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Methodenartikel

Nuklearmagnetresonanzmetabolomische Analyse verbrauchter menschlicher Embryokulturmedien: Methodenvalidierung und technische Überlegungen

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DOI:

10.3791/71285

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31. Juli 2026

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1Department of Reproductive Medicine and Gynaecological Endocrinology, University Medical Centre Maribor, 2Faculty of Medicine, University of Ljubljana, 3National Institute of Chemistry, 4EN-FIST Centre of Excellence, 5Faculty of Chemistry and Chemical Technology, University of Ljubljana, 6Department of Reproductive Science, Manipal Academy of Higher Education

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erfassung, Vorbereitung und Analyse ausgebrannter menschlicher Embryokulturmedium mittels Kernspinresonanzspektroskopie (NMR), das eine reproduzierbare Detektion von Metaboliten mit niedrigem Molekulargewicht aus Proben im Mikrolitermaßstab unter routinemäßigen klinischen Kulturbedingungen ermöglicht.

Zusammenfassung

Verbrauchte menschliche Embryokulturmedien enthalten niedrig-molekulare Metaboliten, die eine nicht-invasive Anzeige der präimplantativen Embryonalphysiologie liefern können. Die metabolomische Analyse dieser Proben auf Basis von Kernmagnetresonanz (NMR) ist jedoch technisch herausfordernd, da routinemäßige Embryokulturbedingungen Mikrolitervolumen, Proteinsupplementierung und Paraffinölüberlagerungen umfassen, die Hintergrundsignale erzeugen und die spektrale Qualität beeinträchtigen. Hier präsentieren wir einen optimierten NMR-Metabolomik-Workflow für verbrauchte Embryokulturmedien, der kontrollierte Tröpfchensammlung zur Minimierung der Ölkontamination, fluorierte Ethylenpropylen-(FEP)-Röhrenliner zur chemischen Isolierung der Probe von der externen Referenz (TMSP) bei Berücksichtigung von Mikrolitervolumen sowie die Aufnahme mittels einer Carr-Purcell-Meiboom-Gill-Pulssequenz zur Unterdrückung makromolekularer Hintergrundsignale umfasst. Das Protokoll ermöglicht eine konsistente Erkennung und Quantifizierung von Metaboliten mit niedrigem molekularem Gewicht aus einzeln kultivierten menschlichen Embryonen und unterstützt reproduzierbare Analysen unter routinemäßigen Laborbedingungen. Aufgrund zahlreicher technischer Herausforderungen muss die Methode ordnungsgemäß validiert werden, bevor sie für Forschungs- oder klinische Zwecke eingesetzt werden kann.

Einleitung

Während der Präimplantationsentwicklung in vitro konsumieren und setzen Embryonen kontinuierlich niedrigmolekulare Metaboliten in das umliegende Medium ab und geben sie frei. Die Zusammensetzung des verbrauchten Embryo-Kulturmediums (SECM) spiegelt daher die metabolische Aktivität des Embryos wider und liefert eine nicht-invasive funktionelle Analyse der Embryophysiologie und Entwicklungskompetenz 1,2. Die Analyse dieses metabolischen Fußabdrucks kann konventionelle Bewertungsmethoden ergänzen und die Strategien zur Embryoauswahl in der assistierten Reproduktionstechnologieverbessern 3,4. Insbesondere wurden Veränderungen im Aminosäure- und Kohlenhydratumsatz mit dem Entwicklungspotenzial und der Lebensfähigkeit von Embryonen in Verbindung gebracht 5,6,7.

Die Kernmagnetresonanzspektroskopie (NMR) wird weit verbreitet für unzielgerichtete Metabolitprofilierung verschiedener biologischer Proben, einschließlich der Kultur verbrauchter Embryonen 8,9,10. Die Analyse dieser Proben bleibt jedoch analytisch herausfordernd11. In der routinemäßigen klinischen Praxis werden Embryonen in definierten Mikroumgebungen kultiviert, die physiologische Bedingungen nachahmen. Kulturmedien werden mit Proteinen, typischerweise Albumin, ergänzt, um den osmotischen Druck zu stabilisieren, toxische Verbindungen zu binden und Trägermoleküle für Lipide und Wachstumsfaktoren bereitzustellen, die die normale Entwicklungunterstützen 12. Um Verdunstung zu verhindern und konstante Konzentrationen der gelösten Stoffe aufrechtzuerhalten, werden Kulturtröpfchen mit sterilem Paraffinöl13 überlagert.

