Tunnelhandhabung und Umweltanreicherung für wiederholte Ganzkörperplethysmographie bei Mäusen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Tunnelhandhabung und Umweltanreicherungsverfahren für wiederholte Ganzkörperplethysmographie, um stressassoziierte Atemvariabilität während längsschnittiger Studien bei Mäusen zu verringern.

Zusammenfassung

Die wiederholte Ganzkörperplethysmographie (WBP) wird häufig zur longitudinalen Beurteilung der Atemfunktion bei Mäusen eingesetzt. Allerdings kann handhabungsinduzierter Stress physiologische Variabilität verursachen, die die Behandlungseffekte verwässert und die experimentelle Reproduzierbarkeit verringert. Traditionelle Methoden der Schwanzhandhabung können anhaltende Stressreaktionen und eine schlechte Gewöhnung über wiederholte Sitzungen hinweg hervorrufen, was die experimentellen Ergebnisse potenziell beeinflussen kann. Dieses Protokoll beschreibt verfeinerte Handhabungs- und Unterbringungsmethoden, die Tunnelhandhabung und Umweltanreicherung für wiederholte WBP-Sitzungen integrieren. Sechs Wildtyp-129S1/SvImJ-Mäuse (3 Männchen, 3 Weibchen) erhielten während einer zehnwöchigen Studie kontinuierliche Tunnelbehandlung und kontinuierliche Umweltbereicherung. Die Tiere unterzogen sich wiederholten WBP-Sitzungen, und die Eingewöhnungszeiten wurden zu Ausgangs-, Früh-, Zwischen- und späten Studienzeiten analysiert. Die Atemfrequenz während der ersten Kammerplatzierung (f-Anfang, 0–2 Min) und stabile Ausgangsfrequenz (F-Ausgangswert, 8–10 Min) wurden quantifiziert, um die Longitudinal-Akklimatisierungsmuster zu beurteilen. Unter den umgesetzten Bedingungen wurden im gesamten Studienverlauf fortschreitende Veränderungen beobachtet. Die mittlere anfängliche Atemfrequenz sank von 345 ± 111 SD-Atemzügen/min zu Beginn auf 267 ± 43 SD-Atemzüge/min in späten Studiensitzungen, begleitet von einem reduzierten Variationskoeffizienten (32 % bis 16 %). Die Ausgangswerte der Atemaufnahmen sanken ebenfalls von 255 ± 67 auf 193 ± 43 Atemzüge/min (p = 0,033), was mit einer verbesserten Messstabilität in späteren Sitzungen übereinstimmt. Verhaltensbeobachtungen zeigten ruhige Akklimatisierung mit minimalem Defäkation, Wasserlassen oder Unruhe. Dieses Protokoll bietet einen praktischen Ansatz für Labore, die wiederholte Atemuntersuchungen bei Mäusen durchführen. Tunnelhandhabung und Umweltanreicherung waren während der longitudinalen WBP-Studien mit fortschreitender Akklimatisierung und reduzierter respiratorischer Variabilität assoziiert.

Einleitung

Die Ganzkörperplethysmographie (WBP) ermöglicht eine nicht-invasive Beurteilung der Atemfunktion bei bewussten, ungebremsten Nagetieren und ist zu einem unverzichtbaren Werkzeug für Längsstudien in der Atemphysiologie, Inhalationstoxikologie und^{Krankheitsmodellierung geworden.} Die Hauptvorteile der Technik, darunter ihre nicht-invasive Natur und Eignung für wiederholte Messungen, machen sie besonders wertvoll, um Atemwegsveränderungen während des Krankheitsverlaufs, therapeutischer Interventionen oder Expositionszeiten zu verfolgen. Glaab und Braun² hoben hervor, dass nicht-invasive Kopf-heraus-Körperplethysmographie eine zuverlässige Methode für wiederholte Lungenfunktionsmessungen bei bewussten Mäusen ist und wichtige Werkzeuge für translationale Forschung zu Atemwegserkrankungen, einschließlich neuer Atemwegsinfektionen, bereitstellt. Die Qualität und Reproduzierbarkeit der WBP-Messungen hängt jedoch entscheidend davon ab, niedrige Atemfrequenzzustände zu erreichen, die mit der Verhaltensruhe übereinstimmen und durch handhabungsinduzierten Stress beeinträchtigt sein können. Der Umgang mit Stress stellt eine bekannte, aber oft unterschätzte Quelle experimenteller Variabilität dar, die physiologische Messungen beeinträchtigen und die Datenqualität beeinträchtigen kann. Die übliche Laborpraxis beinhaltet typischerweise die Schwanzhandhabung, bei der die Mäuse am Schwanz zum Transport und zur Manipulation^{gehalten werden.}

Die übliche Laborpraxis beinhaltet typischerweise die Schwanzhandhabung, bei der die Mäuse am Schwanz zum Transport und zur Manipulation festgehalten werden. Gouveia und Hurst³ zeigten, dass das Schwanzhandhaben bei Mäusen Angst auslöst, wobei die Tiere, die im Griff gehalten werden, im erhöhten Plus-Labyrinth ein erhöhtes angstähnliches Verhalten zeigen als bei Tunnelkontrollen. Diese Angstreaktion ist mit veränderten physiologischen Parametern verbunden. Rasid et ^al.4 verwendeten WBP, um die Atemwegswirkungen routinemäßiger Laborverfahren zu quantifizieren, und stellten fest, dass Fesselung und Handhabung das winzige Volumen in geschlechtsabhängiger Weise signifikant veränderten, wobei die Wirkung bis zu 24 Stunden nach dem Eingriff anhielt. Das Ausmaß und die Dauer dieser handhabungsinduzierten Effekte unterstreichen, dass kurz nach der Schwanzhandhabung durchgeführte Atemmessungen eher auf die Physiologie des akuten Stresses als auf eine stabile Ausgangsfunktion zurückzuführen sein können.

