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Methodenartikel

Echtzeit-nicht-invasive Bewertung der Mitochondrienfunktion mittels Resonanz-Raman-Spektroskopie

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DOI:

10.3791/71290

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7. August 2026

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1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Hospital for Children, 3Pendar Technologies

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine nicht-invasive, Echtzeit-Methode zur Überwachung der Mitochondriengesundheit mittels Resonanz-Raman-Spektroskopie (RRS). Wir nutzten RRS, um mitochondriale Redoxzustände zu quantifizieren, und entwickelten eine Metrik für die mitochondriale Gesundheit, das Resonance Raman reduzierte mitochondriale Verhältnisse (3RMR), das eine schnellere Reaktion auf Veränderungen der Sauerstoffversorgung zeigt als traditionelle Blut-Gas-Analyte.

Zusammenfassung

Obwohl Mitochondrien zentral für Pathogenese und Krankheitsprogression sind, bleibt mechanistische Einsicht in die Dynamik der mitochondrialen Gesundheit kostspielig und unzugänglich. Um diese Lücke zu schließen, verwendet diese Studie Resonanz-Raman-Spektroskopie (RRS), um die mitochondriale Funktion zu bewerten, wobei ein tragbares System verwendet wird, das Echtzeit-, nicht-invasive und quantitative Messungen der mitochondrialen Cytochrom-Redoxzustände in Rattenlebern liefert. In diesem Protokoll demonstrieren wir den Einsatz dieser Technologie, einschließlich Einrichtung, Datenerfassung und Datenverarbeitung. Diese Studie präsentiert ein Proof-of-Concept-Experiment, das die Fähigkeit von RRS hervorhebt, Echtzeitänderungen des mitochondrialen Redoxzustands – und damit der mitochondrialen Funktion – zu messen. Kurzzeitig wurde das RRS-Gerät mit einer Laserpumpe sowie einem Datenerfassungscomputer verbunden und 1 cm von der Rattenleber entfernt platziert.  Die Aufnahmeparameter wurden gemäß dem Protokoll der Rattenleber ausgewählt; Redoxzustände wurden unter sauerstoffhaltigen und ischämischen Bedingungen mittels eines Sauerstoffstresstests gemessen. Veränderungen der mitochondrialen Redoxzustände wurden während des gesamten Sauerstoffstresstests verfolgt.

Einleitung

Mitochondrien spielen eine entscheidende Rolle bei der zellulären Funktion und der Homöostase. Mitochondrien sind die Haupttreiber des zellulären Stoffwechsels, da sie die ATP-Erzeugung durch oxidative Phosphorylierung regulieren. Sie dienen außerdem als Signalorganellen, die das Zellschicksal bestimmen, indem sie apoptotische Bahnen regulieren, sowie die ROS- und Ca+2-Signalübertragung 1. Daher kann eine mitochondriale Dysfunktion zu verschiedenen neurodegenerativen, muskulösen und kardiovaskulären Erkrankungen führen. Trotz der entscheidenden Rolle, die Mitochondrien im Krankheitsverlauf spielen, kann die Bewertung der mitochondrialen Funktion invasiv, kostspielig und begrenzt sein.

Wichtige Indikatoren der mitochondrialen Funktion, wie die Sauerstoffverbrauchsrate, oxidative Phosphorylierung und die Aktivität verschiedener Komplexe innerhalb der Elektronentransportkette (ETC), werden mittels Respirometrie gemessen. Das ETC besteht aus vier Komplexen (I–IV), die in die innere mitochondriale Membran (IMM) eingebettet sind. Diese Komplexe übertragen mit Hilfe anderer Co-Enzyme Elektronen von reduzierten Substraten wie NADH und FADH2 an den EndelektronenakzeptorO2, der dann zu Wasser reduziert wird. Die meisten zeitgenössischen Respirometrie-Assays, wie Seahorse und Orobros O2k, erfordern Gewebeverarbeitung, was ihre Anwendung für translationale Forschungeinschränkt 4,5. Die Messung des mitochondrialen Membranpotenzials (MMP) ist eine weitere Methode zur Bewertung der mitochondrialen Dysfunktion, die kationische lipophile Fluorophore wie JC-1 zusammen mit mikroskopischer Bildgebung verwendet, bei der gekoppelte (gesunde) und ungekoppelte (beschädigte) Mitochondrien mit unterschiedlichen Wellenlängen6 fluoreszieren. Diese Assays können jedoch eine geringeEmpfindlichkeit von 5 aufweisen. Der Farbstoff selbst kann auch bei hohen Konzentrationen eine hohe Zytotoxizitätaufweisen. Schließlich erfordert diese Technik, ähnlich wie bei Respirometriemessungen, auch eine Gewebeverarbeitung. Spektroskopiebasierte Techniken wurden kürzlich als nicht-invasive Methoden zur Bewertung der Mitochondriengesundheit eingesetzt. So wurde beispielsweise die Phosphor-Magnetresonanzspektroskopie (P-MRS), eine Methode zur Bewertung des zellulären Stoffwechsels durch Messung der Konzentrationen phosphorhaltiger Metaboliten, zur Charakterisierung von künstlich hergestelltem adipogenem Gewebe während der Differenzierung7 verwendet. Diese Technik erfordert jedoch auch spezielle Ausrüstung und Schulung.

Unsere Gruppe hat kürzlich eine Echtzeit-, nicht-invasive und hochspezifische Technik zur Messung des mitochondrialen Redoxzustands als Marker für die Organlebensfähigkeit mittels Resonanz-Raman-Spektroskopie (RRS) demonstriert. RRS verwendet inelastische Streuung von Photonen zur Quantifizierung der Redoxzustände mitochondrialer Cytochrome. Porphyrinringe in Häm-Gruppen von Molekülen wie mitochondrialen Cytochromen, Hämoglobin und Myoglobin erzeugen je nach ihrem Oxidationszustand ein charakteristisches Raman-Spektrum bei Anregung mit einem 441-nm-Wellenlängenlaser8. Obwohl das RRS-System eine Wellenlänge von 441 nm verwendet, können auch Laser mit 420 nm und 405 nm Wellenlängen eingesetzt werden, von denen jeder bevorzugt einen anderen Cytochromkomplex verstärkt. Das aus einer unbekannte interessierende Probe gewonnene Spektrum wird mit voraufgezeichneten Bibliotheken vollständig oxidierter oder reduzierter intakter Mitochondrien abgeglichen, was das Verhältnis von reduzierten zu totalen Mitochondrien oder den durchschnittlichen Redoxzustand der in situ ETC-Cytochrome ergibt. Dieses Verhältnis ist als Resonanz-Raman-reduziertes Mitochondrialverhältnis (3RMR) definiert.

