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Forschungsartikel
* These authors contributed equally
Mit Hilfe öffentlicher Bluttranskriptom-Datensätze identifizierte diese Studie potenzielle Biomarker für Bluthochdruck, die mit dem Renin-Angiotensin-System (RAS) verbunden sind. Bioinformatik und maschinelles Lernen lieferten eine acht-Gen-Signatur, die in einer unabhängigen blutbasierten Kohorte getestet wurde und RAS-Transkriptom-Veränderungen mit Immun- und Entzündungssignaturen in Verbindung brachte, die weitere Validierung erfordern.
Diese Arbeit zielte darauf ab, Kandidaten-Renin-Angiotensin-System (RAS)-bezogene Bluttranskriptom-Biomarker zu identifizieren, die mit Bluthochdruck assoziiert sind, ein extern getestetes Kandidaten-Diagnosemodell zu erstellen und ausgewählte Gene in einem Ang-II-induzierten Endothelzellmodell zu validieren. Zwei öffentliche Microarray-Datensätze, GSE75360 und GSE74144, wurden analysiert. Die differentielle Expressionsanalyse wurde mit Limma durchgeführt, gefolgt von GO/KEGG-Anreicherung, vorbewertetem GSEA, CIBERSORT-Immuninfiltrationsanalyse, Protein-Protein-Interaktion und regulatorischen Netzwerkaufbau sowie maschinell-learningbasierter Merkmalsauswahl mittels logistischer Regression und Zufallswald. Ein logistisches Regressionsmodell auf Basis der ausgewählten Gene wurde in GSE75360 entwickelt und extern in GSE74144 getestet. Die experimentelle Validierung wurde in Ang-II-induzierten HUVECs unter Verwendung von qRT-PCR, Western Blotting, ELISA und CST3/FURIN-Verlust- und -Gewinn-Assays durchgeführt, gefolgt von CCK-8-, Transwell-, Entzündungs-, oxidativen Stress- und Endothelfunktionsanalysen. Im GSE75360 wurden 173 differenziell exprimierte Gene identifiziert, darunter 18 RAS-bezogene differenziell exprimierte Gene. Acht Kandidatengene, LRP1, CTSD, MTHFR, AUTS2, FURIN, CST3, FCER1G und TBXAS1, wurden durch kombinierte maschinelle Lernanalysen ausgewählt. Anreicherungs- und Immuninfiltrationsanalysen zeigten, dass diese Gene hauptsächlich mit Immun- und Entzündungssignaturen assoziiert sind. Das Acht-Gen-Modell zeigte eine hohe Diskriminierung bei GSE75360 und behielt moderate Leistung bei GSE74144. Bei mit Ang II behandelten HUVECs wurden die meisten Kandidatengene auf mRNA-Ebene hochreguliert, und CST3, FURIN und TBXAS1 wurden auf Proteinebene weiter validiert. CST3- und FURIN-Modulation veränderten die durch Ang II induzierte Endothelvitalität, Migration, Expression von Entzündungs-/Adhäsionsmarkern, ROS-Akkumulation und eNOS/NOS-bezogene funktionelle Anzeigen. Diese Studie identifizierte kandidatische RAS-bezogene Biomarker und immunassoziierte Signaturen bei Bluthochdruck und entwickelte ein extern getestetes Kandidat-Diagnosemodell. Die in-vitro-Ergebnisse stützen die funktionelle Relevanz von CST3 und FURIN bei Ang-II-induzierten Endothelreaktionen und rechtfertigen eine weitere klinische und mechanistische Validierung.
Diese Studie konzentriert sich auf Bluthochdruck, eine chronische Herz-Kreislauf-Erkrankung, die weltweit verbreitetist 1. Bluthochdruck erhöht das Risiko schwerwiegender gesundheitlicher Komplikationen, einschließlich kardiovaskulärer und zerebrovaskulärer Ereignisse sowie Nierenschäden, erheblich. Dies stellt eine ernsthafte Bedrohung für die Lebensqualität und Langlebigkeit der Patienten dar und verursacht eine erhebliche soziale und wirtschaftliche Belastung 2,3. Derzeit basieren die Diagnose und Behandlung von Bluthochdruck hauptsächlich auf Blutdr....
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Überblick über den Analyse-Workflow
Das Gesamtdesign der transkriptomischen und maschinell-learning-basierten Analyse dieser Studie ist in Abbildung 1 dargestellt und umfasst die wichtigsten Schritte: Sammlung von Renin-Angiotensin-System-verwandten Genen (RASRGs); Screening von RAS-bezogenen, differenziell exprimierten Genen (RASRDEGs) aus Hypertoniedatensätzen; funktionale Anreicherungsanalyse (GO/KEGG/GSEA); Immuninfiltrationsanalyse (CIBERSORT); Aufbau von Protein-Protein-Interaktionen (PPI) und regulatorischen Netzwerken; maschinell-learningbasierte Schlüsselgen-Auswahl (logistische Regres....