Lipide, die aus überlagerten Öl- und Proteinkomponenten stammen, erzeugen breite Hintergrundsignale, die enge Resonanzen von niedrigmolekularen Metaboliten wie Glukose, Pyruvat und Aminosäuren verschleiern. Außerdem erfordert die Analyse von Mikroliter-Probenvolumina in Standard-5-mm-NMR-Röhren eine erhebliche Verdünnung, um das aktive Volumen der HF-Spule zu erreichen. Diese Reduktion der Analytenkonzentration verringert das Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) erheblich, maskiert Metaboliten mit geringer Häufigkeit und erschwert die reproduzierbare Quantifizierung. Obwohl zahlreiche Studien NMR-basierte Metabolomik auf verbrauchte menschliche Embryokulturmedien angewandt haben, begrenzt das Fehlen standardisierter und reproduzierbarer Sammel- und Präparationsprotokolle die Reproduzierbarkeit und die Vergleichbarkeit zwischen Studien 8,9,11.

Hier präsentieren wir einen NMR-basierten Metabolomik-Workflow (Abbildung 1), der darauf ausgelegt ist, technische Herausforderungen bei der Probenahme und Analyse menschlicher Embryokulturmedien zu überwinden. Der Ansatz kombiniert kontrollierte Tröpfchensammlung zur Reduzierung des Ölübertrags, Mikrolitervolumenaufnahme mit fluoriniertem Ethylenpropylen-(FEP)-Liner zur Vermeidung von Verdünnungsartefakten und makromolekulare Signalabschwächung mittels einer Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)-Pulssequenz.

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Protokoll

Diese Studie wurde zwischen Januar und April 2023 in der Abteilung für Reproduktionsmedizin und Gynäkologische Endokrinologie am Universitätsmedizinischen Zentrum Maribor, Slowenien, durchgeführt. Die NMR-Analyse wurde am Nationalen Institut für Chemie in Ljubljana, Slowenien, durchgeführt. Von allen Teilnehmern wurde eine schriftliche informierte Zustimmung eingeholt. Sie erhielt die Zustimmung sowohl vom Institutionellen Ethikausschuss (Nr. UKC-MB-KME-1/21) als auch vom Nationalen Medizinischen Ethikkomitee (Nr. 0120-37/2021/15).

1. Studiendesign

HINWEIS: Die Studie analysierte das Kultur des menschlichen Embryos mittels NMR-basierter Metabolomik.

  1. Proben werden nach einer ausgedehnten Embryokultur nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion (ICSI) entnommen. Sammeln Sie eine gleiche Anzahl unverbrauchter inkubierter Kontrollproben.

2. Probenentnahme

  1. Sammeln Sie verbrauchte Embryokulturmedienproben (SECM) nach der Embryoinkubation, wie in Abbildung 2 dargestellt.
  2. Nach der Entnahme des Embryos aus dem Kulturtröpfchen werden überschüssiges Öl vorsichtig von der Oberfläche der Kulturschale aspiriert, ohne das Medium zu stören (Abbildung 2, Schritt 1).
  3. Mit einer sterilen Pipette werden etwa 35 μL Kulturmedium aus dem ursprünglichen Tröpfchen aspiriert, wobei etwa 5 μL zurückbleiben, um das Einziehen von Rest-Oberflächenöl zu vermeiden. Übertragen Sie dieses Volumen in eine sterile Petrischale, um einen neuen Tröpfchen zu bilden (Abbildung 2, Schritt 2).
  4. Untersuchen Sie den neu entstandenen Tropfen unter einem Stereomikroskop visuell. Saugen Sie vorsichtig etwa 30 μL aus diesem Tröpfchen, wobei erneut etwa 5 μL zurückbleiben, um den Öltransport zu minimieren. Übertragen Sie dieses Volumen an einen zweiten sterilen Ort, um einen saubereren Tröpfchen zu bilden (Abbildung 2, Schritt 3).
  5. Untersuchen Sie den zweiten Tropfen visuell unter Vergrößerung. Identifizieren Sie Regionen, in denen Öltropfen am wenigsten ausgeprägt sind. Führen Sie die Pipettenspitze in diesen Bereich ein und saugen Sie etwa 25 μL Medium ab, wobei erneut etwa 5 μL zurückbleiben, um den Öltransport zu minimieren (Abbildung 2, Schritt 4).
  6. Übertragen Sie die gesammelten 25 μL sofort in ein steriles, RNase-freies Mikrozentrifugenrohr. Vermeiden Sie es, beim Abgeben der Probe die Innenwände des Röhrchens zu berühren, um Kontamination und Probenverlust zu vermeiden. Alle gesammelten Proben werden sofort mit flüssigem Stickstoff gefriert und bis zur NMR-Analyse bei -80 °C gelagert (Abbildung 2, Schritt 5).
  7. Sammeln Sie abgestimmte, nicht verbrauchte inkubierte Kontrolltröpfchen (Medium ohne Embryonen), die unter identischen Kulturbedingungen vorbereitet, befruchtet und verarbeitet wurden, mit denselben Kulturschalen, Overlay-Öl, Inkubationsdauer, Inkubatorumgebung und Handhabungsverfahren wie oben beschrieben, um Umweltvariabilität und mögliche systematische Verzerrungen zu minimieren.
    HINWEIS: Strikte Einhaltung sequentieller Tröpfchentransfers und visueller Inspektion verringern die Ölverschmutzung erheblich. In dieser Phase kann das Experiment vor weiterer Probenaufbereitung für die NMR-Entnahme pausiert und fortgesetzt werden.