Es gibt drei verschiedene Berechnungen/Typen von 3RMR: mitochondriale 3RMR (mito-3RMR), komplexe III 3RMR (cIII-3RMR) und komplexe IV 3RMR (cIV-3RMR). Jeder dieser Indizes wird durch den Anteil von reduziert auf die Gesamtzahl einer gegebenen Komponente berechnet. Zum Beispiel wäre der 3RMR von cIII das Verhältnis von reduziertem cIII zur Gesamtanzahl cIII im Gewebe (cIII-R/(cIII-O+CIII-R)). Das gleiche Muster gilt für cIV. Daher würde 3RMR-cIII das Verhältnis von reduziertem cIII zur Gesamtmenge von cIII bezeichnen, und 3RMR-cIV das Verhältnis von reduziertem cIV zur Gesamtmenge an cIV. Durch Regressionsanalyse werden entweder mitochondriale Redoxzustände (mito-3RMR) unter Verwendung von spektralen Bibliotheken intakter Mitochondrien berechnet, oder einzelne komplexe Redoxzustände (cIII-3RMR und cIV-3RMR) werden mit cIII- und cIV-Spektralbibliotheken berechnet. Eine aktuelle Veröffentlichung9 zeigte, dass Mito-3RMR repräsentativ für den gewichteten Durchschnitt der cIII- und cIV-Redoxzustände (oder cIII-3RMR und cIV-3RMR) ist. Es ist wichtig zu beachten, dass cI und cII weder Raman-aktiv noch resonant verstärkt über die 441-nm-Wellenlänge sind. Folglich werden sie bei der Berechnung des Mito-3RMR nicht berechnet.

Unter Nutzung dieser Arten von 3RMR definieren wir den optimalen Bereich von 3RMR. In "gesunden" Organen sind die Mitochondrien intakt und verfügen über ausreichende Sauerstoffversorgung. Im Gegensatz dazu können beschädigte Organe eine unzureichende Sauerstoffzufuhr oder -nutzung aufweisen, wodurch ETC-Komplexe Elektronen ansammeln. Die Elektronenansammlung verursacht "reduktive Spannung", wodurch die Mitochondrien vom oxidierten in den reduzierten Zustand verschoben werden und die 3RMR-Werte steigen. Mehrere Studien8, 9, 10, 11, 12, die von Herzen und Lebern in Nagetier- und Schweinemodellen reichen, haben begonnen, den optimalen "gesunden" Bereich für 3RMR zu beleuchten, der zwischen 10 und 30 liegen soll. So untersetzten Perry et al. Säugetierherzen Hypoxie, wobei ein 3RMR von 30 % das optimale Gleichgewicht für Sensitivität und Spezifität zur Detektion von hypoxischem Gewebe8 lieferte. Dieser Trend wurde in weiteren Studien mit Herzgewebe11,12 und Lebertransplantaten10 bestätigt. Außerdem zeigten Nyugen et al.9, dass 3RMR-Werte für Gewebe, in denen der Stoffwechsel gestoppt ist, auf sehr niedrige (oxidierte) Werte sinken, mit 3RMR-Werten (7,667 ±± 4,926) nicht transplantierbarer warm-ischämischen Lebern nach 3 Stunden normotherm Maschinenperfusion, verglichen mit 3RMR-Werten über 10 (~12–15) für frische und transplantierbare warm-ischämische Lebern9.

Über diese Demonstrationen hinaus, wie 3RMR die Gewebelebensfähigkeit messen kann, machen die Sensitivität, Spezifität und Benutzerfreundlichkeit von RRS es für viele andere Forschungsarten sehr anwendbar, bei denen der zelluläre Stoffwechsel und die mitochondriale Funktion beeinflusst sind. In früheren Studien wurde RRS eingesetzt, um Makuladegeneration und Glaukom bei Mäusen zu erkennen, indem die metabolische Aktivität von unmyelinisierten Axonen von retinalen Ganglienzellen am Sehnervkopf13 bewertet wurde. Zusätzlich wurde es verwendet, um eine Koarktation der Aorta (CoA) in einem Rattenmodell der angeborenen Herzerkrankungen nachzuweisen, eine Diagnose, die bei Neugeborenen-Herzuntersuchungenoft übersehen wird. Diese Technologie wurde genutzt, um die Organfunktion und -viabilität unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu verstehen, die im Bereich der Organtransplantation relevant sind, einschließlich Studien, die die Organlebensfähigkeit auf ex vivo Maschinenperfusion10,11 bewerten, die Reoxygenierung poststatische Kaltlagerungbewerten oder Reperfusionsschäden von warmischämischen Lebern mindern9.

Dieses Papier zielt darauf ab, RRS als ein Echtzeit-sensibles Instrument zur Bewertung der Mitochondriengesundheit zu etablieren. Ganze Lebern aus einem Rattenmodell wurden als Belastungstest unterschiedlich stark auf Ischämie und Sauerstoffreperfusion untersucht, um die mitochondriale Reaktion zu bewerten. Bei diesem Sauerstoff-Stresstest werden frische Lebern 5 Minuten initialem Perfusionsfluss, 5 Minuten Ischämie und 5 Minuten Reperfusion unterzogen. Während des gesamten Stresstests wurden 3RMR-Messungen sowie Laktat-, K+- und Sauerstoffpartialdruckmessungen (pO2) durchgeführt. Eine schnellere Reaktion auf Veränderungen der Sauerstoffversorgung wurde mit 3RMR im Vergleich zu herkömmlichen Blutgasanalyten beobachtet. Mit diesen Experimenten wird der Einsatz von RRS nicht nur für mechanistische Studien, sondern auch als diagnostische Methode sowie als therapeutisches Testfeld hervorgehoben. Daher kann das gemeinsame Protokoll für verschiedene Forscher, die mit Mitochondrien arbeiten, nützlich sein. Insgesamt könnte RRS mit seiner nichtinvasiven, Echtzeit- und hochspezifischen Natur einen erheblichen Einfluss auf den zellulären Stoffwechsel haben.

