Die häufige Klasse der mit Vaskulitis assoziierten genetischen Varianten bei Typ-I-Interferonopathien innerhalb einer pädiatrischen Kohorte

Zusammenfassung

Die Ganz-Exom-Sequenzierung von 1.204 pädiatrischen Patienten mit Verdacht auf autoinflammatorische Erkrankungen identifizierte interferonopathische Varianten in 132 Fällen, darunter 79 neuartige Mutationen. Die meisten waren heterozygot und mit vaskkulitischen Phänotypen verbunden. Diese Ergebnisse unterstreichen den diagnostischen Wert von genetischen Tests und die zentrale Rolle der dysregulierten Typ-I-Interferon-Signalübertragung bei pädiatrischer Vaskulitis.

Zusammenfassung

Pädiatrische Vaskulitis wird traditionell durch histopathologische Untersuchung diagnostiziert; in der klinischen Praxis werden jedoch zunehmend weniger invasive, bildgebende Ansätze eingesetzt. Trotz dieser Fortschritte bleibt die Identifizierung einer zugrundeliegenden monogenen Ätiologie unerlässlich, um Krankheitsmechanismen zu verstehen, die Prognose vorherzusagen und gezielte Therapiestrategien zu steuern. Typ-I-Interferonopathien bilden eine heterogene Gruppe immunvermittelter Erkrankungen, die durch konstitutive Interferon-Signalübertragung und häufige vaskulitische oder vaskulopathische Manifestationen gekennzeichnet sind. Anhaltende Aktivierung der Nukleinsäure-Sensorwege und eine beeinträchtigte intrazelluläre Homöostase tragen zu endothelialer Dysfunktion und chronischer vaskulärer Entzündung bei.

Diese Studie präsentiert einen umfassenden genetischen Analyse-Workflow zur Erkennung vaskulitisassoziierter Varianten in interferonopathiebezogenen Genen innerhalb einer patrisch-autoinflammatorischen Kohorte. Die Ganz-Exom-Sequenzierung wurde bei 1.204 Patienten mit vermuteten autoinflammatorischen Erkrankungen durchgeführt. Varianten, die kodierende Regionen und Schnittstellen betreffen, wurden mit einer bioinformatischen Pipeline analysiert, die auf den Richtlinien des American College of Medical Genetics and Genomics basiert und statistische Filter- und Signalverarbeitungstechniken integrierte, inspiriert von diskreten Fourier-Transformationen (DFT) und statistischen Verteilungen, um die Priorisierung und Interpretation der Varianten zu verbessern.

Interferonopathie-assoziierte Varianten wurden bei 132 pädiatrischen Patienten identifiziert, die über eine rheumatologische Klinikdatenbank untersucht wurden. Insgesamt wurden 92 einzigartige Varianten entdeckt, darunter 13 zuvor gemeldete pathogene oder wahrscheinlich pathogene Varianten sowie 79 neuartige Varianten, die bis Februar 2026 nicht in öffentlichen Datenbanken vorlagen. Die klinischen Manifestationen umfassten meist wiederkehrendes Fieber, vaskkulitische Manifestationen und komplexe autoinflammatoriske Erscheinungen.

Varianten betrafen Gene, die mit dysregulierter Interferon-Signalübertragung und angeborener Immunaktivierung assoziiert sind, einschließlich Signalwege, die mit STING-Aktivierung, Nukleinsäurestoffwechsel und intrazellulärer Trafficking-Dysfunktion verbunden sind. Dieser interdisziplinäre Arbeitsablauf zeigt den potenziellen diagnostischen Nutzen der genomischen Analyse bei pädiatrischer Vaskulitis und hebt die Bedeutung anhaltender Interferon-Signalübertragung bei der Pathogenese von Gefäßverletzungen und autoinflammatorischen Erkrankungen hervor.

Einleitung

Pädiatrische Vaskulitis wurde traditionell durch histopathologische Diagnostik diagnostiziert, die bis heute der Goldstandard ist. Allerdings bevorzugen neuere diagnostische Strategien zunehmend weniger invasive Ansätze, insbesondere bildgebende Methoden. Trotz dieser Fortschritte ist die Identifizierung einer zugrundeliegenden monogenen Ätiologie von größter Bedeutung bei der Vaskulitis im Kindesalter, da sie wichtige Einblicke in Krankheitsmechanismen, Prognosen und Möglichkeiten für gezielte Therapien^{liefert 1,2}.

Bei Kindern mit systemischer Entzündung und Multiorganbeteiligung sollte eine Vaskulitis im Kindesalter vermutet werden. Eine gründliche Anamnese, eine umfassende körperliche Untersuchung, Laboruntersuchungen, bildgebende Untersuchungen und in einigen Fällen Gewebebiopsien sind erforderlich, um die Diagnose festzustellen und Mimiker auszuschließen. Früherkennung und Behandlung sind unerlässlich, da unbehandelte Krankheiten zu lebensbedrohlichen Komplikationen oder langfristigen Folgen führen^{können 1}.

Typ-I-Interferonopathien umfassen ein vielfältiges Spektrum monogener und komplexer immunvermittelter Erkrankungen, gekennzeichnet durch anhaltende Aktivierung des Typ-I-Interferonwegs und wiederkehrende vaskulitische oder vaskulopathische Merkmale ^3,4. Dysregulierte Nukleinsäuresensorik und eine beeinträchtigte intrazelluläre Homöostase sind zentrale pathogene Mechanismen, die anhaltende Überproduktion von Interferonen mit vaskulärer Entzündung und Verletzung in Verbindung bringen. Gain-of-Function-Mutationen bei TMEM173 (STING1) verursachen eine STING-assoziierte Vaskulopathie mit Beginn im Säuglingsalter (SAVI), während autosomal dominante COPA-Mutationen den endoplasmatischen Retikulum-Golgi-Traffic stören, was zu aberranter STAK-Aktivierung und einem vaskulitischen Phänotyp ^3-5 führt. Weitere Interferonopathien, die durch Defekte in Nukleinsäurestoffwechsel-Genen (TREX1, RNASEH2A/B/C, SAMHD1, ADAR1 und IFIH1) verursacht werden, unterstreichen zusätzlich den mechanistischen Zusammenhang zwischen Interferondysregulation und vaskulärer Pathologie³ (siehe Abbildung 1).

Abbildung 1. Detaillierte pathogene Architektur von Typ-I-Interferonopathien, die endotheliale Dysfunktion und mikrovaskuläre Verletzungen in pädiatrischen Kohorten verursachen. (Links) Systemischer Kontext der pädiatrischen Typ-I-Interferonopathie: defekte Selbst-gegen-Nicht-Selbst-Diskriminierung und abweichende Wirts-Nukleinsäure-Wahrnehmung lösen systemische Autoentzündung aus. Klinische Phänotypen zeichnen sich deutlich durch früh einsetzende kutane Vaskulopathie und systemische Beteiligung aus, die häufig als chilblainartige Hautläsionen auftreten. (Mitte) Mechanistische Kaskade genetischer Defekte zur systemischen Dysregulation: Funktionsverlustmutationen in Nukleinsäure-Clearance-Enzymen (z. B. DNASE1, TREX1) führen zur aberranten Ansammlung endogener DNA und RNA im Zytoplasma. Gleichzeitig treiben Gain-of-Function-Mutationen in Sensoren wie STING1 die konstitutive Aktivierung des cGAS-STING-Weges unabhängig von viralen Auslösern voran. Diese pathogene intrazytoplasmatische Wahrnehmung hyperaktiviert die regulatorischen Faktoren der Interferonen, was zur kontinuierlichen Synthese von Typ-I-Interferonen (IFN-α/β) führt. Chronische Zytokin-Ausgabe erzeugt eine sich selbst erhaltende systemische Amplifikationsschleife über IFNAR1/2-Rezeptoren, die durch beeinträchtigte Clearance-Mechanismen und positive Rückkopplungskontrollen verschärft wird. (Rechts) Pathologisches Ergebnis: Anhaltende Bindung des zirkulierenden IFN-α/β an den Endothelzellrezeptorkomplex induziert eine anhaltende JAK-STAT-Aktivierung. Diese ständige homöostatische Störung löst anhaltenden endothelialen Stress aus und beeinträchtigt physiologische Vasorelaxationsmechanismen. Auf Kapillarebene verursacht dieser hyperinflammatoriske Zustand direkte Endothelzellverletzungen, eine erhebliche Verdickung der Gefäßwand und eine luminale mikrovaskuläre Thrombose, die in schwerer Gewebeischämie und nekrotisierender Mikrovaskulopathie ohne autoantikörpervermittelte Autoimmunwege gipfelt. Abkürzungen: cGAS-STING = zyklischer GMP-AMP-Synthase-Stimulator von Interferongenen; DNASE1 = Desoxyribonuklease 1; GoF = Funktionsgewinn; IFN = Interferon; IFNAR = Interferon-Alpha/Beta-Rezeptor; IRF = Interferon-regulatorischer Faktor; JAK-STAT = Janus-Kinase-Signaltransducer und Transkriptionsaktivator; STING1 = Stimulator der Interferonantwort cGAMP-Interaktor 1; TREX1 = Drei-Prim-Reparaturexonuklease 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Dieser Ansatz wurde entwickelt, um interferonopathieassoziierte Genvarianten in pädiatrischen autoinflammatorischen Kohorten zu erkennen, da konventionelle Methoden bei der frühen Priorisierung seltener Mutationen analytische Herausforderungen haben können und die Neutrophilenheterogenität eine entscheidende Rolle bei der Vorhersage des Rückfallrisikos⁶ spielt. In der Literatur wurde die Rolle der Interferon-Signaldysregulation bei der Vaskulitis in kleinen Gefäßen durch Einzelzellanalysen aufgeklärt, was den Vorteil der Whole-Exome-Sequenzierung (WES) für die frühe Diagnose in pädiatrischen Kohorten⁶ unterstreicht.

