Plattenbasierte Bildgebungsanalyse zur Quantifizierung photoperiodischer Reaktionen in Neurospora crassa mittels Protoperithecia-Entwicklung

Zusammenfassung

Der Protoperithecia-Assay quantifiziert photoperiodische Reaktionen in Neurospora crassa, indem er die Bildung der Protoperithecia unter definierten Hell-Dunkel-Zyklen misst. Diese plattenbasierte Methode bietet einen einfachen und skalierbaren Ansatz zum Vergleich photoperiodabhängiger Entwicklungsreaktionen über experimentelle Bedingungen hinweg.

Zusammenfassung

Neurospora crassa ist ein gut etabliertes Modellorganismus zur Untersuchung biologischer Zeitpunkte und lichtregulierter Entwicklung. Der Protoperithecia Assay (PPA) ist eine plattenbasierte Bildgebungsmethode zur Quantifizierung photoperiodischer Reaktionen, indem die Protoperithecia-Bildung als Entwicklungsoutput gemessen wird. Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen reproduzierbaren und skalierbaren Workflow bereitzustellen, um zu bewerten, wie definierte Hell-Dunkel-Zyklen die sexuelle Entwicklung von Pilzen beeinflussen. Bei diesem Test werden Pilzkulturen auf synthetischem Kreuzungsmedium unter kontrollierten photoperiodischen Bedingungen gezüchtet, gefolgt von einer standardisierten Entfernung der Oberflächenkonidien zur Verbesserung der Sichtbarkeit. Protoperithecien werden durch manuelle, bildbasierte Zählung quantifiziert, und für statistische Vergleiche zwischen Photoperiodenbedingungen werden Durchschnittszählungen pro Platte verwendet. Im Gegensatz zu früheren Ansätzen integriert das PPA standardisierte Kulturbedingungen, kontrollierte photoperiodische Exposition und quadrantenbasierte Bildgebung, um reproduzierbare quantitative Vergleiche über Stämme hinweg zu ermöglichen. Dieser Workflow geht über ein einfaches Protokoll hinaus, indem er einen konsistenten und skalierbaren Rahmen zur Messung photoperiodabhängiger Entwicklungsausgabe unter definierten experimentellen Bedingungen etabliert. Die Methode benötigt etwa eine Woche von der Impfung bis zur Analyse und kann auf mehrere Stämme unter definierten Umweltbedingungen angewendet werden. Das PPA bietet eine einfache und zugängliche Plattform für vergleichende Analysen der photoperiodabhängigen Entwicklung bei Pilzen unter kontrollierten Laborbedingungen.

Einleitung

Der Protoperithecia-Test (PPA) quantifiziert photoperiodische Reaktionen im Pilz Neurospora crassa. Viele Organismen messen die Tages- und Nachtlänge, um biologische Prozesse in einem Phänomen namens^{Photoperiodismus} 1,2,3,4,5,6,7,8 zu koordinieren. Bei diesem Test dient die Entwicklung der weiblichen Geschlechtsstruktur, des Protoperitheciums, als messbarer, lichtabhängiger Proxy für die photoperiodische Reaktion. Obwohl der Photoperiodismus bei Pflanzen durch Night-Break Experimente³ gut charakterisiert ist, existieren weniger standardisierte Ansätze zur Quantifizierung photoperiodischer Reaktionen bei nicht-photosynthetischen Eukaryoten wie Pilzen. N. crassa bietet für diesen Zweck aufgrund seiner gut definierten Genetik und lichtempfindlichen Entwicklungswege ein handhabbares Modellsystem. Eine photoperiodabhängige Regulation der Fortpflanzungszeit wurde bei^Organismen 1,2,3,4,5,6,7,8 beobachtet, was die Relevanz lichtgetriebener physiologischer Reaktionen unterstützt; mechanistische Studien an Pilzen bleiben jedoch durch das Fehlen reproduzierbarer Tests eingeschränkt.

Protoperithecia sind vorzeitige weibliche Geschlechtsstrukturen bei N. crassa. Sie entstehen aus Ascogonien, die gewindete Trichogynen entwickeln, die mit Hyphen oder Konidien des entgegengesetzten Paarungstyps⁹ verschmelzen. Nach der Fusion treten die Kerne des "männlichen" Partners in das Protoperithecium ein. Die Anzahl der produzierten Protoperithezien ist saisonal reguliert und stark lichtinduziert:¹⁰. Die photoperiodische Regulation ist zentral für Ökologie, Chronobiologie und Pilzphysiologie, da viele von der Uhr gesteuerte Prozesse vom Licht abhängen. Licht beeinflusst zahlreiche genetische Wege, darunter Photorezeptoren, Kinasen und Lichttransduktionsmechanismen, die mit der sexuellen^{Entwicklung in} Verbindung stehen. Protoperithekien eignen sich gut zur Messung des photoperiodischen Ausgangs, da sie unter dem Mikroskop leicht sichtbar werden können und empfindlich auf Licht reagieren.