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Protokoll

Alle Tiere für die Experimente wurden gemäß den Richtlinien des National Research Council gehalten und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Massachusetts General Hospital (Boston, MA, USA) genehmigt.

1. Einrichtung und Nutzung von RRS

  1. Gerätebeschreibung:
    HINWEIS: Das tragbare RRS-System (Pendar Technologies; das Produkt dient ausschließlich Forschungszwecken) verwendet einen 441-nm-Laser, da das Raman-Spektrum mitochondrialer Cytochrome mit dieser Wellenlänge resonant verstärkt wird. Der Laser arbeitet zwischen 4 mW und 8 mW.
    1. Verbinden Sie eine Laseranregungsquelle über ein Glasfaserkabel mit einer speziell gebauten Sonde. Die Sonde richtet einen 2 mm großen Laserpunkt auf das Gewebe und sammelt zudem das emittierte Spektrum. Das Spektrum passiert dann einen Bandpassfilter und wird von einem Charge-Coupled Device (CCD)-Array erfasst. Das Spektrum wird jede Sekunde über einen Zeitraum von 180 Sekunden gesammelt und gemittelt, um ein rohes, rauschreduziertes Spektrum für die Analyse zu erzeugen.
    2. Die Software vergleicht dieses erhaltene Spektrum mit vorgemessenen Spektralbibliotheken mittels einer Regressionsanalyse.
  2. Verfahren für Voraufnahme-Bibliotheken
    HINWEIS: Für die in diesem Artikel vorgestellten Experimente wurden reduzierte und oxidierte Formen von Mitochondrien, Bibliotheken des Komplexes III sowie des Komplexes IV, Hämoglobins und Myoglobins erstellt und genutzt. Die RRS-Signale aller Bibliotheken wurden in einer Black Box bei Raumtemperatur (21 °C) empfangen. Diese Bibliotheksdateien werden separat mit der Analysesoftware bereitgestellt. Je nach interessierendem Gewebe und dem Vorhandensein anderer Raman-aktiver Moleküle könnten jedoch auch andere Bibliotheken geschaffen werden, indem das folgende Protokoll entsprechend angepasst wird. Rohe RRS-Spektren der Hämoglobin-, Myoglobin- und oxidierten/reduzierten Komplex-III/IV-Bibliotheken werden bereitgestellt in Ergänzende Abbildung 1.
    1. Hämoglobinbibliotheken (Ergänzende Abbildung 1C):
      1. Frisches Nagetierblut durch Tierexsanguination sammeln. Oxygenieren Sie das gesammelte Blut mit 100 % Sauerstoff oder deoxygenieren Sie es mit 100 % Stickstoff in einer Glascuvette und fügen Sie Natriumdithionat hinzu.
      2. Messen Sie die RRS jedes Zustands 10 Minuten lang durch die Glaskuvettewand, wobei die RRS-Sonde 9 mm von der Glascuvette entfernt positioniert ist.
      3. Verwenden Sie spektrale Peaks bei 1356 cm-1 , um den sauerstoffarmen Zustand zu überprüfen, und verwenden Sie Peaks bei 1376 cm-1 , um den sauerstoffreichen Zustand zu bestätigen.
    2. Reduzierte/oxidierte mitochondriale Bibliotheken (Abbildung 1)
      1. Isolieren Sie Mitochondrien aus homogenisierten und gereinigten Nagetierherzen in einer Glascuvette. Platzieren Sie die Raman-Sonde 9 mm von der Glaskuvette entfernt und messen Sie die Spektren dieser Mitochondrien durch die Glaswand.
      2. Schaffen Sie vollständig oxidierte Bedingungen, indem Sie den Mitochondrien einen 100%igen Sauerstofffluss zuführen. Überprüfen Sie den oxidierten Zustand durch das Fehlen des reduzierten RR-Peaks bei 1357 cm-1.
      3. Schaffen Sie vollständig reduzierte Bedingungen, indem Sie die Mitochondrien 100 % Stickstoff mit kleinen Mengen Schwefelwasserstoff aussetzen. Verifizieren Sie die reduzierten Bedingungen durch das Fehlen eines oxidierten RR-Marker-Peaks bei 1371 cm-1.
    3. Oxidierter/reduzierter Komplex III/IV (Ergänzende Abbildung 1A,B):
      1. Isoliere Komplex III und IV, wie anderswo beschrieben 9,15,16,17. Kurz gesagt, verwenden Sie eine Lagerprobe isolierter Mitochondrien (entsprechend 200 Nanomol Cytochrom a) als Ausgangsmaterial.
      2. Verdünnen Sie die Mitochondrien auf 10 nmol Cytochrom A/mL im eiskalten Puffer C (50 mM Tris, 1 mM MgSO4, pH 8,45). Dann geben Sie 10 % mit W/v n-β-D-Dodecyl-Maltosid (DM) tropfen für tropfen zu einer Endkonzentration von 1 %, während Sie vorsichtig auf Eis mischen.
      3. Zentrifugieren Sie den Extrakt bei 40.000 × g für 40 Minuten bei 4 °C. Trage das Überstandsmittel auf eine 2,5 cm × 20 cm große Glassäule auf, die zuvor mit einem Austauschharz gefüllt wurde, das mit 5 Spaltenvolumina Puffer C (mit 0,02 % w/v DM) ausgeglichen ist.
      4. Nach dem Waschen mit 2 Säulenvolumina des Puffers C elutieren mitochondriale Komplexe durch Anwendung eines linearen NaCl-Gradienten von 0–400 mM im selben Puffer und sammeln das Elut in 4 mL-Fraktionen.
      5. Grüne Fraktionen, die Komplex IV enthalten, eluierten nahe der Mitte des Gradienten (~180 mL NaCl), vor den rötlichen Brüchen mit Komplex III. Konzentrieren Sie die zusammengefassten Fraktionen, die jeden Komplex enthalten, auf 20–30 nmol Cytochrom a/mL.
      6. Sobald die einzelnen Komplexe isoliert wurden, setzen Sie jeden oxidierenden und reduzierenden Bedingungen aus. Reduzieren Sie eine 11 mM große Probe des Komplexes III im Tris-Puffer mit 2 mL Ascorbat (1 M), um Cytochrom c1 und 2 mL HS (Hydrosulfit) zu reduzieren, um Cytochrome bL und bH vollständig zu reduzieren.
      7. Reduzieren Sie eine 18,67 mM lange Probe des Komplexes IV im Tris-Puffer in mehreren Schritten, da Komplex IV einen mehrstufigen katalytischen Oxidationsprozess durchläuft. Um den komplexen IV vollständig zu reduzieren, fügen Sie zwei 2 mL H2O2 (10 mM) hinzu, gefolgt von 2 mL HS.
      8. Sammle nach jeder Addition Bibliotheksspektren, um jeden Schritt des Zyklus zu erfassen. Fügen Sie vollständig oxidierte und reduzierte Spektren zur endgültigen Referenzbibliothek hinzu, um die stationären Zustände des komplexen IV darzustellen.
      9. Bereiten Sie alle Proben in einem 1-mL Glasfläschchen vor, halten Sie sie in einer festen Position 9 mm von der Sondenlinse entfernt und schließen Sie sie in eine schwarze Box, um Lichtkontamination zu verhindern. Sammeln Sie RRS-Spektren für 600 s für jeden Komplex und Oxidationszustand.
      10. Validieren Sie die Reinheit von isolierten cIII und cIV, wie zuvorbeschrieben 17, und validieren Sie die Angemessenheit isolierter cIII- und cIV-Spektralbibliotheken zur Erklärung der vollständigen mitochondrialen Spektren, wie sie in einer aktuellen Studie beschriebensind. 9.
    4. Myoglobinbibliotheken (Ergänzende Abbildung 1D):
      1. Mit ähnlichen Sauerstoff- und Stickstoffflüssen (mit gelöstem Natriumdithionit) variieren Sie die Oxymyoglobinsättigung des myokardialen Myoglobinextrakts zwischen 0 % und 100 %. Überprüfen Sie die Raman-Spektren durch Markierungsspitzen bei 1355 cm-1 und 1376 cm-1.

