Dreidimensionale Immunlokalisation bei Maismeiocyten

Zusammenfassung

Dieses Immunlokalisationsprotokoll bei männlichen Maismeiozyten erhält während der Meiose die dreidimensionale Integrität der Zellen. Es ermöglicht die dynamische Verfolgung der intrazellulären Lokalisierung von bis zu drei unabhängigen Antikörpern in konserviertem, paraformaldehydfixiertem Material, zusätzlich zu DAPI, das DNA färbt.

Zusammenfassung

Während der meiotischen Prophase I variiert die physikalische Konfiguration der Chromosomen stark zwischen den Entwicklungsstadien, glücklicherweise ermöglichen diese stufenspezifischen Konfigurationen die korrekte Identifikation jedes dieser klassischen meiotischen Stadien, die jeweils als Leptoten (z. B. die 'dünnen Fäden'), Zygoten (z. B. die 'gekoppelten Fäden'), Pachyten (z. B. die 'dicken Fäden'), Diploten (z. B. die 'Doppelfäden') und Diakinese (z. B. die 'Abstoßungsbewegung') bekannt sind. Die visuelle Analyse mehrerer zytogenetischer Phänomene, die während Prophase I auftreten, wie Rekombination, Paarung und Synapse, erfordert äußerst zuverlässige Immunlokalisierungstechniken. Im Gegensatz zu traditionellen Ausbreitungs- und Quetschtechniken, die alle subzellulären und subnuklearen Informationen unterdrücken, ermöglicht das hier beschriebene 3D-Konservierungsverfahren die Erhaltung wichtiger meiotischer Proteine an ihren nativen subzellulären Standorten (zytoplasmatisch, nuklear und subnuklear: Euchromatin, Heterochromatin und nukleolar). So beschreibt dieses Protokoll, wie man meiotische Staubbeutel effizient fixiert, Meiozyten aus Staubbeuteln zerlegt und freisetzt sowie die gleichzeitige Immunlokalisierung von drei Schlüsselproteinen in männlichen Maisozyten durchführen kann.

Einleitung

Meiose ist ein Schlüsselprozess, der die Übertragung von Eigenschaften in Modellpflanzen und -kulturen reguliert; Daher erleichtern einfache mikroskopische Methoden, die eine konsistente und treue Visualisierung der Proteinlokalisierung ermöglichen, das Verständnis, wie diese Eigenschaften effizienter übertragen werden könnten. Leider variiert die Visualisierung der Lokalisierung von Proteinen innerhalb von Meiozyten stark je nach verwendeter Technik ^1,2. Das Ziel des Protokolls ist es daher, eine einfache, reproduzierbare Methode bereitzustellen, die Artefakte während der Beobachtung von Meiozyten eliminiert. So ist beispielsweise seit langem anerkannt, dass die Beobachtung meiotischer Chromosomen ein empfindlicher Prozess ist, der durch das Zerquetschen der Zellen entweder durch einfaches Quetschen oder durch noch störendere Ausbreitungstechniken^(3,4,5) erleichtert wird. Bei Arabidopsis thaliana verwenden Forscher häufig Spreading-Methoden, die Carnoys Fixativ (eine 3:1-Mischung aus Ethanol und Essigsäure) zusammen mit verschiedenen Detergenten wie Lipsol, Tween-20 und TritonX-100 sowie Enzymmischungen mit Cellulase, Pektinase und Cytohelikasen verwenden, um Zellen zu zerlegen und eine effektive Immunlokalisierung auf den kleinen Chromosomen ^1,2 zu ermöglichen. Diese Techniken verwandeln eine 3D-Chromosomenformung in eine 2D, was eine schnelle Beobachtung aller künstlich verteilten Chromosomen in einem einzigen Bild ermöglicht. Bestimmte Merkmale der Chromosomen, die diesen harten Behandlungen standhalten, können offensichtlich sein; sie spiegeln jedoch oft das typische Verhalten von Zellen und Chromosomen in vivo⁶ nicht wider. Eine schnelle und sehr breite Detektion von bis zu zwei Antikörpern ist mit 2D-Ausbreitungstechniken in verschiedenen Pflanzenarten, darunter Mais 7,8,9,10,11, möglich.