Die breitere Literatur zu Fixierung und Stressbewältigung zeigt Auswirkungen, die über unmittelbare Verhaltensreaktionen hinausgehen. Buynitsky und Mostofsky⁵ untersuchten die umfangreichen Auswirkungen von Fixierungsstress auf physiologische, immunologische, endokrine und entwicklungsbezogene Prozesse und betonten, dass stressbedingte Störungen in Forschungsartikeln oft unzureichend dokumentiert sind. Speziell bei Atemuntersuchungen wird das Problem durch die Notwendigkeit wiederholter Messungen verschärft. Jedes Handhabungsereignis kann die Stressreaktion zurücksetzen, die fortschreitende Habituation einschränken und inkonsistente Baseline-Messungen über Längszeitpunkte hinweg erzeugen. DeLorme und Moss¹ verglichen Plethysmographie-Ansätze mit zurückgehaltenen und ungebundenen Plethysmographien bei Mäusen mit bekannten physiologischen Unterschieden zwischen Spannung und stellten fest, dass zwar ungebundene Einkammersysteme eine verbesserte Analyse der Atemwegsreaktivität ermöglichten, die Herausforderung jedoch blieb, reproduzierbare Basismessungen zu erhalten.

Tunnelhandhabung, bei der Mäuse freiwillig einen Tunnel betreten, um transportiert zu werden, hat sich als evidenzbasierte Alternative erwiesen, die die durch das Handhaben verursachten Angst erheblich reduziert. Die Wirksamkeit der Methode wurde in mehreren Stämmen und experimentellen Kontexten nachgewiesen. Gouveia und Hurst³ zeigten, dass Mäuse mit Tunnelhandhabung eine größere Bereitschaft zur Interaktion mit Betreuern zeigten und bei erhöhten Plus-Labyrinth-Tests weniger angstähnliches Verhalten zeigten als Mäuse mit Schwanzhandgriff, wobei Vorteile, die auch bei unbekannten Tunneln beobachtet wurden. Wichtig ist, dass diese Vorteile über die unmittelbare Zeit nach der Behandlung hinausgehen. Sensini et ^al.6 untersuchten die Auswirkungen der Handhabungstechnik und der Häufigkeit der Geschlechter hinweg und stellten fest, dass häufiges Schwanzhandhaben wohlfühlassoziiertes Verhalten wie Graben reduzierte und bei Männchen vermehrtes verzweifeltes Verhalten, während Tunnelhandhabung von beiden Geschlechtern bevorzugt wurde und mit positiveren Annäherungsverhalten sowie weniger Abwehrreaktionen verbunden war. Darüber hinaus zeigten Davies et ^al.7 , dass die Vorteile der Nicht-Schwanzhandhabung auch bei komplexen Verfahren bestehen bleiben. Mäuse, die während ihrer gesamten Laborerfahrung, einschließlich der Fesselungsverfahren, einer Schwanzhandhabung ausgesetzt waren, zeigten eine höhere Reaktion auf Umweltreize und eine geringere Handhabung im Vergleich zu Mäusen, die ausschließlich mit Schröpf- oder Tunnelmethoden gehandhabt wurden.

Über die Auswahl der Handhabungsmethode hinaus kann die systematische Gewöhnung an experimentelle Verfahren die stressbedingte Variabilität weiter verringern. Sorli et ^al.8 untersuchten das Training von Mäusen für die Kopf-Heraus-Plethysmographie, ein auf Fixierung basierendes System, und stellten fest, dass fünf aufeinanderfolgende Trainingstage die Toleranz verbesserten, wobei die Mäuse bereits am zweiten Tag eine verbesserte Verhaltensstabilität zeigten, obwohl die Atemparameter während aller Sitzungen innerhalb von 5 Minuten stabilisiert wurden. Ähnlich zeigten Ueno et ^al.9 , dass wiederholtes sanftes Handhaben männlicher C57BL/6-Mäuse vor Verhaltenstests das angstähnliche Verhalten bei erhöhten Plus-Labyrinth-Tests reduzierte und die räumliche Kognition verbesserte, was darauf hindeutet, dass wiederholter Kontakt mit Betreuern messbare Habituationseffekte hervorrufen kann. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Kombination nicht-aversiver Handhabungsmethoden mit systematischen Gewöhnungsprotokollen kumulative Vorteile zur Verringerung der physiologischen Variabilität bei wiederholten Messungen bieten kann.

