Vitamin-C-unterstützte Fenton-Oxidation verbessert die oxidative Tötung von Helicobacter pylori in vitro

Zusammenfassung

Diese Studie untersucht, wie Vitamin C das kinetische Verhalten einer Fenton-Reaktion unter in-vitro-Bedingungen moduliert. Chemische Farbstoffsonden und bakterielle Tests zeigen, dass eine kontrollierte Vitamin-C-Dosierung das oxidative Verhalten der Reaktion verändert und mit einer erhöhten antibakteriellen Wirkung gegen Helicobacter pylori in einem vereinfachten Modellsystem assoziiert ist.

Zusammenfassung

Die Helicobacter pylori-Infektion bleibt eine große globale Gesundheitsbelastung, und die zunehmende Prävalenz von Antibiotikaresistenzen unterstreicht die Notwendigkeit alternativer antibakterieller Strategien. Diese Studie untersuchte, ob die Vitamin-C-Dosierung die Fenton-Oxidation modulieren und die oxidative antibakterielle Wirkung gegen H. pylori unter definierten sauren In-vitro-Bedingungen steigern kann. Die oxidative Aktivität wurde unter Verwendung der Säure-Orange-7-Entfärbung als indirekter chemischer Auswertung und eines Terephthalsäure-Fluoreszenz-Tests als relativer Indikator für die Bildung von hydroxylradikal-assoziierten Produkten in Eisenperoxid-Reaktionen mit Vitamin C bewertet. Die antibakterielle Wirksamkeit wurde durch die Exponierung standardisierter H. pylori bewertet Suspensionen in harnstoffhaltiger Kochsalzlösung bei pH-Wert 3 zu Wasserstoffperoxid und Eiseneisen, mit oder ohne schrittweise Vitamin-C-Supplementierung, gefolgt von koloniebildender Einheitsaufzählung. Die Vitamin-C-Supplementierung veränderte die oxidativen Werte und war mit größeren Reduktionen lebensfähiger Bakterien im Vergleich zur herkömmlichen Fenton-Chemie verbunden. Rettungsexperimente mit Deferoxamin und Thiourea schwächten die antibakterielle Wirkung, was die Hypothese stützt, dass die antibakterielle Aktivität mit eisenvermittelten und radikal-bezogenen oxidativen Prozessen assoziiert ist. Live/Dead Fluoreszenzfärbung und Rasterelektronenmikroskopie lieferten qualitative visuelle Beobachtungen, die mit den Ergebnissen der Koloniebildungseinheit (CFU) übereinstimmen. Zusammen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass eine kontrollierte Vitamin-C-Dosierung Fenton-basierte oxidative Reaktionen modulieren und die antibakterielle Wirkung gegen H. pylori in einem vereinfachten, sauren In-vitro-Modell steigern kann.

Einleitung

H. pylori, ein gramnegatives Bakterium mit spiralförmiger Form, das zur Gattung Helicobacter gehört, wurde durch Populationsgesundheitsstudien gezeigt, dass es eine hohe Prävalenz von Infektionen in geografischen Gebieten, Geschlecht und Alter aufweist, mit einer globalen Prävalenzrate von etwa 50 ^%. Die Internationale Agentur für Krebsforschung (IARC) hat H. pylori als Karzinogen der Gruppe 1 eingestuft und damit seine starke Verbindung zu Magenkrebs und mukosaassoziiertem lymphoidem Gewebe (MALT) unterstreicht. Derzeit basiert die klinische Behandlung der H. pylori-Infektion hauptsächlich auf pharmakologischen Regimen. Die am umfangreichsten untersuchten Wirkstoffe sind Protonenpumpenhemmer (PPIs), die die Magensäuresekretion unterdrücken; Bismutverbindungen, die die Wirksamkeit der Antibiotika erhöhen; sowie Antibiotika wie Amoxicillin, Clarithromycin und Metronidazol. Allerdings hat sich gezeigt, dass die Monotherapie für eine vollständige Ausrottung nicht ausreicht, was zur weit verbreiteten Anwendung von Kombinationsregimen führt, die allgemein als Dreifachtherapie bezeichnet werden. Dieser Ansatz besteht typischerweise aus einem PPI, Clarithromycin und entweder Amoxicillin oder Metronidazol, das etwa zwei Wochen lang verabreicht^wird. Mit der zunehmenden Prävalenz antibiotikaresistenter H. pylori-Stämme ist die Wirksamkeit der Dreifachtherapie deutlich zurückgegangen, was zur Einführung einer vierfachen Therapie mit PPI, Bismut und^{zwei Antibiotika} führte. Dennoch sind diese Regime weiterhin grundlegend auf Antibiotika angewiesen, und Antibiotikaresistenz bleibt eine große Herausforderung im klinischen Management ^4,5. Folglich hat die Erforschung alternativer, antibiotikaunabhängiger antibakterieller Strategien wachsendes Interesse geweckt.

