieben¹⁷.
   4. Eliminieren Sie einfache Punkte¹⁹ in der Mittellinie der Atemwege, die keine Verzweigungsendpunkte sind (d. h. solche, die an mehr als einem Mittellinienvoxel angrenzen), um topologische Konsistenz zu gewährleisten und eine Mittellinie mit nur einem Voxel zu erhalten.
5. Durchführung der Segmentierung des Lungenparenchyms in Mikroaufnahmen der Frettchenlungen bei 0 cmH₂O.
   1. Manuelle Abgrenzung des Lungenparenchyms auf jedem fünften koronalen Bildschnitt mithilfe von Rechenalgorithmen und grafischen Schnittstellen, die in ITK-SNAP²⁰ eingebettet sind.
      HINWEIS: Der Mikro-CT-Intensitätskontrast zwischen dem Lungenparenchym und dem umgebenden Hintergrund bei 25 cmH₂O Inflationszustand war unzureichend, was eine zuverlässige Segmentierung des Lungenvolumens verhinderte.
   2. Wenden Sie Bildinterpolation an, um eine Segmentierung des Lungenparenchyms an Zwischenbildschnitten zu erzeugen.
   3. Führen Sie eine sekundäre Qualitätskontrolle durch, um die strukturelle Kontinuität der parenchymalen Segmentierung sowohl in axialer als auch sagittaler Richtung sicherzustellen.
   4. Schließen Sie das Atemwegslumen und die Wandregionen aus dem Lungenparenchym aus, indem Sie eine lokale skalenbasierte Dilatation des Lumenvolumens verwenden und anschließend das erweiterte Volumen vom Lungenparenchym abziehen.
6. Quantifizieren Sie mechanische Messungen der Atemwege²¹.
   1. Quantifizieren Sie die atmungsbedingte radiale Expansion einzelner Atemwege durch Messung von Veränderungen der räumlich angepassten Lumen-Querschnittsfläche (CSA) zwischen den inspiratorischen (25 cmH₂O Inflation) und dem exspiratorischen (0 cmH₂O Inflation) Lungenvolumen. Berechnen Sie die radiale Expansion an einem Atemwegzweig b, bezeichnet mit Δ_air-R(b), als:
      (1)
      wobei CSA_ins(b) und CSA_exp(b) das Atemwegslumen CSA an den Lungenvolumen der Atem- und Atmungslunge bezeichnen. CSA bei b wird mittels radialer Linienverfolgung und lokal adaptiver Halbmax-Methode über die mittlere Hälfte des Zweigs b²² berechnet.
   2. Quantifizieren Sie die atembedingte längsgående Dehnung einzelner Atemwege wie folgt:
      (2)
      wobei L_ins(b) und L_exp(b) die geodätischen Weglängen des Atemwegzweigs b an den Lungenvolumen der Atmung bzw. Atmung bezeichnen. Die geodätische Pfadlänge eines Zweigs wird berechnet, indem der Mittellinienweg von der Carina bis zum distalen Endpunkt des Zweigs²¹ verfolgt wird.
7. Quantifizieren Sie intensivitätsbasierte Messgrößen des Lungenparenchyms.
   1. Räumlich visualisieren Sie die Mikro-CT-Intensitätsverteilung des Lungenparenchyms bei gesunden und fibrotischen Frettchen, indem eine "Look-through 3D-Volumenwiedergabe" des Lungenparenchymvolumens im Kontext des Atemwegsbaums erzeugt wird. Erreichen Sie den Look-through-Effekt mit mikro-CT-intensitätsdefinierter Transparenzkartierung und Farbcodierung. Wenden Sie dieselben Transparenzkartierungen und Farbkodierungsskalen sowohl auf gesunde als auch auf fibrotische Frettchenlungen an. Die folgenden Schritte werden angewendet, um die durchsichtige 3D-Volume-Darstellung zu erzeugen.
      1. Verwenden Sie 3D Slicer²³ , um das dreidimensionale (3D) NIfTI-Bild der Atemwegsegmentierung bei 0 cmH₂O Inflation als "Segmentierung" zu öffnen.
      2. Erzeugen Sie eine 3D-Atemwegsrepräsentation mit dem Segmentationsmodul. Wählen Sie das Atemwegvolumen als Eingang aus und klicken Sie im Tab Darstellungen unter der Option Geschlossene Fläche erstellen.
      3. Importiere das Mikro-CT-Intensitätsbild mit getrenntem Lungenparenchym als Volumen in den 3D-Slicer. In diesem Bild sind die ursprünglichen Mikro-CT-Intensitätswerte für Lungenvoxel erhalten, während allen nicht-lungenvoxeln ein Wert von -2000 HU zugewiesen wird.
      4. Konfigurieren Sie Farb- und Transparenzzuordnung für Lungenparenchymalintensitäten mit dem Volume Rendering-Modul . Kartenintensitätswerte von -1500 HU, -600 HU, 0 HU und 1500 HU bis hin zu Schwarz, Grün, Gelb und Rot, mit Opazitäten von 0, 0,15, 0,3 bzw. 1.
   2. Verwenden Sie den in dieser Studie entwickelten Algorithmus, um den Anteil des kranken Gewebes im Lungenparenchym zu schätzen, indem die beobachtete Intensitätsverteilung aus Mikro-CT-Bildgebung analysiert wird. Die Methode geht davon aus, dass die Intensitätswerte gesunder Parenchymalregionen einer Gaußschen Verteilung folgen. Im Gegensatz dazu verzerren fibrotische Regionen mit charakteristisch höheren Intensitäten die Gaußianität der rechten Seite des beobachteten Histogramms. Erfüllen Sie diese Aufgabe in den folgenden Schritten.
      1. Berechnen Sie das Histogramm für isolierte Lungenparenchymalbilder in Schritt 3.7.1.3 mit 50 Bins im Intensitätsbereich von -1500 HU bis 500 HU.
      2. Berechnen Sie den Mittelwert der Ziel-Gaußschen Verteilung als Modus des Histogramms und leiten Sie den Standardabweichungsparameter anhand der Intensitätswerte links vom Histogramm ab.
      3. Quantifizieren Sie das fibrotische Gewebevolumen als die überschüssige Fläche auf der rechten Seite des beobachteten Histogramms, die oberhalb der erwarteten Gaußschen Verteilungskurve liegt, definiert durch den Mittelwert und die Standardabweichungsparameter aus Schritt 3.7.2.2.
      4. Berechnen Sie den Anteil des erkrankten Gewebes als Verhältnis des fibrotischen Gewebevolumens zur Gesamtzahl des Histogramms, das das Volumen der Parenchymalregion darstellt.

