Eine halbautomatisierte Methode zur Erkennung von Gruppenunterschieden in den anterioren medialen Clustern dopaminergerer Neuronenzahlen des protocerebralen Clusters im Gehirn der Drosophila

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine halbautomatisierte Methode zur Quantifizierung dopaminergerer Neuronenzahlen im großen Drosophila-protocerebralen anterioren medialen Cluster vor. Speziell entwickelt, um Unterschiede zwischen experimentellen und Kontrollgruppen zu erkennen und zu vergleichen, reduziert dieser Ansatz die Abhängigkeit von manuellem Zählen und bietet ein praktisches Werkzeug für Gruppenanalysen auf Gruppenebene.

Zusammenfassung

Drosophila melanogaster dient als leistungsstarkes Modellorganismus zur Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen, einschließlich der Parkinson-Krankheit (PD), hauptsächlich durch die Analyse der dopaminergen (DA) Neuronendegeneration und der damit verbundenen Lokomotionsdefizite. Historisch war die Quantifizierung des DA-Neuronverlusts im Fliegenhirn auf kleinere, leicht abzählbare Cluster beschränkt, darunter protocerebrale posteriore mediale (PPM) Cluster und protocerebrale posteriore laterale (PPL) Cluster. Im Gegensatz dazu stellt der deutlich größere protocerebrale anteriore mediale (PAM) Cluster, der über 100 Neuronen umfasst, eine erhebliche Herausforderung für das manuelle Zählen dar, was zu seiner Unterrepräsentation in quantitativen Studien führt. Bis heute basieren berichtete Untersuchungen weiterhin auf arbeitsintensiven manuellen Zählungen über konfokale Z-Stacks, die zeitaufwendig und variabilitätsanfällig sind. Um diese methodische Lücke zu schließen, entwickelten wir eine halbautomatisierte Bildanalyse-Pipeline mit dem Open-Source-Tool Labkit. Dieses Protokoll ermöglicht eine effiziente gruppenrelative Quantifizierung von Tyrosinhydroxylase-(TH)-positiven Neuronen im PAM-Cluster innerhalb desselben experimentellen Batches. Die Methode beginnt mit einer standardmäßigen Immunfluoreszenzfärbung und konfokaler Bildgebung, gefolgt von einer detaillierten Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Segmentierung und Analyse. Dieser Ansatz adressiert den Engpass der PAM-Cluster-Quantifizierung und bietet einen praktischen Arbeitsablauf zur Erkennung von Intergruppenunterschieden in der DA-Neuronenverwundbarkeit in Modellen der Neurodegeneration. Die relative Knappheit von PD-Studien zum PAM-Cluster spiegelt eher eine historische technische Hürde wider als einen Mangel an biologischer Relevanz. Indem wir diese Barriere überwinden, öffnet unsere Methode die Tür für eine systematische Untersuchung der Verwundbarkeit von PAM-Neuronen bei PD und deren möglicher Zusammenhang mit nicht-motorischen Symptomen.

Einleitung

Die Essigfliege, Drosophila melanogaster, ist ein beliebtes Modellorganismus zur Untersuchung der genetischen und molekularen Grundlagen neurodegenerativer Erkrankungen, insbesondere der Parkinson-Krankheit (PD)^1. Seine konservierten neuronalen Signalwege, sein ausgefeiltes genetisches Werkzeugkasten und seine kurze Lebensdauer machen es besonders geeignet zur Untersuchung altersabhängiger neuronaler Verwundbarkeit sowie zur Durchführung von hochdurchsatzgenetischen und pharmakologischen Screens ^2,3. Im Zentrum dieser Untersuchungen steht die Analyse dopaminerger (DA) Neuronen, deren selektive Degeneration ein pathologisches Merkmal von PD⁴ ist. Im Gehirn von Drosophila sind DA-Neuronen in diskrete, genetisch identifizierbare Cluster^{organisiert 5,6}. Der fortschreitende Verlust von DA-Neuronen innerhalb spezifischer Cluster, visualisiert durch TH-Immunfärbung und quantifiziert durch Mikroskopie, dient als primäres funktionelles Signal zur Bewertung des Krankheitsverlaufs und neuroprotektiver Interventionen in experimentellen Modellen ^7,8. Daher ist eine zuverlässige Quantifizierung des DA-Neuronenverlusts unerlässlich, um die Kraft der Drosophila-Genetik in sinnvolle PD-Forschungsergebnisse umzusetzen.

Konventionell konzentriert sich die quantitative Analyse des DA-Neuronverlusts auf die Immunfärbung kleiner Cluster, darunter protocerebrale posteriore mediale (PPM) Cluster und protocerebrale posteriore laterale (PPL) Cluster, wobei jeder Cluster weniger als 10 Zellen enthält, die leicht mit^{Auge 7} abzählbar sind. Die manuelle Aufzählung durch konfokale Z-Stacks ist zwar mühsam, aber in vielen PD-Studien mit Drosophila ^9,10,11 die etablierte Methode für diese Cluster. Im Gegensatz dazu stellt die manuelle Zählung des protocerebralen anterioren medialen (PAM)-Clusters, der größten DA-Neuronengruppe im Fliegenhirn mit über 100 Zellen, einen langjährigen methodischen Engpass dar und schließt seine Aufnahme in die Mehrheit der PD-Studien ^9,10,11 aus. Trotz der entscheidenden Rolle der PAM-Neuronen in Lern-, Gedächtnis- und Motivationskreisläufen hat diese Einschränkung zu ihrer relativen Unterrepräsentation in quantitativen Analysen der Neurodegeneration^geführt 12,13,14,15. Bemerkenswert ist, dass selbst jüngste Untersuchungen weiterhin auf diesen ineffizienten manuellen Zählansatz setzen, was einen anhaltenden und unerfüllten Bedarf an einer standardisierten, automatisierten Lösung im Bereich¹³ unterstreicht.

Um diese kritische Lücke zu schließen, haben wir eine halbautomatisierte Bildanalyse-Pipeline entwickelt, die eine effiziente gruppenrelative Quantifizierung von TH-positiven (TH⁺)-Neuronen im PAM-Cluster innerhalb eines Experiments ermöglicht. Dieses Protokoll nutzt das quelloffene, maschinell-learningbasierte Plugin Labkit innerhalb der Fiji/ImageJ-Plattform sowie die 3D-Bildverarbeitungssoftware^16,17. Der Kernworkflow erfordert, dass der Benutzer eine repräsentative Teilmenge von Bildern annotiert, um ein Pixelklassifikationsmodell zu trainieren, das dann auf experimentelle TH-Färbungsdatensätze im Batch-Prozess angewendet wird, gefolgt von der Erstellung und Klassifikation des Kernflecks in Bezug auf die TH^+-Region. Dieser Ansatz balanciert Automatisierung mit fachkundiger Aufsicht: Er verringert die Belastung und Variabilität vollständig manueller Zählungen, während der Input der Forscher zur Steuerung des Algorithmus und zur Überprüfung der Ergebnisse berücksichtigt wird.

Ziel dieses Artikels ist es, Forschern ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für effiziente PAM-Cluster-DA-Neuronenrelativquantifizierung für gruppenrelative Vergleiche innerhalb eines Experiments bereitzustellen. Wir demonstrieren den gesamten Arbeitsablauf – von der Gehirndissektion, der Immunfluoreszenzfärbung und der konfokalen Bildgebung bis hin zur detaillierten Bildanalyse mit der halbautomatisierten Methode. Durch die Standardisierung dieses wichtigen quantitativen Schrittes zielt dieses Protokoll darauf ab, die Forschungsgemeinschaft zu befähigen, den großen PAM-Cluster konsequent in ihre Analysen einzubeziehen. Diese halbautomatisierte Methode ist speziell für den PAM-Cluster entwickelt und nicht auf andere dopaminerge Cluster oder auf TH-positive Neuronen in den Sehlappen anwendbar. Diese Methode könnte Studien auf Batch-Ebene zur Verwundbarkeit von PAM-Cluster-DA-Neuronen sowie weitere Untersuchungen zur synaptischen Plastizität, Neurodegeneration und therapeutischen Screenings mit dem Drosophila-Modell erleichtern.