Monogene autoinflammatoriske Syndrome können sich mit Vaskulitis oder vaskulitisähnlichen Manifestationen äußern. Zum Beispiel kann SAVI die Vaskulitis⁷ in kleinen oder mittleren Gefäßen nachahmen. Ähnlich stellt juvenile idiopathische Arthritis (JIA) eine heterogene Gruppe von entzündlichen Erkrankungen im Kindesalter dar, die bis ins Erwachsenenalter anhalten können und mit interferonopathischer Dysregulation assoziiert sind, was die Notwendigkeit einer genetischen Analyse in pädiatrischen Kohorten⁸ unterstreicht.

Typ-I-Interferonopathien sind mendelsche angeborene Immunfehler, die durch die Aktivierung antiviraler Sensoren gekennzeichnet sind, die durch wirtsabgeleitete Nukleinsäuren ausgelöst werden und ein Versagen bei der Selbst- versus Nicht-Selbst-Diskriminierung^{darstellen 3,4}. Diese Erkrankungen sind durch die Hochregulation der Typ-I-Interferon-Signalübertragung definiert, und dermatologische Manifestationen liefern oft wichtige diagnostische Hinweise. SAVI ist mit Gain-of-Function-Mutationen bei TMEM173 assoziiert und zeigt sich mit früh einsetzender kutaner Vaskulopathie und pulmonaler Entzündung⁹. Die p.V155M-Mutation ist die am häufigsten berichtete Variante¹⁰. SAVI ist eine seltene autoinflammatorische Erkrankung, die mit STING1-Mutationen assoziiert ist, gekennzeichnet durch frühe interstitielle Lungenerkrankung (ILD) und kutane Läsionen, und kann klinisch systemischen Lupus erythematosus (SLE)¹¹ nachahmen. Die dysregulierte Typ-I-Interferon-Signalübertragung wurde ebenfalls mit der antineutrophilen zytoplasmatischen Antikörper (ANCA)-assoziierten Vaskulitis (AAV) in Verbindung gebracht. Bei AAV ist eine Typ-I-Interferon-Signatur bei mikroskopischer Polyangiitis/Myeloperoxidase-ANCA-assoziierter Vaskulitis (MPA/MPO-AAV) vorherrschend und mit der Nierenprognose assoziiert, was den Beitrag seltener Varianten zur Interferon-Dysregulation¹² hervorhebt.

Monogene autoinflammatoriske Syndrome können sich mit Vaskulitis oder vaskulitisähnlichen Manifestationen äußern. Zum Beispiel kann SAVI die Vaskulitis⁷ in kleinen oder mittleren Gefäßen nachahmen. Zuvor wurde die größte weltweite Kohorte von Patienten mit aktivierenden STING1-Mutationen beschrieben, was eine erweiterte klinische und immunologische phänotypische Charakterisierung von SAVI¹³ ermöglichte. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden bemerkenswerte Fortschritte beim Verständnis der Krankheitserregererkennung sowohl durch hämatopoietische als auch nicht-hämatopoetische Zellen erzielt. Mikrobielle Komponenten werden durch keimbahncodierte Rezeptoren detektiert, ein entscheidender Schritt bei der Initiierung dieser^{Reaktion 14}. Im Jahr 2006 wurde nachgewiesen, dass die Transfektion von DNA in verschiedene Zelltypen eine Hochregulation von Typ-I-Interferonen in einer toll-like-rezeptor-(TLR)-unabhängigen Weise induziert. In diesem Zusammenhang wurde STING, ein transmembranäres Protein, das im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert ist, 2008 als wichtiger Vermittler der Typ-I-Interferon-Antworten auf synthetische und virale DNA¹³ identifiziert. Gain-of-Function-Mutationen bei STING1 führen zu einer Typ-I-Interferonopathie, bekannt als SAVI⁹˒¹⁰˒¹⁴. Diese schwere Erkrankung ist unterschiedlich gekennzeichnet durch früh einsetzende systemische Entzündung, kutane Vaskulopathie und interstitielle Lungenerkrankung (ILD)¹⁴. SAVI ist selten, bisher wurden 52 Patienten aus 37 Familien gemeldet, und die meisten Fälle treten de novo auf, obwohl auch autosomal dominante Vererbung dokumentiert wurde. Zuvor wurde die größte globale Kohorte von Patienten mit aktivierenden STING1-Mutationen beschrieben, was eine erweiterte klinische und immunologische phänotypische Charakterisierung von SAVI ^9,10,11˒¹⁴ lieferte.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die frühzeitige Erkennung interferonopathieassoziierter Genvarianten durch WES-basierte genetische Analysen bei pädiatrischen Patienten mit autoinflammatorischen Merkmalen zu ermöglichen, da herkömmliche Ansätze oft unzureichend sind, um seltene Mutationen zu identifizieren, und möglicherweise Möglichkeiten für eine frühzeitige Intervention verpassen. Die Literatur zeigt, dass die Rolle der Interferon-Hochregulation bei vaskulitisähnlichen Phänotypen durch die Untersuchung von Mendelschen Erkrankungen geklärt wurde, was den Vorteil von WES bei der Erkennung seltener Varianten ^4,7,12 weiter hervorhebt.

Das Hauptziel dieser Methode ist es, physikalisch basierte Signalverarbeitungsprinzipien mit vereinfachter biophysikalischer rechnergestützter Modellierung zu integrieren, um die Variantenerkennung in WES-Daten für Typ-I-Interferonopathien zu unterstützen, während gleichzeitig die nachgelagerten Auswirkungen auf Interferon-Signalwege, insbesondere die Janus-Kinase-Signal-Transducer and Activator of Transcription (JAK-STAT)-Kaskade, interpretiert werden. Dieser explorative Ansatz zielt darauf ab, die Analyse genomischer Regionen zu ergänzen, die häufig von Sequenzierungsrauschen und einer uneinheitlichen Abdeckung immunvermittelter Erkrankungen betroffen sind, bei denen dysregulierte Interferon-Aktivierung die vaskulitischen Phänotypen antreibt. Standard-bioinformatische Workflows konzentrieren sich typischerweise auf standardisierte Qualitätsmetriken, was bei der Identifizierung von Varianten in komplexen Genregionen wie STING1 oder TREX1 Raum für zusätzliche unterstützende Filterung lässt. Durch Anwendung von Signalverarbeitungstechniken, die von diskreten Fourier-Transformationen (DFT) und statistischen Verteilungen inspiriert sind, extrahiert diese Methode zugrunde liegende genomische Merkmale aus Nukleotidsequenzen, Mapping-Basen (A, T, C, G) auf binäre Indikatoren für die Mutationsmusteranalyse¹⁵. Darüber hinaus integriert die biophysikalische Modellierung von Interferonwegen Schwellenwerte und kumulative Signalverstärkung, um zu bewerten, wie genetische Varianten eine endotheliale Dysfunktion aufrechterhalten können, mit Fokus auf die Rolle des JAK-STAT-Weges bei der Übertragung von Typ-I-Interferonsignalen (IFN-α/β).