Ergebnisse

Von den fünf Frettchen wurden die entfernten Lungen von einem gesunden Frettchen und einem fibrotischen Frettchen mit einem Mikro-CT-Scanner bei kontrollierten Atemwegsdrücken von 0 cmH₂O und 25 cmH₂O abgebildet, um exspiratorische bzw. inspiratorische Lungeninflationen zu simulieren.

Abbildung 1 illustriert die Zwischenergebnisse der Bildverarbeitungspipeline für das Mikro-CT-Bild (Abbildung 1A) einer ex vivo Frettchenlunge bei 0 cmH₂O-Druck. Abbildung 1B zeigt Zwischenergebnisse der Segmentierung des Atemwegsbaums über Iterationen hinweg und entsprechende Schwellenwerte auf einem Mikro-CT-Bild einer ausgeschnittenen Frettchenlunge, aufgeblasen auf 0 cmH₂O. Abbildung 1B zeigt die Effektivität des FG-Algorithmus bei der Erfassung kleinerer Atemwege mittels Parameterrelaxation in späteren Iterationen. Abbildung 1C veranschaulicht die Ergebnisse der Erkennung von Atemweg-Mittellinienbäumen vor und nach dem Schneiden von unfruchtbaren Ästen.

Es wurde beobachtet, dass nach der fünften Generation die Anzahl der nachgewiesenen Atemwege in der fibrotischen Lunge deutlich geringer ist als bei der gleichen Generation in der gesunden Lunge (Abbildung 2A). Konkret wurden 161 Atemwegszweige in der gesunden Lunge über die fünfte Generation hinaus nachgewiesen, während in den fibrotischen Lungen über die entsprechenden Generationen hinweg nur 91 Atemwege nachgewiesen wurden. Im Allgemeinen waren die Atemwegwände in der fibrotischen Lunge dicker als in der gesunden Lunge (Abbildung 2B). Die computergestützte Analyse zeigte eine signifikante Zunahme der normalisierten Atemwegswanddicke mit Lumendurchmesser in Bereichen mit sichtbarer Fibrose im Vergleich zu abgestimmten Bereichen der gesunden Lunge.