Trotz der Bedeutung des Photoperiodismus bei Pilzen sind nur wenige standardisierte und reproduzierbare Tests verfügbar, um die Produktion von Protoperithecia unter kontrollierten Lichtzyklen zu quantifizieren. Ein mitteldurchsatzbasierter, plattenbasierter Test ist wertvoll, da Pilze kostengünstige und leicht zu pflegende Modellorganismen sind, was eine systematische Analyse der lichtinduzierten sexuellen Entwicklung und Genfunktion ermöglicht. Die meisten Photoperiodismus-Forschungen konzentrieren sich auf Pflanzen, während äquivalente quantitative Rahmenwerke für Pilzsysteme weiterhin begrenzt sind. Bei anderen Organismen, einschließlich Insekten, sind lichtabhängige Phänomene wie Diapause^{gut charakterisiert}, aber vergleichbare Ansätze bei Pilzen fehlen. Diese Lücke schränkt den reproduzierbaren Vergleich photoperiodischer Reaktionen zwischen Stämmen und experimentellen Bedingungen ein.

Die PPA baut auf einer Studie von 2004 auf, die die Produktion von Protoperithecia über zunehmende Tageslängen maß, von konstanter Dunkelheit bis zu konstantem Licht, im Band-(bd)-Mutanten (RAS-1^bd), das in zirkadianen Studien ^4,12 verwendet wurde. In diesem Hintergrund wurden photoperiodabhängige Veränderungen in der Protoperithezienproduktion beobachtet. Der derzeitige Workflow passt diesen Ansatz an und erweitert diesen Ansatz unter Verwendung des Referenzstamms FGSC 2489, der mit Whole-Genome Sequencing und Knockout-Ressourcen^13,14 assoziiert ist. Der Test quantifiziert die durchschnittliche Anzahl der unter definierten Photoperioden über eine Woche produzierten Protoperithecia als Proxy für die photoperiodische Antwort. Dieser Ansatz standardisiert Kulturbedingungen, Bildgebung und Quantifizierung und ermöglicht so einen reproduzierbaren Vergleich zwischen experimentellen Bedingungen und Stämmen. Wichtige methodische Fortschritte umfassen standardisierte plattenbasierte Kulturbedingungen, definierte Photoperiodenbelichtungsparameter, quadrantenbasierte Bildgebung und einen reproduzierbaren Quantifizierungs-Workflow.

Dieses Protokoll quantifiziert photoperiodische Reaktionen bei N. crassa , indem es die Bildung von Protoperithezien nach der Belichtung definierter Hell-Dunkel-Zyklen misst. Für jede photoperiodische Bedingung werden vier biologische Replikate verwendet, von denen jede aus einer unabhängig geimpften synthetischen Kreuzungsplatte (SC) besteht. Pro Platte werden vier Bilder gesammelt und gemittelt, um einen einzigen Wert pro biologischer Replikat für die statistische Analyse zu erzeugen. Die Platten werden sieben Tage lang unter kalibrierten Photoperioden (z. B. 12 H:12 H oder 8 H:16 H Hell-Dunkel-Zyklen) inkubiert.

Ein Datenlogger wird in der Wachstumskammer platziert, um kontinuierlich Lichtintensität, Temperatur und Luftfeuchtigkeit aufzuzeichnen und so stabile Umweltbedingungen zu überprüfen. Die Lichtintensität wird über 1.000 Lux gehalten, da niedrigere Werte die Produktion der Protoperithezien verringern. Übermäßige Beleuchtung wird vermieden, um Temperaturanstiege der Kammer und störende thermische Effekte zu verhindern. Nach der Inkubation werden die Makrokonidien vorsichtig mit einem feuchten Papiertuch entfernt, das mit 70 % Ethanol gesättigt ist. Vier gleichmäßig verteilte Quadranten am Rand jeder Platte werden mit 40× Vergrößerung mit einem Stereomikroskop unter Hellfeldbeleuchtung fotografiert. Protoperithekien werden manuell mit einem Bildverarbeitungspaket gezählt, und für statistische Vergleiche zwischen Photoperioden werden Durchschnittszählungen pro Platte verwendet.

