Eine fluoreszenzbasierte Methode zur Visualisierung der Dynamik von Lipidtröpfchen und Organellen während der Mitose in Hepatomzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll ermöglicht eine reproduzierbare Visualisierung von Lipidtröpfchen und Organellendynamiken während der Mitose mit synchronisierten Hepatomen.

Zusammenfassung

Intrazelluläre Lipidtröpfchen (LDs) sind in verschiedenen Zelltypen allgegenwärtig. LDs speichern neutrale Lipide wie Triacylglycerol und Cholesterylester und spielen wichtige Rollen im Energiestoffwechsel, in der Signalübertragung und bei Stressreaktionen. Obwohl LDs als intrazelluläre Organellen anerkannt werden, bleibt ihr Verhalten während des Zellzyklusverlaufs unklar. Während der Mitose werden mehrere Organellen, darunter Mitochondrien und der Golgi-Apparat, umfangreich umgebaut und anschließend wieder zusammengesetzt, was die Frage aufwirft, ob LDs auch zellzyklusabhängige Veränderungen durchlaufen. Da LDs als Energiequellen und Signalzentren dienen können, ist es besonders wichtig, ihre Dynamik während der Mitose zu klären. Um dem entgegenzuwirken, stellen wir ein Protokoll vor, das Zellzyklus-Synchronisation mit fluoreszierender LD-Färbung in Hepatomzellen kombiniert. Die Zellen werden an der G2/M-Grenze mit einem cyclinabhängigen, auf Kinase-1-Inhibitoren basierenden Ansatz synchronisiert, in den Zellzyklus freigesetzt und zu bestimmten Zeitpunkten gesammelt. Die LDs werden anschließend mit einem neutralen Lipidfarbstoff markiert und mittels Fluoreszenzmikroskopie visualisiert. Diese Methode bietet einen reproduzierbaren Ansatz zur Untersuchung der LD-Umverteilung während der Mitose und kann breit auf Studien zur Organellenbiologie, Stoffwechselregulation und Krebszellphysiologie angewendet werden.

Einleitung

Der Zellzyklus ist ein hochgradig orchestriertes Ereignis, das die genaue Duplikation und Segregation der chromosomalen DNA ^1,2 sicherstellt, während dessen die intrazellulären Organellen dynamisch reorganisiert^{werden 3}. Sie besteht aus vier Hauptphasen: G1, S, G2 und M ^1,2. Während der Mitose richten sich die duplizierten Chromosomen an der äquatorialen Ebene der bipolaren Spindel aus und werden anschließend auf zwei Tochterzellen⁴ übertragen. Organellen wie Mitochondrien und der Golgi-Apparat werden während der Mitose 5,6,7,8 umfassend umgebaut. Diese Organellen zersplitterten sich in kleine Vesikel, bevor sie auf die beiden Tochterzellen verteilt wurden, wo sie sich während des Verlaufs im folgenden^{Zellzyklus 3} wieder zusammensetzen.

Lipidtröpfchen (LDs) sind neutrale, lipidhaltige Organellen, die aus einem Kern neutraler Lipide bestehen, der von einer Phospholipid-Monoschicht umgeben ist. Sie sind mit einer Vielzahl von Proteinen assoziiert und sind in vielen Zelltypen weit verbreitet, darunter proliferierende Zellen ^9,10. Die Protein- und Lipidzusammensetzung von LDs variiert je nach Zell- und Gewebetyp¹¹. Unter diesen Proteinen wurde die Perilipin-(PLIN)-Familie umfassend untersucht, und PLIN2 stabilisiert LDs in Hepatozyten^12,13. Neben der strukturellen Stabilisierung sind die Proteine der PLIN-Familie auch an der Regulation der LD-Dynamik und den Interaktionen mit anderen zellulären Komponenten beteiligt¹⁴. LDs dienen nicht nur als Speicherdepots für Triacylglycerol und Cholestylesterester, sondern auch als Hubs für den Energiestoffwechsel¹⁵, Signalwege¹⁶ und Stressanpassung¹⁷. Bei pathologischen Erkrankungen wie metabolischer Störungs-assoziierter Steatohepatitis (MASH, früher bekannt als NASH) ist die LD-Ansammlung im Vergleich zur gesunden Kontrolle^18,19 deutlich erhöht, was ihre Bedeutung für die Krankheitsbiologie unterstreicht. Trotz umfangreicher Forschung zur Dynamik der Mitochondrien, des endoplasmatischen Retikulums und des Golgi-Apparats während der Mitose war jedoch nur begrenzte Beobachtung der räumlichen Lokalisierung von LDs in teilenden Zellen verfügbar. Wir analysierten die LD-Lokalisierung während der Mitose mit der hier vorgestellten Methode. Wir haben zuvor berichtet, dass LDs räumliche Verteilungsmuster aufwiesen, die sich von denen anderer intrazellulärer Organellen^{unterschieden}.