Über ihre direkten pathologischen Auswirkungen hinaus wurde die H.-pylori-Infektion auch mit Veränderungen der Magenmikronährstoff-Homöostase in Verbindung gebracht. Klinische und epidemiologische Studien haben verringerte Vitamin-C-Konzentrationen im Magensaft und Serum infizierter Personen^berichtet, was mit schleimhautartiger Entzündung, beeinträchtigter Sekretion oder erhöhter oxidativer Konsumaufnahme zusammenhängen könnte ^7,8,9. Parallel dazu wurde eine H.-pylori-Infektion durch verschiedene Mechanismen mit Eisenmangel in Verbindung gebracht, darunter eine verringerte Magensäure, eine beeinträchtigte Eisenaufnahme in der Ernährung und bakterielle Konkurrenz um verfügbares^Eisen-10. Diese Beobachtungen heben das komplexe biochemische Umfeld hervor, das mit einer H.-pylori-Infektion einhergeht, und unterstreichen die Bedeutung von Redox- und Eisen-bezogenen Prozessen bei sauren, magischen Bedingungen.

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) haben aufgrund der oxidativen Eigenschaften dieser Spezies großes Interesse an der antimikrobiellen Forschung erregt. ROS bezeichnet eine Klasse chemisch reaktiver Moleküle, die während der partiellen Reduktion von Sauerstoff gebildet werden, wie Superoxidanion (O₂•⁻), Wasserstoffperoxid (H₂O₂), Singlet-Sauerstoff (¹O₂) und Hydroxylradikale (•OH), unter anderem. In biologischen Systemen sind ROS umfangreich am normalen physiologischen Stoffwechsel beteiligt und für vielfältige zelluläre Regulationsaktivitäten^{unerlässlich 11}. Bemerkenswert ist, dass zahlreiche Studien gezeigt haben, dass eine übermäßige ROS bakterielle Zellmembranen durch Lipidperoxidation zerstören kann, was zu Veränderungen der Membranstruktur und -funktion führt und letztlich zur bakteriellen Inaktivierung¹² führt. Dementsprechend haben ROS-basierte antimikrobielle Ansätze Interesse als potenzieller Weg zur Untersuchung nicht-antibiotischer antibakterieller Wirkungen gegen H. pylori 13,14,15,16 geweckt. Unter verschiedenen ROS-Erzeugungsmethoden hat die Fenton-Reaktion für ihre hocheffiziente Radikalproduktion erhebliche Aufmerksamkeit erregt. Die Fenton-Reaktion ist ein fortgeschrittener Oxidationsprozess¹⁷, bei dem Eisenionen (Fe²⁺) unter sauren Bedingungen mit H₂O₂ reagieren, um Hydroxylradikale (•OH) zu bilden, die ein starkes oxidatives Potenzial besitzen und intrazelluläre Biomoleküle oxidieren können.