Fibrotische Lungen zeigten kleine, dickwandige zystische Lufträume, die mit Honigkammen, Verdickung der Interlobularsepta und Bereichen mit Bodenglasopazität übereinstimmen. Bodenglasopazitäten beziehen sich auf Lungenbereiche, in denen verdicktes Lungengewebe und teilweise gefüllte Lufträume den Bereich auf CT-Bildern verschwommen und grau erscheinen lassen. Es wurde beobachtet, dass fibrotische Lungen höhere CT-Intensitätswerte im Parenchym aufweisen, die den fibrotischen Regionen entsprechen. Abbildung 3A zeigt eine "durchschauende 3D-Volumenwiedergabe" des segmentierten Lungenparenchymvolumens zusammen mit dem segmentierten Atemwegbaum. Die Mikro-CT-Intensitätswerte über dem Parenchym in den fibrotischen Frettchenlungen (-502 ± 238 HU) waren signifikant höher (p < 0,001) als die in der gesunden Frettchenlunge (-588 ± 167 HU). Die Analyse der regionalen Intensitätserhöhung (Abbildung 3B) zeigte, dass die fibrotische Lunge ein Parenchymalvolumen von 27,8 % mit erhöhter CT-Intensität aufweist (angezeigt durch den violetten Bereich im Histogramm). Im Vergleich dazu hat die gesunde Lunge nur 1,24 % ihres Parenchymalvolumens bei erhöhter CT-Intensität.

Ein visueller Vergleich der Atemwegsmechanik zwischen normalen und kranken Lungen zeigt die Verteilung der atemwegsmechanischen Biomarker in gesunden und fibrotischen Frettchenlungen über Atemwegszweige hinweg (Abbildung 4). Die radiale Ausdehnung der Atemwege wurde von 66,8 % ± 9,8 % in den gesunden Frettchenlungen beobachtet, was signifikant höher war (p < 0,001) als in den fibrotischen Frettchenlungen (32,4 % ± 7,6 %). Ein signifikanter Unterschied (p < 0,001) bei der längsverlaufenden Atemwegsdehnung wurde ebenfalls zwischen gesunden (35,7 % ± 5,3 %) und fibrotischen (16,0 % ± 4,9 %) Frettchenlungen beobachtet.

Repräsentative CT-Bilder wurden mit einem Mikro-CT-Scanner bei zwei verschiedenen Atemwegsdrücken (0 cmH₂O und 25 cmH₂O) für jede Lunge aufgenommen. Abbildung 5 zeigt die Unterschiede zwischen normalen (Abbildung 5B, C) und BLEO-behandelten Frettlinglungen (Abbildung 5E, F). In den normalen Lungen zeigen die CT-Scans eine typische Lungenarchitektur mit geringer Abschwächung und keinen Anzeichen von Fibrose (Abbildung 5B, C). Im Gegensatz dazu zeigen die mit BLEO behandelten Frettchenlungen signifikante pathologische Veränderungen, darunter eine erhöhte Lungenabschwächung, was auf eine Gewebefibrose hindeutet (Abbildung 5E, F). Zusätzlich ist eine ausgeprägte Wabenbildung zu beobachten, gekennzeichnet durch zystische Räume und verdickte Interlobularsepta (Abbildung 5E, F). Ground-glass-Opazitäten (GGO), die Bereiche mit Entzündung oder frühen fibrotischen Veränderungen darstellen, sind ebenfalls in den mit BLEO behandelten Lungen sichtbar (Abbildung 5E, F).

Die histologische Analyse (Abbildung 6) bestätigte erhebliche Geweberemodellierung und Fibrose in bleomycin-behandelten Frettchenlungen. Die Färbung von Hämatoxylin und Eosin (HE) zeigte eine erhaltene alveoläre Architektur in normalen Lungen (Abbildung 6A, C), während fibrotische Lungen umfangreiche strukturelle Verzerrungen, erhöhte Zellularität, Verdickung der Atemwegswand und ausgeprägte fibrotische Läsionen aufwiesen (Abbildung 6B, D). Massons Trichromfärbung zeigte zudem eine minimale Kollagenablagerung in den Atemwegen und dem Parenchym normaler Lungen (Abbildung 6E, G), während fibrotische Lungen eine deutliche Ansammlung von Kollagen sowohl in den Atemwegen (Abbildung 6F) als auch in den Parenchymalregionen zeigten (Abbildung 6H). Eine quantitative Bildanalyse (Abbildung 6I,J) bestätigte einen signifikanten Anstieg des kollagenpositiven Bereichs in fibrotischen Lungen im Vergleich zu normalen Kontrollen sowohl im Atemweg als auch im Parenchymkompartiment (P < 0,0001), was auf eine umfangreiche Ablagerung der extrazellulären Matrix und fortschreitende Geweberemodellierung hinweist.