Umweltbereicherung stellt einen weiteren Faktor dar, der die Stressreaktion und die Grundphysiologie beeinflussen kann, obwohl ihre Effekte komplex und kontextabhängig sind. Während Anreicherung im Allgemeinen ein positives Wohlbefinden fördert, kann übermäßige oder unvorhersehbare Anreicherung paradoxerweise die physiologische Variabilität und stressassoziierte Verhaltensweisen in einigen experimentellen Kontexten erhöhen^10,11. Ein ausgewogener Ansatz, der stabile Kernelemente wie Verschachtelmaterial beibehält und gleichzeitig durch periodische Rotation von Anreicherungsobjekten eine handhabbare Neuheit bietet, kann das Wohlbefinden optimieren, ohne eine Störungsvariation¹² einzuführen. Die Wechselwirkung zwischen Anreicherung, Handhabungsmethode und Gewöhnungsprotokollen ist im Zusammenhang mit wiederholten Atemmessungen noch wenig erforscht, was die Notwendigkeit integrierter Protokolle unterstreicht, die alle drei Faktoren gleichzeitig berücksichtigen.

Trotz wachsender Anerkennung der Auswirkungen auf die Handhabung physiologischer Messungen bleiben standardisierte Protokolle, die speziell darauf ausgelegt sind, Handhabungsstress während wiederholter WBP-Sitzungen zu minimieren, weiterhin begrenzt. Bestehende WBP-Protokolle basieren typischerweise auf verlängerten Akklimatisierungsphasen (10–30 Minuten pro Sitzung), um stressinduzierte Tachypnoe nachzulassen, behandeln jedoch selten die zugrunde liegende Handhabungsmethode oder bewerten systematisch, ob eine fortschreitende Gewöhnung zwischen den Sitzungen auftritt. Außerdem bewerten die meisten Studien nicht, ob Tiere physiologische Zustände erreichen, die mit einer Verhaltensruhe übereinstimmen, wie etwa Atemfrequenzen, die in der Literatur als mit Ruhe- oder schlafbezogenen Zuständen berichtet werden, annähernd erreichen, oder ob sie stattdessen von akutem Stress zu chronischer, niedrigstufiger Erregung übergehen. Hier präsentieren wir ein Protokoll, das Tunnelhandhabung, ausgewogene Umweltanreicherung und wiederholte WBP-Sitzungen über eine zehnwöchige Längsschnittstudie integriert. Wir beschreiben einen Ansatz, der mit fortschreitenden Veränderungen der Atemfrequenz im Einklang mit der Gewöhnung assoziiert ist, einschließlich sinkender anfänglicher Atemfrequenzen über Sitzungen hinweg und Ausgangsmessungen, die sich den in der Literatur als mit Ruhe- oder schlafbezogenen Zuständen gemeldeten Bereichen nähern. Wichtig ist, dass dieses Protokoll nicht nur als Verfeinerung des Tierschutzes präsentiert wird, sondern auch als experimentelle Designüberlegung, die helfen kann, die Variabilität zu verringern und die Konsistenz bei longitudinalen Atemmessungen zu verbessern.

Protokoll

Durchführung aller Verfahren gemäß den vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC Protocol #23-103) an der University of Miami genehmigten Protokollen. Hausmäuse in einer AAALAC-akkreditierten Vivariumseinrichtung, deren Umweltbedingungen nach institutionellen Standards eingehalten werden.

1. Tierselektion und Wohnbedingungen

1. Wählen und bereiten Sie Tiere für die Studie vor
   1. Wählen Sie Tiere aus einer etablierten Zuchtkolonie aus oder beziehen Sie sie bei einem kommerziellen Händler. Für diese Studie werden sechs Wildtyp-129S1/SvImJ-Mäuse verwendet (3 Männchen, 3 Weibchen).
   2. Tiere unter SPF-Bedingungen (specific pathogen-free) in einer AAALAC-akkreditierten Einrichtung zu halten, wobei routinemäßige Gesundheitsüberwachungen nach institutionellen Standards durchgeführt werden.
   3. Bestätigen Sie, dass die Tiere bei Studienbeginn etwa 6 Monate alt sind (junge Erwachsene).
      HINWEIS: Die Mäuse in dieser Studie hatten zuvor im Rahmen der routinemäßigen Haltung Kontakt mit Tunnelhandhabung. Für naive Mäuse sollten Sie vor Beginn der WBP-Sitzungen eine Konditionierungsphase einführen (siehe Schritt 3.2).
2. Beginnen Sie mit experimentellen Verfahren, wenn die Mäuse das für die Studienziele geeignete Alter erreicht haben. In dieser Studie waren die Mäuse zu Beginn der WBP-Sitzungen etwa 6 Monate alt (junge Erwachsene). Zur Reproduzierbarkeit verwenden Sie Mäuse innerhalb eines definierten Altersbereichs (z. B. ±1 Monat) und geben Sie das verwendete genaue Alter an, da das Alter die Ausgangswerte der Atemwegswerte und die Habituationskinetik beeinflussen kann.