Protokoll

1. Probenvorbereitung und konfokale Bildgebung

1. Fliegenzucht und Sammlung
   1. Kreuzelternfliegen der gewünschten Genotypen erzeugen experimentelle Nachkommen. Nach der Eklusion sammeln Sie 20–30 Fliegen pro frischer Lebensmittelphiole. Halten Sie Fliegen gemäß dem Versuchsdesign des Nutzers aufrecht, bis das gewünschte experimentelle Alter erreicht ist.
2. Vorbereitung auf die Sektion
   1. Bereiten Sie eine Sektionsschale vor, indem Sie den Deckel einer 30 mm großen Petrischale bis zur Hälfte mit Sylgard-Silikonelastomer füllen. Füllen Sie die Schale mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Aliquot 450 μL Fixativ, das 1x PBS und 4 % Paraformaldehyd (PFA) enthält, in einem 0,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen, und legt das Rohr dann auf Eis.
   2. Betäuben Sie 10–20 Fliegen mit einem 5–10 s Puls CO₂ und übertragen sie dann sofort auf eine 60-mm-Petrischale, die auf Eis gelegt wird, um die Beweglichkeit zu gewährleisten.
      VORSICHT: PFA ist giftig und ein vermuteter krebserregender Stoff. Führe sie in einer Abzugsmaske mit Handschuhen, Laborkittel und Schutzbrille. Entsorgung von Abfällen gemäß den institutionellen Richtlinien für gefährliche Stoffe.
3. Fliegenhirndissektion und Fixierung
   1. Greifen Sie eine Fliege an der Flügelwurzel mit einer Pinzette und tauchen Sie sie mit der Bauchseite nach oben in die mit PBS gefüllte Sektionsschale. Durchbohren Sie den Thorax mit einem feinen Sektionsstift, um die Fliege am Sylgard-Pad zu verankern.
   2. Orientiere den Körper horizontal (z. B. Kopf links, Bauch rechts). Halten Sie die Rüsselbasis mit einer Zange fest, während Sie mit der anderen den gesamten Rüssel entfernen und so eine Öffnung zwischen den zusammengesetzten Augen schaffen.
   3. Greifen Sie die freiliegenden Augenränder mit zwei Pinzetten und ziehen Sie sie sehr langsam symmetrisch auseinander, wodurch das Gehirn freigelegt wird, während die Verbindung zum ventralen Nervenstrang erhalten bleibt.
   4. Entfernen Sie die Luftröhrensäcke und den Fettkörper rund um das Gehirn. Durchtrennen Sie das ventrale Nervenstrang, um das Gehirn zu befreien und es mit der vorderen Seite nach oben auf der Schale absetzen zu lassen.
      HINWEIS: Wenn das beruhigte Gehirn zeigt, dass die ventrale Hälfte höher als die dorsale Hälfte liegt (Abbildung 1B, C), verwenden Sie eine Pinzette, um den erhöhten Teil sanft nach unten zu drücken.
   5. Vornässen Sie eine P10-Pipettenspitze mit 0,1 % Triton X-100, um zu verhindern, dass das dissektionierte Gehirn an der Innenwand der Spitze haftet. Mit dieser vorbenetzten Spitze wird jedes dissektionierte Gehirn in das Rohr mit dem Fixativ übertragen und dann zur nächsten Dissektion übergefahren. Nachdem alle Gehirne übertragen wurden, drehe das Rohr fünfmal um und stelle es 30 Minuten horizontal auf Eis. Inkubieren Sie das Rohr bei Raumtemperatur (RT) für 1 Stunde mit Rührung.
   6. Lass das Gehirn 1 Minute lang auf den Boden sinken. Wasche das Gehirn 3 x 10 Minuten mit einer Waschlösung, die 1x PBS und 0,1 % Triton X-100 (PBST) mit Rühren enthält. Lagern Sie das Gehirn in PBS mit 0,1 % Natriumazid bei 4 °C oder beginnen Sie mit einer Immunfärbung.
4. Immunfärbung
   1. Färbe Gehirne in 300 μL primärer Antikörperfärbungslösung mit 1x PBS, 0,1 % Triton X-100, 5 % normalem Ziegenserum, 0,1 % Natriumazid und Kaninchen-Anti-TH-Antikörper (1:500 Verdünnung) für 2 Tage bei 4 °C mit Bewegung. Wasche das Gehirn 3 x 10 Minuten mit PBST.
   2. Färben Sie das Gehirn mit einer sekundären Antikörperlösung, die 1x PBS, 0,1 % Triton X-100, 5 % normales Ziegenserum, 0,1 % Natriumazid und Antikaninchen-Alexa Fluor 635 für 2 Tage bei 4 °C enthält. Wasche das Gehirn einmal mit PBST.
   3. Inkubieren Sie Gehirne in PBST, ergänzt mit 4',6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) (1:1.000 Verdünnung) für 2 Stunden bei RT, dann 2 Stunden in PBST. Lagern Sie die Gehirne über Nacht bei 4 °C oder fahren Sie mit der Montage fort.
5. Montage
   1. Laden Sie 0,5 ml Montagemittel auf eine 1-mL-Spritze, die mit einer feinen Nadel ausgestattet ist. Erstelle eine Montagekammer, indem du zwei parallele Streifen transparenten Klebebands auf einen Glasträger anbringst und dabei einen 3 mm großen Spalt lässt (Abbildung 1A,D).
      VORSICHT: Scharfe Nadeln stellen eine Einstichgefahr dar. Immer mit Vorsicht umgehen, bei Bedarf mit einer einhändigen Schaufeltechnik aufdecken und gebrauchte Nadeln sofort in einem zugelassenen Behälter für scharfe Gegenstände entsorgen.
   2. Übertrage die Gehirne mit einer abgeschnittenen P200-Spitze in eine saubere Petrischale. Entferne überschüssige Flüssigkeit um das Gehirn herum und gib 10 μL Mountant auf die Gehirne ab. Mische vorsichtig das Gehirn mit dem Mountant.
   3. Verteilt drei Tropfen Mountant entlang der Lücke auf der Rutsche und verteilt sie gleichmäßig über die Lücke. Übertragen und positionieren Sie das Gehirn entlang der zentralen Linie der Lücke mit einer P10-Pipette (Abbildung 1A).
   4. Positioniere die Gehirne gleichmäßig entlang der Mittellinie des Spalts, wobei die vordere Seite nach oben zeigt. Decken Sie die Lücke langsam mit einem Deckdeckel ab. Drücke mit den Daumen in der Nähe der Ränder des Deckdeckels für 3 Sekunden, um festen Kontakt zu gewährleisten.
   5. Legt den Objektträger horizontal in einen Dia-Ordner, um ihn über Nacht bei RT im Dunkeln auszuhärten, dann bei 4 °C zur Langzeitlagerung.
6. Konfokale Bildgebung
   1. Schalte das konfokale Mikroskopsystem ein und warte 15 Minuten auf die Laserstabilisierung. Lokalisieren Sie die Gehirne im hellen Feld mit einer 10-fachen Objektivlinse, wechseln Sie dann zu einer 100-fachen Öl-Immersionsobjektivlinse und navigieren Sie live zum PAM-Cluster.
   2. Stelle Stufe XY ein, um einen PAM-Cluster im Bildaufnahmezentrum zu lokalisieren. Überprüfen Sie die Vorschau durch Z, um die Grenzen und die Ausrichtung zu bestätigen. Stellen Sie den digitalen Zoom und die Ausrichtung so lange an, bis das PAM-Cluster an den Bildrahmen entlang der Diagonale passt.
   3. Stellen Sie die obere und untere Position des Stapels ein. Stellen Sie die Z-Schrittgröße auf 0,34 μm und die Bildauflösung auf 512 x 512 ein. Stelle das Stiftloch auf Auto-Modus. Setze die Anzeige-Lookup-Tabelle (LUT) auf Sättigungsindikator.
   4. Passen Sie die Laserleistung und die Detektorverstärkung des TH-Kanals an, bis eine minimale Menge an gestreuten, diskreten Puncta innerhalb der PAM-Neuronen gesättigt ist. Passen Sie die Einstellungen des DAPI-Kanals an, um ein helles, klares Kernsignal ohne Sättigung zu erhalten.
      HINWEIS: Der optimale Zoomfaktor variiert. Unterschiede in der Gewebeschrumpfung können zwischen experimentellen Chargen und zwischen einzelnen Gehirnen innerhalb derselben Charge auftreten.
   5. Erfassen und speichern Sie Bilder im RAW-Format mit 12- oder 16-Bit-Format im Eingabeordner (z. B. D:\Confocal\Images). Zurück zur Live-Ansicht, Zoom zurücksetzen und entlang der Lücke blättern, um das nächste Gehirn zu finden, ohne auf niedrigere Vergrößerung umzuschalten.
      HINWEIS: Speichern, exportieren oder konvertieren Sie die primären Datendateien in diesem Stadium nicht in ein verarbeitetes .tif-Format. Die Erhaltung der ursprünglichen Rohmetadaten ist für die nachfolgende Bildverarbeitung unerlässlich.