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Untersuchung der Verteilung von LDs und anderen intrazellulären Organellen während der Mitose in Hepatomzellen. Die Methode umfasst Zellzyklus-Synchronisation und fluoreszierende Färbung, wodurch eine reproduzierbare Visualisierung der LD-Dynamik während der Mitose möglich ist. Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass LDs zellzyklusabhängige Veränderungen in der räumlichen Verteilung zwischen Interphase und Mitose zeigen, was eine vergleichende Analyse der LD-Lokalisierung während der Zellteilung erleichtert. Dieser Ansatz kann breit angewendet werden, um Organellenlokalisierung, Dynamik und Stoffwechselregulation sowohl in physiologischen als auch in pathologischen Kontexten zu untersuchen.

Protokoll

1. Für dieses Protokoll erforderliche Standardlösungen

1. Bereiten Sie 24 % (w/v) fettsäurefreie rindische Serumalbuminlösung (BSA) in 150 mM NaCl vor.
2. Bereiten Sie 10 mM RO-3306 (ein selektiver cyclinabhängiger Kinase-1 (CDK1)-Inhibitor) Lagerlösung in DMSO unter sterilen Bedingungen vor.
   HINWEIS: Weitere häufig verwendete Lösungen wie NaOH, NaCl und phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) wurden nach Standardlaborpraxis hergestellt. PBS wurde hergestellt, indem 2,6 g NaH₂PO₄·2H₂O, 29 g Na₂HPO₄·12H₂O, 80 g NaCl und 2,0 g KCl in destilliertem Wasser gelöst und das Endvolumen auf 1 L angepasst wurden.

2. Herstellung von mit BSA konjugierter Oleinsäure

1. Gib 90 mg Ölsäure in einen 50-mL-Becher und gib 2 ml Ethanol (99,5 %) dazu, um ihn aufzulösen.
2. Gib 100 μL 5 N NaOH zur Lösung und rühre, bis sie vollständig vermischt sind.
3. Verdampfen Sie Ethanol unter einem Strom aus Stickstoffgas.
4. Fügen Sie 10 ml 150 mM NaCl hinzu und inkubieren Sie die Mischung bei 60 °C für 5 Minuten.
5. Fügen Sie 12,5 ml gekühlte 24%ige (w/v) BSA-Brühlösung langsam und tropfenweise zur Oleinsäurelösung (2,4) hinzu und rühren Sie die Mischung vorsichtig 10 Minuten lang kontinuierlich um, um bei Raumtemperatur ein allmähliches und homogenes Mischen zu ermöglichen.
6. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein und bringen Sie das Endvolumen auf 25 mL mit 150 mM NaCl. Die Endkonzentration der Ölsäure beträgt 12,8 mM.
7. Filtern Sie die Lösung unter sterilen Bedingungen durch einen 0,22 μm-Filter und lagern Sie Aliquots bei bis zu 2 Wochen bei 4 °C oder bei -20 °C für längere Lagerung.