2. Umweltanreicherungsprotokoll

1. Bereitstellen Sie konstantes Schachtmaterial
   1. Setze bei jedem Käfigwechsel ein komprimiertes Baumwollquadrat (etwa 5 cm × 5 cm, ~2,5 g) in jeden Käfig.
   2. Übertragen Sie den Großteil der bestehenden Niststruktur intakt in den neuen Käfig während des Käfigwechsels mit beiden Händen.
   3. Wenn das angesammelte Nistmaterial etwa 10 g übersteigt (etwa das Doppelte der ursprünglichen Masse), werden die ältesten und am stärksten verdichteten Teile vom Boden entfernt und die äußere Kuppelstruktur erhalten.
   4. Fügen Sie ein frisches Baumwollquadrat (5 cm × 5 cm) in den sauberen Käfig hinzu, um den weiteren Nestbau und die Pflege zu unterstützen.
   5. Ersetzen Sie das Nistmaterial nur, wenn es sichtbar nass ist (Urinkontamination bedeckt >25 % der Oberfläche) oder wenn das Nest innerhalb von 48 Stunden zerstört und nicht wieder aufgebaut wurde (Abbildung 1A und 1C).
      HINWEIS: Bewahren Sie die Neststruktur, um den Stress im Zusammenhang mit Käfigwechseln zu minimieren und konsistente olfaktorische und taktile Hinweise während der gesamten Studie aufrechtzuerhalten. Die Nestqualität dient als Indikator für das Tierwohl und den Gesundheitszustand¹³.
2. Bewerten Sie wöchentlich den Nestbau nach folgendem standardisierten Verfahren
   1. Bei jedem Käfigwechsel werden Sie das intakte Nest vorsichtig mit beiden Händen auf eine saubere Oberfläche übertragen, ohne die Struktur zu stören.
   2. Fotografieren Sie das Nest direkt von oben, wobei die Kamera 30–40 cm senkrecht zur Oberfläche positioniert ist, um die Gesamtstruktur und die Kraterbildung zu visualisieren.
   3. Fotografieren Sie das Nest von der Seite auf Nesthöhe, um die Wandstabilität und die Eigenschaften der Kuppel zu dokumentieren.
   4. Bewerten Sie das Nest mit der standardisierten 5-Punkt-Deacon-Skala¹³, wobei 1 = Nistmaterial weitgehend unberührt und 5 = kuppelförmiges Nest mit klarem Krater. Siehe Abbildung 1A–1C für Beispiele für Punkte 5 Nester.
   5. Bringen Sie das Nest vorsichtig zurück in den sauberen Käfig.
      HINWEIS: Wöchentliche Nestfotos liefern eine objektive Dokumentation der Nestqualität während der gesamten Studie. Eine Verschlechterung im Nestbau kann auf Krankheiten, Stress oder andere Wohlfahrtsbedenken hinweisen, die tierärztliche Aufmerksamkeit erfordern.
3. Wöchentlich wechselnde Bereicherung anbieten
   1. Wählen Sie einen Anreicherungsgegenstand aus und legen Sie ihn in den Käfig. Verwenden Sie zerrissenes Papier (einfaches weißes Papier, eine Handvollgröße), Papiertücher (2–3 Blätter, unparfümiert, weiß, gefaltet oder zerknittert) oder papierbasierte Unterschlüsse (Papptuben oder kleine Schachteln).
   2. Wechseln Sie wöchentlich die Bereicherungsgegenstände nach einem vorgegebenen Zeitplan (z. B. Woche 1: vernichtetes Papier; Woche 2: Papiertücher; Woche 3: Papprohr; Woche 4: wiederholen), um eine handhabbare Neuheit zu bewahren.
      HINWEIS: Die wöchentliche Rotation sorgt für Neuheit, ohne die Mäuse zu überfordern. Vermeiden Sie Kunststoffanreicherungsgegenstände wie Plastikhütten, Bälle oder starre Strukturen, die die physiologische Variabilität erhöhen können¹¹. Ersetzen Sie bei jedem Käfigwechsel alle Bereicherungsgegenstände.

Abbildung 1. Protokollumsetzung und Wohlfahrtsindikatoren während longitudinaler Ganzkörperplethysmographie (WBP)-Studien. (A) Repräsentatives, hochwertiges Nest (Deacon-Wert 5) aus einem weiblichen Käfig, das eine gut geformte Kuppelstruktur mit einem definierten Krater zeigt. (B) Klarer Polycarbonat-Handhabungstunnel (etwa 10 cm lang × 5 cm Innendurchmesser), der mit dem Nistmaterial im Stammkäfig integriert ist. Tunnel blieben während der gesamten Studie dauerhaft in Käfigen als Anreicherungs- und Handhabungsgeräte. (C) Repräsentative Nestqualität der späten Studien (Woche 10), die einen nachhaltigen Wert 5 im Nestbau sowohl in männlichen als auch weiblichen Käfigen zeigt. (D) Nest-Qualitätswerte während des 10-wöchigen Studienzeitraums. Jeder Datenpunkt repräsentiert den wöchentlichen Nistwert eines Käfigs anhand der standardisierten 5-Punkte-Deacon-Skala¹³, wobei 1 = unberührtes Nistmaterial und 5 = vollständiges, kuppelförmiges Nest mit Krater ist. Beide Käfige behielten während aller Studienphasen eine konstante Punktzahl von 5 Nistqualität. Der schattierte grüne Bereich kennzeichnet die Werte, die mit optimalen Wohlfahrtsbedingungen verbunden sind (Werte 4–5). Die Studienphasen werden durch farbige Hintergrundbereiche angezeigt, die dem Ausgangspunkt (Woche 0), Frühstudien (Wochen 2–3), Zwischenstudien (Wochen 5–7) und Spätstudien (Wochen 8–10) entsprechen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