Fe²⁺ +H→Fe³⁺+•OH+OH^-

Fe³⁺+ H→Fe²⁺+•OOH+ H⁺

H₂O→OH+•OOH+H₂O

Konkret unterzieht H₂O₂ bei einem pH-Wert von etwa 2,8–4,5 eine katalytische Zersetzung durch Fe²⁺, wodurch •OH entsteht, während Fe²⁺ zu Fe³⁺ oxidiert wird. Fe³⁺ reagiert dann mit H₂O₂, um Fe²⁺ zu regenerieren, wodurch ein Fe²⁺/Fe³⁺ Redoxzyklus entsteht, der die kontinuierliche ROS-Produktion¹⁸ aufrechterhält. Die Reduktion von Fe³⁺ auf Fe²⁺ verläuft jedoch relativ langsam, stellt den Geschwindigkeitsbegrenzungsschritt dar und verringert folglich die Gesamteffizienz der Fenton-Reaktion. Studien zeigen, dass die Einführung eines geeigneten Reduktionsmittels in das Fenton-Reaktionssystem die^Fe-2⁺-Reduktion auf Fe²⁺ beschleunigen kann, wodurch die ROS-Erzeugung verbessert wird. Vitamin C hat eine kontextabhängige Redox-Rolle. In eisenhaltigen Systemen kann es die^Fe-2⁺-Reduktion auf Fe²⁺ fördern und so das Fenton-Cycling unterstützen, während es bei höheren Konzentrationen oder unter anderen Reaktionsbedingungen auch als Antioxidans oder^{Radikal-Scavender 19} wirken kann.

Auf diesem Hintergrund untersucht die vorliegende Studie ein Vitamin-C-unterstütztes Fenton-Reaktionssystem als chemisch abstimmbaren Ansatz zur Modulation der oxidativen Aktivität unter definierten sauren in-vitro-Bedingungen ^20,21. Vitamin C wurde als Reduktionsmittel eingesetzt, um die^Fe-2⁺-Regeneration zu erleichtern und damit das effektive oxidative Verhalten der Fenton-Reaktion zu verändern. Das hier verwendete experimentelle System war ein vereinfachtes Modell für saure Kochsalzlösung und Harnstoff und sollte nicht die physiologische Magenmikroumgebung vollständig reproduzieren, die Schleim, Pufferkomponenten, Wirtszellen, Immunfaktoren und verschiedene organische Substrate enthält. Innerhalb dieses kontrollierten Modells wurde die oxidative Aktivität mittels chemischer Anzeigen charakterisiert und parallel zu bakteriellen phänotypischen Reaktionen bewertet, was eine experimentelle Grundlage für die Untersuchung ROS-assoziierter antibakterieller Effekte gegen H. pylori in vitro liefert.

Protokoll

Ethikerklärung
Diese Studie war eine in-vitro-bakterielle Studie und umfasste weder menschliche Teilnehmer, Tierprobanden noch von Patienten stammende Materialien. Daher waren keine Genehmigung des institutionellen Prüfungsausschusses und der Tierethikgenehmigung erforderlich.

Bewertung des AO7-Abbaus im vitamin-C-unterstützten Fenton-System
Um die Wirkung von Vitamin C auf das beobachtbare oxidative Verhalten der Fenton-Reaktion zu bewerten, wurde die Säure-Orange-7-(AO7)-Degradation als indirekter chemischer Auswerter der oxidativen Aktivität verwendet. Dieser Test quantifiziert nicht gezielt einzelne reaktive Sauerstoffspezies. Ich habe 100 ml AO7-Lösung mit 5 mg/L vorbereitet und die Lösung auf pH 3 angepasst. H₂O₂ und FeSO₄ wurden zu den Endkonzentrationen von 2,2 mM bzw. 0,055 mM hinzugefügt. Vitamin C wurde entweder als einzelner Bolus bei Reaktionsinitiation oder in einem dreistufigen Dosierungsschema hinzugefügt. Für das Dosis-Antwort-Experiment wurden Vc:Fe²⁺ molare Verhältnisse von 0, 0,12, 0,24, 0,48, 2, 4, 6 und 8 verwendet, was den endgültigen Vitamin-C-Konzentrationen von 0, 0,0066, 0,0132, 0,0264, 0,110, 0,220, 0,330 bzw. 0,440 mM entspricht, wenn FeSO₄ bei 0,055 mM verwendet wird. Für die Drei-Schritt-Additionsbedingung wurde die gleiche Gesamtmenge Vitamin-C in drei gleich große Aliquots geteilt und ein Aliquot 3, 5 und 7 Minuten nach Reaktionsbeginn hinzugefügt. Zum Beispiel wurde bei einem Vc:Fe²⁺-Verhältnis von 0,48 Vitamin C bei 0,0088 mM pro Aliquot hinzugefügt, was eine Endkonzentration von 0,0264 mM ergab.