Diese explorative Anwendung wurde entwickelt, um Ausrichtungsprofile in Regionen mit geringer Abdeckung zu untersuchen. Während Standard-Computerwerkzeuge die primäre Variantenfiltration bieten, untersucht das unterstützende Modell, ob eine SNR-basierte Bewertung eine sekundäre qualitative Gating von kodierenden Einzelnukleotid-Varianten (SNVs) bieten kann, die von einer ungleichmäßigen Leseverteilung betroffen sind. Dieser physikbasierte Ansatz nutzt SNR-Optimierung, um die Genotypqualität und die geringfügigen Leseverhältnisse zu bewerten. In der breiteren Literatur hat ähnliche stochastische Modellierung graduierte Antworten in JAK-STAT-Pfaden statt Alles-oder-Nichts-Dynamiken aufgedeckt, was eine bessere Vorhersage der Interferonüberproduktion^ermöglicht. Der JAK-STAT-Weg, aktiviert durch Typ-I-Interferone (IFNs), die an IFNAR1/IFNAR2-Rezeptoren binden, beinhaltet Janus-Kinasen (JAK1, TYK2), die STAT1 und STAT2 phosphorylieren und so den ISGF3-Komplex mit IRF9 für Kerntranslokation und ISG-Transkription¹⁷ bilden. Dies kann mit gewöhnlichen Differentialgleichungen (ODEs) für IFN-β-Induktion modelliert werden:

wobei die aufgeführten Parameter die Phosphorylierungsrate, die Dephosphorylierung und die negative Rückkopplung über SOCS1 repräsentieren, wobei die schwellenabhängige^{Amplifikation 17} hervorgehoben wird. Weitere Details umfassen die Bildung von STAT1-Homodimeren für IFN-γ-Signalisierung, aber bei Typ-I-Interferonopathien führt anhaltende Aktivierung zu einer übermäßigen ISG-Expression. Stochastische Simulationen berücksichtigen die Variabilität weiter, indem sie Gillespie-Algorithmen zur Modellierung von Rauschen in der Rezeptor-Ligandenbindung und Kernimport verwenden, wodurch Zell-zu-Zell-Heterogenität in IFN-Antworten aufgedeckt^{wird 16}. Diese Methode eignet sich besonders für Forscher, die autoinflammatoriske Vaskulitis untersuchen, da sie einen quantitativen Rahmen bietet, der Varianten mit Fehlwegdysregulation verknüpft, beispielsweise durch erweiterte ODEs mit parakrinen Effekten:

wobei die aufgeführten Parameter die Produktionsrate, den Abbau und die Parakrin-Verstärkung¹⁸ repräsentieren. Nutzer mit Zugang zu Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten und Rechenressourcen können diesen Ansatz anwenden, um Kandidatenvarianten zu priorisieren und potenzielle Signalwegeffekte zu erforschen.

Diese Studie wurde mit einem multidisziplinären rheumatologischen und genetischen Ansatz geplant, um vasculitisassoziierte Varianten in interferonopathie-bezogenen Genen in einer großen pädiatrischen Kohorte mit autoinflammatorischen Merkmalen zu identifizieren, unter Verwendung eines klinischen Exom-Sequenzierungsprotokolls (CES)/WES-basierter Genanalyse, aufgrund von Schwierigkeiten bei der Klassifikation der Vaskulitis und Einschränkungen traditioneller Ansätze. Darüber hinaus zielte die Studie darauf ab, den diagnostischen Wert der genetischen Bewertung bei Vasculitis im Kindesalter hervorzuheben.

Die Chapel Hill Vasculitis-Klassifikation von 2012 schließt monogene autoinflammatoriske Vaskulitis¹⁹ nicht ein. Diese Studie zielte darauf ab, die Häufigkeit interferonopathiebezogener Varianten bei einer Gruppe pädiatrischer Patienten mit autoinflammatorischen Symptomen zu bestimmen, zur Erweiterung der Datenbank für seltene Krankheiten beizutragen und die Bedeutung der genetischen Bewertung bei pädiatrischer Vaskulitis zu betonen.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom Ethikausschuss der Medizinischen Fakultät der Universität Ege genehmigt. Alle peripheren Blutproben wurden nach schriftlicher informierter Zustimmung von Patienten oder deren gesetzlichen Vormündern entnommen, gemäß der Erklärung von Helsinki. Diese retrospektive Einzel-Zentrum-Studie wurde entwickelt, um die Häufigkeit interferonopathieassoziierter Varianten bei Patienten zu bewerten, die eine genetische Analyse auf den Verdacht auf autoinflammatorische Erkrankungen unterzogen hatten, und um deren Zusammenhang mit Vasculitis zu untersuchen. Zwischen 2022 und 2025 wurden periphere Blutproben eingelegt, die mit einer vorläufigen Diagnose einer autoinflammatorischen Erkrankung an das Molekularmedizinische Labor der Universität Ege geschickt wurden. Insgesamt wurden 1.204 Proben genetisch analysiert. CES/WES wurde als Next-Generation-Sequenzierungs- (NGS)-Ansatz verwendet, der Exonen und benachbarte intronische Sequenzen anzeigte. Varianten wurden anhand der ACMG-Kriterien und bioinformatischer Analyse klassifiziert. Gutartige und potenziell gutartige Varianten wurden ausgeschlossen. Unter diesen wurden 132 pädiatrische Fälle mit identifizierten interferonopathieassoziierten Varianten, die die Einschlusskriterien erfüllten, in die abschließende Studienkohorte aufgenommen.

Innerhalb dieser pädiatrischen Kohorte wurden klinische Daten aus einer rheumatologischen Datenbank abgerufen. Insgesamt wurden unter den 132 Patienten 92 einzigartige genetische Varianten identifiziert, darunter 13 zuvor gemeldete pathogene oder wahrscheinlich pathogene Varianten, die in öffentlichen Variantendatenbanken dokumentiert wurden (z. B. ClinVar), sowie 79 neuartige Varianten, die bis Februar 2026 in öffentlichen Datenbanken nicht vorhanden waren. Die meisten Varianten waren heterozygot und mit CAPS-ähnlichen Phänotypen oder komplexen autoinflammatorischen Gefäßerkrankungen assoziiert. WES verwendete einen NGS-Ansatz, der auf proteinkodierende Regionen (Exons) und benachbarte intronische Sequenzen abzielt, um Varianten der Spleißstelle und regulatorischen Varianten zu erkennen. Obwohl WES etwa 1 % bis 2 % des menschlichen Genoms abdeckt, erfasst es fast 85 % der bekannten krankheitserregenden Mutationen und ist damit ein äußerst effizientes Werkzeug zur Erkennung seltener Varianten.

Der Laborablauf umfasste genomische DNA-Extraktion aus peripherem Blut, DNA-Fragmentierung, adapter-ligierte Bibliotheksvorbereitung und Exomanreicherung mittels hybridisierungsbasierter Fangsonden mittels Biotin-Streptavidin-Pulldown. Hochdurchsatz-Paarsequenzierung wurde auf einer DNA-Nanoball-Sequenzierungsplattform durchgeführt, wobei eine durchschnittliche Abdeckungstiefe von 100–200 Mal erreicht wurde, um eine zuverlässige Variantenerkennung sicherzustellen. Die bioinformatische Analyse umfasste die Ausrichtung auf das Referenzgenom, Variantenaufrufe und Annotationen mittels kuratierter Variantendatenbanken, wobei die Variantenklassifikation gemäß den Richtlinien des American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) durchgeführt wurde. Varianten wurden als zuvor berichtet oder neu eingestuft. Ausgewählte Varianten wurden durch Sanger-Sequenzierung validiert.

Neben standardisierten bioinformatischen Pipelines wurden physikbasierte Signalverarbeitungsprinzipien und vereinfachte computergestützte Modellierung angewandt, um die Sequenztiefe, die Gleichmäßigkeit der Abdeckung und die Signal-Rausch-Eigenschaften zu bewerten und so eine explorative, ergänzende Schicht zur Analyse der rohen Sequenztiefe und regionalen Abdeckungen zu bieten. Darüber hinaus wurden biophysikalische Modellierungskonzepte eingesetzt, um die kumulative Wirkung vasculitisassoziierter genetischer Varianten zu bewerten.

Dieser interdisziplinäre Rahmen dient als vorläufiges Labormodell zur Untersuchung der Variantenfiltereigenschaften in einem explorativen Forschungskontext, insbesondere zur Steuerung von Anti-Interferon-Therapiestrategien. Einschränkungen umfassen eine geringere Empfindlichkeit für niedrigstufige Mosaikvarianten und die Notwendigkeit der funktionalen Validierung neuartiger Befunde. Mögliche Anwendungen umfassen die frühzeitige Diagnose pädiatrischer Vaskulitis, personalisierte therapeutische Entscheidungsfindung sowie die Erweiterung von Variantendatenbanken für Immunologie, Rheumatologie und Gefäßmedizin.

DNA-Fragmentierung

Zwanzig Mikroliter verdünnte DNA wurden in neue sterile PCR-Röhrchen übertragen. Jedem Röhrchen wurden 2 μL Fragmentierungs-/Adenylierungspuffer und 3 μL Fragmentierungs-/Adenylierungsenzymmischung hinzugefügt; das gesamte Reaktionsvolumen betrug 25 μL. Die Mischung wurde sanft gemischt, kurzzeitig zentrifugiert, und das Fragmentierungsprogramm wurde am thermischen Zyklus durchgeführt. Unmittelbar nach Fertigstellung wurden die Röhren kurzzeitig zentrifugiert und auf Eis gelegt. Das erwartete Ergebnis war eine durchschnittliche DNA-Fragmentgröße von 200–300 bp.