Abbildung 1: CT-Bildverarbeitung und Segmentierung. (A) Auswahl des Interessenbereichs (ROI) in einem Mikro-CT-Bild. Die Cropping-Linie wurde manuell ausgewählt, um den Schlauch und andere Trachealeinsätze auszuschließen, die zur Aufblasung der entfernten Frettchenlungen verwendet wurden. (B) Zwischenergebnisse der Segmentierung des Atemwegbaums in einem Mikro-CT-Bild einer ausgeschnittenen Frettchenlunge, aufgeblasen bei 0 cmH_2Omit dem Freeze-and-Grow (FG)-Algorithmus. (C) Mittellinienerkennungsergebnisse vor und nach dem Beschneiden von unscheinbaren Skelettästen, die auf das Atemwegsegmentierungsvolumen angebracht wurden, basierend auf einem Mikro-CT-Bild eines 0 cmH₂O. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Computergestützte Analyse der Erzeugung von Atemwegbäumen. (A) Die Anzahl der in der gesunden Lunge festgestellten Atemwege vs. fibrotische Lunge. (B) Unterschiede in der Dicke der Atemwegswände bei gesunden vs. fibrotischen Lungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Visualisierung der farbcodierten Mikro-CT-Intensität. (A) Eine 3D-Visualisierung farbcodierter Mikro-CT-Intensitätsverteilungen über das Parenchym für gesunde und fibrotische Frettlinglungen bei 0 cmH2O-Inflation. (B) Mikro-CT-Intensitätshistogramme gesunder und fibrotischer Frettchenlungen, wobei der in Lila markierte Histogrammbereich Regionen erhöhter CT-Intensität basierend auf Gauß-Modellierung zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Atemwegsmechanische Biomarker für gesunde und fibrotische Frettchenlungen. Für jeden Biomarker (A zeigt die radiale Ausdehnung der Atemwege, B zeigt die longitudinale Dehnung der Atemwege) wurde ein normalisiertes Farbcodierungsschema im Bereich von μ_x ± 3σ_x angewendet, bei dem der Mittelwert (μ_x) und die Standardabweichung (σ_x) jeder Metrik über alle Zweige der gesunden Frettchenlunge berechnet wurden. Siehe Text für quantitative vergleichende Ergebnisse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Mikro-CT-Bildgebung zeigt umfangreiche strukturelle Remodellierung und Verlust des belüfteten Lungenvolumens in bleomycininduzierten fibrotischen Frettchenlungen. (A–F) Repräsentative Mikro-CT-Aufnahmen bei einem Inflationsdruck von 25 cm H₂O vergleichen gesunde Kontrollfrettchen (A–C) mit bleomycinbehandelten fibrotischen Frettchen (D–F). Dreidimensionale (3D) volumenrenderte Rekonstruktionen (A,D) zeigen erhaltene Lungenarchitektur und homogene Expansion in gesunden Lungen (A), während fibrotische Lungen (D) eine verminderte Lungenerweiterung und eine ausgeprägte parenchymale Verzerrung aufweisen. Transversale (B,E) und koronale (C,F) CT-Schnitte heben die Unterschiede zwischen den Gruppen weiter hervor. Gesunde Lungen zeigen gleichmäßig belüftetes Parenchym mit normalen Atemwegsverzweigungen und minimaler Gewebedichte (B,C). Im Gegensatz dazu zeigen fibrotische Lungen eine ausgedehnte bilaterale subpleurale und basilar-dominierende Opacifikation, erhöhte Parenchymaldichte, architektonische Verzerrung und zystische Luftraumvergrößerung, die mit einer wabenartigen Umstrukturierung (rote Pfeile) übereinstimmen (E,F). Gelbe gestrichelte Linien