Protokoll

Die verwendeten Reagenzien, Software und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung von Medien und Materialien

(Geschätzte Zeit: 1–1,5 Stunden Aktivität; optionale Kühlung über Nacht)

1. Vorbereitung von synthetischem Kreuzungsmedium (SC)
   1. Bereite SC Medium vor: 0,2 % Saccharose, 5 μg/L Biotin, 1,5 % Agar und Westergaards Salze (pH 6,5 mit 1 N NaOH)¹⁵.
   2. Autoklav das Medium. Lassen Sie es auf 50–55 °C abkühlen, bis es einen gießbaren Zustand erreicht.
      VORSICHT: Verwenden Sie hitzebeständige Handschuhe, wenn Sie Flaschen aus dem Autoklaven entfernen.
2. Gießplatten
   1. Pipettieren Sie 10 ml geschmolzenes Medium in 60 mm Petrischalen mit einer Einwegpipette.
   2. Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur 30–45 Minuten fest werden.
   3. Lagern Sie die Teller kopfüber bei 4 °C bis zu 4 Wochen lang.
      HINWEIS: Halte die Tellerflüssigkeit aufrecht. Lagern Sie Teller nicht länger als 4 Wochen bei 4 °C.
3. Bereite Pilzstämme vor.
   1. Wachsen Sie jede Sorte in kleinen Glasreagenzgläsern, die vollständiges oder minimales Medium enthalten, das gemäß Laborhandbuchanleitung¹⁵ vorbereitet ist.
   2. Röhren werden in ständiger Dunkelheit (DD) bei 30 °C inkubiert, bis sich eine sichtbare Myzelbedeckung entlang der Röhrenoberfläche bildet (typischerweise 2–3 Tage).
      VORSICHT: Führen Sie Pilzkulturen mit den gängigen mikrobiologischen Methoden und arbeiten Sie in einem Biosicherheitsschrank, um die Kontamination zu minimieren.

2. Inokulation der Platten

(Geschätzte Zeit: 15–30 Minuten pro Plattensatz)

1. Pilzkonidien übertragen
   1. Inokulieren Sie jede SC-Platte mit steriler Technik und einer Inokulationsschleife.
   2. Platzieren Sie Konidien in der Mitte der Platte, um ein gleichmäßiges Wachstum zu gewährleisten (Abbildung 1A). Konidien erscheinen als puderige, helle Sporen, die die Kolonieoberfläche bedecken.
   3. Tragen Sie etwa 1–2 μL konzentrierte konidiale Suspension (oder eine entsprechende Schleife) auf, um die Impfung über die Platten zu standardisieren.
2. Bereite Teller für die Brutzeit vor
   1. Schließen Sie die Platten sicher, um Verunreinigungen zu verhindern und gleichzeitig einen Gasaustausch zu ermöglichen.
   2. Beschriften Sie jede Platte mit Stammname, Datum und Zustand der Photoperiode.

3. Photoperiodische Behandlung

(Geschätzte Zeit: 10 Minuten Aufbau + 7-tägige Brutzeit)

1. Kalibrieren Sie die Wachstumskammer
   1. Stellen Sie die Kammertemperatur auf 25 °C ein.
   2. Stellen Sie die Luftfeuchtigkeit auf 50 % (akzeptabler Bereich: 40 %–60 %), um das Trocknen des Tellers zu verhindern.
   3. Programm-Photoperiodenzyklen: EQ (Tagundnachtgleiche): 12 Stunden Licht / 12 Stunden Dunkel und SDP (kurzer Tag): 8 Stunden Licht / 16 Stunden Dunkel
   4. Stellen Sie die Lichtintensität auf >1.000 Lux auf Plattenniveau mit einem kalibrierten Lichtmesser ein. Vermeiden Sie Intensitäten, die die Kammertemperatur über 25 °C erhöhen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Kammerlampen im Inneren nicht überhitzen.
      VORSICHT: Verwenden Sie keine Parafilm oder Plastiktüten zur Aufrechterhaltung der Luftfeuchtigkeit, da diese den Gasaustausch einschränken und das Pilzwachstum beeinträchtigen. Wenn keine Feuchtigkeitskontrolle verfügbar ist, platzieren Sie einen Wasserbehälter in der Kammer.
2. Platzplatten in der Kammer
   1. Stellen Sie die Teller gleichmäßig auf den Regalen an, um eine gleichmäßige Lichteinsetzung zu gewährleisten.
   2. Platzieren Sie einen Datenlogger in der Kammer, um kontinuierlich Temperatur und Luftfeuchtigkeit zu überwachen und stabile Umweltbedingungen zu überprüfen.
3. Beginnen Sie mit dem Assay
   1. Inkubieren Sie die Platten unter der programmierten Photoperiode für 7 Tage ohne Störung.