3. Probenvorbereitung für die NMR-Analyse

  1. Proben bei Raumtemperatur für ~10 Minuten auftauen.
  2. Bereite eine NMR-Mischung vor:
    1. Übertragen Sie 25 μL SECM in ein 1,5-mL Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie 200 μL D₂O hinzu. Wirbeln Sie es 10 s lang und zentrifugieren Sie dann bei 1000 × g bei Raumtemperatur 10 s lang.
  3. Lasteinsatz: 225 μL des Gemisch in einen FEP-Liner übertragen.
  4. Bereite das externe Referenzrohr vor.
    1. Füllen Sie ein 5-mm-NMR-Rohr mit 150 μL D₂O, das 1 mM 3-(Trimethylsilyl)Propionsäure-2,2,3,3-d4-säurehaltiges Natriumsalz (TMSP-d4) enthält.
  5. Zusammenbauen Sie die Probe: Setzen Sie den FEP-Einsatz in das NMR-Rohr ein und versiegeln Sie es mit Parafilm.

4. NMR-Erfassung und spektrale Verarbeitung

  1. 1H-CPMG-Aufnahme mit der Bruker cpmgpr1d-Pulssequenz mit: 64 Scans; 65.536 Datenpunkte; Entspannungsverzögerung: 8 s; Spektralbreite: 11,9 kHz; Echozeit: 400 μs × 80 Schleifen (effektiver T₂-Filter 32 ms); Gesamtaufnahmezeit: ~15 Minuten.
    HINWEIS: Die effektive CPMG-T₂-Filterdauer von 64 ms wurde auf Grundlage etablierter Metabolomikprotokolle für proteinhaltige biologische Proben ausgewählt, wobei dieser Wert eine effiziente Unterdrückung makromolekularer Signale ermöglicht und gleichzeitig niedrigmolekulare Metabolitenresonanzen14 erhalten bleibt.
  2. Spektralverarbeitung durchführen:
    1. Fourier-Transformationsspektren erhalten.
    2. Wenden Sie eine exponentielle Linienverbreiterung von 0,3 Hz an.
    3. Führen Sie Phasen- und Baseline-Korrektur durch.
    4. Referenzspektren auf TMSP-d4 bei 0 ppm.
    5. Referenzchemische Verschiebungen (δ) zum externenTMSP-d-4-Signal bei 0 ppm.
      HINWEIS: Da das Probengemisch im FEP-Liner (225 μL) und die externeTMSP-d-4-Referenzlösung im äußeren Koaxialspalt (150 μL) unterschiedliche physikalische Geometrien und Volumina innerhalb des aktiven NMR-Spulen-Detektionsfensters einnehmen, skalieren ihre absoluten Signalintensitäten nicht 1:1. Die direkte absolute Quantifizierung mit der externen Referenz erfordert eine systemspezifische geometrische Kalibrierungskurve. Daher wurden angesichts der streng konstanten Probenvolumina und der hochreproduzierbaren Pipettierungspräzision dieses Protokolls rohe Eimerintegrale direkt verwendet, um relative Stoffwechselvariationen zwischen den Proben zu verfolgen, wobei externe Referenz- oder Gesamtsummenintensitätsnormierung ausgelassen wurde.
  3. Spektral-Binning durchführen:
    1. Schließen Sie die Wasserresonanzregion (z. B. 4,65–5,00 ppm) und die TMSP-d4-Referenzregion (z. B. -0,05–+0,05 ppm) vor dem Binning aus.
    2. Teile die Spektren in variable Breite Buckets, um Peaks nicht zu spalten.
    3. Verwenden Sie rohe Eimerintegrale für die statistische Analyse, anstatt auf das externe TMSP-d4-Signal zu normalisieren, da die Referenz physikalisch im äußeren Rohrvolumen isoliert ist. Dieser Ansatz vermeidet Quantifizierungsfehler, die durch die unterschiedlichen aktiven Volumina des Einsatzes im Vergleich zum äußeren Rohr entstehen.
    4. Exportiere Eimerintegrale als numerische Datenmatrix für statistische Analysen.
      HINWEIS: Jeder "Bucket" (oder Bin) stellt das summierte numerische Integral aller NMR-Signale innerhalb eines definierten ppm-Bereichs dar. Während diese Integrale die relative Konzentration der chemischen Gruppen in diesem Bereich widerspiegeln, kann ein einzelner Eimer Signale mehrerer überlappender Metaboliten enthalten oder nur einen Teil des gesamten Signals eines bestimmten Metaboliten.