Die Reaktionslösung wurde 10 Minuten lang kontinuierlich im Dunkeln gerührt, während die Temperatur unter 30 °C gehalten wurde. Vor und nach der Reaktion wurden 2 ml Proben entnommen. Die Absorption wurde bei 483 nm mit einem UV-Vis-Spektrophotometer gemessen und die AO7-Abbaurate mit Gleichung 1 berechnet:

Abbaurate (%) = [(A₀ − A₁) / A₀] × 100 % (1)

Hier steht A₀ für die Absorption der Probe vor der Reaktion, während A₁ die Absorption der Probe nach der Reaktion darstellt.

Bewertung des •OH-assoziierten Fluoreszenzsignals mit einer TA-Sonde
Um hydroxylradikal-assoziierte Fluoreszenzsignale unter denselben sauren, in vitro verwendeten Bedingungen wie in den antibakteriellen Experimenten zu bewerten, wurde ein zellfreies chemisches System mit Dinatriumterephthalat (TA, 1 mM) als Fluoreszenzsonde etabliert. Dieser Test wurde als relativer Indikator für •OH-assoziierte Produktbildung verwendet und nicht als absolute Quantifizierung der Hydroxylradikalerzeugung interpretiert. Sieben Gruppen wurden eingeschlossen: (1) Blank (1 mM TA nur im Reaktionspuffer), (2) H₂O₂ allein, (3) Fe²⁺ allein, (4) Vc allein (schrittweise Addition), (5) konventionelles Fenton (Fe²⁺ + H₂O₂), (6) vitamin-C-unterstütztes Fenton mit bolus-Vc-Addition (Fe²⁺ + H₂O₂ + Vc, Bolus) und (7) Vc-unterstütztes Fenton mit schrittweiser Vc-Addition (Fe²⁺ + H₂O₂ + Vc, schrittweise). In der Bedingung der schrittweisen Addition wurde Vc 3, 5 und 7 Minuten nach Reaktionsinitiation in gleicher Aliquot eingeführt, während der Bolus-Zustand die gleiche Gesamtmenge Vc erhielt wie eine einzelne Addition.

Aliquots wurden über eine Reaktionsperiode von 10 Minuten gesammelt, sofort mit NaOH alkalinisiert, um weitere Radikalreaktionen abzuschrecken und die Fluoreszenz zu stabilisieren, und vor der Messung bei 4 °C gelagert. Die Fluoreszenzintensität des TA-abgeleiteten Produkts wurde mit einem Mikroplattenleser gemessen (z.B./Em: 315/425 nm). Die Radikalerzeugung wurde als Fluoreszenzintensität nach Blanksubtraktion ausgedrückt und als relativer Indikator für die Radikalentstehung verwendet. Mindestens drei unabhängige Experimente wurden durchgeführt, und die Daten wurden als Zeitverlaufprofile und Endpunktvergleiche nach 10 Minuten präsentiert.

Bewertung der antibakteriellen Leistung durch Kolonienzählung
H. pylori-Stämme wurden bei −80 °C in einer Hirn-Herz-Infusion (BHI)-Brühe mit 25 % Glycerol gelagert. Der primäre Stamm, der für den Haupt-Koloniezähl-Test, den Rettungsassay, den Matrix-Interferenz-Assay, die Färbung lebender und toter Fluoreszenzfärbung und die Analyse der Rasterelektronenmikroskopie verwendet wurde, war H. pylori G27. Vor jedem Experiment wurden Bakterien auf Columbia-Blutagarplatten gestrichen und 3 Tage lang bei 37 °C unter mikroaerophilen Bedingungen mit 5 % O₂, 10 % CO₂ und 85 % N₂²² inkubiert.