2. Bildverarbeitung und Quantifizierung

1. Bilddatei-Konvertierung und TH-Kanalaufteilung
   1. Konvertiere Rohbilder im Eingabeordner in ein Format, das mit der 3D-Bildanalyse-Software kompatibel ist, mithilfe des zugehörigen Dateikonverters (Materialtabelle). Platzieren Sie die konvertierten Dateien in den konvertierten Ordner (z. B. D:\Confocal\converted)
   2. Öffne Fiji und navigiere zur Datei | Neu | Drehbuch. Klicken Sie im Skripteditor auf Datei | Öffnen zum Laden der Makrodatei ImageFolder_Split_ChannelAndSaveMacro_UltimateDepth.ijm (Ergänzungsdatei 1). Klicke unten im Editor-Fenster auf Ausführen (wenn der Button versteckt ist, klicke auf das kleine dreieckige Symbol, um ihn anzuzeigen).
   3. Im Konfigurationsdialog klicken Sie auf Durchsuchen und wählen Sie den konvertierten Ordner aus. Unter der Namenskonvention wählen Sie Option 3. Wählen Sie unter Channel zum Export den Kanalindex aus, der TH entspricht. Klicken Sie auf OK , um den TH-Kanal zu teilen; die exportierten TH-Stacks werden automatisch in einem Ordner gespeichert, der mit ChannelSplitOut endet.
2. Training des Labkit-Klassifikators
   1. Vorbereitung des Trainingsdatensatzes
      1. Wählen Sie 20 repräsentative Stacks aus, die eine Bandbreite von Signalintensitäten und Hintergrundvariationen von Samples aus dem TH-Stack-Ordner erfassen. Kopiere die ausgewählten Dateien in den Auswahlordner (z. B. D:\Confocal\selection).
      2. Führe das Fiji-Makro ImageFolder_UniCropZStack_ToThinestLayers.ijm (Supplemental File 2) aus. Wenn du aufgefordert wirst, wähle den Ordner mit den Trainingsbildern aus. Das Makro kürzt jeden Stack auf die gleiche Anzahl von Z-Slices und verkettet die Stacks zu einer Zeitraffer-TIFF-Datei zum Training.
   2. Interaktives Training des Pixelklassifikators
      1. Labkit über Fiji Plugins starten | Labkit | Aktuelles Bild mit Labkit öffnen (Materialtabelle). Klicken Sie in der Werkzeugleiste auf die 3D-Box-Taste , um in den Slice-View-Modus zu wechseln und durch Z-Schnitte (Schieberegler rechts) und über Samples (Schieber unten) zu navigieren.
      2. Drücke S, um das Helligkeits- und Kontrastpanel zu öffnen und den Max-Schieberegler für eine optimale Visualisierung der TH⁺-Neuronen anzupassen. Stellen Sie eine passende Pinselgröße ein (z. B. 5 Pixel). Klicken Sie auf Einstellungen, um das Werkzeugfeld zu erweitern. Behalten Sie die Standard-Anzeigemodi (Fused, Quelle, Nächstes).
      3. Klicken Sie auf Zeichnen. Im Labeling-Panel markieren Sie Hintergrund und zeichnen Sie einige nicht-zelluläre Regionen; Hervorheben Sie den Vordergrund und zeichnen Sie das Innere einiger TH^+- Neuronen.
      4. Zoome mit Strg + Shift + Scroll ins Feld hinein und wieder heraus. Navigiere mit dem vertikalen Regler zu anderen Z-Slices und mit dem unteren Regler zu anderen Trainingsproben. Wiederholen Sie das Ziehen mehrmals, um ein robustes Training mit Klassifikatoren sicherzustellen.
      5. Klicken Sie auf die Pixel-Klassifikation. Klicken Sie auf das Start Training Dreieck, um Training und Lazy Prediction zu starten, das später Echtzeit-Segmentierungsfeedback liefert, während jederzeit zwischen Proben, Schnitten oder Positionen (Rechtsklick und Ziehen) navigiert wird.
      6. Klicken Sie auf Zeichnen , um korrigierende Anmerkungen hinzuzufügen, wenn die Vorhersage ungenau ist, mit optionalem Umschalten der Sichtbarkeit von Vorhersage und Beschriftung im Quellen-Panel und Nachtrainieren. Iterieren Sie, bis der Klassifikator TH⁺ -Neuronen zuverlässig vom Hintergrund unterscheidet, und speichern Sie dann den Klassifikator über Segmentierung | Speichere den Klassifizierer, bevor du Labkit schließt.
3. Batch-Labkit-Segmentierung
   1. Öffne ein zufälliges Bild aus dem TH-Stack-Ordner in Fiji. Starte Labkit und klicke auf Alle entfernen, dann lade den vortrainierten Klassifikator über Segmentation | Öffne den Klassifikator , um das Bild zu segmentieren. Inspizieren Sie die Qualität visuell, um die Generalisierbarkeit des Klassifikators zu validieren, und schließen Sie dann das Fenster.
   2. Wiederhole 2.3.1 bei mehreren anderen zufälligen Bildern. Schließe das Fenster nach jeder Inspektion, außer bei der letzten.
   3. Erstelle einen Labkit-Ausgabeordner (z. B. D:\Confocal\LabkitOut). Beginnen Sie mit der Batchverarbeitung über Others > Batch Segment Images. Setze Input Directory auf den TH-Stack-Ordner und Output Directory auf den Labkit-Ausgabeordner und klicke dann auf OK , um die Batch-Verarbeitung zu starten.
   4. Für zukünftige Experimente mit demselben TH-Antikörper und vergleichbaren konfokalen Einstellungen überspringen Sie 2.2 und verwenden Sie den vorherigen Klassifikator erneut.
      HINWEIS: Wir stellen außerdem einen vortrainierten Klassifikator für Testzwecke bereit (Supplemental File 3).
4. Erstellung von DAPI-Spots und TH⁺ Neuronenquantifizierung
   1. Legen Sie XT_Jove_Labkit_TH.m (Supplemental File 4) in einen Skriptordner (z. B. D:\scripts) ab. Öffnen Sie 3D-Software und navigieren Sie zur Datei | Einstellungen, dann wähle Benutzerdefinierte Werkzeuge aus. Im XTension-Ordner-Panel klicke auf Add... um den Skriptordner auszuwählen und OK zu klicken.
   2. Für jede konvertierte Datei führt das Skript automatisch die folgenden aufeinanderfolgenden Operationen aus.
      HINWEIS: Dieser erklärende Abschnitt enthält keine Aktionen für den Nutzer, ist aber unerlässlich, um mit den nächsten Schritten fortzufahren.
      1. Der DAPI-Kanal wird durch Hintergrundsubtraktion und Gaußschen Filter verarbeitet, um eine optimierte DAPI-Spot-Identifikation zu ermöglichen.
      2. Die Labkit-Segmentierungsmaske wird durch Entschädigung und Lochfüllung verfeinert und als Maskenkanal an den Datensatz angeschlossen. Ein verfeinertes TH-Oberflächenobjekt wird aus dem Maskenkanal konstruiert. Das TH-Oberflächenobjekt erzeugt außerdem eine verfeinerte Maske, um den Maskenkanal zu überschreiben.
      3. Aus der TH-Fläche wird ein Distanztransformationskanal erzeugt, bei dem Voxel innerhalb der Oberfläche auf 0 gesetzt werden und Voxel außerhalb der Oberfläche Gleitkommawerte erhalten, die ihre euklidische Entfernung zur nächstgelegenen TH-Oberfläche darstellen.
      4. Verwenden Sie das Intensitätsprofil jedes DAPI-Flecks im Ferntransformationskanal als Metrik für die TH⁺ -Neuron-Identifikation. DAPI-Spots, die sich innerhalb oder nahe TH^+- Regionen befinden, haben niedrige Distanzwerte. Dieses Kriterium hilft, falsch-negative Ergebnisse zu retten, wie echte DA-Neuronenkerne, die sich knapp draußen, aber unmittelbar neben einem unvollkommenen, von Labkit vorhergesagten Vordergrundbereich befinden.
