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Überblick über den Analyse-Workflow
Das Gesamtdesign der transkriptomischen und maschinell-learning-basierten Analyse dieser Studie ist in Abbildung 1 dargestellt und umfasst die wichtigsten Schritte: Sammlung von Renin-Angiotensin-System-verwandten Genen (RASRGs); Screening von RAS-bezogenen, differenziell exprimierten Genen (RASRDEGs) aus Hypertoniedatensätzen; funktionale Anreicherungsanalyse (GO/KEGG/GSEA); Immuninfiltrationsanalyse (CIBERSORT); Aufbau von Protein-Protein-Interaktionen (PPI) und regulatorischen Netzwerken; maschinell-learningbasierte Schlüsselgen-Auswahl (logistische Regression, Zufallswald [RF]); und Bewertung des diagnostischen Modells für Bluthochdruck. Eine vollständige Liste der in dieser Studie verwendeten Software, Datenbanken und Online-Tools findet sich in der Materialtabelle.
Datendownload
Hypertonie-Datensätze GSE753608 und GSE74144 (Homo sapiens) wurden über das R-Paket GEOquery9 aus der GEO-Datenbank10 gewonnen. GSE75360 aus peripheren mononukleären Blutzellen (Plattform: GPL10558) abgeleitet, umfassten 10 Hypertonie- und 11 Kontrollproben; GSE74144 aus weißen Blutkörperchen gewonnenen (Plattform: GPL13497) umfassten 14 Hypertonie- und 8 Kontrollproben (Tabelle 1). Proteinkodierende RASRGs (1.264) wurden zunächst über GeneCards11 (Stichwort: "Renin-Angiotensin-System") und PubMed (Stichwort: "Renin-Angiotensin-System") 12,13 identifiziert. Die Schnittmenge dieser RASRGs mit Genen in GSE75360/GSE74144 ergab 1.159 endgültige RASRGs14. Die beiden Datensätze wurden getrennt verarbeitet, da sie auf unterschiedlichen Mikroarray-Plattformen generiert wurden. Die Probe-Annotation wurde gemäß den entsprechenden GPL-Plattform-Annotationsdateien durchgeführt, und normalisierte Genexpressionsmatrizen wurden für nachgelagerte Analysen verwendet. Boxdiagramme wurden verwendet, um Ausdrucksverteilungen vor und nach der Normalisierung zu vergleichen.
Hypertonie-bedingte, renin-angiotensin-bezogene, differenziell exprimierte Gene
Proben im GSE75360-Datensatz wurden in die Hypertoniegruppe und Kontrollgruppe eingeteilt. Die Limma-Software wurde eingesetzt, um eine differentielle Genexpressionsanalyse zwischen den beiden Gruppen14 durchzuführen, wobei differenziell exprimierte Gene (DEGs) durch die Schwelle von |logFC| identifiziert wurden. > 0,45 und p-Wert < 0,05. Die Ergebnisse dieser Differentialanalyse wurden anhand von Vulkandiagrammen visualisiert (erzeugt mit dem R-Paket ggplot2).
Um RASRDEGs zu erhalten, wurden DEGs, die die oben genannte Schwelle erfüllten (|logFC| > 0,45, p-Wert < 0,05), mit RAS-bezogenen Genen (RASRGs) abgeglichen und das Schnittergebnis über ein Venn-Diagramm präsentiert. Anschließend wurden die Expressionsmuster der identifizierten RASRDEGs als Heatmap mit dem R-Paket-Pheatmap visualisiert, und die chromosomale Lokalisierung der RASRDEGs wurde anhand von Chromosomenkarten dargestellt, die mit dem R-Paket RCircos15 erzeugt wurden.
Differenziell exprimierte Genvalidierung und ROC-Kurvenanalyse
Ein Intergruppen-Plot wurde erstellt, um RASRDEG-Expressionsunterschiede zwischen Hypertonie und Kontrolle in GSE7536016 zu analysieren; das R-Paket pROC wurde verwendet, um ROC-Kurven zu zeichnen und AUC (0,5–0,7: niedrige Genauigkeit; 0,7–0,9: moderat; >0,9: hoch) für die RASRDEG-Diagnostik zu berechnen.