markieren die Lungengrenzen. Diese bildgebenden Ergebnisse deuten auf eine schwere fibrotische Remodellierung und eine erhebliche Verringerung des funktionellen belüfteten Lungenvolumens nach Bleomycin-Exposition bei Frettchen hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Validierung der durch BLEO induzierten Frettchenlungenfibrose. (A–H) Repräsentative Brightfield-Hämatoxylin- und Eosin-(HE)-gefärbte Schnitte zeigen Unterschiede zwischen normalen Lungen (A,C) und fibrotischen Lungen (B,D). Niedrigvergrößerungs-HE-Bilder zeigen erhaltene alveoläre Architektur in normalen Lungen (A) sowie umfangreiche Geweberemodellierung und fibrotische Läsionen in fibrotischen Lungen (B). Höher vergrößerte HE zeigen zudem die normale alveoläre Struktur in normalen Lungen (C) sowie eine erhöhte Zellularität, die Verdickung der Atemwegwand und eine architektonische Verzerrung in fibrotischen Lungen (D). Repräsentative Brightfield-Bilder von Frettchenlungenschnitten, die mit Masson's Trichrome gefärbt wurden, zeigen eine minimale Kollagenablagerung in normalen Lungenatemwegen (E) und Parenchym (G) sowie eine erhöhte Kollagenablagerung (blau) in fibrotischen Lungenwewegen (F) und Parenchym (H). (I,J) Die Quantifizierung des kollagenpositiven Bereichs zeigte eine signifikant erhöhte Kollagenablagerung in fibrotischen Lungen im Vergleich zu normalen Lungen sowohl in den Atemwegsregionen (I) als auch im Lungenparenchym (J). P < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Diese Studie beschreibt ein Protokoll, das intratracheale Bleomycin-Verabreichung bei Frettchen mit hochauflösender ex vivo Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) kombiniert, um strukturelle und mechanische Merkmale der Lungenfibrose zu charakterisieren. Micro-CT kann kleine Atemwege von nur 0,2 mm erkennen und Volumen, Atemwegsdicke, Dichte und Morphologie messen. Erhöhte Gewebedichte, Volumenverlust und regionale Heterogenität entsprechen eng der Histopathologie. Das Hauptziel war es, die Machbarkeit festzustellen und zu zeigen, dass dieses Großtiermodell zusammen mit fortschrittlichen bildgebenden Analysen radiologische, Atemwegs- und histopathologische Merkmale erfassen kann, die menschlicher Lungenfibrose ähneln. Mehrere Schritte im Protokoll sind entscheidend für die Reproduzierbarkeit und Interpretierbarkeit. Erstens ermöglicht die bronchoskopisch geführte intratracheale Bleomycin-Instillation eine diffuse Lungenexposition und minimiert proximale Atemwegspooling, eine bekannte Einschränkung von Kleintiermodellen ^4,7,11. Dieser Ansatz verringert wahrscheinlich die Variabilität in der regionalen Verletzungsverteilung, was besonders bei größeren Lungen mit komplexeren Atemwegsverzweigungen wichtig ist. Zweitens bevorzugt die Wahl eines 8-wöchigen Zeitpunkts nach der Instillation die etablierte Fibrose gegenüber einer akuten Entzündung. In Mausmodellen löst sich die durch Bleomycin induzierte Fibrose oft teilweise im Laufe der Zeit ab, was die translationale Relevanz ^4,8,11 begrenzt. Im Gegensatz dazu zeigten die Frettchenlungen in dieser Studie anhaltende radiologische und histologische fibrotische Merkmale.