3. Implementierung der Tunnelhandhabung

1. Vorbereitung der Handhabungstunnel
   1. Verwenden Sie klare Polycarbonat-Tunnel (100 mm oder 130 mm lang × 50 mm Innendurchmesser) mit glatten, abgerundeten Kanten (Abbildung 1B).
   2. Setzen Sie dauerhaft einen Tunnel in jeden Hauskäfig als Teil der Bereicherung.
   3. Entferne keine Tunnel zwischen den Handhabungsereignissen.
      HINWEIS: Das Halten des Tunnels im Haus-Käfig ermöglicht es, vertraute Käfiggerüche zu erhalten und mit der häuslichen Umgebung zu assoziieren, anstatt die Abläufe zu übernehmen. Mäuse nutzen Tunnel oft als Zufluchtsorte oder Nistplätze.
   4. Bei jedem Käfigwechsel wischen Sie das Tunnelinnere mit einer kleinen Menge verwendeter Einstreu aus dem vorherigen Käfig ab, bevor Sie ihn in den sauberen Käfig legen.
   5. Autoklaven-Tunnel verwenden oder sie mit demselben Desinfektionsmittel reinigen, das auch für die Reinigung der Käfige verwendet wird, falls zwischen den Gebrauchen Desinfektion erforderlich ist. Spülen Sie gründlich ab und lassen Sie die Tunnel an der Luft trocknen, bevor Sie sie zurück in den Käfig bringen.
      HINWEIS: Die wahre olfaktorische Kontinuität hilft, den Stress durch ungewohnte Gerüche zu minimieren. Tunnel sind autoklavierbar und wiederverwendbar.
2. Konditionierung von Mäusen zur Tunnelhandhabung
   1. Bei naiven erwachsenen Mäusen sollten Sie eine Konditionierungsphase von mindestens 1–2 Wochen vor Beginn der WBP-Sitzungen^14,15 einführen.
   2. Platzieren Sie durchsichtige Polycarbonat-Tunnel (siehe Schritt 3.1) dauerhaft in den Hauskäfig und lassen Sie 3–7 Tage für passive Eingewöhnung ein.
   3. Nach der passiven Exposition führen Sie täglich sanfte Handhabungssitzungen durch. Ermutigen Sie die Mäuse, freiwillig in den Tunnel zu gehen, dann heben Sie den Tunnel horizontal für 30–60 Sekunden, bevor Sie die Maus wieder in den Käfig bringen.
   4. Bewertung der erfolgreichen Gewöhnung anhand folgender Kriterien: freiwilliger Tunneleintritt innerhalb von 10–30 Sekunden, ruhiges Verhalten im Tunnel ohne Fluchtversuche oder Lautäußerungen sowie spontane Tunnelnutzung zum Ausruhen oder Erkunden während routinemäßiger Käfigbeobachtungen^14,15.
   5. Beginnen Sie mit den WBP-Sitzungen, sobald alle Gewöhnungskriterien erfüllt sind.
      HINWEIS: Die Mäuse in dieser Studie hatten bereits vor Beginn der WBP-Sitzungen Kontakt mit Tunnelhandhabung im Rahmen der routinemäßigen Pflege.
3. Führen Sie nicht-aversive Behandlung aus
   1. Tragen Sie puderfreie Nitrilhandschuhe für alle Handhabungsverfahren.
   2. Verwenden Sie die Tunnelhandhabung als primäre Handhabungsmethode. Wenn sich die Maus im Tunnel befindet, heben Sie den Tunnel horizontal mit einer Hand zur Unterstützung der Basis an.
   3. Befindet sich die Maus außerhalb des Tunnels, positioniere die Tunnelöffnung innerhalb von 5–10 cm um die Maus und lass 10–30 Sekunden freiwillig ein, ohne Verfolgung oder Zwang.
   4. Wenn die Maus innerhalb von 30 Sekunden nicht eintritt, fördern Sie die Bewegung zum Tunnel mit einer geformten Hand hinter der Maus, ohne Kontakt herzustellen.
   5. Wenn die Maus nach zwei Versuchen (maximal 60 Sekunden) nicht eintritt, wird die Schröpfungsmethode verwendet. Lege eine flache Hand in die Nähe der Maus, lass einen freiwilligen Annäherungsschritt 10–20 Sekunden zu, und schaffe die Maus dann vorsichtig mit beiden Händen, ohne das Schwanzberühren zu vermeiden.
   6. Verwenden Sie die Handhabungsmethode, die zu ruhigem Verhalten führt, definiert als Abwesenheit von Lautäußerung, Fluchtversuche oder stressbedingtes Defäkieren.
4. Transferieren der Mäuse in die Plethysmographiekammer
   1. Übertragen Sie die Maus aus dem Tunnel in die geballten Hände, bevor Sie sie in die Kammer legen.
   2. Halte den Tunnel horizontal und kippe das Heck (Heckseite) etwa 10–20° nach oben.
   3. Lass die Maus mit den hinteren Beinen zuerst aus dem Tunnel zurückweichen und auf die geballten Hände.
   4. Senken Sie beide Hände in die Kammer und lassen Sie die Maus innerhalb von 5–10 Sekunden freiwillig auf den Kammerboden treten.
      HINWEIS: Diese Tunnel-zu-Hand-zu-Kammer-Übertragungsmethode bietet eine verbesserte Kontrolle während der Kammerplatzierung.
   5. Alternativ kann man die Maus direkt vom Tunnel in die Kammer übertragen, indem man den Tunnel über die Kammeröffnung kippt.
      HINWEIS: Der direkte Tunnel-zu-Kammer-Transfer bietet weniger Kontrolle während der Platzierung und wurde in dieser Studie seltener eingesetzt.
   6. Niemals den Tunnel vertikal umdrehen oder erschüttern.
   7. Schließen Sie den Kammerdeckel sofort nach dem Platzieren der Maus ab und bringen Sie den Tunnel zurück in den Stammkäfig.
      KRITISCHER SCHRITT: Greifen Sie Mäuse zu keinem Zeitpunkt während der Studie am Schwanz. Wenn eine Maus den Tunnel innerhalb von 30 Sekunden nicht betritt oder sich einer geformten Hand nicht nähert, fördern Sie sanfte Bewegung mit weicher Einstreuung, ohne die Interaktion zu verfolgen oder zu erzwingen. Erlaube der Maus, je nach individueller Vorliebe Tunnel- oder Handansatz zu wählen. Geduld während der ersten Sitzungen hilft, positive Assoziationen mit nicht-aversivem Umgang^{herzustellen 3,7}.