4. Überwachung und Vorbereitung von Platten für Bildgebung

(Geschätzte Zeit: 15–20 Minuten pro Teller)

1. Platten aus der Kammer entfernen
   1. Entferne die Platten nach 7 Tagen Brutzeit.
   2. Untersuchen Sie Platten auf Konidenwachstum und Protoperithecia-Bildung.
2. Saubere Platten zur Sichtbarkeit
   1. Entfernen Sie Oberflächenkonidien vom Plattendeckel und der Agaroberfläche mit zerrissenen Papiertüchern (Abbildung 1B).
   2. Befeuchte ein Papiertuch mit 1–2 ml 70 % Ethanol. Tupfen Sie die Plattenoberfläche vorsichtig 3–5 Mal, um die Konidien zu entfernen. Lassen Sie die Platten vor der Bildnahme 1–3 Minuten an der Luft trocknen (Abbildung 1C).
      VORSICHT: Ethanol ist brennbar; Halte dich von Wärmequellen fern.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, übermäßigen Druck auszuüben. Ziehen Sie das Handtuch nicht über die Agaroberfläche, da dies das Medium beschädigen oder die Protoperithezie stören könnte.

5. Bildabbildung von Protoperithecien

(Geschätzte Zeit: 5 Minuten pro Teller)

1. Bereiten Sie sich auf die Bildgebung vor
   1. Stellen Sie ein Mikroskop mit gleichmäßiger Beleuchtung und Vergrößerung (typischerweise 40×) auf.
   2. Stellen Sie sicher, dass die Plattenoberfläche trocken und frei von Schmutz ist.
2. Bilder aufnehmen
   1. Stellen Sie sich vier gleichmäßig verteilte Quadranten am Plattenrand mit gleichmäßiger Vergrößerung vor.
   2. Beschrifte jedes Bild mit Dehnung, Photoperiodenzustand, Kennzeichen und Quadrantenposition.
   3. Speichern Sie Bilder in einem konsistenten Format (z. B. TIFF) zur Analyse.

6. Quantifizierung und Datenanalyse

(Geschätzte Zeit: 10–20 Minuten pro Teller zum Zählen; 15–25 Minuten für die Analyse)

1. Graf Protoperithecia
   1. Öffnen Sie jedes Bild in einem Bildverarbeitungspaket.
   2. Verwenden Sie das Cell Counter-Plugin, um Protoperithecia manuell zu zählen. Blasen, Randartefakte und mehrdeutige Strukturen werden ausgeschlossen. Der Count gruppierte Protoperithekien als einzelne, unterscheidbare Einheiten.
   3. Zählen Sie die Aufzeichnungen für jedes Quadrant und berechnen Sie den Durchschnitt pro Teller.
2. Daten analysieren
   1. Quantifizierte Daten in statistische Analysesoftware importieren.
   2. Führen Sie statistische Analysen mit Welchs t-Test für Vergleiche durch, wie in Abbildung 2 gezeigt.
   3. Erstellen Sie Diagramme, die photoperiodische Behandlungen, Stämme oder Replikate vergleichen.

Ergebnisse

Nach der Impfung mit dem Wildtyp-Stamm bedeckten Konidien innerhalb von 36–48 Stunden die SC-Oberfläche. Nach 7 Tagen Photoperiod-Exposition bildete sich eine dichte konidiale Schicht, die mit einem mit 70 % Ethanol getränkten Papiertuch entfernt wurde (Abbildung 1). Dieser Schritt legte die zugrundeliegende Protoperithezie frei, ohne deren Struktur zu stören. Unter der Mikroskopie erschienen Protoperithecien als dunkle, kreisförmige Strukturen, die über die Plattenoberfläche verteilt sind. ...