Kolonienzähl-Assay im Primärstamm
Verwendung von Colony-Forming Unit (CFU) Enumeration zur Bewertung der antibakteriellen Aktivität unter verschiedenen Behandlungsbedingungen. Dazu gehörten folgende Gruppen: unbehandelte Kontrolle, H₂O₂ allein, Vitamin C allein, konventionelle Fenton-Reaktion und Vitamin-C-unterstützte Fenton-Reaktion. Wenn eine Fe²⁺-Alleingruppe im ursprünglichen Experiment nicht enthalten war, sollte man vermeiden, den primären Test so zu interpretieren, dass die reinen Eiseneffekte vollständig von den Fenton-Reaktions-vermittelten oxidativen Effekten getrennt werden. Geerntet, kultivierte H. pylori und die Bakterien werden in physiologischer Kochsalzlösung wieder suspendiert. Die optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀₀) wurde auf 0,5 angepasst und die Suspension in physiologische Kochsalzlösung mit 3 mM Harnstoff überführt, angepasst auf pH-3. H₂O₂, FeSO₄ und Vitamin C wurden je nach zugewiesener Behandlungsgruppe hinzugefügt. Es wurden Endkonzentrationen von 2,2 mM H₂O₂ und 0,055 mM FeSO₄ verwendet. Bei der Fenton-Behandlung mit Vitamin C wurde Vitamin C in drei gleich großen Aliquoten nach 3, 5 und 7 Minuten hinzugefügt, mit einer Endkonzentration von 0,0264 mM.

Nach 10 Minuten Behandlung wurde jede Probe sofort 100-fach in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) verdünnt, um die saure Suspension zu neutralisieren und den Übergang von Restoxidanten und Eisen in den Beschichtungsprozess zu reduzieren. Die verdünnte bakterielle Suspension wurde auf Columbia-Blutagarplatten aufgetragen und bei 37 °C 3 Tage lang unter mikroaerophilen Bedingungen von 5 % O₂, 10 % CO₂ und 85 % N₂ inkubiert. Zählte CFUs und berechnete antibakterielle Aktivität als log₁₀ CFU-Reduktion relativ zur unbehandelten Kontrolle mittels Gleichung 2:

log₁₀ CFU-Reduktion = log₁₀(_{CFU-Kontrolle}) − log10(_{CFU-behandelt}) (2)

Rettungstest
Um zu untersuchen, ob die antibakterielle Aktivität des vitamin-C-unterstützten Fenton-Systems mit der Eisenverfügbarkeit und radikalbezogenen Prozessen in Verbindung steht, wurden Rettungsexperimente mit Deferoxamin (DFO) als Eisenchelator und Thiourea als Hydroxylradikal-Aasfresser durchgeführt. DFO oder Thiourea wurde der bakteriellen Suspension 5 Minuten vor der Zugabe von FeSO₄ und H₂O₂ hinzugefügt. DFO und Thiourea wurden bei Endkonzentrationen von 100 μM bzw. 5 mM verwendet.

Sechs experimentelle Gruppen wurden eingeschlossen: unbehandelte Kontrollgruppe, Fenton mit Vitamin-C-Unterstützung, Fenton mit DFO, Fenton mit Vitamin-C-Assistenz mit Thiourea, allein DFO und nur Thiourea. Alle anderen experimentellen Parameter, einschließlich pH-Wert, Kochsalz-/Harnstoff-Hintergrund, H₂O₂-Konzentration, FeSO₄-Konzentration, Vitamin-C-Dosierungsplan, Behandlungsdauer, Verdünnung/Neutralisation vor der Beschichtung und Inkubationsbedingungen, waren identisch mit denen, die im primären Kolonienzählungstest verwendet wurden. Die antibakterielle Aktivität wurde durch CFU-Enumeration quantifiziert und als log₁₀ CFU-Reduktion im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle ausgedrückt.