4. WBP-Sitzungsprotokoll

1. Bereiten Sie das Plethysmographiesystem vor
   1. Kalibrieren Sie den Ganzkörper-Plethysmographen einmal täglich vor der Datenerfassung.
   2. Sobald die Kammern leer und versiegelt sind, starten Sie die automatisierte Kalibrierungssequenz über die FinePointe-Atemanalyse-Software (Ziel: 18–22 cm H₂O). Bestätigen Sie die erfolgreiche Kalibrierung, wenn der effektive Bereich des Box-Durchflusses ±40 mL/s pro Stelle überschreitet.
   3. Stellen Sie den Vorspannfluss auf 1,0 l/min pro Kammer ein.
   4. Überwachen Sie die Kammertemperatur (22°C–24°C) und die Luftfeuchtigkeit kontinuierlich mit digitalen Sensoren.
   5. Platziere Kammern an einem ruhigen Ort mit gleichmäßiger Beleuchtung und minimaler Vibration.
      HINWEIS: Halten Sie während aller Sitzungen konstante Kammerbedingungen aufrecht. Temperaturschwankungen verändern Atemmuster und erschweren longitudinale Vergleiche¹.
2. Führen Sie WBP-Sitzungen während einer konstanten zirkadianen Phase durch
   1. Führen Sie alle Messungen im gleichen Zeitfenster des Lichtzyklus durch.
   2. Führen Sie Sitzungen zwischen 08:00 und 10:00 Uhr durch (Lichteinschaltung um 06:00 Uhr) und vermeiden Sie die ersten 2 Stunden nach dem Einschalten, wenn sich die zirkadianen Rhythmen ändern.
3. Mäuse in den Versuchsraum transportieren
   1. Transporte die Hauskäfige etwa 15 Minuten vor Beginn der Sitzung auf einem Wagen in den Versuchsraum.
   2. Lassen Sie Mäuse sich an die experimentelle Umgebung gewöhnen, während sie in ihrem vertrauten Häuskäfig bleiben.
   3. Stellen Sie Hauskäfige in der Nähe der Plethysmographiekammern auf.
   4. Verwenden Sie die Tunnelbehandlung (siehe Schritte 3.3–3.4), um jede Maus aus dem Stammkäfig in die geballten Hände und dann in die Kammer zu bringen.
   5. Gehen Sie ruhig mit Mäusen um und minimieren Sie abrupte Bewegungen während des Transfers.
      HINWEIS: Die individuelle Mausübertragung benötigt nur wenige Sekunden.
4. Platziere die Maus in die Kammer
   1. Übertragen Sie die Maus vorsichtig von den gewölbten Händen in die Kammer (siehe Schritt 3.4).
   2. Versiegeln Sie den Kammerdeckel innerhalb von 5 Sekunden nach der Mausplatzierung.
5. Beginnen Sie mit der Akklimatisierung und der Aufnahme
   1. Beginnen Sie damit, Atemsignale mit der Atemanalyse-Software aufzuzeichnen.
   2. Erwarte 10 Minuten für die Eingewöhnung ohne Störung oder Eingriff.
6. Überwachen Sie die Verhaltensstabilität während der Akklimatisierung
   1. Beobachten Sie die Maus während der gesamten Eingewöhnungsphase kontinuierlich.
   2. Zeichnen Sie übermäßige Bewegung, anhaltende Bewegungsunbeweglichkeit mit Anzeichen von Stress (z. B. starre Haltung) oder wiederholte Fluchtversuche ohne Phasen ruhigen Verhaltens im Sitzungsprotokoll auf.
   3. Erkennen Sie an, dass solche Sitzungen weiterhin gültige f-Anfangsdatenliefern können; Allerdings können F-Baseline-Messungen unzuverlässig sein.
   4. Kennzeichnung von Sitzungen ohne beobachtbare Ruhephasen während des Akklimatisierungsfensters für einen möglichen Ausschluss von Ausgangsanalysen gemäß studienspezifischen Kriterien.
   5. Alle Sitzungen in dieser Studie werden behalten, da keine die Ausschlusskriterien aufgrund des Akklimatisierungsverhaltens erfüllte.
      KRITISCHER SCHRITT: Die 10-minütige Eingewöhnungsphase ist entscheidend, um die Gewöhnung zu beurteilen. Obwohl einige Protokolle 20–30-minütige Akklimatisierungsphasen verwenden, erreichten gut gewohnte Mäuse in dieser Studie innerhalb von 8–10 Minuten stabile Atemmuster, was eine verlängerte Akklimatisierung unnötig und potenziell kontraproduktiv machte, da die Bewegung erhöht wurde.