HINWEIS: Die oben beschriebenen spektralen Komponenten, wie Hämoglobin oder oxidierte/reduzierte Mitochondrien, sind hämhaltige Moleküle und werden mit derselben Wellenlänge angeregt. Dieses RRS-System vermeidet Signalüberlappungen, indem es für jedes Molekül eine Regressionsbibliothek basierend auf seinem einzigartigen spektralen Signal erstellt. Die erhaltenen gestreuten Spektren werden durch einen Regressionsalgorithmus gegen die ausgewählten Bibliotheken durchgeführt. Der Regressionsalgorithmus liefert für jedes Bibliotheksspektrum einen Faktor, der die bestpassende Schätzung seines relativen Beitrags im aufgezeichneten Spektrum und damit seiner relativen Konzentration im Gewebe darstellt. Da der Algorithmus die beste Anpassung über einen Bereich von Wellenzahlen verwendet, ermöglichen kleine Unterschiede in der Position oder Intensität der spektralen Peaks der verschiedenen Bibliothekskomponenten der Regression, selbst eng verwandte Chromophoren zu erkennen. Durch den Regressionsalgorithmus und Spektralbibliotheken kann das RRS-System das gesamte, gestreute Signal je nach ihren einzigartigen spektralen Peaks in verschiedene Komponenten zerlegen und so Signalüberlappungen durch hämhaltige Moleküle vermeiden. Um die Beziehung zwischen Hämoglobin und Mitochondrien zu zeigen, ist die ergänzende Abbildung 2 enthalten, die Bilder von Spektren aus einer Leberperfusion zeigt, aufgeteilt in das gemessene Signal, die Linie der besten Passung und den unerklärten Rest, der durch Unterschiede in den einzelnen spektralen Peaks entsteht. In Panel A werden reduzierte und oxidierte Hämoglobinbibliotheken sowie reduzierte und oxidierte Mitochondrienregressionsbibliotheken ausgewählt. Die Linie der besten Passung, die durch die Bibliotheken und die Regressionsanalyse kuratiert wird, überschneidet sich sauber mit dem gemessenen Signal, und es gibt kaum unerklärte Residuen. In Panel B werden nur oxidierte und reduzierte Mitochondrienbibliotheken ausgewählt. Da eine große, unerklärliche Reststruktur vorliegt, ist der mitochondriale spektrale Peak um mehrere Wellenzahlen von dem des Hämoglobins verschoben, das in der Regressionsanalyse nicht berücksichtigt wurde. Darüber hinaus erklären die Autoren in den ergänzenden Abbildungen von Nguyen et al. 9 die Beziehung zwischen Mitochondrien und den einzelnen Komplexen (cIII und cIV) sowie die Beziehung zwischen einzelnen Komplexen16, wobei Komplex III schärfere, niedrigfrequentere Spitzen aufweist, während Komplex IV breitere, hochverschobene Bänder aufweist. Außerdem zeigen die Autoren, dass die reduzierten Bibliotheken des Komplexes III und Komplex IV das gemessene Spektrum der reduzierten ganzen Mitochondrien vollständig erklären, was zu minimalen unerklärten Residuen führt.