Dennoch wird trotz der Bequemlichkeit älterer 2D-Techniken inzwischen anerkannt, dass bestimmte Phänomene empfindlich auf disruptive Methoden reagieren und nicht beobachtet werden können, wenn Zelle, Zellkern oder Chromosomen beim Ausbreiten oder Quetschen beschädigt werden. So wurde beispielsweise die Bewegung des RAD50-Proteins vom Zytoplasma zum Zellzell während der Leptotenphase oder während der Zentromerkopplung (Leptonem/Zygonem) nur in intakten 3D-Meiozyzyten¹² nachgewiesen. Hier erhalten die Leser ein detailliertes 4-tägiges 3D-Protokoll, das Staubbeutel verwendet, die in 4%-Paraformaldehyd fixiert sind, um drei Schlüsselproteine in männlichen Maismeiozyten immunzulokalisieren und so deren strukturelle Integrität zu erhalten. Im Vergleich zu einer ähnlichen Mais-3D-Immunlokalisierungsmethodik⁸ haben wir praktische Anmerkungen und Tipps zur Fehlersuche für Forscher hinzugefügt. Dieses Protokoll wird der Arbeit von Pflanzenbiologen und Pflanzenzüchtern zugutekommen, die daran interessiert sind, verschiedene meiotische Prozesse zu untersuchen, wie etwa die Kontrolle der meiotischen Rekombination durch den synaptonemalen Komplex.

Protokoll

VORSICHT: Formaldehyd und Acrylamid mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und einer chemischen Haube handhaben; Beide sind toxisch (Acrylamid ist vor der Polymerisation auch neurotoxisch). Alle in der Studie verwendeten Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Fixierung von Maisstaubbeuteln zur Erhaltung der intakten Struktur der Meiozyten