3. G2/M-Randsynchronisation von Zellen

1. Bereiten Sie die notwendigen Steuerungen vor.
   1. Bereite unbehandelte asynchrone Zellen ohne RO-3306-Behandlung als Basiskontrolle vor.
   2. Für mit Lölsäure behandelte Bedingungen bereiten Sie Zellen, die ausschließlich mit Ölsäure ohne Synchronisation behandelt wurden, als Basiskontrolle vorbereiten.
   3. Für die Fluoreszenzfärbung führen Sie für jedes Fluorophor Einzelfärbungskontrollen durch, um die Signalspezifität zu überprüfen und spektrale Überlappungen zwischen den Kanälen auszuschließen (ergänzende Abbildung 1).
   4. Erfassen Sie Bilder mit sequentiellen Aufnahmeeinstellungen oder geeigneten Filterkonfigurationen, um spektrale Überschneidungen und Kanalübersprechen zu minimieren.
      HINWEIS: Diese Kontrollen sind unerlässlich, um zellzyklusabhängige Veränderungen von der Verteilung der Organellenbasis zu unterscheiden und die Fluoreszenzspezifität zu validieren.
2. Halten Sie HuH7-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum, 100 U/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin bei 37 °C in einem 5 % CO₂-Inkubator.
3. Setze Glasdeckblätter in eine 35-mm-Kulturschale. Samen 2 × 10⁵ Zellen pro 35-mm-Schüssel im oben beschriebenen Medium und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C in einem 5%igen CO₂-Inkubator.
4. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und inkubieren Sie anschließend mit frischem Medium, das 9 μM RO-3306 und 0,5 mM Ölsäure enthält.
5. Inkubieren Sie die Zellen 20 Stunden unter Standardkulturbedingungen.

4. Entfernung des RO-3306-Reagens aus den synchronisierten Zellen, um in die mitotische Phase zu gelangen

1. Wasche die Zellen (Schritt 3.4) drei- bis fünfmal mit PBS.
2. Wasche die Zellen einmal mit frischem Kulturmedium.
3. Zellen werden 1 Stunde lang in frischem Medium bei 37 °C in einem 5%igen CO₂-Inkubator inkubiert, um den Eintritt in die Mitose zu ermöglichen.
   HINWEIS: Die Entfernung von RO-3306 ermöglicht es synchronisierten Zellen, von der G2/M-Grenze in die mitotische Phase einzutreten. Nach dem Auswaschen des Reagens treten ein erheblicher Anteil der Zellen innerhalb von etwa 1 Stunde in die mitotische Phase ein, während dieser Zeit können mitotische Zellen durch Zellrundung und Chromosomenkondensation identifiziert werden. Der optimale Zeitpunkt zur Beobachtung einer bestimmten Mitosephase kann je nach Zelltyp und Kulturbedingungen variieren.

5. Probenvorbereitung mitotischer Zellen

1. Cellen mit 4 % Paraformaldehyd in PBS für 10 Minuten bei Zimmertemperatur fixieren.
   VORSICHT: Mitotische Zellen neigen dazu, sich von der Schale abzulösen; Vermeiden Sie das Waschen vor der Fixierung.
   HINWEIS: Bei der PLIN3-Färbung wurden die Zellen mit einer Kombination von 2 % Paraformaldehyd und 2 % Glutaraldehyd fixiert.
2. Permeabilisiere fixierte Zellen mit 0,1 % (w/v) Triton X-100 in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
3. Blockzellen mit 1 % (w/v) BSA in PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur.

6. Färbung von LDs und anderen zellulären Organellen

1. Entfernen Sie vorsichtig die Glasdeckfolien aus der Kulturschale mit feinen Pinzetten und legen Sie sie mit der Zellseite nach oben in eine befeuchtete Kammer, um das Austrocknen zu verhindern.
   HINWEIS: Führen Sie alle nachfolgenden Färbungsschritte in einer befeuchteten und lichtgeschützten Umgebung durch, um Fluoreszenzsignale zu erhalten.
2. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und inkubieren Sie mit primären Antikörpern, die in PBS verdünnt sind, eine Stunde lang bei Raumtemperatur.
3. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und inkubieren Sie mit sekundären Antikörpern, die in PBS verdünnt sind, für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
4. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und färben Sie mit einem neutralen lipidfluoreszierenden Farbstoff für 10 Minuten bei Zimmertemperatur.
   HINWEIS: Farbstoffe mit ausgeprägten spektralen Eigenschaften wurden ausgewählt, um eine flexible mehrfarbige Bildgebung zu ermöglichen und spektrale Überschneidungen mit anderen Organellenmarkern zu minimieren.
5. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und färben Sie die Kerne mit einem DNA-bindenden fluoreszierenden Farbstoff (DAPI: Anregung, 350–410 nm; Emission, 420–450 nm), verdünnt 1:1.000 in PBS für 5 Minuten.
6. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und montieren Sie dann die Deckfolien auf Glasträgern mit einem Antifade-Montagemedium, um die Fluoreszenz während der Bildgebung zu erhalten.
7. Versiegeln Sie die Ränder der Deckblätter mit klarem Nagellack, um Austrocknung und Bewegung während der Bildgebung zu verhindern.
   HINWEIS: Da fluoreszierende Signale allmählich verblassen, werden Bilder innerhalb einer Woche nach der Färbung aufgenommen.