Korrelationsanalyse
Spearmans Korrelationsanalyse wurde auf der RASRDEG-Expression in GSE75360 durchgeführt; Die Ergebnisse wurden über Heatmap (R-Paket ggplot2) visualisiert (|r| < 0,3: kein/schwache Korrelation; 0,3–0,5: schwach; 0,5–0,8: moderat; >0,8: stark).
Anreicherungsanalyse von GO und KEGG
GO (Gene Ontology, Release 2024, http://geneontology.org/) ist eine weit verbreitete Ressource für großflächige funktionelle Anreicherung und umfasst drei Bereiche: biologische Prozesse (BP), zelluläre Komponenten (CC) und molekulare Funktionen (MF)17. KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Release 109.0, 2024, https://www.genome.jp/kegg/) speichert Daten zu Genomen, Biowege, Krankheiten und Arzneimitteln18.
RASRDEGs wurden der GO-Annotation und der KEGG-Signalweganreicherungsanalyse mit dem R-Paket clusterProfiler19 unterzogen. Anreicherungstestmethode: hypergeometrischer Test; Mehrfachtestkorrekturmethode: Benjamini-Hochberg-(BH)-Methode. Screening-Kriterium: bereinigter p-Wert < 0,05.
Genmengenanreicherungsanalyse (GSEA)
Für das GSEA auf Kohortenebene wurden alle in der differentiellen Expressionsanalyse von GSE75360 getesteten Gene nach logFC in absteigender Reihenfolge geordnet und als Eingabegenliste für clusterProfiler19 verwendet. Vor GSEA wurde keine DEG-Vorfilterung angewendet. Die C2-Gensatzsammlung von MSigDB20. Parameter: Seed = 2022, 10–500 Gene pro Set; Screening-Kriterien: korrigiert p < 0,05 (Benjamini-Hochberg, BH-Methode), FDR < 0,2521.
Konstruktion des Hypertonie-Diagnosemodells
Um Schlüsselgene zu identifizieren, die mit Bluthochdruck assoziiert sind, verwendeten wir zwei Arten von maschinellen Lernalgorithmen: logistische Regression und Zufallswälder (RF). Logistische Regression (binäre abhängige Variable: Hypertonie/Kontrolle) screente RASRDEGs mit p < 0,05. Random Forest (RF, R-Paket randomForest): Parameter set.seed(520), ntree = 1000; MeanDecreaseGini (variabler Importance Indicator) wurde extrahiert, und die Top 15 RASRDEGs wurden ausgewählt. RASRDEGs wurden mit einem p-Wert < 0,05 als Standard geprüft.
Der RF-Algorithmus (Random Forest), eine Ensemble-Lernmethode unter der Kategorie Bagging (Integration mehrerer Entscheidungsbäume), wurde über das R-Paket randomForest22 (Parameter: set.seed(520), ntree = 1000) angewendet. MeanDecreaseGini (die variable Bedeutung durch durchschnittliche Reinheitsabnahme während der Knotenteilung widerspiegelt) der Merkmalsgene wurde extrahiert, und die obersten 15 RASRDEGs wurden ausgewählt. Schließlich wurde ein Venn-Diagramm von Genen, die durch logistische Regression und RF gescreent wurden, dargestellt, um hypertoniebezogene Schlüsselgene zu identifizieren.
Validierung des diagnostischen Hypertoniemodells
Ein logistisches Regressionsmodell wurde auf Basis von Schlüsselgenen aufgebaut; Linearer Vorhergesagter Wert (η) wurde berechnet als:
Das R-Paket pROC16 wurde verwendet, um ROC-Kurven darzustellen und die Wirksamkeit des Modells bei der Vorhersage des Hypertonierisikos zu bewerten. Über das R-Paket rms23 wurde ein Nomogramm erstellt, um den Beitrag jedes Schlüsselgens zum logistischen Regressionsmodell zu visualisieren (was die Verbindung zwischen Schlüsselgenen und Bluthochdruckrisiko widerspiegelt). Kalibrierungskurven wurden erstellt, um die Konsistenz zwischen vorhergesagten und tatsächlichen Hypertoniewahrscheinlichkeiten zu bewerten; Die Entscheidungskurvenanalyse (DCA, R-Paket ggDCA24) wurde durchgeführt, um den klinischen Nutzen (Nettonutzen) des Modells in GSE75360 und GSE74144 zu bewerten.