1. Verwenden Sie Maispflanzen in der V13-Phase mit noch wachsenden Blütenständen im Stängel. Während der Woche der meiotischen Anther-Fixierung tragen Sie Handschuhe und drücken Sie den vergrößerten Stiel vorsichtig auf die Beule, um festzustellen, ob sie weich genug zum Aufschneiden ist.
   HINWEIS: Dieses Protokoll zur Fixierung und Immunlokalisation kann sowohl für Mais- als auch für Arabidopsis thaliana-meiotische Blütenknospen (weniger als 400 μm) verwendet werden. Im Fall von Mais dauert es jedoch, je nach verwendeter Sorte und Jahreszeit (im Frühjahr wächst schneller), etwa 8 Wochen ab der Pflanzung für die Referenz-Inzuchtlinie B73, aber nur 6 Wochen für die frühblühende Inzuchtlinie A344.
2. Vorbereitung von Puffern.
   HINWEIS: Am Tag vor der chemischen Fixierung bereiten Sie die folgenden Arbeitslösungen vor, machen Sie dies sorgfältig und etikettieren Sie alle Flaschen korrekt.
   1. Bereite 100 ml 10x Buffer A (BA) Salze vor, indem 4,53 g PIPES (Piperazin-N, N′-bis(2-Ethanesulfonsäure) bei einer Endkonzentration von 150 mM), 5,96 g KCl (Endkonzentration 800 mM), 1,17 g NaCl (Endkonzentration 200 mM), 0,74 g EDTA (Endkonzentration 20 mM), 0,19 g EGTA (Endkonzentration 5 mM) und 90 mL H2_{O hinzugefügt}werden, zuerst den pH-Wert mit KOH auf 6,8–7 einstellen, dann die Lautstärke auf 100 mL.
   2. Filtersterilisieren Sie schließlich mit einem Einweg-Rapid-Flow-Sterilfiltergerät mit PES von 0,45 μm Pore (bei 4 °C halten, aber nicht einfrieren; Sie können es mehrere Monate lagern).
   3. Bereiten Sie sich vor:
      -50 mM ROHRE (pH-Wert auf 7 mit KOH eingestellt).
      - Sperminbestände mit einer Konzentration von 0,4 M (zuvor gelöst in 50 mM ROHREN, pH-Wert mit KOH auf 7 eingestellt, Aliquoten von 50 μL bei -20 °C behalten).
      - Bestände von Spermidin in einer Konzentration von 0,4 M (gelöst in 50 mM ROHREN, mit pH-Wert auf 7 und KOH, gefrorene Aliquoten von 125 μL bei -20°C aufbewahren).
      - Bestände von Dithiothreitol (DTT) 1 M (gelöst in 0,01 M Natriumacetat, pH 5,2, gefrorene Aliquoten von 100 μL bei -20 °C).
      - Sorbitol 2 M, bei 4 °C gehalten.
3. Bereiten Sie 50 ml 2x Buffer A (BA) auf Eis vor, verwenden Sie 10 ml 10x Puffer-A-Salze (bei 4 °C gehalten), 50 μL Spermin (0,4 M in 50 mM ROHREN, mit pH-Wert auf 7 mit KOH), 125 μL Spermidin (0,4 M in 50 mM ROHREN, mit pH-Wert auf 7 mit KOH), 100 μL DTT (1 M in 0,01 M Natriumacetat, pH 5,2) wirbeln energisch, um sich aufzulösen; und nicht erhitzen.
   1. Dann fügen Sie 16 ml 2 M Sorbitol hinzu. Stellen Sie das Endvolumen mit sterilem Wasser auf 50 mL ein. Filtersterilisieren Sie mit einem Einweg-Rapid-Flow-Sterilfilter und lagern Sie bei 4 °C.
4. Bereiten Sie eine feuchte Kammer aus 5–10 befeuchteten Papiertüchern vor, die in eine Plastikbox gelegt werden. Überprüfen Sie, ob der Deckel gut abschließt. Beseitigen Sie überschüssiges Wasser.
5. Dann werden folgende Gegenstände in ein Tablett gelegt: die feuchte Kammer, eine Rasierklinge, feine Pinzette (zuvor sterilisiert mit 70 % Ethanol), eine kleine Flasche steriles Wasser und Malerband. Bringen Sie das Tablett und seinen Inhalt zu den Maispflanzen, die in Schritt 1.1 überprüft sind.
6. Mit einer Rasierklinge schneiden Sie den unebenen Stängel auf Höhe des Blütenstandes auf. Die Hauptquastenzweige sowie die seitlichen Zweige des Blütenstands können zur Ernte meiotischer Blüten verwendet werden.