7. Beobachtung intrazellulärer Organellen und ihrer subzellulären Lokalisation

1. Erfassen Sie Fluoreszenzbilder mittels Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie, um mehrere Zellen schnell zu screenen und repräsentative Interphasen- und Mitosezellen auszuwählen, wobei niedrige Anregungsintensität und schnelle Aufnahmeeinstellungen verwendet werden, um das Photobleaching zu minimieren.
2. Aufnahme von Bildern der ausgewählten Zellen mit angemessener Vergrößerung für die Fluoreszenzfärbungsanalyse.
   HINWEIS: Interphasenzellen weisen typischerweise einen intakten Einzelkern auf, der zentral im Zytoplasma positioniert ist. Im Gegensatz dazu zeigen mitotische Zellen kondensierte Chromosomen, die in der äquatorialen Ebene der bipolaren Spindel ausgerichtet sind. Diese morphologischen Merkmale können als visuelle Kriterien dienen, um Interphasen- und mitotische Zellen zu unterscheiden.
3. Visualisieren Sie LDs und Kernmorphologie mit geeigneten Filtersätzen für neutrale Lipidfluoreszenzfarbe und einen DNA-bindenden fluoreszierenden Farbstoff mittels der Breitfeld-Fluoreszenzmikroskopie.
   HINWEIS: Wählen Sie Filtersets entsprechend den Spezifikationen des verwendeten Mikroskopsystems aus.
4. Für eine höher aufgelöste Validierung werden Fluoreszenzbilder mit Konfokalmikroskopie aufgenommen, die mit einem hochnumerischen Aperturobjektiv ausgestattet ist (z. B. 60×, NA ≥1.2). Erkennen Sie Fluoreszenzsignale für neutrale lipidfluoreszierende Farbstoffe und einen DNA-bindenden fluoreszierenden Farbstoff mit geeigneten Anregungslasern und Emissionsfiltereinstellungen. Verarbeiten Sie Bilder mit allgemein verfügbarer Bildaufnahme- und Analysesoftware.
   HINWEIS: Je nach Mikroskopsystem können entweder Wasser- oder Öl-Immersionsobjektive verwendet werden. Die Wahl des Immersionsmediums sollte den Empfehlungen des Herstellers und dem experimentellen Zweck folgen. Die Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie eignet sich für routinemäßige Beobachtungen und den Vergleich der LD-Verteilung zwischen Interphasen- und mitotischen Zellen, während eine konfokale Mikroskopie empfohlen wird, wenn eine höhere räumliche Auflösung erforderlich ist.

8. Quantifizierung der Anzahl und Größe der LDs

1. Nehmen Sie Fluoreszenzbilder von Zellen unter identischen Bildaufnahmen für alle Bedingungen auf.
2. Öffnen Sie die aufgenommenen Bilder mit einer Bildanalyse-Software.
3. Setzen Sie geeignete Schwellenwerte zur Identifizierung von LDs ein und führen Sie eine Partikelanalyse durch, um die Anzahl und Fläche der Lipidtröpfchen zu quantifizieren.
   HINWEIS: Bildparameter sollten unter allen Bedingungen konstant gehalten werden, um einen genauen Vergleich von LD-Zahl und -fläche zu gewährleisten.

Ergebnisse

Synchronisation von Hepatomzellen an der G2/M-Grenze mit RO-3306

Um die Dynamik intrazellulärer Organellen während der Mitose zu untersuchen, wurde RO-3306, ein selektiver CDK1-Inhibitor, verwendet, um die Zellen an der G2/M-Grenze^20,21 zu synchronisieren. Wenn Zellen 20 Stunden lang mit dem CDK1-Inhibitor behandelt wurden, gefolgt von weiteren 1 Stunde in einem frischen Medium, waren über 50 % der Zellen an der G2/M-G...