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Abbildung 1: Spektralbibliotheken vollständig oxidierter und reduzierter Mitochondrien. RRS-Bibliotheksspektren wurden erhalten, nachdem isolierte Mitochondrien mit (A) 100 % Sauerstoff bzw. 100 % Stickstoff (B) versorgt wurden, um oxidierte bzw. reduzierte Zustände zu erreichen. Diese Zustände wurden durch das Vorhandensein von RR-(C)-oxygenierten und reduzierten (D)-Marker-Peaks bestätigt. Die Verschiebung dieser Spitzen entspricht Veränderungen der molekularen Schwingungsmoden in Anwesenheit von Sauerstoff. Die Intensität jedes Peaks wird auf eine beliebige Intensitätseinheit (AU) normalisiert, da die Verstärkung des reduzierten Zustands unter Verwendung dieser 441 nm Anregungswellenlänge größer ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

2. Datenerhebung mittels RRS

  1. Geräteeinrichtung:
    1. Verbinden Sie das Spektrometergerät (in einer kompakten Box untergebracht) mit dem Gleichstrom (DC) und mit dem Netzteil über die mitgelieferten Kabel. Die Spektrometereinheit besitzt einen runden Plug mit Ausrichtungseindrücken.
    2. Richten Sie die Vertiefungen des runden Steckers mit denen des Kabels aus, das an den Netzteil angeschlossen wird. Vor dem Anschluss der Ports ist keine Reinigung erforderlich.
    3. Schließen Sie den Computer, der die Analyse durchführt, mit demselben Netzadapter an, der auch das Spektrometer und die Stromversorgung mit den mitgelieferten Kabeln verbindet.
    4. Setze die Lasersonde in den Halter der Sonde. Passen Sie die Position dieser Sonde zu Beginn des Experiments an.
    5. Öffnen Sie die Spektrometer-Steuerungssoftware (Cellular Energetics Software).
  2. Software-Einrichtung:
    HINWEIS: Einstellungsdateien und Regressionsbibliotheken für verschiedene Gewebetypen werden dem System mitgeliefert. Diese Dateien enthalten Informationen darüber, welche Bibliotheken das RRS-System in der Regression enthalten sollte, wie viele Spektren im Regressionsfenster enthalten sind und weitere Parameter wie die Laserleistung. Standardeinstellungen können geändert und eine neue Einstellungsdatei für zukünftige Experimente gespeichert werden. Screenshots der unten beschriebenen Software sind in ergänzender Abbildung 3 dargestellt.
    1. Beim Öffnen der Spektrometer-Steuerungssoftware erscheint ein Diagramm mit Prozent 3RMR, Sauerstoffsättigung (StO2) und Myoglobinsättigung. Auf diesem Bildschirm werden diese Kennzahlen, falls ausgewählt, in Echtzeit während der Messungen angezeigt. Klicken Sie auf den Tab Einstellungen unten links auf der Seite.
    2. Unter dem Info-Tab geben Sie die Sitzungsinformationen unter Sitzungsnamen ein und alle notwendigen Details unter dem Reiter Sitzungsbeschreibung .
    3. Es gibt zwei Modi zur Datenerfassung. Verwenden Sie den Spot-Check-Modus , um Spektren zu sammeln, bis bestimmte Qualitätsmetriken erreicht sind (z. B. Ziel-Sigma oder Regressionsfenster/Anzahl der Spektren), und beenden Sie die Aufzeichnung. Verwenden Sie den kontinuierlichen Modus, um Spektren aufzunehmen, bis die Stopptaste gedrückt wird. In beiden Modi werden alle Daten, sowohl 3RMR-Ergebnisse als auch einzelne Spektren, automatisch gespeichert. Dieses Experiment nutzt den kontinuierlichen Modus.
    4. Sobald alle Sitzungsinformationen eingegeben sind, klicken Sie auf den Reiter System .
    5. Wählen Sie unter Settings File das für das Projekt geeignete Protokoll aus (für azelluläre Rattenleberperfusionen wählen Sie das Rat Liver Acellular Protocol). Dies passt automatisch den Messtyp, die durchschnittliche Messlänge (Regressionsfenster) sowie das Zielsigma an.
      1. Um eine neue Einstellungsdatei zu erstellen, passen Sie eine der oben genannten Komponenten an und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Speichern . Diese Parameter sollten als separate Einstellungsdatei gespeichert werden, die dann ins System importiert werden kann.
      2. Um eine neue Einstellungsdatei zu importieren, klicken Sie auf das Dropdown-Menü neben Default (Mod) und wählen Sie die Datei Neue Einstellungen importieren. Klicken Sie auf die neue Einstellungsdatei , um importiert zu werden.
    6. Unter Regressionsbibliotheken wählen und bestätigen Sie die Kombination der Bibliotheken, die für Datenerfassung und -analysen verwendet werden sollen. Die Bibliotheken für reduzierte und oxidierte Mitochondrien [nur Mito] wurden für dieses Experiment ausgewählt. Andere Nutzer können sich entscheiden, Bibliotheken zu verwenden, die auch Hämoglobin, Myoglobin oder andere Komplexe unter der Erweiterten Bibliothek enthalten.
    7. Wählen Sie den bevorzugten Fensterbreitenmodus aus und bestätigen Sie.
      1. Adaptiver Breitenmodus: Verwenden Sie den adaptiven Breitenmodus , um einzelne Spektren zum gemittelten Spektrum hinzuzufügen, bis das maximale Sigma-Ziel erreicht ist. Wenn das Sigma-Ziel nicht erreicht wird, wird die Aufzeichnung gestoppt, sobald sie die obere Grenze des gesetzten Regressionsfensters erreicht (d. h. die maximale Anzahl der Spektren, die ihm aufgezeichnet wurde). Die Messergebnisse werden auf dem Bildschirm angezeigt, nachdem das Mindest-Sigma-Ziel erreicht wurde.
      2. Modus mit fester Breite: Verwenden Sie den Modus mit fester Breite , um einzelne Spektren zum gemittelten Spektrum hinzuzufügen, bis die Zielanzahl der Spektren (unter der durchschnittlichen Länge eingestellt) enthalten ist.
    8. Sobald die Systemeinstellungen abgeschlossen sind, klicken Sie auf den Reiter Plot .
    9. Wählen Sie unter Hauptreihe die Komponenten aus, die während der Messungen auf dem Bildschirm angezeigt und angezeigt werden.
    10. Bestätigen Sie, dass alle ausgewählten Messkomponenten dem relevanten Protokoll entsprechen.
  3. Datenerfassung:
    HINWEIS: Raman-Messungen sollten in einem dunklen Raum durchgeführt werden. Vor Beginn der Datenerhebung sollten Sie sicherstellen, dass der Arbeitsplatz so licht wie möglich geschützt ist. Wenn der Raum nicht vollständig von Licht abgeschirmt werden kann, wird das RRS-System mit einer schwarzen Abdeckung mit einer rechteckigen Öffnung in der Mitte geliefert (siehe in Abbildung 2), durch die die Lasersonde platziert werden kann. Die Box kann die Probe/den Bereich des Organs abdecken, aus dem RRS-Messungen entnommen werden. Bei der Arbeit mit dem RRS-Laser sollten Sie direkte oder längere Augenexposition vermeiden. Blenden Sie keinen Laser direkt ins Auge oder auf reflektierende Oberflächen. Aktiviere den Laser nur, wenn er direkt auf dem interessierenden Gewebe positioniert ist. Der RRS-Laser ist ein Klasse 3R-Laser bei 4 mW und Klasse 3B bei 10 mW. Der Laser ist sicher für Gewebekontakt.
    1. Wählen Sie die passenden, vorgespeicherten Einstellungen, Aufnahmeparameter und Bibliotheksdateien aus.
    2. Platziere die Lasersonde direkt über dem interessierten Gewebe/Organ. Positioniere die Sonde so senkrecht wie möglich und 1 cm vom Gewebe entfernt. Verwenden Sie ein Lineal, um genau 1 cm von der Oberfläche des Orgels zu messen. Stellen Sie die Sonde so ein, dass sie näher als 1 cm entfernt ist, wenn das Signal nicht klar ist. Achten Sie jedoch darauf, dass die Sonde das Gewebe niemals berührt.
      HINWEIS: Die Sonde kann auch von Hand gehalten werden, aber es wird empfohlen, einen verstellbaren Sondenhalter/-ständer zu verwenden, der stabil bleibt. Positioniere die Sonde so senkrecht wie möglich und 1 cm vom Gewebe entfernt. Ein Lineal konnte verwendet werden, um genau 1 cm von der Orgeloberfläche zu messen. Die Sonde könnte so eingestellt werden, dass sie näher als 1 cm entfernt ist, wenn das Signal nicht klar ist. Die Sonde sollte jedoch niemals das Gewebe berühren.
    3. Bestätigen Sie, dass der Laserpunkt am linken lateralen Lappen liegt, so nah wie möglich an der Pfortvene.
    4. Bestätigen Sie, dass alle ausgewählten Bibliotheken, Regressionseinstellungen, Ziel-Sigma, Regressionsfenster und Erwerbsmodi korrekt und wie gewünscht sind.
      1. Achte darauf, dass der Raum so dunkel wie möglich ist. Überprüfen Sie, dass die Sonde keine Kontamination, insbesondere Blut, am Fenster aufweist. Im Falle einer Kontamination verwenden Sie ein fusselfreies, nicht abrasives Tuch mit 70 % Isopropylalkohol, um das Quarzfenster zu reinigen, gefolgt von gründlichem Trocknen mit einem trockenen Tuch, bevor Sie fortfahren.
      2. Bei starker Kontamination wischen Sie die Sonde so gründlich wie möglich ab, wie oben beschrieben. Kalibriere dann das Gerät, indem du den Laser in ein dunkles Gehäuse mit schwarzem Klebeband stellst und den Take Dark-Knopf drückst. Die Kalibrierung dauert etwa 5–10 Minuten. Unabhängig von Kontamination kalibrieren Sie das Gerät einmal im Monat, und es sendet automatische Erinnerungsnachrichten.
        HINWEIS: Die Erläuterungen jeder Qualitätskontrollmetrik, Beispiele solcher QC-Metriken sowie das rohe spektrale Signal, das aus optimalen und suboptimalen Aufzeichnungen gewonnen wird (Supplementary File 1, Abbildung 3, Supplementary Abbildung 3). Diese Qualitätskontrollkriterien wurden für ganze Lebern aus dem Rattenmodell optimiert. Jedes neu entwickelte Protokoll, das ein anderes Organ-/Tiermodell verwendet, sollte diese Metriken entsprechend verfeinern und anpassen.
    5. Klicken Sie auf der Hauptseite auf die Start-Taste, um mit der Datenerhebung zu beginnen. Je nach gewählten Einstellungen nimmt die Software Aufnahmen auf, bis der Zielfehlerwert (Sigma) oder 180 Sekunden erreicht ist. Die Datenerfassung ist nun abgeschlossen.
      1. Aus diesen Diagrammen und Werten werden die Qualität des RRS-Signals abgeleitet, um eine Anpassung der Sondenposition oder der Messbedingungen zu ermöglichen (Abbildung 3). Wenn das erhaltene RRS-Signal diese Qualitätskontrollkriterien nicht erfüllt, wird die Sonde so senkrecht wie möglich und etwa 9 mm von der Oberfläche bis zum Sondenfenster eingestellt.
    6. Sobald das Datenerfassungs- bzw. experimentelle Protokoll abgeschlossen ist, entsorgen Sie die gesamte Leber/das gesamte Gewebe in einen Biohazard-Behälter. Reinige jedes System oder jede Oberfläche, die mit dem Organ/Gewebe in Kontakt war, mit 70 % Ethanol.
      1. Bei der Arbeit mit einem Perfusionssystem werden DI-Wasser mit enzymatischem Reiniger (7,8 ml verdünnt in 1 L deionisiertem [DI]-Wasser, gefolgt von sauberem DI-Wasser, betrieben.
        HINWEIS: Jede Aufnahme wird als separate Analysedatei unter einer neuen Sitzungsdatei gespeichert. Ergebnisse für 3RMR und mitochondriale Signalstärke (r3RMR) werden im Hauptfenster dargestellt. Das Rohspektrum kann ebenfalls dargestellt werden. Weitere Qualitätskontrollkennzahlen, wie Restsignalstärke und Gesamtsignalstärke, werden unter dem Reiter Spectrum angezeigt.
  4. Datenanalyse:
    1. Sobald die Datenerfassung abgeschlossen ist, klicke auf den Review-Ordner am unteren Bildschirmrand, um die experimentelle Datei zu öffnen und die Ergebnisse zu sehen.
    2. Alternativ können Sie eine Textdatei mit den Ergebnissen öffnen. Wählen Sie die interessante Sitzungsdatei aus. Eine Analysedatei mit allen erhaltenen Messungen öffnet sich. Jeder Parameter und sein Sigma-Wert haben eine eigene Spalte. Zum Beispiel werden 3RMR-Werte, die jede Sekunde erhalten werden, unter der Spalte "3RMR" aufgeführt, und ihr Sigma-Wert unter "sigma_3RMR".
    3. Die letzte Zeile jeder Spalte enthält die Endwerte für jeden Parameter dieser Sitzungsdatei. Verwenden Sie diesen Wert zum Plotten.
    4. Wiederholen Sie die Schritte für jede Sitzungsdatei/jede Aufnahme. Die Werte wurden wie gewünscht dargestellt.