   HINWEIS: Diese Quastenzweige enthalten die Blüten, die zum Sammeln meiotischer Staubbeutel interessant sind. Jede Blüte enthält sechs Staubbeutel, und die drei oberen, größeren werden typischerweise für die Analyse verwendet. Die ungefähre Größe und Farbe der Staubbeutel korrelieren mit jedem meiotischen Stadium. Fast transparente Staubbeutel von etwa 1 mm Länge befinden sich im Leptotenstadium, durchscheinende Staubbeutel von 1,5 mm Länge befinden sich im Zygotenstadium, weißliche Staubbeutel von 2 mm Länge befinden sich im Pachytenstadium, und gelbliche Staubbeutel von > 2 mm Länge können Meiocyten am Diploten, Tetraden und Pollenkörner enthalten, die die Gametogenese abschließen. Beachten Sie, dass eine weitere Längenstufenkorrelation zwischen Mais-Genetik variieren kann und dass Umweltfaktoren (z. B. hohe Temperatur) die meiotische Entwicklung beschleunigen und diese Beziehung verändern können. Es wird empfohlen, dass Forscher weitere Größenstufenkorrelationen für jeden spezifischen Maisgenotyp und jede Wachstumsbedingungen validieren (mittels Acetocarmin-Squashing, vgl. 1.6).
7. Verwenden Sie feine Pinzette, um die seitlichen Zweige der Blütenstände zu zerschneiden und sorgfältig zu sammeln und sie in das Papiertuch der feuchten Kammer zu wickeln.
   HINWEIS: Mit etwas Übung ist nur ein kurzer, linearer Schnitt von 3–4 cm im Stängel erforderlich, um die Äste der meiotischen Quaste zu entfernen. Sie können diesen Schnitt schließen, indem Sie ihn drei- bis viermal mit Standard-Malerband umwickeln, sodass Sie später dieselbe Pflanze mit dem verbleibenden, nicht dissektionierten Blütenstand ernten können. Gewebe wächst weiter und kann später zur Bestäubung genutzt werden.
8. Halte die Kammer bei Zimmertemperatur. Verwenden Sie nur jene Äste des Blütenstands, die Blüten enthalten, die im meiotischen Stadium Staubbeutel tragen. Achten Sie darauf, die Äste mit der Hälfte der feuchten Handtücher zu bedecken, aber tauchen Sie sie nicht in Wasser.
9. Befeuchte erneut, wenn die Handtücher trocken sind. Schließen Sie die Schachtel bis zur Zerlegung der Staubbeutel, vorzugsweise bis 30 Minuten vor Beginn der Anthersammlung.
10. Mit einem binokularen Stereomikroskop mit kalibrierter Skala werden frische Staubbeutel aus den Blüten in 2 ml 1x BA in einer 35 mm Petrischale gesammelt und so eine genaue Identifikation der meiotischen Stufen anhand von Antwortgröße und -farbe gewährleistet.
    HINWEIS: Um das Meiozytenstadium in den beprobten Staubbeuteln genau zu bestimmen, wird einer von drei synchronisierten Staubbeuteln pro Floret schnell mit 3:1 Ethanol-Essigsäurefixierung, Acetocarmin-Färbung und traditioneller Squashmikroskopie¹³ analysiert.
11. Bereite das 4%ige Formaldehydfixativ in 1x BA und 0,0025% Tween-20 vor.
    HINWEIS: Für 3 ml fügen Sie 750 μL Formaldehyd 16 %, 750 μL H₂O, 1,5 mL 2x BA und 7,5 μL Tween-20 bei 1 % hinzu.
12. Entferne den initialen BA-Puffer und gib die 3 ml dieser frischen Fixationslösung zu den gestuften Staubbeuteln und lasse sie 45 Minuten in einer neuen 35-mm-Petrischale fixieren, die mit Parafilm versiegelt ist, um die Verdunstung von Formaldehyd zu verhindern, und dann auf eine größere Petrischale auf einem Rotationsschüttler (eingestellt auf 40–60 U/min), oder 0,2 x g). Mach es bei Zimmertemperatur. Staubbeutel sollten leicht wirbeln für eine gute Fixierung. Sie schwimmen meist an der Oberfläche.
13. Spülen Sie mit 3 ml 1x BA ab, übergeben Sie die Probe dann in eine kleine Petrischale und legen Sie sie 45 Minuten lang auf einen Rotationsschüttler (40–60 U/min) bei Raumtemperatur.
14. Mit einer sauberen Zange überträgt man die Staubbeutel in eine kleine 35 mm Petrischale mit frischem 3 ml 1X BA. Verschließen Sie die Petrischuffel fest mit Parafilm. Dann bewahren Sie die kleine Petrischale in einer Petrischale, decken Sie sie mit Alufolie ab, um sie im Dunkeln zu halten, und stellen Sie sie bis zur Verwendung bei 4 °C auf. Sie können es bei Bedarf mehrere Monate lagern.