Diskussion

Die beobachtete Umverteilung der LDs während der Mitose deutet darauf hin, dass ihre Positionierung nicht zufällig ist, sondern in Koordination mit der zytoskelettalen Reorganisation und dem Zellzyklusverlauf steht. Insbesondere kann der Ausschluss von LDs aus dem Spindelbereich räumliche Einschränkungen widerspiegeln, die durch mitotische Spindelassemblage oder aktive Transportmechanismen auferlegt sind, die die Organellensegregation während der Zellteilung aufrechterhalten. In dieser S...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,25% Trypsin/EDTA	Wako	201-16945	Zelldissoziation
10 cm Petrischale	Corning	430167	Zellkultur
35 mm Gewebekulturschale	IWAKI	3000-035	Zellkultur
6 cm Gewebekulturschale	IWAKI	3010-060	Zellkultur
Anti-PLIN2 (ADRP) Antikörper	Proteintech	15294-1-AP	Lipidtropfenmarker
Anti-PLIN3 (TIP47) Antikörper	Proteintech	10694-1-AP	Lipidtropfenmarker
Anti-α-Tubulin Antikörper	Sigma-Aldrich	T6199	Mitosespindelmarker
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	Neutrale Lipidfärbung
Flaschenhalsfilter (0,22 μm)	NEST	WNB343001	Sterile Filtration von OA–BSA-Lösung
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A8022	Blocking-Reagenz
Klarlack	Handelsüblich	Nicht zutreffend	Siegel von Objektträgern
Konfokalmikroskop	Olympus	FV1200	Hochauflösende Bildgebung
DAPI	Dojindo	340-07971	Kernfärbung
D-PBS (–)	Wako	049-29793	Zellkultur
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Wako	041-30081	Zellkulturmedium
Ethanol (99,5%)	Wako	057-00456	Lösungsmittel für Ölsäure
Fettsäurefreies BSA	Sigma-Aldrich	A7030	Trägerprotein für Ölsäure
Fetales Rinderserum	Gibco	10270-106	Mediumzusatz
Fluoreszierende Sekundärantikörper (Alexa Fluor–konjugiert)	Handelsüblich	Nicht zutreffend	Artenspezifische Sekundärantikörper für Immunfluoreszenz
FV10-ASW Software	Olympus	Nicht zutreffend	Bilderfassung und -verarbeitung
Glasobjektträger (φ15 mm)	Matsunami	2-176-03	Zellbefüllung für Mikroskopie
Glasmikroskop-Objektträger	Matsunami	SFF-001	Glasscheiben zum Montieren von Objektträgern
Glutaraldehyd (25% ige Lösung)	Wako	073-00536	Alternative Fixierung für PLIN3
HuH7-Zellen	JCRB Cell Bank	JCRB0403	Menschliche Hepatozelllinie
LipidTOX Red Neutral Lipid Stain	Invitrogen	H34476	Alternative Lipidtropfenfärbung
Stickstoffgas (N2)	Handelsüblich	Nicht zutreffend	Verdampfung von Ethanol
Ölsäure	Sigma-Aldrich	O1383	Zur Herstellung von Ölsäure–BSA-Konjugaten
Paraformaldehyd, 4% in PBS	Nacalai Tesque	09154-85	Fixierung
Penicillin–Streptomycin	Gibco	15140-122	Antibiotika
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (×10)	Nicht zutreffend	Nicht zutreffend	Kann durch jeden Anbieter ersetzt werden
RO-3306	Sigma-Aldrich	SML0569	CDK1-Inhibitor für G2/M-Synchronisation
SlowFade Diamond Antifade Mountant	Invitrogen	S36963	Einbettungsmittel
Natriumchlorid (NaCl)	Wako	191-01665	Herstellung von 150 mM NaCl
Natriumhydroxid (NaOH)	Wako	080-01061	Verwendet für die Verseifung von Ölsäure
Tali Cellular Analysis Slides	Thermo	T10794	Verwendet für die Zellzyklusanalyse
Tali Image-based Cytometer	Thermo	Nicht zutreffend	Verwendet für die Zellzyklusanalyse
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Zellpermeabilisierung
Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop	KEYENCE	BZ-9000	Schnelle Untersuchung von mitotischen Zellen