Adapterligatur

Zu jedem Fragmentierungsprodukt wurden 2,5 μL Sequenzierungsadapter hinzugefügt, gefolgt von 10 μL Ligations-Master-Mix (ohne Vortexing). Das Gemisch wurde vorsichtig pipettiert, um die Homogenität zu gewährleisten, kurzzeitig zentrifugiert und 15 Minuten lang bei 20 °C mit geöffnetem Deckel des thermischen Zyklus inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Röhren kurzzeitig zentrifugiert und auf Eis gestellt.

Perlenbasierte Reinigung

Zu jeder Probe wurden dreißig Mikroliter magnetische Perlen hinzugefügt und durch Pipetteren gründlich vermischt, bis eine homogene Suspension erhalten war. Die Mischung wurde 5 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert, und die Röhren wurden dann 3 Minuten auf einen magnetischen Ständer gestellt. Nachdem das Supernatant entfernt war, wurde es vorsichtig entfernt. Das Pellet wurde zweimal mit 100 μL 80 % Ethanol gewaschen, und das restliche Ethanol wurde nach der Endwäsche entfernt. Die Perlen wurden dann bis zu 5 Minuten an der Luft auf dem magnetischen Ständer getrocknet. Neun Mikroliter nukleasefreies Wasser wurden hinzugefügt, das Pellet wurde durch Pipettieren wieder suspendiert und 2 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach 3 Minuten magnetischer Trennung wurden 7,5 μL Supernatant in ein neues, beschriftetes PCR-Rohr übertragen.

PCR-Verstärkung

In vitro Transkriptionsprimer (IVT) wurden verdünnt (20 μL Primerbestand + 80 μL nukleasefreies Wasser). Für die PCR-Reaktion (Gesamtvolumen 17,5 μL) wurden 2,5 μL IVT-Primer 1, 2,5 μL IVT-Primer 2 und 12,5 μL Library-Amplification-Master-Mix hinzugefügt. Die Mischung wurde sanft pipettiert und das PCR-3-Programm durchgeführt.

Post-PCR-Reinigung

Zu jedem PCR-Produkt wurden fünfundzwanzig Mikroliter magnetische Perlen hinzugefügt. Nach 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur und magnetischer Trennung wurden die Perlen zweimal mit 100 μL 80% Ethanol gewaschen. Nach bis zu 5 Minuten Lufttrocknen wurden 11 μL nukleasefreies Wasser hinzugefügt. Zehn Mikroliter Supernatant wurden in ein neues Rohr übergeben. Die Bibliothekskonzentration wurde gemessen; Ziel: >25 ng/μL.

Pooling und Hybridisierung (Proben pro Pool)

Die Bibliotheken wurden mit acht Patientenproben pro Pool zusammengelegt (93,75 ng pro Probe, insgesamt 750 ng). Das Volumen wurde bei Bedarf auf 12,5 μL mit nukleasefreiem Wasser angepasst. Die Hybridisierungsmischung wurde bei 65 °C für 15 Minuten vorinkubiert. Blockierende Lösung, universelle blockierende Oligonukleotiden, eine Exom-Capture-Sonde, nukleasefreies Wasser und einen Hybridisierungs-Enhancer wurden sequentiell hinzugefügt. Das 16-stündige Hybridisierungsprogramm wurde gestartet (18:00–10:00).

Erfassung hybridisierter Ziele auf Streptavidinperlen

Streptavidinperlen wurden dreimal mit Bindungspuffer gewaschen. Nach der 16-stündigen Hybridisierung wurde die Mischung zu den Perlen hinzugefügt und bei 25 °C für 30 Minuten mit sanftem Mischen alle 5 Minuten inkubiert. Das Waschen erfolgte mit Capture Wash Buffer 1 bei Raumtemperatur, gefolgt von drei Washings mit vorgewärmtem (48 °C) Capture Wash Buffer 2, einschließlich Inkubation bei 48 °C. Nach der endgültigen Waschung wurde das Pellet in 23 μL nukleasefreiem Wasser wieder suspendiert.

Einsträngige DNA-(ssDNA)-Präparation

Vierundzwanzig Mikroliter TE-Puffer wurden hinzugefügt, und die Mischung wurde bei 95 °C für 3 Minuten denaturiert und dann sofort auf Eis gelegt. Ein Master-Mix mit Schienenligationspuffer und schneller DNA-Ligase wurde hinzugefügt, und das SS-2-Programm (37 °C, 30 min) wurde durchgeführt, um die einzelsträngige DNA zirkularisiert zu machen. Verdauungspuffer und Verdauungsenzymmischung wurden hinzugefügt, und das SS-3-Programm (37 °C, 30 min.) wurde durchgeführt. Anschließend wurden 3,75 μL Verdauungsstopppuffer hinzugefügt. Fünfundachtzig Mikroliter magnetische Perlen wurden hinzugefügt, gefolgt von einer standardmäßigen Perlenreinigung. Fünfzehn Mikroliter Supernatant wurden in ein neues Rohr umgefüllt; die erwartete Konzentration betrug 0,8–2 ng/μL.

DNA-Nanoball (DNB)-Präparation

Die ssDNA-Produkte wurden für die Bildung von DNB verwendet. DNB-Formationspuffer, niedrig-EDTA-TE-Puffer und DNB-Enzymmischungen 1 und 2 wurden hinzugefügt. Die Programme DNB-1 und DNB-2 wurden nacheinander durchgeführt. Nach Fertigstellung wurden 20 μL DNB-Reaktionsstopppuffer hinzugefügt und sanft (5–8x) mit breiten Pipettenspitzen gemischt; Die erwartete Konzentration betrug 8–40 ng. Die vorbereiteten DNBs wurden auf die DNA-Nanoball-Sequenzierungsplattform für Hochdurchsatzsequenzierung geladen.

Sequenzierungsdatenverarbeitung und Signalanalyse

Roh-Sequenzierungslesungen wurden qualitätskontrolliert mit FastQC (v0.11.9) und fastp (v0.23.1). Die Schwelle des Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR) von 20 dB wurde mittels Analyse der Empfänger-Betriebscharakteristik (ROC) gegen einen Benchmark-Datensatz bekannter autoinflammatorischer Varianten optimiert, wobei eine False Discovery Rate (FDR) von <1 % mit einer Zielsensitivität von >95 % für niederfrequente Varianten ausbalanciert wurde; Lesungen, die unter dieser Schwelle von 20 dB lagen, wurden verworfen. Die Ausrichtung auf das Genome Reference Consortium Human Build 38 (GRCh38) Referenzgenom und initiale Variantenaufrufe wurden mit BWA-MEM (v0.7.17) und dem Genome Analysis Toolkit (GATK, v4.2.6) durchgeführt.

Für die physikbasierten Signalverarbeitungsschritte wurden Nukleotidsequenzen in binäre numerische Signale umgewandelt (0 steht für Purine; 1 für Pyrimidine). Zur Berechnung des DFT wurde das binäre Signal mit einem gleitenden Zeitfenster von N = 512 Basenpaaren und einer Überlappung von 50 % (256 bp Schrittweite) verarbeitet, um eine lokalisierte genomische Auflösung zu gewährleisten. Die DFT wurde definiert als:

Um hochfrequente Sequenzierungsartefakte herauszufiltern, ohne echte Single-Nukleotid-Varianten (SNVs), die sich als scharfe, hochfrequente lokalisierte Übergänge manifestieren, zu glätten, wurde ein Tiefpass-Digitalfilter programmatisch kalibriert. Die optimale normalisierte Cutoff-Frequenz (fc) wurde iterativ durch das Scannen des Bereichs von 0,05–0,25 Zyklen pro Basis bestimmt. Der Optimierungsalgorithmus wählte fc = 0,15 Zyklen/Basis, definiert als den Wendepunkt, an dem das Signalleistungsspektrum ≥85 % der Gesamtvarianz bekannter wahr-positiver Kontrollvarianten beibehielt und dabei technische Hintergrundrauschen eliminierte. DFT-basierte Filterung wurde mit benutzerdefinierten Skripten in Python (v3.9) angewendet, wobei speziell die Bibliotheken NumPy (v1.23.0) und SciPy (v1.9.1) genutzt wurden, um hochfrequentes Rauschen zu reduzieren und gleichzeitig mutationsassoziierte spektrale Merkmale zu erhalten. Die Filterparameter wurden iterativ programmatisch kalibriert, um eine Überglättung seltener Variantensignale zu verhindern. Der integrierte Arbeitsablauf für Signalverarbeitung und biophysikalische Modellierung ist in Abbildung 2 zusammengefasst.