2. Einbettung von Maismeiozyten in Polyacrylamid-Sandwichpads

TAG 1: 3D-Dias Vorbereitung

1. Bereite 2 ml Acrylamidlösung vor, indem du gleiche Mengen (1:1) Acrylamid und 2x BA mischst. Vor der Zugabe von Natriumsulfit (NaS) und Ammoniumpersulfat (APS) entgasen Sie die Acrylamidlösung im Vakuum für 5–10 Minuten.
2. Aliquot das Acrylamid und das 2x BA 1:1-Verhältnis mischen sich durch Pipettieren von 100 μL in 1,5-mL-Röhren.
   Die Anzahl der Röhren, die du vorbereitest, hängt von der Anzahl der Objektträger ab, die du vorbereiten wirst.
3. Mach 1 ml 1x BA.
4. Legen Sie 2 cm x 2 cm große Parafilmstücke über eine Petrischale und legen Sie sie dann unter ein Seziermikroskop. Pipette 50 μL BA-Lösung mit Staubbeuteln auf Parafilm. Schneiden Sie die Pipettenspitze mit einer Schere ab, um die Übertragung zu erleichtern.
   1. Pipette 25 μL BA-Lösung auf einen anderen Parafilm.
5. Mit einer Pinzette, um Staubbeutel zu halten, schneidet die Spitze der Staubbeutel mit einem Skalpell ab und drückt die Meiozyten vorsichtig heraus. Mit einer Pipette werden die Meiozyten vorsichtig auf den 25 μL BA-Tropfen übertragen und vorsichtig vermischt.
6. Pipette 10 μL vom Meiozyten-Gemisch auf eine separate Deckschicht.
7. Pipettieren Sie schnell 5 μL mit 20 % (0,2 g/1 ml) NaS und 5 μL 20 % (0,2 g/1 mL) APS in ein 1,5 mL Rohr mit Acrylamid/2x Puffer A.
8. Schnell mischen Sie 5 μL der oben genannten Variante auf einen Deckglier und mischen Sie sich mit den Meiozyten. Legen Sie einen mit Poly-L-Lysin versehenen Deckel oben drauf, drehen Sie ihn jedoch um 45 Grad. Nur ein Poly-L-Lysin-Deckdeckblatt (entweder kommerziell gewonnen oder hergestellt, indem Überdeckblätter in eine Poly-L-Lysinlösung in einer Petrischale für einige Minuten eingetaucht und am Rand einer neuen, sauberen Petrischale getrocknet werden) hilft die Freisetzung eines vollständigen Polsters nach der Polymerisation. Der Deckdeckel wird schnell aus der Lösung gehoben und vor der Verwendung getrocknet. Für Super-Auflösungsmikroskopie müssen Hochleistungs-Coverslips mit standardisierter Dicke (≤170 nm)¹⁴ verwendet werden.
9. Bitte berühren Sie die Deckfolien 30–50 Minuten lang nicht, um eine vollständige Polymerisation der Probe bei Raumtemperatur zu ermöglichen (ein schnellerer Polymerisationsprozess verringert die Trocknungszeit des Pads, und die resultierende Qualität ist weniger als optimal).
10. Wiederholen Sie die Schritte '2,6–2,9' für jede Folie, die Sie vorbereiten möchten.
11. Trennen Sie alle Überdeckfolien sorgfältig mit einer Rasierklinge. Lege alle Überdeckfolien, mit der Pad-Seite nach oben, auf ein Polyacrylamid-Pad (oder den Großteil des Pads) auf eine 6-Well-Platte.
12. Waschen Sie jeden Deckdeckel mit einem Pad mit 2 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 10 Minuten. Wiederholen Sie diese Waschzeit einmal mit einer Gesamtwaschzeit von 20 Minuten bei Zimmertemperatur.
13. Bereite 50 mL vor, indem du 49,4 mL PBS 1x, 100 μL EDTA 0,5 m und 500 μL Triton mischst.
14. Spülen Sie jeden Deckdeckel mit einem Pad in 1 ml dieses 1x PBS, ergänzt mit 1 mM EDTA und 1 % Triton für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
15. Bereiten Sie eine frische Charge Blockpuffer vor, die 1x PBS, 1 mM EDTA, 0,1 % Tween-20 und 3 % BSA (1 mL pro Objektträger) enthält. Für 50 ml Blockpuffer mischen Sie 44 ml PBS 1x, 100 μL EDTA 0,5 M, 5 ml 1% Tween-20-Lösung und 1,5 g BSA. BSA wird als Blockiermittel gegenüber Eselserum bevorzugt, da es hilft, unspezifische Signale bei Verwendung mehrerer primärer und sekundärer Antikörper zu minimieren.