7. Beobachte das Verhalten der Maus während der Akklimatisierung
   1. Beobachten Sie die Mäuse kontinuierlich während der 10-minütigen Akklimatisierungsphase durch visuelle Überwachung der Kammern.
   2. Beachten Sie offensichtliche Stressanzeichen, darunter Defäkation, Wasserurinieren, anhaltende Fluchtversuche oder anhaltende Unbeweglichkeit.
   3. Erfassen Sie nach jeder Sitzung das Vorhandensein und die ungefähre Menge von Kotpellets und Urin in der Kammer.
      HINWEIS: Diese Beobachtungen bieten eine qualitative Bewertung des Stresslevels und des Fortschritts der Gewöhnung, wurden jedoch in dieser Studie nicht formell mit einem standardisierten Ethogramm bewertet.
8. Aspiratorische Metriken der Akklimatisierungsphase analysieren
   1. Verwenden Sie die Atemanalyse-Software, um die Atemfrequenz automatisch anhand von Drucksignalen zu berechnen, indem Sie den Standard-Atemdetektoralgorithmus und die Standardschwellenwerte in dieser Software verwenden.
   2. Erfassen Sie Atemsignale unter stabilen Luftstrombedingungen (siehe Schritt 4.1) unter Verwendung standardisierter Erfassungsparameter.
   3. Berechnen Sie die mittlere Atemfrequenz für zwei Zeiträume: f-initiale(0–2 Min), die die anfängliche Stressreaktion und die unmittelbare Physiologie nach der Handhabung darstellt, und f-Ausgangsfrequenz(8–10 Min), die die stabilisierte Ausgangs-Atemfrequenz darstellt.
   4. Perioden mit sichtbaren Bewegungsartefakten werden ausgeschlossen, definiert als nicht-ademungsbedingte Druckabweichungen oder unregelmäßige Wellenformen, die mit Tierbewegungen oder Kammerstörungen verbunden sind.
      HINWEIS: Untersuchen Sie eine Teilmenge der Aufnahmen visuell (etwa 10 %), um die genaue Atemerkennung durch den automatisierten Algorithmus zu bestätigen. Die manuelle Validierung bestätigte die Übereinstimmung zwischen der automatisierten Detektion und den beobachteten Atemmustern.
9. Fahren Sie gegebenenfalls mit dem experimentellen Protokoll fort
   1. Setzen Sie nach der 10-minütigen Akklimatisierungsphase experimentelle Interventionen gemäß dem Studiendesign fort (z. B. aerosolisierte Medikamentenabgabe, hypoxische Herausforderung, Belastungstests).
      HINWEIS: Während der Habituationsbewertungssitzungen in dieser Studie wurden keine experimentellen Interventionen durchgeführt. Die berichteten respiratorischen Metriken (fInitial und fBaseline) wurden während der reinen Akklimatisierungssitzungen ohne zusätzliche Verfahren ermittelt.
10. Bring die Maus zurück in den Hauskäfig
    1. Nutze Tunnelhandhabung oder geformte Hände, um die Maus aus der Kammer zurück in den Stammkäfig zu bringen.
    2. Beobachten Sie die Maus nach der Sitzung 5 Minuten lang, um normales Verhalten zu bestätigen, einschließlich spontaner Bewegung, Pflege, Interaktion mit Käfiggenossen sowie Untersuchung von Futter und Wasser.
    3. Verlängern Sie die Beobachtung und konsultieren Sie das tierärztliche Personal, wenn ein abnormales Verhalten länger als 15 Minuten anhält, einschließlich anhaltender Bewegungsunfähigkeit (>5 Min), schwerer Atmung, gekrümmter Haltung oder fehlender Interaktion mit Käfiggenossen.
       HINWEIS: In dieser Studie wurden keine abnormen Verhaltensweisen nach der Sitzung beobachtet.
11. Halten Sie eine konstante Sitzungshäufigkeit bei
    1. Führen Sie während des längslaufenden Studienzeitraums (10 Wochen in diesem Protokoll) regelmäßig WBP-Sitzungen durch.
    2. Führen Sie wöchentlich Sitzungen durch, um den Fortschritt der Gewöhnung zu verfolgen.
    3. Planen Sie Sitzungen zu konstanten Tageszeiten (siehe Schritt 4.2), um zirkadiane und prozedurale Konsistenz zu gewährleisten.