Ein-Gen GSEA
GSEA untersucht die Rolle von Genen, die mit einem bestimmten Gen in biologischen Prozessen/Wegen/Krankheiten assoziiert sind, indem es dessen Expression analysiert und so die funktionelle Rolle des Gens besser verstehen kann. Für jedes fokale Gen in GSE75360 wurden die Proben im Median in Hoch- und Niedrigexpressionsgruppen aufgeteilt. Anschließend wurde eine differenzielle Expressionsanalyse über alle getesteten Gene durchgeführt, und genomweite logFC-Werte wurden vor GSEA mit clusterProfiler19 von höchst bis niedrigst bewertet. Vor GSEA wurde keine DEG-Vorfilterung angewendet. Parameter: Seed = 2020, 10–500 Gene pro Set (c2-Gensatzsammlung aus MSigDB21). Screening-Kriterien: p < 0,05 (adj. p korrigiert mittels BH-Methode).
Immuninfiltrationsanalyse (CIBERSORT)
Der CIBERSORT-Algorithmus25 (basierend auf linearer Unterstützungsvektorregression) dekonvolutierte die Transkriptommatrix, um die Zusammensetzung der Immunzellen in gemischten Stichproben zu schätzen (Daten mit Immunzellanreicherungswert > 0 wurden ausgewählt). Die endgültige Immunzellinfiltrationsmatrix von GSE75360 wurde anhand eines Proportionsbalkendiagramms visualisiert. Spearmans Korrelation wurde verwendet, um Immunzell-Immunzelle- und Schlüssel-Gen-Immunzell-Assoziationen zu analysieren, wobei die Ergebnisse als Korrelations-Heatmap (R-Paket-Pheatmap) bzw. Korrelationsblasenplot (R-Paket ggplot2) präsentiert wurden.
Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI)
PPI-Netzwerke sind Systeme miteinander verbundener Proteine, die biologische Prozesse durch Wechselwirkungen regulieren. Mit der STRING-Datenbank26 wurde ein PPI-Netzwerk für Schlüsselgene aufgebaut (minimaler Interaktionsscore: 0,150, geringe Zuverlässigkeit). Renin-angiotensin-bezogene Hub-Gene wurden durch Screening interagierender Gene ausgewählt. Die GeneMANIA-Datenbank27, die funktional ähnliche Gene anhand genomischer und proteomischer Datensätze identifiziert, wurde verwendet, um funktional ähnliche Gene wichtiger RAS-Gene vorherzusagen und ein Protein-Interaktionsnetzwerk aufzubauen.
Aufbau eines Regulierungsnetzwerks
mRNA-TF-Netzwerk: Transkriptionsfaktoren (TFs) regulieren die Genexpression über posttranskriptionelle Interaktion mit Zielgenen. TFs, die auf Hub-Gene und deren regulatorische Beziehungen abzielen, wurden aus der ChIPBase-Datenbank28 abgerufen, und das mRNA-TF-Netzwerk wurde mit Cytoscape29 visualisiert.
mRNA-miRNA-Netzwerk: miRNAs modulieren mehrere Zielgene (einzelne Ziele können von mehreren miRNAs koreguliert werden). StarBase v3.030 wurde verwendet, um miRNAs zu identifizieren, die mit RASRDEGs assoziiert sind, und das mRNA-miRNA-Netzwerk wurde über Cytoscape visualisiert.
mRNA-Arzneimittel-Netzwerk: Toxikogenomische Datenbanken31 wurden verwendet, um direkte/indirekte Arzneimittelziele von Hub-Genen vorherzusagen. Das mRNA-Arzneimittel-Netzwerk (mit Gen-Arzneimittel-Interaktionen) wurde mit Cytoscape visualisiert, um den Netzwerkaufbau abzuschließen.
Ang II-induziertes HUVEC-Modell
Menschliche Nabelvenendothelzellen (HUVECs) wurden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 %CO2 gehalten. Die Zellen wurden in einem vollständigen endothelialen Zellkulturmedium aufbewahrt, das gemäß den Anweisungen des Lieferanten mit fetalem Rinderserum und Antibiotika ergänzt wurde. Um ein in-vitro-Modell für hypertoniebedingte Endothelverletzungen zu etablieren, wurden HUVECs 48 Stunden lang mit Angiotensin II (Ang II; 100 nM) behandelt. Vehikelbehandelte Zellen wurden als Kontrollgruppe verwendet.