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Abbildung 2: Einrichtung des RRS-Geräts. Ein Schaltplan des RRS-Systemaufbaus. Die Sonde ist über ein Glasfaserkabel mit dem RRS-System verbunden, das die Laseranregungsquelle und das Spektrometer enthält. Dieses Setup verbindet sich dann mit jedem Laptop, der die Spektrometer-Steuerungs-App für Datenerfassung und -analyse enthält. Sowohl der Computer als auch das Spektrometergerät sind an eine Steckdose angeschlossen. RRS-Messungen sollten im Dunkeln durchgeführt werden. Wenn der Raum nicht vollständig vor Licht abgeschirmt werden kann, verfügt das RRS-System über eine schwarze Abdeckung mit einer rechteckigen Öffnung in der Mitte, an der die Lasersonde platziert werden kann. Die Box umfasst die Probe/den Bereich der Orgel, von der aus die RRS-Messungen entnommen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Beispielspuren und Qualitätskontrollkennzahlen für suboptimale und optimale Qualitätsspuren. Das Restsignal (Rauschen) ist mit einer orangen Klammer markiert, das mitochondriale Signal mit einer grünen Klammerung. (A) Beispielspur aus einem suboptimalen Raman-Signal. Das Restsignal ist zu groß, um sich vom mitochondrialen Signal zu unterscheiden. Spektralspitzen sind im gesamten gemessenen Signal nicht zu unterscheiden. (B) Beispielspur aus dem optimalen Raman-Signal. Das mitochondriale Signal ist sichtbar größer und unterscheidet sich vom Restsignal. Spektrale Peaks aus der erhaltenen Messung sind unterscheidbar. (C) QC-Metriken, die von jedem Signal erhalten werden. Insgesamt ist das insgesamt erhaltene Signal bei der suboptimalen Messung geringer als die optimale Messung. Im Vergleich zur suboptimalen Aufzeichnung werden mehr mitochondriale Signale gemessen, wobei das mitochondriale Signal jeweils 17 % bzw. 14 % des Gesamtsignals ausmacht. Das Signal wurde bei der optimalen Messung mit einem Fehler von 4,3 % gemessen, im Gegensatz zu 18,5 % bei der suboptimalen Messung. Ebenso macht das unerklärte Restsignal 11 % des Gesamtsignals in der suboptimalen Aufzeichnung aus, während es im optimalen Signal 3,6 % ausmacht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

3. Bewertung der mitochondrialen Gesundheit mittels RRS

HINWEIS: Die Resonanz-Raman-Spektroskopie (RRS)-Technologie wurde eingesetzt, um eine mitochondriale Viabilitätsmetrik (3RMR) zu entwickeln, die die Lebensfähigkeit von Transplantationsorganen angibt. Diese Studie soll zeigen, wie Veränderungen der Sauerstoffversorgung – und damit der zellulären Atmung – im Vergleich zu traditionellen Schadensbiomarkern wie Laktat und K+ in 3RMR-Trends widergespiegelt werden. Hier wird ein Sauerstoff-Stresstest verwendet, bei dem nach 5 Minuten kontinuierlicher Perfusion der sauerstoffhaltige Perfusionsfluss für 5 Minuten pausiert und dann für 5 Minuten fortgesetzt wird. RRS-Messungen sowie Ein- und Ausströmungsproben werden während des gesamten Stresstests durchgeführt.

  1. Leberbeschaffung:
    1. Beruhige Tiere in einer Induktionskammer mit 3–5 % Isofluran. Filtern Sie überschüssigen Dampf mit Aktivkohle.
    2. Führen Sie eine vollständige Hepatektomie an männlichen Lewis-Ratten durch (150 g). Verbinde die Äste der Pfortader. Injiziere 50 Μ Natriumheparin durch die IVC. Kanylieren Sie die Pfortvene während der Operation mit einem 16-G-Katheter und spülen Sie die Leber mit 50 ml Kochsalzlösung.
    3. Legen Sie die beschafften Lebern in eine Petrischuel mit 30 ml Lösung der University of Wisconsin (UW) auf Eis.
  2. Subnormotherme Machine Perfusion (SNMP) Aufbau und Resonanz-Raman-Messungen:
    1. Richte das RRS-Gerät wie zuvor beschrieben ein. Stellen Sie das Acellular Rat Liver Protocol in der Spektrometer-Steuerungssoftware ein, die automatisch den Breitenmodus auf adaptive Breite, die durchschnittliche Länge auf 180 und das Ziel-Sigma auf 1,5 setzt. Es wählt außerdem 3RMR und Fluoreszenz als Messparameter sowie Mito nur als Regressionsbibliothek aus. Stellen Sie den Erfassungsmodus auf kontinuierlichen Modus ein.
    2. Richte das SNMP-System wie an anderer Stelle beschriebenein 18.
      1. Kurz gesagt, stellen Sie sicher, dass das Perfusionssystem aus einer Perfusionskammer, einer Peristaltikpumpe, einem Membranoxygenator und einer Blasenfalle besteht.
      2. Abgabe von Sauerstoff mit einer atmosphärischen Mischung (95% O2 und 5 %CO2); Halte pO2 zwischen 400–500 mmHg. Überwachen Sie den intrahepatischen Druck mit einem Drucksensor und halten Sie ihn zwischen 3–5 mmHg. Sammeln Sie die Proben durch Probenports.
    3. Sobald die Software und das Perfusionssystem eingerichtet sind, verbinden Sie die Kanüle, die in die PV eindringt, mit dem Zuflussrohr der Perfusionsmaschine. Lassen Sie das Organ, das Perfusationsmittel und die Perfusionseinrichtung bei Raumtemperatur (21 °C) aufbewahren, ohne ein Wasserbad.
    4. Geben Sie das Perfusat über die Kanüle im PV mit einer peristaltischen Pumpe an das Organ.
      1. Zur Herstellung des Perfusats mischen Sie 500 ml Phenol-rotfreies Williams' Medium mit 5 g Bovines Serumalbumin (BSA), 12 mg wasserlöslichem Dexamethason, 5 ml Penicillin-Streptomycin, 5 ml L-Glutamin, 2,5 μL Insulin und 1000 U Heparin.
      2. Rühren Sie alle Komponenten etwa 20 Minuten auf einer Rührplatte um oder bis alle Komponenten sich aufgelöst haben. Erhöhen Sie die Perfusionsströme, um Drücke von 3–5 mmHg zu erreichen.
    5. Dann wird die RRS-Laserquelle in den Sondenhalter gelegt und 1 cm über dem größten Leberlappen positioniert, so nah wie möglich am PV. Den Perfusionsfluss nach 5 Minuten (T5) pausieren und nach 10 Minuten (T10) wieder aufnehmen. Führe den Stresstest bei 15 Minuten durch (T15).
    6. Nehmen Sie während des gesamten Stresstests RRS-Messungen durch; Nehmen Sie alle 5 Minuten Ein- und Abflussmessungen vor, beginnend bei T0 (Abbildung 4). Zeichnen Sie die 3RMR-Werte sowie die Ausflusswerte von K+ und Laktatwerten für T0, T5, T10, T15 (n = 3) (Abbildung 5) dar.
    7. Berechnen Sie die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) bei T0, T5, T10, T15 , indem Sie den Ein- und Ausflusspartialdruck von Sauerstoff (pO2) mit dem Löslichkeitskoeffizienten von Sauerstoff im Plasma multiplizieren (0,00314). Plotten Sie die OCR für T0, T5, T10, T15 (Abbildung 5).
      HINWEIS: Beispielale Resonanz-Raman-Spektralspuren bei perfizierten (T5), ischämischen (T10) und reperfierten (T15) Zuständen einer Leber sind dargestellt (Abbildung 6)