3. Immunlokalisationen

1. Bereiten Sie primäre Antikörper (oder Antikörper) bei der gewünschten Verdünnung mit Blockpuffer vor. Kombinieren Sie primäre Antikörper basierend auf ihrer Fähigkeit, bei gemeinsamer Verwendung unterschiedliche Signale zu erzeugen. Sie sollten von verschiedenen Organismen stammen, wie Kaninchen, Ratte, Meerschweinchen oder Huhn, die durch spezifische, fluoreszenzmarkierte sekundäre Antikörper erkannt werden können. Die Verwendung von Esel- oder Ziegenantikörpern wird vermieden, da sie als sekundäre Antikörper gedacht sind. Wir empfehlen die Verwendung einer einzelnen Art sekundärer Antikörper (z. B. Ziege im in Abbildung 1 gezeigten Experiment).
2. Fügen Sie 50 μL dieses verdünnten primären Antikörpers mit einem Pad in die Mitte jedes Deckmantels hinzu.
   Fügen Sie Wasser zwischen die Brunnen hinzu, um die Verdunstung zu verlangsamen. Stellen Sie den Teller in eine feuchte Kammer (eine Plastikbox mit Deckel). Über Nacht weggehen.

TAG 2: Waschen

3. Bereiten Sie 500 mL Wash Buffer vor (1x PBS + 0,1 % Tween-20 + 1 mM EDTA).
4. Entferne die Übernachtlösung aus den Brunnen durch Aspiration mit deiner Pipette.
5. Wasche jeden Deckel schnell zweimal mit einem Pad und 1 ml Waschpuffer und entferne ihn dann aus den Brunnen.
6. Pipettiere einen weiteren 1 mL Deckdeckel mit Pad und lasse ihn 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen.
   Wiederhole das noch 7 Mal. (insgesamt 8 Stunden)
7. Nach der letzten Wäsche geben Sie Wasser zwischen den Brunnen, decken Sie die Platte ab und lassen Sie sie über Nacht in einer feuchten Kammer stehen.