Eine kontrollierte Lungeninflation während der ex-vivo-Bildgebung stellt ein weiteres entscheidendes Element dar. Die Bildgebung bei standardisierten Atemwegsdrücken (0 cmH₂O und 25 cmH₂O) ermöglichte die Quantifizierung der radialen Ausdehnung und der Längsstreckung der Atemwege, wodurch die Störeffekte variables Lungenvolumens und der Compliance reduziert wurden. Diese mechanischen Biomarker aus den Atemwegen, die mit automatisierten, generationsabgestimmten Algorithmen abgeleitet werden, liefern objektive Messgrößen der Atemwegsdysfunktion, die nur mit konventioneller Histologie schwer zu beurteilen sind.^15,21.

Mehrere Protokollmodifikationen können die Robustheit weiter verbessern. Die Dosierung von Bleomycin könnte getitriert oder in wiederholt niedrigen Dosen verabreicht werden, um chronische Epithelschäden besser zu modellieren, was für die aktuellen Paradigmen der Lungenfibrose-Pathogenese ^1,3 zentral ist. Segmentale Instillationsstrategien können Vergleiche innerhalb des Tieres zwischen fibrotischen und relativ erhaltenen Regionen ermöglichen. Aus bildgebender Sicht ist eine sorgfältige Standardisierung des Atemwegsdrucks, der Fixationsbedingungen und der Temperatur unerlässlich, um Gewebeverformungen während der ex-vivo-Untersuchung zu minimieren. Schwere Fibrose kann die automatisierte Atemwegsegmentierung aufgrund von Atemwegszerstörung und hoher Gewebedichte erschweren; Daher bleiben adaptive Schwellenwerte und manuelle Qualitätskontrolle wesentliche Ergänzungen zu automatisierten Pipelines¹⁵.

Diese Methode hat mehrere Einschränkungen. Am auffälligsten ist die geringe Anzahl der Tiere, die durch Mikro-CT abgebildet wurden, die statistische Schlussfolgerung begrenzt, und die Ergebnisse sollten als beschreibend interpretiert werden. Diese Arbeit wurde als Pilotstudie konzipiert, um die Machbarkeit eines bleomycininduzierten Frettchenmodells der Lungenfibrose mittels quantitativer Mikro-CT zu bestimmen. Zukünftige Studien mit größeren Kohorten werden notwendig sein, um diese Ergebnisse zu validieren und die statistische Stärke zu verbessern. Die Beschreibung zeigt jedoch einen deutlichen Unterschied bei den bildgebenden Biomarkern und Messungen.

Darüber hinaus bleibt die durch Bleomycin induzierte Fibrose zwar weit verbreitet, aber ein toxingetriebenes Verletzungsmodell und reproduziert nicht vollständig die multifaktorielle Ätiologie der idiopathischen Lungenfibrose, einschließlich Alterung, genetische Anfälligkeit und Umweltexpositionen ^3,6,11. Die Bildgebung wurde ex vivo durchgeführt, was eine direkte Beurteilung des Gasaustauschs, der Gefäßbeiträge und des Längsverlaufs der Erkrankung verhinderte. Dennoch bietet ex vivo Micro-CT eine überlegene räumliche Auflösung und ermöglicht eine detaillierte dreidimensionale Analyse kleiner Atemwege, die derzeit mit klinischer Multidetektor-CT bei Frettchen nicht möglich ist.

Trotz dieser Einschränkungen bietet dieses Protokoll mehrere Vorteile gegenüber bestehenden Modellen. Frettchen besitzen respiratorische Bronchiolen und Atemwegsverzweigungen, die eher denen des Menschen ähneln als denen von Nagetieren, was sie besonders geeignet macht, um atemwegszentrierte Aspekte der Fibrose ^6,12 zu untersuchen. Die Kombination einer menschlich relevanten Atemwegsanatomie mit mikro-CT-basierter quantitativer Bildgebung ermöglicht eine gleichzeitige Beurteilung der Parenchymaldichte, der Atemwegswandstärke, des Atemwegsverlusts und der beeinträchtigten Atemwegsmechanik. Diese Merkmale spiegeln radiologische Muster wider, die bei humanen fibrotischen Lungenerkrankungen beobachtet wurden, darunter Honigkammen, Septumverdickung und regionale Heterogenität ^1,2.

Die hochauflösende Computertomographie (HRCT) ist eine grundlegende Bildgebungsmethode zur Diagnose und Längsüberwachung idiopathischer Lungenfibrose (IPF) in der klinischen Praxis. HRCT basiert auf Prinzipien, die der Mikro-Computertomographie (Micro-CT) ähneln, und wurde optimiert, um parenchymale Lungenanomalien zu erkennen und gleichzeitig die Strahlenbelastung der Patienten^zu minimieren. Wichtig ist, dass Fortschritte in der HRCT die diagnostische Genauigkeit so verbessert haben, dass eine chirurgische Lungenbiopsie für die IPF-Diagnose oft nicht mehr erforderlich ist, wenn charakteristische bildgebende^{Merkmale vorhanden sind}. Markante radiographische Befunde von IPF, darunter architektonische Verzerrungen, Traktionsbronchiektase, Honigkamm und zystische Lufträume, können mit HRCT bei Patienten identifiziert werden. Im Einklang mit diesen klinischen Beobachtungen zeigt unser Frettchenmodell eine Atemwegsverzerrung und eine zystische Luftraumbildung, die durch Mikro-CT nachweisbar ist, und liefert einen bildgebenden Phänotyp, der dem Menschen eng ähnelt.