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Reinigung von Hypertonie-Datensätzen
Um die Zuverlässigkeit nachfolgender Analysen sicherzustellen, wurden Datensätze GSE75360 und GSE74144 zunächst einer Probe-Annotation und Datennormalisierung mittels des R-Pakets limma unterzogen. Die Verteilungen der Genexpressionswerte vor und nach der Normalisierung sind in Supplemental File 1 – Supplemental Abbildung S1A-D dargestellt, wobei Orange die Hypertonieproben und Blau die Kontrollproben darst.......
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Bluthochdruck ist eine komplexe Herz-Kreislauf-Erkrankung, die RAS-Dysregulation, immuninflammatorische Aktivierung, Gefäßverletzungen und Endothelfunktionsstörungenumfasst. In der vorliegenden Studie haben wir zunächst öffentliche Bluttranskriptom-Datensätze und maschinelles Lernen verwendet, um RAS-bezogene Kandidaten-Biomarker zu identifizieren und ein extern getestetes Kandidat-Diagnosemodell zu erstellen. Anschließend erweiterten wir diese bioinformatischen E.......
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Beiträge der Autoren:
Konzeption und Design des Werks: Bai J, Wang Y;
Datenerhebung: Yang X X, Du L, Shi J H, Li X X, Bai M;
Aufsicht: Bai J, Wang Y;
Analyse und Interpretation der Daten: Yang X X, Du L, Shi J H, Li X X, Bai M;
Statistische Analyse: Bai J, Wang Y, Bai M;
Entwurf des Manuskripts: Bai J, Wang Y;
Kritische Überarbeitung des Manuskripts: alle Autoren;
Genehmigung des endgültigen Manuskripts: alle Autoren.
Finanzierung: Gansu Provincial Department of Education Higher Education Faculty Innovation Fund Project (Nr. 2026B-268)
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 96-Well-Zellkulturplatten | Verwendet für CCK-8-Zelllebensfähigkeitstests | ||
| Angiotensin II (Ang II) | Verwendet zur Induktion von Endothelschäden in HUVECs bei 100 nM für 48 h | ||
| Antibiotikalösung | Zugabe zum Endothelzellkulturmedium gemäß den Anweisungen des Lieferanten | ||
| BCA-Protein-Assay-Kit | Verwendet zur Bestimmung der Proteinkonzentration für Western-Blotting | ||
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Verwendet zur Beurteilung der HUVEC-Lebensfähigkeit/Proliferation | ||
| Chemilumineszenz-Nachweisreagenz | Verwendet zur Visualisierung von Western-Blot-Proteinbändern | ||
| ChIPBase v2.0 | Sun Lab / Forschungsressource | N/A | Datenbank zur Gewinnung von Transkriptionsfaktor-Ziel-Beziehungen für Hub-Gene |
| CIBERSORT | Stanford University / Newman Lab | N/A | Immunzell-Dekonvolutionsalgorithmus zur Schätzung der Häufigkeit von 22 Immunzelltypen |
| clusterProfiler (R-Paket) | Bioconductor | N/A | R-Paket für GO-, KEGG- und GSEA-Analysen |
| CO2-Zellkulturinkubator | Verwendet zur Kultivierung von HUVECs bei 37 °C mit 5% CO2 | ||
| Comparative Toxicogenomics Database (CTD) | NC State University / Mount Desert Island Biological Laboratory | N/A | Datenbank zur Vorhersage von Gen-Arzneimittel-Interaktionen |
| Vollständiges Endothelzellkulturmedium | Verwendet für die HUVEC-Kultur | ||
| Computerarbeitsplatz mit Internetzugang | Jede Standard-Forschungs-Computing-Plattform | N/A | Verwendet für Datendownload, Vorverarbeitung, statistische Analyse und Visualisierung |
| CST3 ELISA-Kit | Verwendet zum Nachweis von sezerniertem CST3 im Zellkulturüberstand | ||
| CST3-Überexpressions-Plasmid (oe-CST3) | Verwendet für CST3-Gain-of-Function-Experimente in HUVECs | ||
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | N/A | Software zur Visualisierung von mRNA-miRNA-, mRNA-TF- und mRNA-Drug-Regulatornetzwerken |