TAG 3: Sekundäre Antikörper, Waschungen und Montage von Objektträgern

8. Bereiten Sie die sekundären Antikörper vor, indem Sie jeden im Verhältnis 1:50 im Blockpuffer verdünnen.
   Aspiriere die Waschlösung. Geben Sie 50 μL des verdünnten sekundären Antikörpers mit einer Pipette auf die Mitte jedes Pads ab.
   HINWEIS: Jeder sekundäre Antikörper sollte in Verbindung mit unterschiedlichen fluoreszierenden Farbstoffen mit nicht überlappenden Emissionswellenlängen verwendet werden. Zum Beispiel sollte ein sekundärer Antikörper mit AlexaFluor488 (grün) markiert werden, der nächste mit AlexaFluor555 (orange) und der dritte mit AlexaFluor647 (weit rot), das mit DAPI (Anregung bei 461 nM, blau) kombiniert werden kann. Andere fluoreszierende Farbstoffe wie DyLight (von Dyomics GmbH) sind ebenfalls nutzbar. Außerdem sollten all diese sekundären Antikörper nicht mit anderen Spezies kreuzreagieren, die in der Mischung der primären Antikörper verwendet werden. Zum Beispiel sollte der Antikaninchen-Sekundärantikörper kreuzangepasst werden, um selektiv auf Kaninchenantikörper zu sein und weder Ratten- noch Meerschweinchen-Antikörper zu erkennen. Das Gleiche gilt für alle sekundären Antikörper. Ein gut konzipiertes Experiment sollte verwendet werden, um all diese Anforderungen gleichzeitig bei Co-Immunlokalisierungen zu validieren.
9. Wasser zwischen die Brunnen geben, eine Platte in die feuchte Kammer legen und sie 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehen lassen.
10. Aspiriere die Lösung aus den Brunnen.
11. Führen Sie vier Waschgänge mit 1 ml pro Brunnen durch, jeweils 1 Stunde bei Raumtemperatur (insgesamt 4 Stunden).
12. Wasche jeden Brunnen mit 1 ml 1x PBS für 10 Minuten bei Zimmertemperatur und wiederhole diesen Vorgang noch zweimal. (insgesamt 30 Minuten)
13. DAPI in 1x PBS verdünnen.
14. Färben Sie mit einer Endkonzentration von 1 μg/mL DAPI (DAPI-Pulver gelöst in Wasser) für 30 Minuten bei Raumtemperatur und platzieren Sie 500 μL/Bohrl.
15. Entferne ProLong™ Gold Antifade aus dem 4 °C Gefrierfach, damit es auftauen und Raumtemperatur erreicht.
16. Wasch-Folien in 1x PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 1 ml pro Bohrloch verwenden. Mach es noch einmal zweimal. (1 Stunde 30 Minuten insgesamt)
17. Entferne die letzte Wäsche.
18. Dann geben Sie zwei Tropfen ProLong™ Gold Antifade in die Mitte jedes Pads.
19. Befestige Deckelschlitze an jedem Schlitten, beschrifte jeden, hebe die Abdeckungsschlitze mit feinen Zangen aus dem Schacht und lege sie langsam auf den Schlitten. Mit feiner Pinzette senkt man langsam einen zweiten Deckdeckel auf den ersten. Entfernen Sie mit einem Vakuum überschüssiges Glycerol an den Rändern der Überdeckfolien. Versiegeln Sie die Ränder der Überdeckfolien mit zwei Schichten Nagellack.
20. Wenn Objektträger nicht sofort unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht werden. Bewahren Sie sie in einem -20 °C Gefrierschrank auf, geschützt vor Licht, bis zur Beobachtung. Später lassen Sie die Objektträger 1 Stunde lang in einer Objektträgerbox, horizontal und im Dunkeln, bei Raumtemperatur stehen, um Kondensation zu verhindern.

TAG 4: Mikroskopische Beobachtungen

21. Beobachtet den Slide unter den richtigen Anregungswellenlängen und Filtern. Die Standard-Konfokalmikroskopie ist ausreichend, aber es ist ratsam, ein Mikroskop mit 60-fachem Objektiv zu verwenden, um eine dreidimensionale Abbildung der gesamten Zelle mit einem Z-Stack alle 0,2 μm zu ermöglichen, mit sequentiellen Bildaufnahmen und Dekonvolutionsverarbeitung mit der Software Applied Precision SoftWoRx^® .

Ergebnisse

Mit diesem Protokoll können wir gleichzeitig die Lokalisationsmuster der drei wichtigsten meiotischen Proteine im Mais beobachten (Abbildung 1). Das meiotische Protein ABSENCE OF FIRST DIVISION 1 (AFD1) ist ein Homolog der Alpha-Kleisin-REC8-Untereinheit des meiotischen Cohin-Komplexes. Das ASYNAPTIC 1 (ASY1) ist ein entscheidendes axiales Element, während das ZYPPER1 (ZYP1) das transversale Element des synaptonemalen Komplexes¹⁵ ist....