Für Geninterventionsexperimente wurden kleine interferierende RNAs, die CST3 oder FURIN anvisieren (si-CST3 und si-FURIN), entsprechende negative Kontroll-siRNA (si-NC), CST3- oder FURIN-Überexpressionsplasmide (oe-CST3 und oe-FURIN) sowie die entsprechende leere Vektorkontrolle (oe-NC) gemäß dem Protokoll des Herstellers in HUVECs transfektiert. Nach der Transfektion wurden die Zellen Ang II ausgesetzt und anschließend zur Expressionsvalidierung und funktionellen Tests entnommen. Knockdown- und Überexpressionseffizienzen wurden durch qRT-PCR und Western Blotting bestätigt.
qRT-PCR
Total RNA wurde aus HUVECs mit einem Standard-RNA-Extraktionsreagenz isoliert, und komplementäre DNA wurde mit einem Reverse-Transkriptionskit erzeugt. SYBR Green-Chemie wurde für qRT-PCR verwendet. Die Expressionswerte von LRP1, CTSD, MTHFR, AUTS2, FURIN, CST3, FCER1G, TBXAS1, IL-6, TNF-α, VCAM1, ICAM1 und eNOS wurden auf GAPDH normalisiert und mit der 2−ΔΔCt-Methode berechnet.
Westliche Blotting
Für die Western-Blot-Analyse wurden Proteine mit einem RIPA-Lysepuffer extrahiert und mittels eines BCA-Tests quantifiziert. Gleiche Proteinmengen wurden durch SDS-PAGE aufgelöst und auf PVDF-Membranen übertragen. Nach der Blockierung wurden die Membranen mit primären Antikörpern gegen CST3, FURIN, TBXAS1 oder GAPDH inkubiert und anschließend mit geeigneten sekundären Antikörpern. Bänder wurden durch Chemikulumineszenz nachgewiesen, und die Dichtemessung wurde auf GAPDH normalisiert. Das sekretierte CST3 in Kultursupernatanten wurde mit einem ELISA-Kit nach dem Protokoll des Herstellers quantifiziert.
Zelllebensfähigkeit
Die Zelllebensfähigkeit wurde mit dem Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-Test bewertet. Kurzzeitig wurden transfizierte und mit Ang II behandelte HUVECs in 96-Bohrlochplatten eingesät, und die Absorption bei 450 nm wurde nach Zugabe des CCK-8-Reagens bei 0, 24, 48 und 72 Stunden gemessen. Die Zellmigration wurde mit Transwell-Kammern untersucht. Nach den angezeigten Interventionen wurden Zellen in die oberen Kammern ausgesaat, und wandernde Zellen auf der unteren Membranoberfläche wurden fixiert, gefärbt und unter dem Mikroskop in zufällig ausgewählten Feldern gezählt.
Entzündungstest
Zur Bewertung der entzündlichen Aktivierung, oxidativen Stresses und der Endothelfunktion sind IL-6, TNF-α, VCAM1, ICAM1 und eNOS.mRNA-Spiegel wurden durch qRT-PCR nachgewiesen. Die Stickstoffmonoxid-(NO)-Werte im Kultur-Supernatant wurden mit einem kommerziellen NO-Testkit gemessen, und die intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers mittels DCF-Fluoreszenz nachgewiesen.
Statistische Analyse
Transkriptomische Verarbeitung und Modellierung wurden in R durchgeführt. Kontinuierliche Variablen wurden mit dem Shapiro-Wilk-Test auf Normalität bewertet. Für Zwei-Gruppen-Vergleiche wurden unabhängige Stichproben-t-Tests für normalverteilte Variablen verwendet, während Wilcoxon-Rangsummentests für nicht-normale Variablen verwendet wurden. Für drei oder mehr Gruppen wurde eine Einweganalyse der Varianz mit geeigneter Post-hoc-Prüfung verwendet, wenn die Annahmen zur Normalität und Varianzhomogenität erfüllt waren; ansonsten wurde der Kruskal-Wallis-Test angewandt. Die CCK-8-Zeitverlaufsdaten wurden mittels einer zweiseitigen Varianzanalyse analysiert. Für Assoziationsanalysen wurden Spearman-Korrelationskoeffizienten berechnet. Sofern nicht anders angegeben, werden die experimentellen Ergebnisse als Mittelwert ± SD angegeben, und ein zweiseitiger p < 0,05 wurde als signifikant angesehen.