Multistrain-Validierung
Um eine begrenzte Quersrichtungsunterstützung für die im Primärstamm beobachtete antibakterielle Wirkung zu gewährleisten, wurde der Kolonienzähltest weiter auf zwei weitere H. pylori-Referenzstämme , ATCC 43504 und ATCC 26695, angewendet. Für jeden Stamm wurden drei experimentelle Gruppen einbezogen: unbehandelte Kontrollgruppe, konventionelle Fenton-Reaktion und Vitamin-C-unterstützte Fenton-Reaktion mit schrittweiser Vitamin-C-Zugabe. Die experimentellen Bedingungen und Verfahren waren identisch mit denen, die beim primären Kolonienzähl-Assay verwendet wurden. Die antibakterielle Aktivität wurde als log₁₀ CFU-Reduktion im Verhältnis zur unbehandelten Kontrolle für jeden Stamm ausgedrückt. Jedes Experiment wurde mit n = 3 unabhängigen biologischen Replikaten durchgeführt, und die Daten wurden als einzelne Datenpunkte mit Mittelwert ± Standardabweichung präsentiert.

Matrix-Interferenz-Assay
Um zu bewerten, ob organische Matrixkomponenten die antibakterielle Aktivität des vitamin-C-unterstützten Fenton-Systems abschwächen könnten, wurde ein Proteininterferenzmodell unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) entwickelt. BSA wurde bei Endkonzentrationen von 0, 1 und 3 g· L⁻¹. An jeder BSA-Konzentration wurden drei experimentelle Gruppen eingeschlossen: (1) unbehandelte Kontrolle, (2) konventionelles Fenton (Fe²⁺ + H₂O₂) und (3) vitamin-C-assistiertes Fenton mit schrittweiser Vitamin-C-Zugabe. Der Assay wurde mit dem Primärstamm unter demselben Protokoll durchgeführt, das im primären Koloniezähl-Test beschrieben wurde, mit identischen pH-Bedingungen, Kochsalz-/Harnstoff-Hintergrund, Reagenzienkonzentrationen, Behandlungsdauer (10 Min) und Beschichtungsverfahren. Die antibakterielle Wirkung wurde als log₁₀ CFU-Reduktion relativ zur unbehandelten Kontrolle bei jeder BSA-Konzentration ausgedrückt. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal unabhängig voneinander durchgeführt. Der Hauptvergleich konzentrierte sich darauf, ob die verbesserte Fenton-Bedingung unter proteinhaltigen Bedingungen der konventionellen Fenton-Bedingung überlegen oder zumindest nicht schwächer war.

Bakterielle lebende/tote Fluoreszenzfärbung
Nach der Behandlung wurde die bakterielle Suspension wie oben beschrieben 100-fach in PBS verdünnt, um den restlichen Säure- und oxidativen Übergang zu reduzieren. Zentrifugierte die Suspension bei 1.800 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur und entsorgte den Überstandsmittel. Die bakterielle Pellet wurde in 200 μL physiologischer Kochsalzlösung neu suspendiert. Hinzufügung von SYTO9 und Propidiumiodid (PI) zu den Endkonzentrationen von 6 μM bzw. 30 μM. Ich habe die Suspension im Dunkeln 20 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. 5–10 μL der gefärbten bakteriellen Suspension auf einen sauberen Glasschlitten gelegt und mit einem Deckmantel bedeckt. Aufgenommene Fluoreszenzbilder mit einem Fluoreszenzmikroskop mit grünen und roten Fluoreszenzkanälen unter identischen Belichtungseinstellungen für alle Behandlungsgruppen. Für jede Gruppe wurden mindestens drei zufällig ausgewählte Felder erobert. Die Bilder wurden als qualitativer visueller Beweis für lebendige/tote Färbungsmuster verwendet, statt als quantitative Messung der bakteriellen Lebensfähigkeit.