   3. Manuelle Qualitätsoptimierung für die Erstellung von DAPI-Spots
      1. Öffne eine Zufallsstichprobe aus dem konvertierten Ordner in 3D-Software. Navigiere zum Bearbeiten | Bildeigenschaften und überprüfen, ob die Voxelgröße Z im Koordinatenpanel 0,340 μm beträgt. Wenn nicht, ändere es manuell auf 0,340 μm.
      2. Hintergrundsubtraktion auf den DAPI-Kanal anwenden, indem Sie auf Bildverarbeitung | klicken Schwellenwertung | Hintergrundsubtraktion. Im Dialog markieren Sie nur den DAPI-Kanal, setzen Sie die Filterbreite auf 3 und klicken Sie auf OK. Wiederhole diesen Schritt noch einmal und führe dann eine dritte Wiederholung mit einer Filterbreite von 1 durch.
      3. Gauss-Glättung anwenden, indem Sie auf Bildverarbeitung | klicken Glätten | Gaußischer Filter. Kreuze nur den DAPI-Kanal an, setze die Filterbreite auf 0,2 und klicke auf OK.
      4. In der Surpass-Szene klickst du auf Neue Spots hinzufügen , um den Spots-Erstellungs-Wizard zu starten. Wählen Sie den DAPI-Kanal aus und geben Sie einen geschätzten XY-Durchmesser von 1,2 μm ein. Folgen Sie dem Wizard, fügen Sie einen "Quality above"-Filter hinzu und optimieren Sie die Schwelle, bis sie für jeden Kern einen genauen Fleck liefert.
      5. Wiederholen Sie die Schritte 2.4.3.1–2.4.3.4 über mehrere zufällig ausgewählte Stichproben hinweg und finalisieren Sie Schwellenwerte, die zuverlässig über die Stichproben hinweg funktionieren.
   4. Öffnen Sie das Skript XT_Jove_Labkit_TH.m (Supplemental File 4) im Texteditor, um die folgenden benutzerdefinierten Parameter zu ändern.
      1. Setze ims_Folder auf den Pfad des konvertierten Ordners; setze LabkitOut_Folder auf den Pfad des Labkit-Ausgabeordners. Setze Ch_DAPI für alle Dateien im konvertierten Ordner auf den DAPI-Kanalindex (z. B. 1, wenn DAPI der erste Kanal ist, 2, wenn DAPI der zweite Kanal ist).
      2. Setze reVoxelSizeX, reVoxelSizeY, reVoxelSizeZ. Wenn die Voxelgrößen in Bildeigenschaften korrekt sind (siehe Schritt 2.4.3.1), lassen Sie die Antworten in leeren Klammern []. Andernfalls werden geeignete Werte manuell eingegeben (z. B. 0,130, 0,130, 0,340), die auf alle Dateien im konvertierten Ordner angewendet werden.
   5. Finalisiere die Parameter für die Spot-Erstellung.
      1. Passe mehrere Versionen der Parameter im SpotsParameterAss-Zellarray an, wobei jede Zeile eine Version angibt. Dazu gehört die Definition des geschätzten XY-Durchmessers (μm) für die DAPI-Spot-Detektion im linken Teil jeder Zeile sowie die Definition der Filterkette, die aus Kriterienfiltern besteht, im rechten Teil jeder Zeile, die die Qualitätsschwellenwerte aus Schritt 2.4.3.4 und/oder die Intensitätsschwelle auf dem verfeinerten Maskenkanal aus Schritt 2.4.2.2 oder den distanztransformierten Kanal aus Schritt 2.4.2.3 enthalten.
      2. Stellen Sie "Intensity Center Ch=aSizeC+1" über 0,5 so ein, dass nur Stellen erhalten bleiben, deren geometrisches Zentrum im verfeinerten TH-Maskenkanal von 2.4.2.2 liegt (Voxelwert > 0,5). Dies ist das direkteste und strengste Kriterium für TH⁺ DAPI-Spotfilterung.
      3. Setze "Intensity Mean Ch=aSizeC+2" unterhalb [Schwellenwert], um Stellen zu behalten, deren durchschnittliche Intensität im Distanztransformationskanal aus Schritt 2.4.2.3 unter einem angegebenen Schwellenwert liegt. Untere Schwellenwerte wählen Stellen aus, die innerhalb oder extrem nahe an der TH-Oberfläche liegen; höhere Schwellenwerte umfassen Stellen, die zunehmend weiter entfernt sind. Dies ermöglicht eine empirische Kalibrierung der akzeptablen Nähe für die TH^+- Zuweisung.
      4. Vorkonfiguriertes Beispiel:
         SpotsParameterAss = {
         1.2, ['"Qualität" über 94,5,"Intensity Center Ch=aSizeC+1" über 0,5'];
         1,2, ['"Qualität" über 94,5,"Intensitätsmittelwert Ch=aSizeC+2" unter 0,0001'];
         1.2, ['"Qualität" über 94,5,"Intensity Mean Ch=aSizeC+2" unter 0,001'];
         1,2, ['"Qualität" über 94,5,"Intensitätsmittelwert Ch=aSizeC+2" unter 0,01'];
         ... Weitere Filterkombinationen werden im Skript bereitgestellt.
         };
      5. Für zukünftige Experimente mit denselben TH-Antikörper- und Konfokal-Einstellungen verwenden Sie die vorherigen Parameterkombinationen erneut. Löschen Sie jene schlechten Kombinationen, die erheblich von den tatsächlichen Zahlen abweichen, wodurch unnötige Rechenbelastung reduziert wird.
   6. Batch-Spot-Erstellung
      1. Speichere alle oben genannten Änderungen am Skript XT_Jove_Labkit_TH.m. Öffne ein neues 3D-Softwarefenster. Klicken Sie auf Menü Bildbearbeitung | PAM_TH_processing , das Skript in Batch auszuführen.
      2. Beachten Sie zunächst einige Minuten, dass das Skript für jede Filterkombination ein Spots-Objekt erstellt, das seine Parameter widerspiegelt, und dass Dateien aus dem konvertierten Ordner verarbeitet und als Kopien in einem neuen Ausgabeordner mit dem Suffix "processed" gespeichert werden. Dann lass den Computer unbeaufsichtigt.
      3. Nach Abschluss wird eine Tabelle erstellt. Beachten Sie die erste Spalte mit Dateinamen und die folgenden Spalten mit DAPI-Spots-Zahlen, die zu jeder Filterkombination passen, wobei Spaltenkopfzeilen den geschätzten XY-Durchmesser und die verwendete Filterstring angeben.
   7. Nachbearbeitungsvalidierung
      1. Nachdem Schritt 2.4.6 abgeschlossen ist, öffne manuell einige zufällige Dateien aus dem Ordner "processed" und untersuche die verschiedenen Spots-Objekte im Overlay mit dem ursprünglichen TH-Kanal. Basierend auf visueller Inspektion wählen Sie ein oder zwei optimale Filter aus, die die wahrste Darstellung der echten TH⁺ -Neuronenzählungen liefern. Exportiere die entsprechenden Spalten aus der Tabelle für die nachgelagerte statistische Analyse und Figurenerstellung.
      2. Um Spot-Count-Fehler in der bevorzugten Filterkombination zu korrigieren, wählen Sie die entsprechenden Spots-Objekte in der Surpass-Szene aus und klicken Sie auf den Reiter Bearbeiten . Entferne fehlerhafte Stellen manuell oder füge übersehene Stellen nach Bedarf hinzu, indem du Shift drückst und auf den Bildschirm klickst. Speichere die Updates mit Store als/Export as/Save as, um die entsprechende Datei im Ordner "processed" mit demselben Dateinamen zu überschreiben.
         HINWEIS: Löschen, hinzufügen, umbenennen oder verschieben oder verschieben Sie keine Spots-Objekte – bearbeiten Sie nur die bevorzugten Spots. Es sind keine Änderungen am Skript erforderlich; Führen Sie das Skript einfach erneut aus, um sofort eine aktualisierte Tabelle mit manuellen Verfeinerungen zu generieren. Zur Konsistenz lassen Sie entweder keine Bearbeitungen oder bearbeiten Sie die bevorzugten Spots-Objekte für alle Proben in einem Experiment.