Diskussion

Dieses Protokoll bietet einen entscheidenden Vorteil gegenüber anderen, da es wesentliche dreidimensionale Daten zur Belastung meiotischer chromosomaler Proteine bewahrt. Diese Merkmale können mit regulären Spreizungstechniken ^1,2 nicht erhalten bleiben. Dennoch hat dieses Protokoll zwei Einschränkungen: Es ist langsam und technisch anspruchsvoll im Vergleich zu regulären Spreiztechniken, die innerhalb eines Tages durchgeführt we...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1.5 mL Microtubes Axygen	Corning	MCT-150-C
15 mL Falcon Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
50 mL Falcon Tubes	Thermo Fisher Scientific	339652
6-Well-Plate Falcon Polystyrene Microplate	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B
Essigsäure, 60%	Thermo Fisher Scientific	A38-212
Acrylamide 30%  und Bis-Acrylamide-Lösung, 29:1	Biorad	1610157
Aluminium-Falte	Reynolds	U07211R0
Ammonium-Persulfat (APS)	Merck	A3678
Binokulares Stereomikroskop	N.A.	N.A.
Bovines Serumalbumin (BSA)	Merck	A9418
DAPI	Merck	D9542
DelltaVision Mikroskop	Olympus	N.A.
Destilliertes H2O	N.A.	N.A.
Einweg-Filtereinheiten mit PES-Filtern von 0,45 µm Pore	Thermo Fisher Scientific/Nalgene	09-740-63B
Feinpinzette FST Dumont SS	Fine Science Tools	11200-33
Ziegen (IgG H+L) hoch kreuzadsorbiert  Anti-Ratte, markiert mit AlexaFluor647	Invitrogen	A-21247
Ziegen (IgG H+L) hoch kreuzadsorbiert Anti-Kanin, markiert mit AlexaFluor568	Invitrogen	A-21428
Ziegen (IgG H+L) hoch kreuzadsorbiert Anti-Meerschweinchen, markiert mit AlexaFluor488	Invitrogen	A-11073
Handschuhe	Merck	Z412392
Wachstumskammern / Gewächshaus / oder Feld	N.A.	N.A.
DTT	Merck	D0632
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
Masking Tape 3M	Fisher Scientific	19-047-259
Maissamen	N.A.
Mikroskop 22 x 22 mm-1,5 Glas-Deckgläser	Fisher Scientific	12-542-B
Mikroskop 22 x 22 mm-H Deckgläser	Deckgläser, Zeiss	474030-9020-000
Mikroskopische Glasträger	Fisher Scientific	22-230-900
Mikroskop-Schieberkasten	Fisher Scientific,	03-448-9
Mikropipetten P20, P200, P1000	Merck	CLS4069
NaCl	Merck	S7653
Nagellack	Electron Microscopy Science	72180
Papiertücher	Merck	Z188956
Parafilm	Merck	P7668
Paraformaldehyd 16% Lösung	Electron Microscopy Grade	15710
PBS	Merck	P4474
Plastikbox mit Deckel	Tupperware	N.A.
Poly-L-Lysin	Merck	P4707
Primärantikörper (Ratte anti-ZmAFD1, Kanin anti-ZmASY1, Meerschweinchen anti ZmZYP1)	N.A.
Prolong Antifading	Molecular Probes	P36934
Petrischale (D x H: 35 mm x 10 mm	Corning	351008
Petrischale reguläre Größe	Merck	P5731
PIPES	Merck	P1851
Pipettenspitzen (0,5-10 uL) steril	Merck/Corning	AXYT300
Pipettenspitzen (200 uL) steril	Merck/Corning	AXYT200Y
Pipettenspitzen (1000 uL) steril	Merck/Corning	AXYT1000BRS
Rasierklinge - einschneidig	Fisher Scientific	12-640
Rückschüttel-Schüttler	N.A.	N.A.
Spermin	Merck	85590
Spermidin	Merck	S2626
Sorbitol	Merck	S8143
Tween-20	Merck	P9416
Triton X-100	Fisher Scientific	9002-93-1
Ultrareines Acrylamid	Invitrogen	15512023
Vakuum