Biophysikalische und stochastische Modellierung der Interferon-Signalübertragung

Um die funktionalen Konsequenzen identifizierter Varianten zu untersuchen, wurden die JAK–STAT-Wegdynamiken mit gewöhnlichen Differentialgleichungen (ODEs) modelliert, die wie folgt definiert sind:

Deterministische ODE-Simulationen wurden mit COPASI (Complex Pathway Simulator, v4.36) ausgeführt und mit benutzerdefinierten Python-Skripten im scipy.integrate.solve_ivp-Modul bestätigt. Biologisch realistische Anfangsbedingungen wurden etabliert, und Sensitivitätsanalysen wurden an Verstärkungsratenkonstanten mit der SALib (Sensitivity Analysis Library in Python, v1.4.5) durchgeführt. TYK2-vermittelte IFN-α-Signalkinetiken wurden integriert, um die von Verstärkung der Funktion getriebene STAT2-Verstärkung zu simulieren.

Stochastische Effekte wurden mit einer Langevin-Formulierung eingeführt:

dX = f(X) dt + g(X)dW

Zusätzlich wurden stochastische Simulationen von Gillespie durchgeführt, die die Python-Bibliothek von GillesPy2 (v1.7.0) nutzten, um transkriptionelles Bursting und heterogene IFN-β-induzierte interferonstimulierte Genaktivierung (ISG) zu modellieren. Verteilte Verzögerungsfunktionen, dargestellt durch Gamma-Kernel-Formulierungen, wurden in Python mittels numerischer Integration implementiert, um verzögerte transkriptionelle Rückkopplungsmechanismen zu simulieren. Alle rechnergestützten Pipelines, einschließlich Signalfilterung und mathematischer Modellierung, wurden in einer Linux-basierten High-Performance-Computing-(HPC)-Umgebung ausgeführt.

Abbildung 2. Integriertes Framework für Signalverarbeitung und biophysikalische Modellierung der JAK-STAT-Signalisierung. 1: Signalverarbeitungsphase: binäre Abbildung von Nukleotidsequenzen (Purine = 0, Pyrimidine = 1), gefolgt von DFT-basierter Filterung. Beachten Sie den kritischen SNR-Schwellenwert von 20 dB für eine genaue Variantenaufrufe. 2: Biophysikalische Modellierung: ODE-basierte Simulation von Verstärkungsraten, bei denen kleine Störungen der Anfangsbedingungen zu Schwellenverschiebungen der anhaltenden Signalübertragung führen. 3: Biologischer Phänotyp: Modellierung von TYK2-Gain-of-Function-Varianten im IFN-α-Weg, was zu einer verstärkten STAT2-Aktivierung und resultierenden Interferonopathie-Phänotypen führt. Abkürzungen: DFT = diskrete Fourier-Transformation; IFN-α = Interferon-Alpha; JAK-STAT = Janus-Kinase-Signaltransducer und Transkriptionsaktivator; ODE = gewöhnliche Differentialgleichung; SNR = Signal-Rausch-Verhältnis; STAT2 = Signalwandler und Aktivator der Transkription 2; TYK2 = Tyrosin-Kinase 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2 fasst die Integration der DFT-basierten Signalverarbeitung mit ODE- und stochastischen Modellierungskomponenten zusammen, die im explorativen rechnergestützten Workflow verwendet werden. Dieses umfassende Protokoll integriert fortschrittliche molekulare Genetik, Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien, Signalverarbeitungsalgorithmen und biophysikalische Modellierung, um den Nachweis und die funktionelle Interpretation interferonopathieassoziierter Varianten der pädiatrischen autoinflammatorischen Vaskulitis zu unterstützen.

Statistisches Rahmenwerk und Signalabbildungsverteilung der Wahrscheinlichkeitsverteilung

Um die digitale Abbildung genomischer Sequenzen vor der Signalfilterung zu formalisieren, wurde ein binäres Umwandlungssystem auf Basis der Nukleotidbiochemie etabliert. Für ein gegebenes strukturelles genomisches Fenster der Länge N werden Purine {A, G} auf einen digitalen Wert von 0 abgebildet, und Pyrimidine {C, T} auf 1. Unter der Nullhypothese (H0) einer unvoreingenommenen, einheitlichen Hintergrund-genomischen Verteilung folgt diese binäre Umwandlung einem Bernoulli-Versuchsrahmen. Die Wahrscheinlichkeitsmassenfunktion (PMF) des abgebildeten Signals X ist wie folgt definiert

P(X = x) = p^x(1 - p)^1-x für x ∈ {0,1}

wobei p = 0,5 die Wahrscheinlichkeit darstellt, auf einen Pyrimidinrest auf einer nicht ausgewählten Hintergrundspur zu stoßen. Bei der Skalierung dieser Umrechnung über sequentielle Basen für die Berechnung der Leistungsspektraldichte (PSD) mittels DFT verhält sich die kumulative Hintergrundrauschverteilung wie ein Zufallswandel, der durch den zentralen Grenzwertsatz zu einer Gaußschen weißen Rauschverteilung konvergiert. Folglich folgt das normalisierte Leistungsspektrum dieser Nullverteilung einer Chi-Quadrat-Verteilung (χ²) mit 2 Freiheitsgraden. Um eine strikte statistische Signifikanzschwelle (α = 0,05) aufrechtzuerhalten, wurde die kritische Leistungsintensitätsschwelle zur Definition eines echten pathogenen Variantensignalspikes analytisch mit folgender Wahrscheinlichkeitsdichteintegration berechnet:

Schwelle = - In(a) x a²

wobei σ² die operative Varianz des lokalen Hintergrund-genomischen Rauschbodens darstellt. Jeder spektrale Peak, der diesen Schwellenwert überschritt (p < 0,05, entspricht einem SNR > 20 dB), wurde für nachgeschaltete Silico-Filtrationgatter priorisiert, um sicherzustellen, dass der Variantenaufruf datengetrieben ist und weniger von stochastischen Sequenzierungsrauschen beeinflusst wird.

Betriebseffizienz und Kostenanalyse (Abbildung 3)

Aus translationaler und klinischer Implementierungsperspektive wurden die operative Effizienz, klinische Bearbeitungszeit (TAT) und wirtschaftliche Machbarkeit dieses integrierten Protokolls mit traditionellen diagnostischen Signalwegen wie sequentieller Sanger-Sequenzierung oder eingeschränkten Zielgenpanels vergglichen. Während konventionelle diagnostische Odysseen für pädiatrische Vaskulitis oder vermutete Typ-I-Interferonopathien aufgrund iterativer Einzelgentests häufig 8–12 Wochen dauern, erreicht der optimierte Arbeitsablauf – einschließlich Hochdurchsatz-WES, optimierter 16-Stunden-Hybridisierung und parallelisierter DFT-Signalfilterung auf einem Hochleistungs-Computing-(HPC)-Cluster – einen gemeldeten gesamten klinischen TAT von 10–14 Tagen vom ersten Probeneingang bis zum endgültigen molekularen Bericht. Darüber hinaus wird aufgrund effizienter Probenmultiplexing (das Poolen von acht Patientenproben pro Hybridisierungsblock) die Kosten für das Kernreagenz und die Sequenzierung auf etwa 250–300 US-Dollar pro Patient angegeben, verglichen mit traditionellen umfassenden Panels, die oft über 1.200–1.800 US-Dollar liegen. Diese Kompression sowohl der diagnostischen Zeitleiste als auch der Kostenrahmen legt nahe, dass der vorgeschlagene, physikinspirierte Bioinformatik-Workflow für routinemäßige klinische Genetiklabore machbar und skalierbar sein könnte.

Ergebnisse

In dieser Kohorte von 132 Patienten mit identifizierten interferonopathieassoziierten Varianten wurde ein breites Spektrum genetischer Varianten identifiziert (Tabelle 1). Von den Patienten waren 53 (40,2 %) weiblich und 79 (59,8 %) männlich. Das Durchschnittsalter betrug 10,2 Jahre (Bereich: 0–18 Jahre). Patientendaten, die der endgültigen Kohorte entsprechen, sind in Ergänzungstabelle S1 bereitgestellt.

Tabelle 1: Verbreitung und Klassifikation der Typ-I-interferonopathie-assoziierten genetischen Varianten, die innerhalb der pädiatrischen autoinflammatorischen Kohorte identifiziert wurden (n = 132). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Die am häufigsten betroffenen Gene waren ADAR (25 Patienten, 18,94 %) und DNASE1 (24 Patienten, 18,18 %). DNASE1-Varianten waren ausschließlich Klasse 3 (100 % innerhalb des Gens; 18,18 % der gesamten Kohorte). Ebenso waren die meisten ADAR-Varianten Klasse 3 (24 Patienten, 96,00 %; 18,18 % der Kohorte), mit nur einer Klasse-2-Variante (4,00 % innerhalb des Gens; 0,76 % der Kohorte) (Tabelle 2).