Ergebnisse

Die von der Software gesammelten Rohdaten wurden in einem öffentlichen Repository abgelegt und sind unter folgendem DOI zugänglich: 10.5281/zenodo.19814348. Um die Nutzung dieser halbautomatisierten Quantifizierungspipeline zu demonstrieren, wandten wir sie auf ein gut etabliertes Drosophila-Modell der PD an, das panneuronale Expression von humanem α-Synuklein (nSyb-QF2>QUAS-SNCA) verwendet. Kontrollfliegen beherbergten allein den nSyb-QF2-Treiber . Beide Genotypen wurden 3 Wochen bei 29 °C gealtert, danach wurden Gehirne seziert, auf TH immungefärbt und für den PAM-Cluster abgebildet. Wie in Abbildung 3E gezeigt, erkannte die halbautomatisierte Pipeline eine signifikante Reduktion der PAM TH⁺-Neuronenzählungen bei α-Synuklein-exprimierenden Fliegen im Vergleich zu Kontrollgruppen (Student's t-Test, p < 0,0001), was zeigt, dass die Methode genotypabhängige Unterschiede innerhalb desselben experimentellen Batches erfassen kann. Die folgenden Abschnitte beschreiben die Montagekonfiguration (Abbildung 1), die Labkit-Trainingsschnittstelle (Abbildung 2) und die Bildverarbeitungsschritte (Abbildung 3), die diese Quantifizierung ermöglichen.

Abbildung 1 zeigt die Montagekonfiguration sezierter Drosophila-Gehirne und deren Einfluss auf die Bildgebung von PAM-Haufen. Nach der Dissektion zeigt das Gehirn gelegentlich eine Biegung oder Anlehnung des Gewebes neben dem durchtrennten ventralen Nervenschnur. Diese Hebung im ventralen Teil des Gehirns verändert die Perspektive unter dem Stereoskop, was zu einer veränderten Projektion der stereotypen Furche in der dorsalen Kontur und einer Veränderung der relativen Perspektive der ventralen Orientierungspunkte führt. (Abbildung 1B,C). Diese Verformung tritt oft in dem Moment auf, in dem das Gehirn vom Körper gelöst wird. Eine solche Verformung beeinflusst die Ausrichtung des PAM-Clusters während der Montage und beeinflusst folglich die erforderliche Z-Stack-Tiefe (Abbildung 1C,D). Unter optimalen Befestigungsbedingungen erzeugt der einschichtige Scotch-Tape-Abstandshalter eine ausreichende Kompression auf den zentralen Hirnbereich, wodurch der dorsal gelegene PAM-Cluster eine horizontale Ausrichtung unmittelbar neben dem Deckdeckel annimmt. Diese Konfiguration ergibt Z-Stacks von 15–25 Schnitten mit 0,34 μm-Intervallen (Abbildung 1D). In der anderen Bedingung behält der PAM-Cluster eine geneigte Position, was tiefere Z-Stacks erforderlich macht (Abbildung 1D). Ähnlich liefert der Einsatz eines doppelschichtigen Bandabstandshalters keine ausreichende Kompression, sodass der PAM-Cluster in seiner nativen, geneigten Konformation bleibt und die Z-Stack-Tiefe zunimmt (Abbildung 1D). Abbildung 1E zeigt repräsentative seitliche Projektionsansichten von TH-gefärbten Z-Stacks sowohl unter optimal positionierten als auch geneigten Bedingungen.

Abbildung 2 zeigt die Labkit-Benutzeroberfläche und einen repräsentativen Trainings-Workflow. Mit nur wenigen spärlichen Kritzelei-Annotationen auf einer einzelnen Probe (Abbildung 2A) erzeugt der anfängliche Pixelklassifikator bereits eine bemerkenswert vernünftige Segmentierung (Abbildung 2B). Es ist jedoch entscheidend zu betonen, dass eine solche minimale Annotation für eine robuste, generalisierbare Leistung über einen gesamten Datensatz hinweg nicht ausreicht. Wesentlich eine iterativere Markierung – die mehrere Z-Schnitte, Proben und Färbungsvariationen umfasst – ist erforderlich, um einen Klassifikator zu erzeugen, der TH⁺ -Neuronen zuverlässig über den gesamten Datensatz segmentiert. Bemerkenswert ist, dass die mehreren Trainingsbilder entlang der Zeit- (Rahmen-)Dimension angeordnet sind, anstatt entlang der Z-Achse gestapelt zu sein. Dieses Design bewahrt die räumliche Integrität jedes einzelnen Gehirnvolumens und stellt sicher, dass 3D-Filterkerne ausschließlich innerhalb – nicht quer über – biologische Proben hinweg arbeiten. Würden Proben stattdessen vertikal zu einem dicken Z-Stapel gestapelt, würden Z-Schnitte an den Grenzen zwischen benachbarten Proben räumlich zusammenhängen, wodurch Voxel aus verschiedenen Gehirnen als benachbarte Strukturen behandelt würden, was das Risiko unnötiger manueller Korrekturen erhöht (Abbildung 2C). Eine Verkettung entlang der Zeitachse vermeidet eine solche Kreuzprobenkontamination und ermöglicht gleichzeitig ein effizientes, mehrprobenübergreifendes Training in einer einzigen Labkit-Sitzung.

Abbildung 3 veranschaulicht die Nachbearbeitungspipeline und die endgültige Quantifizierung. Rohe Labkit-Segmentierungsmasken (Abbildung 3A) enthalten zahlreiche kleine falsch-positive Flecken und innere Löcher. Nach Anwendung morphologischer Denoisierungs- und Lochfüllungsoperationen (Abbildung 3B) wird eine geglättete TH-Oberfläche konstruiert und verwendet, um eine verfeinerte binäre Maske zu erzeugen (Abbildung 3C). Die durch diese Verfeinerung erzielte Verbesserung wird als Überlagerung dargestellt, die die Anfangs- und Endmaske vergleicht (Abbildung 3D, oben). Bemerkenswert ist, dass einige TH-reiche Neuritregionen gelegentlich in der Endmaske erhalten bleiben; diese Bereiche sind jedoch fast immer frei von DAPI-gefärbten Kernen und tragen daher kaum zur endgültigen Neuronenzahl bei. Fortgeschrittene Nutzer können die morphologischen Parameter im bereitgestellten Batch-Verarbeitungsskript weiter anpassen, um die Eliminierung solcher Restartefakte zu feinjustieren. Abbildung 3D (unten) zeigt die finalen DAPI-Punkte (magenta), die auf dem TH-Kanal (grün) aus einer Maximalintensitätsprojektion überlagert sind. Abbildung 3D zeigt außerdem eine seltene Art von Falsch-Positives, die gelegentlich in unserer Pipeline beobachtet wird: Ein DAPI-gefärbter Kern, der sich in einer TH-reichen Neuritregion befindet, kann fälschlicherweise als TH⁺-Fleck klassifiziert werden, wenn das Neuritsignal stark mit dem Kern überlappt. Wie in Abbildung 3C dargestellt, sind DAPI-positive Kerne in der Nähe von Neuriten jedoch im Allgemeinen spärlich. Außerdem bleiben die wenigen DAPI-Signale, die in der Nähe solcher Neuritregionen vorkommen, oft korrekt als echte Negative klassifiziert (d. h. nicht als TH⁺ gezählt), da sie von der Pipeline nicht falsch identifiziert werden. Abbildung 3E zeigt den praktischen Nutzen der Methode: 3 Wochen alte nSyb-QF2>SNCA-Fliegen zeigen eine signifikante Reduktion der PAM TH⁺ -Neuronenzählungen im Vergleich zu nSyb-QF2-Kontrollen über mehrere Filter hinweg (Student's t-Test, S. < 0,0001). Obwohl die absoluten Punktzahlen zwischen verschiedenen Filterkombinationen variieren können und die Methode keine perfekte Einzelpunktgenauigkeit erreicht, bleibt der relative Unterschied zwischen experimentellen und Kontrollgruppen robust. Bei mehreren getesteten Filtern bleibt das statistische Ergebnis des Gruppenvergleichs weitgehend über Filter innerhalb desselben experimentellen Batches erhalten. Dementsprechend sollte die Ausgabe als Inside-Batch-Vergleichsauslesung interpretiert werden, anstatt als fehlerfreie absolute Zählung der PAM-Neuronen.