Ergebnisse

Die Anwendung dieses Tunnelhandhabungs- und Umweltanreicherungsprotokolls auf sechs Wildtyp-129S1/SvImJ-Mäuse (3 Männchen, 3 Weibchen) über eine 10-wöchige Längszeit-WBP-Studie ergab Hinweise auf fortschreitende Gewöhnung und verbesserte physiologische Stabilität. Atemfrequenzmessungen wurden während wiederholter WBP-Sitzungen in regelmäßigen Longitudinalintervallen durchgeführt, wobei die Daten aus vier Studienphasen analysiert wurden: Baseline (Woche 0), Frühstudie (Wochen 2–3), Mittle...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt einen integrierten Ansatz, der Tunnelhandhabung, Umweltanreicherung und wiederholte Belichtung im Kontext von langjähriger WBP kombiniert. Unter diesen Bedingungen zeigten die Messungen der Atemfrequenz eine fortschreitende Stabilisierung über wiederholte Sitzungen hinweg, was mit verminderter Erregung und fortschreitender Gewöhnung übereinstimmt. Mehrere Implementierungsfaktoren scheinen wichtig für eine erfolgreiche Protokollperformance zu sein. Zunächst sol...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Aspen Chip Bedding	Lab Supply	Aspen 323	Aspen-Holzspäne-Einstreu. Vor der Verwendung autoklaviert; in einer Tiefe von etwa 1 cm auf dem Käfigboden platziert.
Autoklaviertes Wasser	Von der Einrichtung bereitgestellt	Nicht zutreffend	Autoklaviertes städtisches Wasser wird ad libitum über Standard-Wasserflaschen bereitgestellt.
Kartonröhre	Von der Einrichtung bereitgestellt	Nicht zutreffend	Eine einfache Papprolle von Toilettenpapier. Wird als rotiertes Enrichment- und Schutzmaterial verwendet.
Crink-I-Nest (bestrahlt)	The Andersons / Lab Supply	CNKR	Geschnittenes Papier-Enrichment-Material. Gamma-bestrahlt. Als rotiertes Enrichment im wöchentlichen Wechsel bereitgestellt.
FinePointe Software	Data Sciences International	Keine Katalognummer	Software zur Datenerfassung und -analyse der Atmung, Version 3.0. Wird für die WBP-Datenerfassung und Parameterberechnung verwendet.
Rack für individuell belüftete Käfige (IVC)	Allentown	EP5000E	IVC-Rack mit Abluft, Kapazität für 140 Käfige. Doppelseitiges Hochdichte-System mit automatischen Belüftungsverbindungen.
Bestrahltes Nagetierfutter	Envigo	T.2918.15	Standard-bestrahlte Nagetier-Diät. Wird ad libitum über einen Drahtgitter-Trichter bereitgestellt.
Maus-Transfertunnel	Braintree Scientific	TRANS-TUBE 100X50MM	Transparenter Polykarbonat-Tunnel, 100 mm Länge × 50 mm Innendurchmesser. Autoklavierbar und wiederverwendbar. Wird für Tiertransfers mit geringem Stress verwendet.
Nestlets (bestrahlt)	Lab Supply	IRR	Komprimierte Baumwoll-Nestlinge (ca. 5 cm × 5 cm, ~2,5 g jedes). Gamma-bestrahlt. Wird als konstantes Enrichment bereitgestellt; einer pro Käfig.
Puderfreie Nitrilhandschuhe	Kimberly-Clark	KC500	Lila puderfreie Nitril-Untersuchungshandschuhe. Werden bei allen Tierkontakt-Prozeduren getragen.
Nichtgewebte Mullbinde	Pivetal	21295040	Nicht-sterile, nichtgewebte Mullbinde, 4-lagig, 4 in × 4 in (10,16 cm × 10,16 cm). Wird als Enrichment-Material verwendet.
Papierhandtuch	Tork (Essity)	MB 540A	Mehrfachgefaltetes weißes Handtuch. Wird als rotiertes Enrichment-Material verwendet.
Smartphone-Kamera	Apple	Keine Katalognummer	iPhone-Smartphone-Kamera. Wird für wöchentliche Nestbewertungsdokumentation verwendet.
Ganzkörper-Plethysmographie-System	Data Sciences International	10222C (2-Stellen); 770621 (4-Stellen)	FinePointe FP Series ungebundenes Ganzkörper-Plethysmographie-System für Mäuse. Erhältlich in 2- und 4-Stellen-Konfigurationen.