Tabelle 2: Varianten, die im NGS-Panel für seltene Krankheiten identifiziert wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Varianten bei STING1 (20 Patienten, 15,15 %) und RNASEH2B (14 Patienten, 10,61 %) waren ebenfalls häufig. Alle STING1-Varianten waren Baureihe 3 (100 %). Für RNASEH2B hatten 10 Patienten (71,43 %) Klasse-3-Varianten (7,58 % der Kohorte), während 4 Patienten (28,57 %) Klasse-2-Varianten hatten (3,03 % der Kohorte).

RNASEH2A Mutationen wurden bei 13 Patienten (9,85 %) festgestellt, von denen alle Klasse-3-Varianten trugen (100 %). TREX1-Mutationen waren bei 10 Patienten (7,58 %) vorhanden, darunter 8 Klasse-3-Varianten (80,00 %; 6,06 % der Kohorte) und 2 Klasse-2-Varianten (20,00 %; 1,52 % der Kohorte).

SAMHD1-Varianten wurden bei 9 Patienten (6,82 %) nachgewiesen, wobei 7 Patienten Klasse-3-Varianten trugen (77,78 %; 5,30 % der Kohorte), 1 Patient eine Klasse-1-Variante trug (11,11 %; 0,76 %) und 1 Patient eine Klasse-2-Variante trug (11,11 %; 0,76 %).

RNASEH2C Mutationen wurden bei 8 Patienten (6,06 %) festgestellt, die alle Klasse 3 waren. DNASE1L3 Mutationen wurden bei 6 Patienten (4,55 %) festgestellt, darunter 5 Klasse-3-Varianten (83,33 %; 3,79 % der Kohorte) und 1 Klasse-2-Variante (16,67 %; 0,76 %). PSMB8- und COPA-Mutationen wurden jeweils bei 5 Patienten (3,79 %) festgestellt, wobei alle Varianten der Klasse 3 (100 %) waren. DNASE2- und STAT4-Mutationen waren jeweils bei 3 Patienten (2,27 %) vorhanden, wobei alle Varianten als Klasse 3 klassifiziert wurden.

Insgesamt stellten Klasse-3-Varianten die vorherrschende Variantenklasse in nahezu allen Genen der Kohorte dar. Die spezifischen Variantenstellen, einschließlich detaillierter Nukleotidsubstitutionen und entsprechender Aminosäureveränderungen über die Zielgene, sind in Tabelle 3 katalogisiert.

Explorative Analyse der Signalverarbeitungsleistung

Um die Robustheit und Empfindlichkeit der DFT-basierten Signalverarbeitungspipeline zu untersuchen, wurde ein vergleichender Benchmark mit dem standardmäßigen GATK-reinen Variantenaufruf-Workflow durchgeführt, der sich speziell auf genomische Regionen mit geringer Abdeckung (Tiefe < 30x) konzentrierte. Im vorläufigen Benchmarking zeigte das integrierte DFT-Filterlayout einen möglichen Trend zu einer verbesserten Priorisierung in ausgewählten Regionen mit geringer Abdeckung, was auf eine explorative Erholungsschätzung von bis zu 96,8 % unter diesen spezifischen Laborkontrollbedingungen hindeutet. Wichtig ist, dass diese Parameter und numerischen Effizienzkennzahlen vorläufige, explorative Ergebnisse darstellen, die im spezifischen institutionellen Kohortenkontext kalibriert sind, anstatt eine universell validierte klinische Pipeline. Die Pipeline sicherte außerdem zuvor verworfene wahr-positive Varianten in Regionen mit hohem Rauschen wieder. Darüber hinaus wurde der FDR von 6,4 % auf 1,2 % reduziert, was die potenzielle Robustheit des Tiefpassfilters bei der Eliminierung von Hochfrequenzsequenzierungsartefakten unterstreicht. Unter den neuartigen Varianten, die in der Kohorte identifiziert wurden, wurden 14 Varianten (was 17,7 % der neuen Ergebnisse ausmachte), die überwiegend in Regionen mit ungleichmäßiger Abdeckung in STING1 und TREX1 lagen, zunächst von Standardalgorithmus-Schwellenwerten als qualitativ minderwertige Artefakte klassifiziert, aber erfolgreich durch Sanger-Sequenzierung im Rahmen des Signal-Rausch-Verbesserungsprotokolls wiederhergestellt und validiert. Diese analytische Beobachtung legt nahe, dass die Bewertung physikalischer Signaleigenschaften ein hilfreiches Werkzeug in explorativen Forschungsprozessen sein kann.

Vergleichendes Benchmarking mit Standard-Arbeitsabläufen

Um die vergleichende Leistung dieses integrierten Frameworks zu bewerten, wurde eine nebeneinanderfolgende Benchmarking-Analyse mit zwei Standardvarianten-Calling-Pipelines durchgeführt: dem GATK Best Practices Workflow (BWA-MEM + GATK HaplotypeCaller v4.2.6) und DeepVariant (v1.5). Die Leistungskennzahlen wurden anhand einer High-Confidence-Validierungsteilmenge der Kohorte berechnet, die über Genomregionen mit geringer Abdeckung (Tiefe < 30x) und hohem Rauschen bewertet wurde. Die vergleichende Architektur ist in Tabelle 4 zusammengefasst.

Quantitative Parametrisierung und Validierung von Computermodellen

Um die biophysikalischen und stochastischen Rahmenwerke quantitativ zu verankern, wurden die ODEs und Gillespie-Simulationen mittels empirischer kinetischer Werte parametrisiert, die auf experimentelle Kontrollbedingungen kalibriert waren. Kontinuierliche ODE-Simulationen verfolgen die absolute Konzentration von phosphoryliertem STAT2 ([STAT2p]) über einen 720-minütigen Zeitverlauf nach der simulierten Typ-I-Interferon-Exposition. Im Wildtyp-(WT)-Rechenmodell zeigte die Signalkaskade eine schnelle homöostatische Abschwächung, gekennzeichnet durch einen Aktivierungspeak bei t = 45 min, gefolgt von einer schnellen Clearance, die durch programmierte negative Rückkopplung (k3 = 0,45 Min-1) durch simulierte SOCS1-Expression ausgelöst wurde. Im Gegensatz dazu zeigte die Modellierung von Gain-of-Function (GoF)-Variationen in den STING1- und TYK2-Signalwegen starke Schwellenverschiebungen, was zu einem anhaltenden, nicht-störenden hyperinflammatorischen Zustand führte. Die Änderungen der Signalhalbwertszeit (t1/2) und der stationären Faltung sind in Tabelle 5 zusammengefasst.

Datenverfügbarkeitserklärung

https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-MethodologyPatient-level klinischen Daten, die der finalen Kohorte entsprechen, sind in Ergänzungstabelle S1 bereitgestellt. Die diskreten digitalen Signalverarbeitungsschwellen, mathematischen Formulierungen, Softwareumgebungen und Rechenparameter, die zur Nachbildung der DFT-Filter- und biophysikalischen Wegsimulationen (ODEs und stochastische Modellierung) erforderlich sind, wurden öffentlich zugänglich gemacht. Um einen dauerhaften und ungehinderten Zugang für Leser zu gewährleisten, wurde dieses Replikationsframework auf GitHub deponiert und dauerhaft in Zenodo über DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497 archiviert. GitHub: https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-Methodology. Standard-Open-Source-Softwarebibliotheken und numerische Rechenplattformen, die in diesem Workflow verwendet werden, wie NumPy, SciPy und COPASI, sind öffentlich zugänglich.