5. Statistische Analyse

  1. Importiere bearbeitete 1H-CPMG-Spektren in Python (v3.12) mit nmrglue15.
  2. Entfernen Sie Wasser und TMSP-d4-Spektralregionen.
  3. Exportiere Eimerintegrale zur Analyse.
  4. Führen Sie statistische Tests mit SciPy (v1.14.1) durch:
    1. Bewerten Sie die Normalität jedes spektralen Eimers mit dem Shapiro–Wilk-Test.
    2. Wenden Sie Einweg-ANOVA (für normal verteilte Daten) oder Kruskal-Wallis (für nichtparametrische Daten) an, um Eimer mit statistisch signifikanten Unterschieden zwischen unverbrauchtem inkubiertem Kontrollsystem und verbrauchten Medien zu identifizieren.
    3. Für Eimer mit signifikanten Unterschieden führen Sie die strukturelle Zuweisung mit einer Kombination aus 1D- und 2D-NMR-Experimenten durch: 1 H-13C HSQC, 1 H-13C HMBC und 1 H-1H COSY.
    4. Vergleichen Sie die beobachteten 2D-Korrelationen mit Standarddatenbanken (z. B. HMDB), um die Identität der Metaboliten zu überprüfen, die zu den diskriminierenden Buckets beitragen.

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Ergebnisse

Der analytische Arbeitsablauf für die metabolomische Profilierung der nicht gezielten NMR-Profilierung des verbrauchten Embryokulturmediums ist in Abbildung 1 zusammengefasst.

Entfernung von Ölverschmutzungen während der Probenahme
Abbildung 2 veranschaulicht das sequentielle Tröpfchenübertragungsverfahren, das zur Reduzierung des Überlagerungsöls verwendet wird. Proben, die ohne sorgfältiges Pipettern gesammel...

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Diskussion

In dieser Studie behandelten wir zentrale analytische Herausforderungen bei der Identifizierung und Quantifizierung von Metaboliten mit niedrigem molekularem Gewicht in verbrauchten Embryokulturmedien mittels ungezielter NMR-Metabolomik. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der optimierte Arbeitsablauf die Erfassung hochwertiger, informationsreicher Spektren ermöglicht, die für eine zuverlässige Erkennung niedrigmolekularer Metaboliten geeignet sind.

Sorgfältiger se...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der slowenischen Forschungs- und Innovationsagentur (ARIS) [Projektnummer P3-0327] unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
5 mm FEP RohrfüllungSP Wilmad-LabGlass4682701Innerer Einsatz für koaxiale NMR
5 mm NMR-RohrSP Wilmad-LabGlass535-PP-7-SBÄußeres Rohr
6-Well KulturplatteOosafeOOPW-SW02Embryo-Kulturschale
Kryogenes flüssiges StickstoffMesserKontaktieren Sie den HerstellerBeispielschnelleinfrieren
Deuteriumoxid (D2O)EurisotopD214LNMR-Lösungsmittel
Mikropipette (10–100 µL)Eppendorf4924000053Einstellbare Volumenpipette
Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5 mL, RNase-freiEppendorfN216966NStichprobensammlung und -lagerung
MineralölVitrolifeVTL-10029Kulturtröpfchenüberlagerung
NMR-Spektrometer, 600 MHzBrukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.htmlSpektralerfassung
PasteurpipetteFalconFAL-357575Tropfenübertragung
Pipette, einkanalige mechanischSartorius728060Stichprobenhandhabung
Pipettenspitzen, sterilEppendorf22491148Kompatibel mit Mikropipette
Pipettenspitzen, sterile FilterSartorius790201FAerosolbarriere
Sequenzielles G-Serien-KulturmediumVitrolifeVTL-10143Embryo-Kulturmedium
TMSP-d4 (Natrium-3-trimethylsilylpropionat-d4)Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-48-1Chemische Verschiebungsreferenz
Röhrchen, Safe-LockEppendorf0030121589Lagerungsröhrchen

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