Neben HRCT hat sich die endobronchiale optische Kohärenztomographie (EB-OCT) als wertvoller bildgebender Ansatz für die IPF-Bewertung^erwiesen. EB-OCT ist eine minimalinvasive Technik, die Lichtwellen nutzt, um hochauflösende, dreidimensionale Bilder der peripheren Lunge in vivo mit einem Standard-Bronchoskop²⁶ zu erzeugen. Ähnlich wie HRCT hat EB-OCT vielversprechende Ergebnisse bei der Erkennung fibrotischer Remodellierung ohne chirurgische Biopsie gezeigt. Die Fähigkeit unseres Frettchenmodells, strukturelle Anomalien zu entwickeln, die durch CT-basierte Bildgebung nachweisbar sind, deutet darauf hin, dass es auch für zukünftige Untersuchungen mit neuen klinischen Bildgebenden Methoden wie EB-OCT gut geeignet sein könnte.

Wichtig ist, dass viele Therapien, die Fibrose in Nagetiermodellen abschwächen, keine ähnliche Wirksamkeit beim Menschen gezeigt^{haben 11}. Der hier beschriebene Ansatz kann helfen, diese translationale Lücke zu überbrücken, indem er sensible, räumlich aufgelöste Bildgebende Biomarker bereitstellt, die sowohl Struktur als auch Funktion widerspiegeln. Solche Biomarker könnten verwendet werden, um die therapeutische Reaktion über die globale Kollagenbelastung hinaus zu bewerten und regionale Verbesserungen in der Atemwegsmechanik oder der parenchymalen Remodellierung zu erfassen.

Abschließend etabliert diese Studie ein praktikables Protokoll zur Modellierung der Lungenfibrose bei Frettchen und zur quantitativen Bewertung krankheitsbedingter struktureller und mechanischer Veränderungen mittels Mikro-CT. Obwohl noch vorläufig, hebt der Ansatz das Potenzial hervor, Großtiermodelle mit fortschrittlicher bildgebender Analytik zu kombinieren, um die translationale Relevanz zu erhöhen, das mechanistische Verständnis der Lungenfibrose zu verbessern und die präklinische Bewertung neuartiger therapeutischer Strategien zu unterstützen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 mL Luer-Lock-Spritze	BD	309628
10 mL Luer-Lock-Spritze	BD	303134
24 G ½; 3/4" Exel safelet Katheter	EXELINT INTERNATIONAL CO.	26751
3 mL Luer-Lock-Spritze	BD	309657
30 mL Luer-Lock-Spritze	BD	302832
5 mL Luer-Lock-Spritze	BD	309647
BD Precision glide Nadel 18 G ½; 1 1/1"	BD	305196
BD Precision glide Nadel 20 G ½; 1"	BD	305175
BD Precision glide Nadel 23 G ½; 1"	BD	305145
Dulbecco's phosphat-pufferter Saline (DPBS +/-)	Gibco	14190250
Endotracheale Intubationsschläuche mit Cuff Sauerstoff-Katheter	Caphstion	2.0MM
ET-Schlauch, uncuffed, 2.0	Teleflex	5-10404
Ethicon Permahand Seidenfaden, Größe 2-0, keine Nadel, 18", 36/Box, A185H	Fisher Scientific	50-209-2809
Invitrogen RNAlater Stabilisierungslösung	Fisher Scientific	AM7021
Isofluran	Covetrus	11695-6777-2
Lubricant PM Salbe	AACE Pharmaceuticals	71406-124-35	Augensalbe
MADgic 700 Zerstäuber	Teleflex	MAD700
Manometer, professionelles Luftdruckmessgerät	Leaton	T168
Rodent ventilator Modell 683	Harvard Apparatus, Inc.	55-3438
Sterile Kochsalzlösung, 0,9%	CellPro	DS0329
Veterinär-Pulsoximeter	uPM60V	UVMI