Abbildung 3. Operationelle Storyboard- und datengetriebene Pipeline-Architektur zur Identifikation und biophysikalischen Modellierung von Typ-I-Interferonopathie-assoziierten Varianten. Der Schaltplan skizziert einen chronologischen, vierstufigen experimentellen und rechnergestützten Workflow, der klinische Kohortenanalyse mit biologischer Signalverarbeitung integriert. (A) Kohortenstratifizierung und NGS-Pipeline: Arbeitsablauf für die pädiatrische autoinflammatoriske Kohorte (n = 132), die sich in WES befindet. Das Inset zeigt repräsentative unbearbeitete FastQ-Qualitätskontroll-Phred-Score-Tracks, die in GATK/DeepVariant-Variantenaufrufe und die finale VCF-Matrixgenerierung übergehen. (B) DFT-basierte Signalverarbeitung: algorithmische Übersetzung von genomischem Text in numerische genomische Signale zur Rauschreduktion. Der eingebettete datengetriebene Graph zeichnet eine Leistungsspektrumverteilung und identifiziert pathogene Variantenfrequenzen (Signalspitzen) mit genomischem Hintergrundrauschen mit einem SNR-Schwellenwert von >20 dB. (C) In silico Curation Gate: mehrschichtiger Priorisierungstrichter, der ACMG 5-Stufen-Pathogenitätsrichtlinien, HGMD und Infevers Kreuzprüfungen integriert, um die 79 neuartigen und 13 berichteten Varianten zu priorisieren. (D) Validierung funktioneller biophysikalischer Modellierung: biologische Validierungsschicht. Das deterministische ODE-Framework und die stochastischen Gillespie-Simulationskurven sind als grafische Komponenten integriert, die die 720-minütige Zeitkurswiederherstellung und die anhaltende Signalisierung von Wildtyp- versus simulierter mutantenzellulärer Kinetik darstellen. Abkürzungen: ACMG = American College of Medical Genetics and Genomics; DFT = diskrete Fourier-Transformation; GATK = Genomanalyse-Toolkit; HGMD = Human Gene Mutation Database; NGS = Next-Generation-Sequenzierung; ODE = gewöhnliche Differentialgleichung; SNR = Signal-Rausch-Verhältnis; VCF = Variante des Rufzeichens; WES = Ganz-Exom-Sequenzierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 3: Umfassende Annotation und Locus-Datenbank-Kontrolle identifizierter Typ-I-interferonopathie-assoziierter genetischer Varianten innerhalb der pädiatrischen Kohorte (n = 132). ACMG-Kriterien (aus den ACMG/AMP-Richtlinien von 2015): ACMG/AMP-Evidenzcodes wurden nach Evidenzstärke gruppiert. Sehr starke Evidenz umfasste PVS1, das sich auf vorhergesagte Funktionsverlustvarianten in Genen bezieht, bei denen der Funktionsverlust ein etablierter Krankheitsmechanismus ist. Starke Evidenz umfasste PS1–PS4, die zuvor festgestellte Aminosäureveränderungen, bestätigtes de-novo-Auftreten, unterstützende funktionelle Eher und erhöhte Variantenhäufigkeit bei Betroffenen abdeckte. Moderate Evidenz umfasste PM1–PM6, einschließlich der Lage in einem kritischen Bereich oder mutationalen Hotspot, Fehlen oder sehr geringe Häufigkeit in Populationsdatenbanken, Trans-Vorkommen bei rezessiven Erkrankungen, Proteinlängenänderungen, neuartige Missense-Veränderungen an Residuen mit bekannter pathogener Variation und angenommenes de-novo-Auftreten. Unterstützende Evidenz umfasste PP1–PP5, einschließlich Kosegregation, genspezifischer Missense-Einschränkung, in silico-Evidenz , Phänotyp-Spezifität und seriöser früherer Berichte über Pathogenität, wenn unabhängige Beweise nicht vorlagen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: Nebeneinander-Leistungsvergleich von Variantenaufruf-Pipelines in rauschstarken genomischen Regionen. Benchmarking-Bewertungen wurden in Bereichen mit geringer Abdeckung (<30x) durchgeführt, um die Leistung des physikbasierten DFT-Tiefpassfilters bei der Beseitigung von Sequenzierungsrauschen und dem Schutz von echt-positiven Signalen im Vergleich zu Standardalgorithmuskonfigurationen zu bewerten. Abkürzungen: DFT = diskrete Fourier-Transformation. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 5: Quantitative kinetische Parameter und stationäre Schwankungen der nachgeschalteten JAK-STAT-Signalisierung. Zusammenfassung der ODE- und stochastischen Gillespie-Simulationsgrenzen über einen 720-minütigen Zeitverlauf, wobei das Versagen der zellulären homöostatischen Abschwächung in Modellen mit pathogenen STING1- und TYK2-Variationen hervorgehoben wird. Abkürzungen: JAK-STAT = Janus-Kinase-Signaltransducer und Aktivator der Transkription; ODE = gewöhnliche Differentialgleichung; STING1 = Stimulator der Interferonantwort cGAMP-Interaktor 1; TYK2 = Tyrosin-Kinase 2. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S1. Patientendatensatz für die pädiatrische Kohorte mit interferonopathisch-assoziierten Varianten. Die Tabelle liefert die Patientendaten, die der endgültigen 132-Patienten-Kohorte entsprechen, die im Manuskript analysiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Kritische Schritte im Protokoll sind DNA-Fragmentierung, Adapterligatur, PCR-Amplifikation und Zirkularisierung durch einsträngige DNA (ssDNA). In diesen Phasen ist eine sorgfältige Ausführung unerlässlich, um das Kontaminationsrisiko zu minimieren. Präzise Ethanolwäschen und geeignete magnetische Stand-Inkubationszeiten während der perlenbasierten Reinigung sind zwingend erforderlich, da Abweichungen zu geringerem Produktertrag oder einer übersehenen Variantenerkennung führen können. Während der Vorbereitung der Pooled Library sind eine genaue Berechnung von 93,75 ng pro Patient sowie eine sorgfältige Volumenanpassung erforderlich.

Für die Protokolloptimierung und -fehlerbehebung können niedrige fluorometrische Quantifizierungsmessungen, insbesondere ssDNA-Konzentrationen unterhalb der 0,8–2 ng/μL-Schwelle, eine Erhöhung der Sequenzierungstiefe oder eine Verkürzung der Perlen-Trocknungszeiten erfordern, um die Varianten-Call-Sensitivität zu verbessern. Bei vermuteten Mosaikvarianten kann die Integration von Long-Read-Sequenzierungstechnologien die Erkennungsgenauigkeit verbessern. Darüber hinaus ist der schnelle Übergang der Proben auf Eis nach der enzymatischen Verdauung entscheidend für die Aufrechterhaltung der Produktstabilität^12,13. Während der DNB-Vorbereitung erhält langsames und sanftes Pipettern sowie sorgfältiges Hinzufügen eines Stopppuffers die Integrität der Nanoballs. Dies ist besonders wichtig, um Genotyp-Phänotyp-Korrelationen bei früh einsetzenden Interferonopathien wie SAVI ^6,11 zu etablieren.

Diese auf WES basierende genetische Analyse bietet einen Rahmen zur Bewertung interferonopathieassoziierter Varianten bei pädiatrischen Patienten mit autoinflammatorischen Merkmalen und Vaskulitis. Durch die Identifizierung von Varianten in Schlüsselgenen wie DNASE1, ADAR, STING1, RNASEH2A/B/C, TREX1, SAMHD1 und COPA hebt die Studie die genetische Heterogenität hervor, die interferongesteuerten vaskulitischen Phänotypen zugrunde liegt. Die Häufigkeit von Varianten im Nukleinsäurestoffwechsel und der Sensorgen, insbesondere DNASE1 und ADAR, in dieser Kohorte entspricht der zentralen Rolle der dysregulierten Typ-I-Interferon-Signalübertragung in der Pathogenese von pädiatrischer Vaskulitis und autoinflammatorischen Erkrankungen. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Berichten überein, die diese Gene mit Interferonopathien und vaskkulitischen Manifestationen in Verbindung bringen ^4,5,7.

Durch die Aufklärung vasculitisähnlicher Erscheinungen monogener autoinflammatorischer Syndrome, wie die kutane und interstitielle Lungenbeteiligung bei SAVI, kann dieser Ansatz eine frühe Diagnose erleichtern und Anti-Interferon-gezielte Therapien ^4,5,7 leiten. Monogene Interferonopathien können klinisch ANCA-assoziierte Vaskulitis und andere Gefäße im Kindesalter nachahmen, was die Bedeutung von Gentests in atypischen oder behandlungsresistenten Fällen unterstreicht (^9,10,11). Eine frühzeitige genetische Diagnose kann auch den zeitnahen Beginn gezielter Behandlungen wie JAK-Inhibitoren ermöglichen, die bei Patienten mit STING1 und anderen interferonbezogenen Mutationen klinischen Nutzen gezeigt haben ^7,13,14.

Diese Studie unterstreicht außerdem, dass ein signifikanter Anteil der pädiatrischen Patienten mit komplexer autoinflammatorischer Vaskulitis seltene oder neuartige Varianten in interferonopathie-bezogenen Genen aufweist. Die Identifizierung von 79 neuartigen Varianten in dieser großen Kohorte erweitert das bekannte genetische Spektrum und könnte zu besseren Genotyp-Phänotyp-Korrelationen bei der Vaskulitis im Kindesalter beitragen.

Eine operative Überlegung in diesem explorativen Workflow ist die Bewertung von Schwellenwertgrenzen, da Abweichungen der explorativen SNR-Parameter die Filterausgabe verändern können. Zum Beispiel hilft DFT-basierte Filterung von Nukleotidverteilungen beim Denoise-Lesen, erfordert jedoch eine Kalibrierung, um Überglättung von Mutationssignalen zu vermeiden; Die Fehlerbehebung umfasst die iterative Anpassung von binären Mapping-Parametern (0 für Purine, 1 für Pyrimidine) zur Optimierung der Merkmalsextraktion¹⁵. In der biophysikalischen Modellierung ist die Definition von Anfangsbedingungen für ODEs unerlässlich, da kleine Störungen der Amplifikationsraten Schwellenwerte verschieben und möglicherweise die anhaltende Interferon-Signalübertragung unterschätzen können. Erweiterte JAK-STAT-Details umfassen die Modellierung der Rolle von TYK2 in der IFN-α-Signalisierung, wobei Gain-of-Function-Varianten die STAT2-Aktivierung verstärken, was zu Interferonopathie-Phänotypen²⁰ führt.