Diskussion

Das Ziel des PPA ist es, die sexuelle Entwicklung bei Pilzen als Stellvertreter zu nutzen, um festzustellen, ob ein Organismus eine bestimmte Photoperiode wahrnimmt. Durch die Quantifizierung der durchschnittlichen Anzahl der unter verschiedenen Lichtzyklen produzierten Protoperithekien können photoperiodische Reaktionen bewertet und unter verschiedenen Bedingungen verglichen werden. Im Einklang mit den vorherigen Beobachtungen ^4,16

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agar	BD	90000-786	Für synthetische Kreuzungsmedien/Minimalmedien
Alkoholbrennerflamme	Wards	470346-104	Zum Sterilisieren von Inokulationsschleife
Ammoniumeisensulfat-Hexahydrat	Supelco	FX0245-1	Für synthetische Kreuzungsmedien/Minimalmedien
Ammoniumnitrat (NH4NO3)	BeanTown Chemical	BT134170-250G	Für Minimalmedien
Autoklav	VWR International	76683-456	Zum Sterilisieren von Glaswaren und Medien
Biologische Sicherheitskabinett	ThermoFischer Scientific	1323TS	Zur Reduzierung der Kontamination der Platten und des Labors.
Biotin	VWR	97061-444	Für synthetische Kreuzungsmedien
Borsäure (H3BO3)	Electron Microscopy Sciences	100503-696	Für synthetische Kreuzungsmedien/Minimalmedien
Calciumchlorid (CaCl2)	AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC	JT1311-1	Für synthetische Kreuzungsmedien
Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	223506-25G	Für Minimalmedien
Zitronensäure-Monohydrat (C6H8O7·H2O)	Sigma-Aldrich	1002440500	Für synthetische Kreuzungsmedien/Minimalmedien
Kupfersulfat-Pentahydrat (CuSO4·5H2O H2O)	BeanTown Chemical	BT121245-1KG	Für synthetische Kreuzungsmedien/Minimalmedien
Ethanol	Decon Labs	71001-754	Zum Entfernen von Konidien von der Plattenoberfläche und zum Sterilisieren von Inokulationsschleifen
FIJI/ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	N/A	Zum Analysieren von Bildern/Zählen
Handschuhe	SW Safety Solutions	76382-944	Zum Schutz
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	N/A	Zum Durchführen statistischer Tests und Erstellen von Grafiken
Wachstumskammer	Caron Products & Services	6320 & 6340 Serie	Programmierbar für Photoperiodenzyklen
HOBO Datenlogger	Onset Computer Corporation	MX2202	Zum Aufzeichnen von Lichtintensität und Temperatur
Inokulationsschleife	VWR International	10806-354	Zum Übertragen von Pilzmaterial auf Petrischalen
Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4·7H2O)	BeanTown Chemical	BT145380-1KG	Für synthetische Kreuzungsmedien/Minimalmedien
Mangansulfat-Monohydrat (MnSO4·H2O H2O)	Sigma-Aldrich	1059410250	Für synthetische Kreuzungsmedien/Minimalmedien
Mikroskop (Leica S6 D Greenough Stereomikroskop)	Leica Microsystems	10446297	Zum Abbilden
Neurospora crassa FGSC 2489	Fungal Genetics Stock Center	74-OR23-1VA, JCM19069	Pilzstamm
Papierhandtücher	Kimberly-Clark Professional, Scott und Kleenex	6666114	Zum Gießen von Medien
Permanent Marker	Sharpie	30072	Zum Beschriften von Platten
Petrischalen	VWR International	25384-164	Zum Ausgießen von synthetischen Kreuzungsmedien
Pipetten	VWR International	75816-090	Zum Gießen von Medien
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)	BeanTown Chemical	BT225070-500G	Für synthetische Kreuzungsmedien/Minimalmedien
Kaliumnitrat (KNO3)	Sigma-Aldrich	221295-100G	Für synthetische Kreuzungsmedien
Kleine Einweg-Glas-Teströhrchen	VWR International	470211-698	Für anfängliches Pilzstammwachstum
Natriumchlorid (NaCl)	VWR International	BDH9286-500G	Für synthetische Kreuzungsmedien
Natriumcitrat-Dihydrat (Na3C6H5O7·2H2O)	VWR	97061-008	Für Minimalmedien
Natriumhydroxid (NaOH)	AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC	JT5635-2	Für synthetische Kreuzungsmedien
Natriummolybdat-Dihydrat (Na2MoO4·2H2O)	Supelco	1.06524.1000	Für synthetische Kreuzungsmedien/Minimalmedien
Saccharose	VWR International	BDH9308-500G	Für synthetische Kreuzungsmedien/Minimalmedien
Zinksulfat-Heptahydrat (ZnSO4·7H2O)	BeanTown Chemical	BT122545-500G	Für synthetische Kreuzungsmedien/Minimalmedien