Bakterielle Morphologieanalyse mittels Rasterelektronenmikroskopie
Nach der Behandlung wurden die Bakterienproben entnommen und in 2,5 % Glutaraldehyd fixiert, das in einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) bei 4 °C für 12 Stunden hergestellt wurde. Nach der Fixierung wurden die Proben mit Phosphatpuffer gewaschen, um das Restfixativ zu entfernen. Die Proben wurden anschließend sequentiell in gradierten Ethanollösungen von 50 %, 70 %, 90 % und 100 % dehydriert. Nach der Dehydrierung wurde die Trocknung an kritischen Punkten durchgeführt. Die getrockneten Proben wurden auf SEM-Stubs montiert und mit einer dünnen Goldschicht von etwa 10 nm sputterbeschichtet. Die bakterielle Morphologie wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie bei einer Beschleunigungsspannung von 5 kV untersucht. Repräsentative Bilder wurden bei niedriger und hoher Vergrößerung für jede Behandlungsgruppe aufgenommen. SEM-Bilder wurden als qualitative morphologische Beobachtungen verwendet und nicht als quantitativer Beweis für einen definierten Schadensmechanismus.

Statistische Analyse
Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism Version 10.0 durchgeführt. Alle quantitativen Experimente wurden mit n = 3 unabhängigen biologischen Replikaten durchgeführt, und die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) präsentiert. Für TA-Fluoreszenztests wurden statistische Vergleiche zwischen mehreren Behandlungsgruppen mittels Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, gefolgt vom Tukey-Mehrfachvergleichstest. Für Kolonienzähl-Assays im Primärstamm mit mehreren Behandlungszuständen wurden statistische Vergleiche mittels Einweg-ANOVA durchgeführt, gefolgt vom Tukey-Mehrfachvergleichstest. Für Rettungstests wurden Gruppenvergleiche mittels Einweg-ANOVA durchgeführt, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest, wobei die vitamin-C-unterstützte Fenton-Gruppe als Referenz diente. Für begrenzte Kreuzstamm-Validierungsexperimente wurden log₁₀ CFU-Reduktionen zwischen den konventionellen Fenton- und Vitamin-C-unterstützten Fenton-Gruppen innerhalb jedes Stammes mit einem ungepaarten zweiseitigen T-Test verglichen. Für Matrix-Interferenztests wurde eine zweiseitige ANOVA durchgeführt, wobei Behandlung und BSA-Konzentration Faktoren waren, einschließlich des Wechselwirkungstermes. Paarweise Vergleiche zwischen Behandlungen an jeder BSA-Konzentration wurden mit Šídáks Mehrfachvergleichstest durchgeführt. Die statistische Signifikanz wurde als P < 0,05 definiert. Die Signifikanzniveaus sind als *p < 0,05, ** P < 0,01, ***P < 0,001 und ****p < 0,0001 angegeben.

Ergebnisse

Bewertung des AO7-Abbaus im vitamin-C-unterstützten Fenton-System
Die AO7-Degradation wurde als chemische Sonde verwendet, um zu untersuchen, wie Vitamin C das beobachtbare oxidative Verhalten der Fenton-Reaktion unter sauren Bedingungen beeinflusst. In Abwesenheit von Vitamin C führte das konventionelle Fenton-System über die 10-minütige Reaktionszeit zu einer partiellen AO7-Degradierung. Als Vitamin C eingeführt wurde, nahm das Ausmaß des Farbstoffabbaus zu, wobei d...