| DCF-Fluoreszenzsonde/ROS-Assay-Reagenz | Verwendet zum Nachweis intrazellulärer ROS-Spiegel | ||
| Leeres Vektorkontrollplasmid (oe-NC) | Verwendet als Überexpression-Kontrolle | ||
| Fötales Rinderserum | Ergänzung zum Endothelzellkulturmedium | ||
| FURIN-Überexpressionsplasmid (oe-FURIN) | Verwendet für FURIN-Gain-of-Function-Experimente in HUVECs | ||
| GeneCards | Weizmann-Institut für Wissenschaften | N/A | Datenbank zur Kuratierung von RAS-verwandten Genen |
| GeneMANIA | University of Toronto | N/A | Webbasiertes Werkzeug zur Identifizierung funktionell verwandter Gene |
| GEO-Datenbank | NCBI | N/A | Öffentliche Datenbank zum Zugriff auf GSE75360 und GSE74144 Datensätze |
| GEOquery (R-Paket) | Bioconductor | N/A | R-Paket zum Herunterladen von GEO-Datensätzen |
| ggDCA (R-Paket) | CRAN / GitHub-Quelle, die von Autoren verwendet wird | N/A | R-Paket zur Entscheidungskurvenanalyse |
| ggplot2 (R-Paket) | CRAN | N/A | R-Paket zur Datenvisualisierung |
| Humane umbilikale Venenendothelzellen (HUVECs) | Zellmodell für Ang II-induzierte Endothelschäden-Experimente | ||
| limma (R-Paket) | Bioconductor | N/A | R-Paket zur Normalisierung und Analyse der differentiellen Expression |
| MSigDB | Broad Institute | N/A | Gen-Set-Datenbank zur GSEA |
| Negativer Kontroll-siRNA (si-NC) | Verwendet als Knockdown-Kontrolle | ||
| Stickstoffmonoxid-Assay-Kit | Verwendet zur Messung der NO-Spiegel im Kulturüberstand | ||
| pheatmap (R-Paket) | CRAN | N/A | R-Paket zur Erstellung von Heatmaps |
| Primärantikörper gegen CST3 | Verwendet für Western Blotting | ||
| Primärantikörper gegen FURIN | Verwendet für Western Blotting | ||
| Primärantikörper gegen GAPDH | Verwendet als Western Blot-Ladekontrolle | ||
| Primärantikörper gegen TBXAS1 | Verwendet für Western Blotting | ||
| pROC (R-Paket) | CRAN | N/A | R-Paket zur Erstellung von ROC-Kurven und Berechnung der AUC |
| PubMed | U.S. National Library of Medicine | N/A | Literaturdatenbank zur Ergänzung der Kuratierung RAS-verwandter Gene |
| PVDF-Membran | Verwendet für den Proteintransfer beim Western Blotting | ||
| qRT-PCR-Primer | Verwendet zum Nachweis von Kandidatengenen und entzündlichen/endothelialen Markern | ||
| R-Software | R Foundation for Statistical Computing | N/A | Statistisches Computing-Umfeld für alle Analysen |
| randomForest (R-Paket) | CRAN | N/A | R-Paket für die Merkmalsauswahl durch Random Forest |
| RCircos (R-Paket) | CRAN / Bioconductor-assoziierte Ressource | N/A | R-Paket zur Visualisierung der chromosomalen Lokalisierung von RASRDEGs |
| Reverse-Transkriptase-Kit | Verwendet zur Synthese von komplementärer DNA | ||
| RIPA-Lysepuffer | Verwendet für die Gesamtproteinextraktion | ||
| rms (R-Paket) | CRAN | N/A | R-Paket zur Konstruktion des Nomogramms |
| RNA-Extraktionsreagenz | Verwendet zur Extraktion von Gesamt-RNA aus HUVECs | ||
| Sekundärantikörper | Verwendet für Western Blotting | ||
| siRNA, die auf CST3 abzielt (si-CST3) | Verwendet für CST3-Knockdown-Experimente | ||
| siRNA, die auf FURIN abzielt (si-FURIN) | Verwendet für FURIN-Knockdown-Experimente | ||
| starBase v3.0 | Sun Lab / Forschungsressource | N/A | Datenbank zur Identifizierung von miRNA-Ziel-Interaktionen |
| STRING | STRING Consortium | N/A | Datenbank zur Konstruktion des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks |
| SYBR Green qPCR-Reagenz | Verwendet für qRT-PCR-Nachweis | ||
| Transfektionsreagenz | Verwendet zum Transfizieren von siRNAs und Überexpressionsplasmiden in HUVECs | ||
| Transwell-Kammern | Verwendet für HUVEC-Migrationsassays |