Modifikationen der Methode können die Integration stochastischer Elemente für rauschige zelluläre Umgebungen umfassen, wie zum Beispiel das Hinzufügen von Langevin-Raustertermen zu ODEs:

dX = f(X)dt + g(X)dW

wobei dW, der angegebene Term, Wiener-Prozessrauschen darstellt, was die Realität bei der Simulation der JAK-STAT-Variabilität²¹ erhöht. Stochastische Simulationen von Interferonwegen, die Gillespie-Algorithmen verwenden, erfassen Heterogenität in der IFN-β-Expression aufgrund negativer Rückkopplungsschleifen, bei denen Zell-zu-Zell-Unterschiede in den Transkriptionsfaktoren zu bimodalen Verteilungen der ISG-Aktivierung^{führen 22,23}. Die Fehlersuche bei Pfadmodellen beinhaltet die Validierung gegen experimentelle IFN-β-Daten; Wenn die Amplifikation divergiert, können negative Kontrollen wie die Phosphatase-Aktivierungsraten neu kalibriert oder verteilte Verzögerungen für die Transkription eingebaut werden:

Mit Gamma-Kernel für verzögerte Prozesse.

Im Vergleich zur Ganzgenomsequenzierung (WGS) könnte dieser auf WES fokussierte Ansatz kosteneffektiv sein, ist aber weniger umfassend für nicht-exonische Regionen^24,25. Der Umfang dieses vorläufigen Rahmens beschränkt sich darauf, ein unterstützendes biochemisches Simulationsmodell bereitzustellen, um zu bewerten, wie mathematische Variationen mit dem geschätzten Interferon-Signalverhalten korrelieren, wie es in Schwellenwerten zu sehen ist, bei denen kumulative Effekte kritische Werte übersteigen, die zu Gefäßverletzungen führen. Einschränkungen der Methode umfassen die Möglichkeit, niedrigstufige Mosaikvarianten zu übersehen, sowie die Notwendigkeit der funktionalen Validierung neuartiger Ergebnisse⁶.

Diese Technik hat potenzielle Anwendungen in der Immunologie und Gefäßmedizin, einschließlich der Steuerung von Antiinterferontherapien durch Simulation von Variantenauswirkungen auf Signalwege und der Anreicherung von Datenbanken für Diagnostik seltener Krankheiten¹⁹. Stochastische Erweiterungen können die Vorhersage heterogener Reaktionen in Interferonopathien weiter ermöglichen und so die personalisierte Medizin unterstützen.

In dieser Studie wird die genetische Evaluation bei pädiatrischer Vaskulitis neben konventionellen diagnostischen Werkzeugen wie Histopathologie und bildgebenden Verfahren betont. Insgesamt hebt diese Studie die Bedeutung der genetischen Bewertung bei pädiatrischer Vaskulitis hervor und hebt gleichzeitig die Häufigkeit interferonopathieassoziierter Varianten hervor, die bei Patienten identifiziert werden, die sich einer genetischen Analyse auf vermutete autoinflammatoriske Erkrankungen unterziehen. Durch die Bewertung der Auswirkungen dieser Varianten auf die Interferon-Signalwege und die Unterstreichung der Bedeutung der frühen Diagnose bei pädiatrischer Vaskulitis trägt diese Arbeit zur Bereicherung seltener Krankheitsdatenbanken im Zusammenhang mit vaskulitischen und autoinflammatorischen Erkrankungen bei und liefert Einblicke für zukünftige Studien zur Variantenpathogenität und populationsspezifischen Polymorphismen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Einstellbare Pipetten (P2, P10, P20, P200, P1000)	Jeder Lieferant		Für genaue Flüssigkeitshandhabung
Tischzentrifuge	Jeder Lieferant		Für kurze Zentrifugation von PCR-Röhrchen
Equinox Library Amp Mix	MGI Tech/ NEB	7K0014-096 (oder gleichwertig)	PCR-Amplifikationsmastermix
Ethanol (molekularbiologischer Grad)	Jeder Lieferant		Zur Herstellung der 80%igen Ethanol-Waschlösung
IVT Primer 1 & IVT Primer 2	MGI Tech	Im Kit enthalten oder separat	Bibliothekamplifikationsprimer
Niedrig bindende PCR-Röhrchen (0,2 ml)	Jeder Lieferant		Sterile PCR-Röhrchen
Magnetständer / Magnetisches Rack	Jeder Lieferant		Zur magnetischen Perlenseparation
MGI DNBSEQ-G400	MGI Tech Co., Ltd.	900-000641-00	Tischnext-Generation-Sequencer mit DNBSEQ-Technologie (DNA Nanoball Sequencing); unterstützt mehrere Leselängen (z. B. SE50 bis PE300); Hochdurchsatz-Output bis zu 1440 Gb pro Durchlauf; ideal für WES, WGS und gezielte Sequenzierungsanwendungen.
MGIEasy Circularization Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (Dual Barcode, 16 RXN) oder 1000005260 (V2.0)	Circularisierungskit zur Erzeugung von einzelsträngiger zirkulärer DNA (ssCirDNA); Dual-Barcode-Version reduziert Index-Hopping; wesentlicher Schritt nach der Bibliotheksvorbereitung für die DNB-Bildung im MGI-Sequenzierungsworkflow.
MGIEasy DNA Clean Beads	MGI Tech Co., Ltd.	1000005279	Magnetische Perlen zur DNA-Reinigung
MGIEasy DNB Prep Kit/ DNB Make Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (integriert mit Dual-Barcode-Circularization) oder verwandter DNB Make (z. B. 940-000036-00 Onestep DNB)	DNA Nanoball (DNB) Vorbereitungsmodul; umfasst Circularisierung und Nanoball-Generierung für die Flow Cell-Beladung; letzter Schritt in der Bibliotheksverarbeitung für DNBSEQ-Sequencer (oft in Kombination mit dem Circularization Kit).
MGIEasy Exome Capture Accessory Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000009657 (oder gleichwertig)	Enthält Blocker-Lösung, MGI Universal Blocker, Enhancer, Bindungspuffer, Waschpuffer 1 & 2 und Streptavidin-Perlen
MGIEasy Exome Capture V4 Probes (oder Twist CES Probes, kompatibel mit MGI/DNBSEQ)	MGI Tech Co., Ltd. (für MGIEasy) oder Twist Bioscience (für Twist)	1000007745 (V4 Probe Set, 16 RXN) oder 1000007740 (Sonden); Twist: Individuell / panel-spezifisch (auftragsbasiert, keine Standardnummer)	Hybridisierungsbasierte ganzes Exon-Capture-Sonden; zielen auf ~59 Mb kodierende Regionen (CCDS, RefSeq, GENCODE, miRBase); entwickelt für hocheffiziente Anreicherung in WES-Workflows auf DNBSEQ-Plattformen; verwendet mit dem MGIEasy Accessory Kit für Hybridisierung (65°C Vorinkubation, 16-Stunden über Nacht bei 65°C), Blockerzusatz, Streptavidin-Perlen-Capture (Bindungspuffer, Waschpuffer 1/2 bei 48°C), Elution und PCR-Amplifikation nach der Capture (kompatibel mit Equinox-Mix).
MGIEasy Fast Hybridization and Wash Kit	MGI Tech Co., Ltd.	940-001974-00 (16 RXN)	Hybridisierungs- und Waschreagenzien
MGIEasy FS DNA Library Prep Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000006987 (16 RXN Set) oder 1000005256 (96 RXN Kernkit)	Schnelle fragmentierungsbasierte DNA-Bibliotheksvorbereitungskit; enzymatische Fragmentierung mit 5–400 ng gDNA-Input; kompatibel mit DNBSEQ-Plattformen für effiziente WGS/WES-Bibliothekskonstruktion.
Nukleasenfreies Wasser	Jeder Lieferant		Molekularbiologischer Grad
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	Für Bibliotheksquantifizierung
Qubit ssDNA Assay Kit (optional)	Thermo Fisher Scientific	Q10212	Für ssDNA-Quantifizierung nach Circularisierung
Streptavidin-Magnetische Perlen	MGI Tech	Im Zubehörkit enthalten	Für Hybrid-Capture
TE-Puffer (pH 8,0)	Jeder Lieferant		Für Denaturierungsschritt
Thermocycler	Verschiedene (Bio-Rad, Thermo usw.)		Verwendet für Fragmentierung, Ligation, PCR und DNB-Programme
Vortex Mixer	Jeder Lieferant		Für Probenmischung
Weitmaul Pipettenspitzen	Jeder Lieferant		Erforderlich für DNB-Vorbereitung