Abbildung 1. Drosophila-Gehirndissektion und Montagekonfiguration. (A) Schaltplan der Gehirnmontage. Gelbe Balken stehen für Scotch-Tape-Abstandshalter. Ein vergrößertes Gehirnschema zeigt den ungefähren Standort des PAM-Clusters (lila). (B) Seitliche Querschnittspläne, die der gestrichelten Ebene in A entsprechen und zwei gängige Gehirnmorphologien nach der Sektion darstellen: optimal positioniert (oben) und geneigt (unten). (C) Zwei sezierte Fliegenhirne, unter einem Stereoskop betrachtet: optimal positioniert (links) versus geneigt (rechts). Gelbe Pfeile zeigen die stereotype Furche entlang der dorsalen Kontur. Blaue gestrichelte Linien verbinden zwei entsprechende Orientierungspunkte auf der linken und rechten Seite der ventralen Hälfte. Blaue Pfeile verdeutlichen die daraus resultierende Verschiebung der relativen Perspektive dieser ventralen Orientierungspunkte. Skalenleiste = 500 μm. (D) Schematische Darstellung, die zeigt, wie Gehirnmorphologie und Bandabstandsdicke (Einzel- vs. Doppelschicht) die vertikale Positionierung des PAM-Clusters und folglich die erforderliche Z-Stack-Tiefe beeinflussen. (E) Repräsentative seitliche Ansichten (Y-Projektion) von TH-gefärbten konfokalen Z-Stacks aus optimal positionierten (oberen) und deformierten (unteren) Montagebedingungen. Skala = 5 μm. Abkürzung: PAM = protocerebraler anterior medial. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2. Labkit-Training und interaktive Segmentierung. (A) Labkit-grafische Benutzeroberfläche. Anmerkungen (Kritzeleien) werden in zwei Klassen dargestellt: Vordergrund (rot) und Hintergrund (blau). (B) Segmentierungsergebnis, das unmittelbar nach dem Training auf den in A gezeigten Kritzeleien generiert wird. Rot zeigt die Vordergrundfarbe an; Blau zeigt die Hintergrundfarbe an. Skalenbar = 5 μm. (C) Übersprechen zwischen benachbarten Z-Schnitten. Einzelschnitt-Bilder fluoreszierender protein-markierter Mitochondrien aus verschiedenen Fliegenhirnen wurden entlang der Z-Achse verkettet. Schnitte 1 und 3 sind identische Kopien desselben Bildes, während Schnitte 2 und 4 aus unterschiedlichen Gehirnen stammen. Gelbe Pfeile, Vorhersage-Durchlauf von Schnitt 2 in Schnitt 1. Grüne Pfeile, Vorhersage durchfließt von Schnitt 4 in Schnitt 3. Skala = 3 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3. Nachbearbeitung von Labkit-Segmentierungsmasken und TH^+-Neuronquantifizierung. (A) Roh-Labkit-Binärmaske (cyan, obere) und überlagert mit dem ursprünglichen TH-Kanal (unten). Beachten Sie reichlich kleine Sprenkel und unvollständige Befüllung der neuronalen Zellkörper. (B) Maske nach morphologischer Deoisation und Lochfüllung (magenta, obere); Overlay mit TH-Kanal (unten). (C) Verfeinerte binäre Maske (rot, oben) von einer geglätteten TH-Oberfläche für B und Neumaskierung; Overlay mit TH-Kanal (unten). (D) Oberseite: Überlagerung von rohen (cyanfarbenen) und verfeinerten (roten) Masken, die durch Nachbearbeitung korrigierte Bereiche hervorhebt. Unten: Projektion mit maximaler Intensität, die finale DAPI-Punkte (magenta) zeigt, die auf dem TH-Kanal (grün) überlagert sind. Beachten Sie, dass die beiden Punkte in der oberen rechten Ecke vom kontralateralen PAM-Cluster ausgehen. Filter 4 wurde zur Veranschaulichung verwendet. (E) Quantitative Validierung in einem Parkinson-Modell mit mehreren Filterkombinationen. Drei Wochen alte nSyb-QF2>SNCA (PD-Modell) Fliegen zeigen eine signifikante Reduktion der PAM TH⁺-Neuronenzahlen im Vergleich zu nSyb-QF2-Kontrollen in mehreren Filtern (oben). Rohdaten werden in einer Tabelle (unten) bereitgestellt. filter 1: 1.2, ['"Quality" above 94,5,"Intensity Mean Ch=aSizeC+2" unter 0.0001']; filter 2: 1.2, ['"Quality" above 94,5, "Intensity Mean Ch=aSizeC+2" unter 0.001']; filter 3: 1,2, ['"Qualität" über 94,5,"Intensitätsmittelwert Ch=aSizeC+2" unter 0,01']; filter 4: 1,2, ['"Quality" above 94,5,"Intensity Mean Ch=aSizeC+2" unter 0,05']; filter 5: 0,6, ['"Quality" above 94,5,"Intensity Mean Ch=aSizeC+2" unter 0.001']; filter 6: 0,6, ['"Qualität" über 94,5,"Intensitätsmittelwert Ch=aSizeC+2" unter 0,01']; filter 7: 0,9, ['"Qualität" über 94,5,"Intensitätsmittelwert Ch=aSizeC+2" unter 0,01']; n = 57 Gehirne (Kontrolle), n = 65 Gehirne (PD); Schüler-t-Test, p < 0,0001 (****). Die Fliegen wurden bei 29 °C kultiviert. Skalenbalken = 5 μm (A–D). Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Akte 1. Fiji-Makro zum Aufteilen des TH-Kanals aus konvertierten Bilddateien und zum Speichern der Ausgabestapel.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 2. Fiji-Makro zum Zuschneiden von Trainings-Z-Stacks auf eine gemeinsame Z-Slice-Tiefe und das Zusammenfügen in eine Zeitraffer-TIFF-Datei für das Training von Labkit-Klassifikatoren.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 3. Vortrainierter Labkit-Klassifikator, der zum Testen des PAM TH-Segmentierungsworkflows verwendet wird.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 4. MATLAB-Skript zur Batchverarbeitung von Labkit-Masken, zur Erzeugung von DAPI-Punkten, zur Anwendung von Filterkombinationen und zum Export von TH⁺ -Neuronenzählungen.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die Quantifizierung von DA-Neuronen im Drosophila-PAM-Cluster war historisch gesehen eine gewaltige Herausforderung. Hier präsentieren wir einen halbautomatisierten Workflow, der maschinell-learningbasierte Pixelklassifikation mit Bildanalysesoftware integriert, um dieses langjährige Problem anzugehen. Diese Methode ermöglicht den Nachweis von Variationen in TH^+- Neuronen im PAM-Cluster auf Batch-Ebene zwischen Gruppen desselben Experiments und unterstützt vergleichende Studien in Parkinson-Modellen¹⁸.

Bei der Auswahl des optimalen Filters für ein gegebenes Experiment können Nutzer entweder den Filter wählen, der am besten zur visuellen Inspektion der Rohbilder passt, oder auf den gemeldeten Bereich und/oder Durchschnitt der Wildtyp-PAM-Neuronenzahlen in der Literatur^12,13 zurückgreifen. Vorsicht ist jedoch geboten: Nur zwei Studien haben PAM-Clusterzählungen gemeldet, von denen keiner PD-bezogen ist, und die berichteten Werte zeigen erhebliche Inkonsistenzen. Außerdem kann die Standardabweichung mit dem Alter zunehmen, was die Querstudienvergleiche weiter erschwert. Daher sollte literaturbasierte Referenz nur als grobe Orientierung verwendet werden, nicht als absoluter Standard. Wir erkennen an, dass diese Pipeline keine fehlerfreien absoluten Zählungen liefert (Abbildung 3D). Solange die Vergleiche jedoch auf Gruppen innerhalb desselben experimentellen Batches beschränkt sind (d. h. Daten nicht über verschiedene Batches in einem einzigen Plot zusammengeführt werden), kann die Methode verwendet werden, um relative Unterschiede zwischen Genotypen oder Behandlungsbedingungen innerhalb eines Batches zu erkennen.

Nach unserer Erfahrung sollten AF488-konjugierte sekundäre Antikörper aufgrund des hohen Hintergrunds vermieden werden, und AF546 aufgrund der höheren Signalabschwächung entlang der Z-Achse. Wir stellten außerdem fest, dass eine gründliche DAPI-Inkubation und -Waschung entscheidend sind, um ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis und klare nukleare Signale zu erreichen, was die Leistung der automatisierten Segmentierung direkt beeinflusst. DAPI ist für diese Anwendung Hoechst vorzuziehen, da die bevorzugte Färbung von Heterochromatin hellere und schärfer definierte Kernflecken erzeugt, was eine genauere Detektion ermöglicht.