Diskussion

Die vorliegende Studie untersuchte, ob eine Vitamin-C-Dosierung das oxidative Verhalten und die antibakteriellen Werte eines Fenton-basierten Systems unter definierten sauren In-vitro-Bedingungen modulieren kann. Über die chemischen und mikrobiologischen Tests hinweg veränderte die schrittweise Vitamin-C-Supplementierung das beobachtbare Reaktionsverhalten und war mit einer stärkeren antibakteriellen Wirkung gegen H. pylori verbunden als die konventionelle Fenton-Reakti...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Acid Orange 7 (AO7)	Aladdin Reagent (Shanghai) Co., Ltd.	O113230	Wird als Modellfarbstoff für den AO7-Degradationstest verwendet.
Bovines Serumalbumin (BSA)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	B885114	Verwendet für den Matrix-Interferenz-Test.
Brain Heart Infusion (BHI)-Bouillonpulver	Sichuan Hapyear Bio-engineering Co., Ltd.	N/A	Verwendet für Bakterienkultur und Kryolagerung.
Columbia-Blutagarplatten (5% Schafsblut)	Changde Bkmam Biotechnology Co., Ltd.	110701028.0	Verwendet für Bakterienkultur und CFU-Zählung.
Kritischer Punkt-Trockner (EM CPD300)	Leica Microsystems	EM CPD300	Verwendet für SEM-Probevorbereitung nach stufenweiser Ethanol-Entwässerung.
Deferoxamin (DFO)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	D873692	Verwendet als Eisenchelatbildner im Rettungstest.
Dinatriumterephthalat	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	D835937	Verwendet als TA-Fluoreszenzsonde für die OH-Signalerkennung.
Ethanol, absolut	Sigma-Aldrich	E7023	Verwendet zur Herstellung der gestaffelten Ethanolreihe für SEM-Probenentwässerung.
Fluoreszenzmikroskop (DMi8)	Leica Microsystems	DMi8	Verwendet für Live/Dead-Fluoreszenzbildgebung.
Glutaraldehydlösung	Sigma-Aldrich	G5882	Verwendet zur Fixierung von Bakterienproben vor SEM.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Verwendet für Bakterien-Kryolagerung in BHI-Bouillon.
GraphPad Prism 10	GraphPad Software, LLC	Prism 10	Verwendet für statistische Analyse und Grafikerstellung.
Helicobacter pylori-Stamm ATCC 26695	American Type Culture Collection (ATCC)	700392	Zusätzliche Referenzstämme, die für begrenzte Kreuzungsvalidierung verwendet werden.
Helicobacter pylori-Stamm ATCC 43504	American Type Culture Collection (ATCC)	43504	Zusätzliche Referenzstämme, die für begrenzte Kreuzungsvalidierung verwendet werden.
Helicobacter pylori-Stamm G27	Center of Infectious Diseases, West China Hospital, Sichuan University	N/A	Primärer Stamm, der für Koloniezählung, Rettungstest, Matrix-Interferenz-Test, Live/Dead-Färbung und SEM verwendet wird.
Wasserstoffperoxid-Lösung	Sigma-Aldrich	H1009	Verwendet als Peroxid-Substrat in Fenton-Reaktionstests.
Eisen(II)-sulfat-Monohydrat (FeSO4·H2O)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	F904376	Verwendet als zweiwertige Eisenquelle in der Fenton-Reaktion.
Mikroplatten-Reader (Synergy H1)	Agilent BioTek	Synergy H1	Verwendet zur Messung der TA-abgeleiteten Fluoreszenz (Ex/Em = 315/425 nm).
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4	Sigma-Aldrich	P4417	Verwendet für Nachbehandlungsverdünnung/Neutralisation vor Platten und Probenwäsche.
Physiologische Kochsalzlösung (0,9%ige Natriumchloridlösung)	Millipore	567442	Verwendet für Bakteriensuspension und Herstellung des sauren Salz-Harnstoff-Modells.
Rasterelektronenmikroskop (INSPECT F)	FEI Company	INSPECT F	Verwendet für Bakterienmorphologieanalyse.
Natronlauge	Sigma-Aldrich	S5881	Verwendet zur Alkalisierung von TA-Assay-Aliquots und Stabilisierung der Fluoreszenz.
Sputterbeschichtungsanlage (EM ACE200)	Leica Microsystems	EM ACE200	Verwendet zur Auftragung der dünnen Goldbeschichtung vor SEM-Bildgebung.
SYTO 9/PI Live/Dead bakterielles Doppelfärbe-Kit	Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd.	MX4234	Verwendet für Fluoreszenz-basierte Live/Dead-Bakterienfärbung.
Thioharnstoff	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	T81602	Verwendet als Radikalfänger im Rettungstest.
Harnstoff	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	U820349	Verwendet zur Herstellung des sauren Salz-Harnstoff-Modells.
UV-Vis-Spektrophotometer (UV-2600i Plus)	Shimadzu Corporation	UV-2600i Plus	Verwendet zur Messung der AO7-Absorption bei 483 nm.
Vitamin C (L-Ascorbinsäure)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	A800295	Verwendet als Reduktionsmittel im Vitamin C-unterstützten Fenton-System.