Diskussion zur Fehlerbehebung häufiger Fehlerarten

Fleckenbedingte Versagen. Die Dissektionsfähigkeit ist ein wesentlicher Faktor für die Datenqualität. Der PAM-Cluster befindet sich oberflächlich und kann leicht beschädigt werden, wenn die beiden Trachealsäcke und das dorsale Fett in diesem Bereich entfernt werden. Die Pinzette sollte vorsichtig behandelt werden, um das Piercing oder die Kompression des PAM-Bereichs zu vermeiden. Eine ventrale Deformation tritt häufig in dem Moment auf, in dem das ventrale Nervenkabel durchtrennt wird, wodurch das Gehirn beim Platzieren auf einem Glasträger kippt oder sich krümmt; diese Deformation kann nach der PFA-Inkubation dauerhaft fixiert werden. Nutzer sollten während des Abtrennens mit Pinzettenwinkeln experimentieren, um eine optimale Technik zu finden. Wenn nach der Dissektion eine Neigung beobachtet wird, kann ein sanfter Druck auf den erhöhten Bereich die Verformung umkehren (akzeptabel, wenn die komprimierte Fläche nicht das gewünschte Gebiet ist).

Segmentierungsfehler. Schlechte Segmentierung entsteht meist durch unzureichend vielfältige Trainingsdaten. Der Labkit-Klassifizierer muss an einem repräsentativen Satz von Bildern trainiert werden, die das gesamte Spektrum der Färbungsqualität innerhalb der Charge abdecken, einschließlich beste, durchschnittlicher und schlechtester. Während der iterativen Korrektur priorisieren Sie das Annotieren von Falsch-Positiven und Falsch-Negativen, bei denen Sie sich sicher sind. Vermeiden Sie es, mehrdeutige oder unsichere Bereiche zu korrigieren, da dies den Klassifikator in die Irre führen und die Leistung beeinträchtigen könnte.

Fehlschläge bei der Spot-Erkennung. Die Parameteroptimierung erfordert eine systematische Untersuchung einer kleinen Teilmenge repräsentativer Stichproben. Testen Sie unterschiedliche geschätzte Spot-Durchmesser und Qualitätsfilter-Schwellenwerte oder sogar Filtertypen jenseits des in diesem Protokoll verwendeten "Quality above"-Filters. Der Spot-Erstellungsassistent bietet verschiedene Filteroptionen (z. B. Intensität). Nutzer werden ermutigt, Filterschwellenwerte und -typen an ihren spezifischen Datensatz anzupassen und vor der Batchverarbeitung empirische Abstimmungen durchzuführen.

Warum bleibt das manuelle Zählen von PAM-Clusterneuronen außergewöhnlich schwierig? Der PAM-Cluster weist einzigartige anatomische und Färbungsmerkmale auf, die traditionelle manuelle Zählmethoden unzureichend machen. Erstens markiert die TH-Immunfluoreszenz im Zytosol von Drosophila-dopaminergen Neuronen überwiegend einen dünnen zytoplasmatischen Ring, der einen großen, unverfärbten Kernraum umgibt. Folglich weisen der DAPI-gefärbte Kern und das TH⁺ zytoplasmatische Kompartiment minimale räumliche Überlappung auf. Dieses grundlegende Fehlen von Kolokalisierung schließt die direkte Klassifikationsstrategie "DAPI-Spot in der TH-Maske" aus. Zweitens besteht der PAM-Cluster aus über 100 dicht gepackten Neuronen, die in einer dreidimensionalen, traubenartigen Architektur angeordnet sind. Während man durch konfokale Z-Stacks navigiert, erscheinen und verschwinden allmählich Neuronen – einige treten in die Ebene ein, andere verlassen es – was eine hohe kognitive Belastung und eine erhebliche Inter-Beobachter-Variabilität erzeugt. Die jüngste Studie zur Quantifizierung von PAM-DA-Neuronen basierte auf manuellem Zählen mit dem Cell-Counter-Plugin von ImageJ. Obwohl dieser Ansatz für kleinere Cluster wie PPM1/2 oder PPL1 völlig angemessen ist, wird er bei Anwendung auf den PAM-Cluster unerschwinglich arbeitsintensiv, insbesondere bei Studien, die Dutzende oder Hunderte von Proben benötigen.

Warum eignet sich Labkits Random Forest-Architektur besonders gut für die Segmentierung von TH-Neuronen? Labkit implementiert einen zufällig waldbasierten Pixelklassifikator, der außergewöhnlich gut an die spezifischen Herausforderungen von TH-gefärbten PAM-Clusterbildern angepasst ist. Der Algorithmus berechnet für jedes Pixel einen umfassenden Merkmalsvektor, indem er eine Kaskade von Transformationsfiltern anwendet, darunter Gaußsche Unschärfe, Differenz der Gaußschen Eigenwerte, Gaußsche Gradientenstärke, Laplace-Operator des Gaußschen und Hessische Eigenwerte – jeweils auf mehreren Sigma-Skalen ausgewertet (1, 2, 4, 8). Diese mehrskalige Merkmalsextraktion erfasst effektiv die texturalen und Randmerkmale, die das nukleare Innere vom extrazellulären Hintergrund unterscheiden. Wichtig ist, dass Zufallswälder um Größenordnungen weniger Trainingsdaten benötigen als Deep-Learning-Ansätze, sodass Nutzer den Klassifikator iterativ mit spärlichen Kritzelei-Annotationen auf so wenigen wie 20–40 repräsentativen Bildern verfeinern können. Jede Iteration fügt dem Ensemble neue Entscheidungsbäume hinzu, die gemeinsam dafür stimmen, jeden Pixel zu klassifizieren. Dieser Prozess berücksichtigt von Natur aus die Variabilität von Charge zu Charge bei Färbungs- und Bildgebungsbedingungen – ein entscheidender Vorteil angesichts der biologischen Variabilität, die bei Drosophila-Genkreuzungen und Alterungsstudien innewohnt. Mit diesem Ansatz kann der TH⁺ -Neuronverlust in α-Synuklein-exprimierenden Parkinson-Modellen nachgewiesen werden, und die Effekte genetischer Enhancer und Suppressoren auf die Anzahl von PAM-Cluster-Neuronen können innerhalb einer experimentellen Charge verglichen werden.

Wichtig ist, dass für das Training die zugeschnittenen Stapel entlang der Zeitdimension verkettet werden, anstatt entlang der Z-Achse gestapelt zu werden. Diese Designentscheidung ist entscheidend für optimales Training des Klassifikators. Labkits 3D-Pixelklassifikation berücksichtigt Voxelinformationen über aufeinanderfolgende Z-Schnitte, was für die genaue Auflösung des dünnen, zytoplasmatischen TH-Rings, der die Morphologie des PAM-Neurons definiert, unerlässlich ist. Wenn die einzelnen Proben stattdessen vertikal zu einem einzigen, ultradicken Z-Stapel gestapelt würden, würden die Z-Schnitte an den Rändern zwischen benachbarten Proben räumlich zusammenhängend im Stapel werden. Folglich würden Voxel, die zu verschiedenen biologischen Proben gehören, als benachbarte Strukturen innerhalb desselben dreidimensionalen Volumens behandelt. Während des interaktiven Trainings kann ein Kritzelei, das in der Nähe einer solchen Grenze gezeichnet wird, unbeabsichtigt Merkmale aus zwei verschiedenen Stichproben gleichzeitig erfassen, was den Klassifikator verwirrt (Abbildung 2B, Pfeile). Außerdem könnten falsch-positive Signale, die von einer Probe stammen, in das Volumen der benachbarten Probe projizieren, was zu fehlerhaften Korrekturkritzeleien führt, die sich durch nachfolgende Trainingiterationen weiterentwickeln und Entscheidungsbäume erzeugen, die biologisch bedeutungslose Regeln kodieren. Das Aneinanderreihen von Proben entlang der Zeitachse bewahrt die räumliche Integrität jedes einzelnen Volumens, sodass die 3D-Filter-Kerne ausschließlich innerhalb – nicht quer – biologische Proben arbeiten können, während gleichzeitig effizientes, mehrprobenübergreifendes Training in einer einzigen Labkit-Sitzung ermöglicht wird.

Methodologische Überlegungen und Einschränkungen

Mehrere wichtige Vorbehalte verdienen eine Diskussion. Erstens ist dieses Protokoll speziell für den PAM-Cluster optimiert und lässt sich möglicherweise nicht auf andere DA-Cluster (z. B. PPM1/2/3, PPL1) oder auf TH⁺ -Neuronen in den optischen Lappen verallgemeinern. Der PAM-Bereich profitiert von relativ dünner DAPI-Dichte, wobei die Kerne im dreidimensionalen Raum gut getrennt sind, was eine robuste und eindeutige DAPI-Punkterkennung ermöglicht. Im Gegensatz dazu ist dieser Workflow nicht leicht auf andere DA-Cluster wie PPL1 oder PPM1/2 übertragbar. In diesen Regionen sind Neurite häufiger neben oder überlappen DAPI-gefärbte Kerne von Nicht-DA-Zellen. Angesichts der sehr geringen Ausgangszahl von DA-Neuronen in diesen kleinen Clustern (oft weniger als 10 Zellen pro Cluster) können selbst wenige Fehlklassifikationen zu proportional großen Fehlern führen, was die Methode für solche Anwendungen weniger zuverlässig macht. Zweitens markiert die TH-Immunfärbung auch Neurite und axonale Projektionen im Neuropil. Trotz korrektiver Annotationen während des Trainings erzeugen diese Faserbahnen gelegentlich starke TH-Signale und können vom Klassifikator fälschlicherweise als Vordergrund klassifiziert werden. Diese Regionen im PAM-Cluster sind jedoch fast immer frei von DAPI-gefärbten Kernen; daher tragen falsch-positive Voxelle im neuritreichen Bereich des PAM-Clusters minimal zur endgültigen Neuronenzählung bei. Drittens arbeitet Labkits Pixelklassifikation auf lokalen Texturmerkmalen innerhalb einer endlichen Nachbarschaft (Standard-Filter-Kernel reagieren auf etwa 16 × 16 Pixel Fenster). Dieses Design gewährleistet die Recheneffizienz und ermöglicht interaktive Echtzeitsegmentierung, bedeutet aber auch, dass der Klassifikator den globalen anatomischen Kontext nicht nutzen kann. Daher können seltene Artefakte oder Unregelmäßigkeiten, die erheblich vom Trainingsset abweichen, eine Fall-zu-Fall-Kuratierung erfordern. Schließlich erzeugt die hier beschriebene Batch-Verarbeitungspipeline – die Labkit-Segmentierung mit DAPI-Spot-Erkennung und Entfernungstransformation integriert – mehrere Ausgangskanäle und Filterkombinationen. Nutzer sollten systematisch die optimalen Filterparameter für ihre spezifischen experimentellen Bedingungen validieren, anstatt die in diesem Protokoll dargestellten Standardschwellenwerte unkritisch zu übernehmen.

Zukünftige Anwendungen

Über das hier demonstrierte PD-Modell hinaus kann diese halbautomatisierte Pipeline direkt auf jedes Drosophila-Modell angewendet werden, das die Quantifizierung von DA-Neuronen im PAM-Cluster umfasst, einschließlich Studien zu Lernen und Gedächtnis, Motivation, Schlafregulation und altersbedingter Neurodegeneration. Insbesondere könnte die Batch-Verarbeitungskapazität dieser Methode sie geeignet machen für: (1) Medikamententests mit mittlerem bis hohem Durchsatz: Das Testen mehrerer neuroprotektiver Verbindungen über verschiedene Dosen hinweg wird ohne eine proportionale Erhöhung des manuellen Zählaufwands praktikabler. (2) Genetische Modifikator-Screens: Quantifizierung der Anzahl von PAM-Neuronen in Hunderten von genetischen Kreuzungen (z. B. RNAi-Linien, Überexpressionslinien) zur Identifizierung von Enhancern oder Suppressoren der α-Synuklein-Toxizität. (3) Longitudinale Alterungsstudien: Verfolgung des PAM-Neuronenverlusts über mehrere Zeitpunkte hinweg mit reduzierter manueller Zählbelastung. Darüber hinaus ist der Labkit-basierte Segmentierungsworkflow nicht auf TH-Färbung beschränkt; mit entsprechender Umschulung kann sie angepasst werden, um andere neuronale Populationen im Gehirn von Drosophila zu quantifizieren, vorausgesetzt, sie teilen zwei zentrale Merkmale mit dem PAM-Cluster: eine relativ geringe Dichte von DAPI-gefärbten Kernen und minimale Interferenz durch Neurit-Färbungen. Über Labkit und die hier verwendete 3D-Software hinaus kann die Gesamtlogik dieser Pipeline – maschinell-lernbasierte Pixelklassifikation gefolgt von Spoterkennung und Entfernungstransformation – in anderen unterstützten 3D-Bildanalyseplattformen implementiert werden, wodurch die Zugänglichkeit und Flexibilität für die breitere Forschungsgemeinschaft erhöht wird.

Zusammenfassend präsentieren wir einen halbautomatisierten Workflow zur Erkennung von Gruppenunterschieden in der TH⁺-Neuronenzahl des PAM-Clusters. Durch die Kombination von Labkit-basierter Pixelklassifikation mit Spotdetektion und Entfernungstransformation ermöglicht diese Methode den Vergleich der TH⁺-Neuronenzahlen zwischen experimentellen und Kontrollgruppen innerhalb derselben Charge, während der manuelle Zählaufwand mit zunehmender Stichprobengröße reduziert wird. Die Skalierung von mehreren zehn bis hunderten von Stichproben erhöht die Rechenzeit proportional, aber der zusätzliche manuelle Aufwand beschränkt sich hauptsächlich auf Dateiorganisation und Stichprobenprüfung der Qualität. Obwohl der PAM-Cluster bisher wenig Aufmerksamkeit in der PD-Forschung erhalten hat, liegt dies größtenteils an technischen Einschränkungen und nicht an biologischer Irrelevanz. Durch die Bereitstellung eines praktischen Quantifizierungswerkzeugs wird unser Protokoll in Zukunft die Untersuchung erleichtern, ob und wie PAM-Neuronen in PD-Modellen degenerieren, und ihren potenziellen Beitrag zu nichtmotorischen Symptomen wie olfaktorischen Defiziten und motivationalem Rückgang untersuchen. Wir erwarten, dass dieses Protokoll Batch-Studien zur dopaminergen Neurodegeneration, synaptischen Plastizität und neuroprotektiven Medikamentenscreenings im Drosophila-Modellsystem erleichtern wird.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3D-Bildverarbeitungssoftware – Bitplane Imaris 8.0+	Oxford Instruments	http://www.bitplane.com/	In dieser Studie verwendete 3D-Bildanalyse-Software
4',6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	62248
D. melanogaster: nSyb-QF2	Bloomington Drosophila Aktienzentrum	51960
D. melanogaster: nSyb-QF2>QUAS-SNCA	Bloomington Drosophila Aktienzentrum	600605
DOWSIL SYLGARD 184	Tat Lee Engineering Pte Ltd	https://www.tatlee.com.sg/
Dumont-Pinzette Styple 3C Dumoxel, 0,04/0,08 mm	Elektronenmikroskopiewissenschaften	72680-D (0203-3C-PO)
FV3000 konfokal	Olympus	https://www.olympus-global.com/
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) kreuzadsorbierter sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244
ImageJ/Fiji (1,53q)	Fiji/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/
Labkit	Fiji/ImageJ	https://imagej.net/plugins/labkit/
Minutien-Pins, Edelstahl, 0,15 mm Durchmesser	Austerlitz	https://mothandbeetle.com/products/austerlitz-stainless-steel-minutens.html
Normales Ziegenserum, lyophilisierter fester Stoff	Sigma-Aldrich	566380
Numerische Rechensoftware – Python	Python	3.8+
Numerische Rechensoftware – Matlab	Mathematische Arbeit	R2016a+	In dieser Studie verwendete numerische Rechensoftware
Octylphenolethoxylat (Triton X-100)	Bio-Rad	1610407
Paraformaldehydlösung 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnologie	SC-281692
Polystyrolzellkulturschale	Nest Scientific	706001
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36934
Kaninchen-Antityrosin-Hydroxylase (TH)	Pel Freeze	P40101-0
Natriumazid	Sigma-Aldrich	S2002
Stereoskop	Olympus	SZ51
Sterican Einmalkanü len 27 G grau 0,40 x 12 mm&nbske;	Sterican	D-34209
Spritze, 1 ml	Terumo	DVR-5175
Transparentes Klebeband	3M Scotch 600, frei	600