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Abbildung 4: Diagramm, das den experimentellen Fluss darstellt. Eine vollständige Hepatektomie wurde bei weiblichen Lewis-Ratten durchgeführt. Die beschaffte Leber wurde auf eine subnormotherme Perfusionsmaschine gesetzt und für die ersten 5 Minuten mit sauerstoffreichem Perfusat versorgt. Das Perfusat fließt durch die Pfortader in die Leber und zirkuliert durch die peristaltische Pumpe (Perfusionsfluss dargestellt mit blauen Pfeilen). Die sauerstoffreiche Perfusion wurde bei T5 für die nächsten 5 Minuten pausiert und bei T10 für weitere 5 Minuten wieder gestartet. 3RMR-Messungen wurden während des Belastungstests durchgeführt (dargestellt als Laser). Perfusatproben wurden bei T0, T5, T10 und T15 entnommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Ergebnisse

Frische Lebern wurden mit einem Sauerstoff-Stresstest Phasen von Ischämie und Reperfusion unterzogen. Anschließend wurden die Echtzeitänderungen des 3RMR während des Stresstests mit der Sauerstoffverbrauchsrate, dem Ausflusslaktat und dem Kalium aus der Perfusatanalyse bei T0, T5, T10, T15 verglichen. Unter gesunden Bedingungen werden 3RMR-Werte zwischen 10 % und 30 % erwartet (Abbildung 5A). Wie erwartet liegen di...

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Diskussion

Diese Studie zeigt eine nicht-invasive, Echtzeit- und hochsensible Methode zur Quantifizierung der Mitochondriengesundheit mittels eines tragbaren Resonanz-Raman-Spektroskopiesystems, das aus einem Laser in einer kompakten Sonde besteht, der über ein Glasfaserkabel mit einer Laserpumpe verbunden ist. Bei dieser Methode wurde ein 441-nm-Laser verwendet, um Mitochondrien anzuregen, die je nach Oxidationszustand eindeutige spektrale Signale erzeugen. So kann RRS jeden Zustand von Mitochondr...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären konkurrierende Interessen. S.N.T und P.R. verfügen über vorläufige Patentanmeldungen, die für diese Studie relevant sind. P.R. ist Mitarbeiter und Anteilseigner von Pendar Technologies. S.N.T. werden von MGH und Partners HealthCare gemäß deren Interessenkonfliktrichtlinien verwaltet. Die konkurrierenden Interessen von J.N.K. werden durch die Interessenkonfliktpolitik von BCH verwaltet. In dieser Studie wurden folgende patentierte Technologien verwendet: US2020/0281474A1 In vivo Überwachung zellulärer Energien mit Raman-Spektroskopie (Anwendung). Weitere Patentanmeldungen für den Einsatz in der Augenheilkunde, der Gewebetragfähigkeit und der Bewertung von Brandverletzungen mittels Resonanz-Raman-Spektroskopie wurden eingereicht, wobei R.J. ebenfalls Erfinder ist.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch großzügige Mittel für S.N.T. von den US National Institutes of Health (R01DK134590) unterstützt. Wir danken auch dankbar für die Finanzierung von S.N.T durch das US National Institute of Health (K99/R00 HL1431149; R01HL157803; R24OD034189), National Science Foundation (EEC 1941543), Polsky Family Foundation und Shriners Children's Boston (Zuschuss #BOS-85115). Darüber hinaus erkennen wir die Finanzierung von R.J. durch ein Stipendium #LIFER23-263034 der American Association for the Study of Liver Diseases Foundation an. Die Autoren drücken ihren tiefen Dank für die fachkundige Unterstützung durch den Pathology Core der Harvard Medical School für Histologiestudien aus. Wir möchten Dr. Robert Balaban und Dr. Armel Femnou vom NIH National Heart, Lung, and Blood Institute für ihre Expertise in mitochondrialer Energetik und ihre wichtige Unterstützung bei der Entwicklung der RRS-Bibliothek einzelner mitochondrialer Komplexe danken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
16 G Catheter BD Insyte Authoguard381454Zum Kanülieren der Pfortader verwendet
Activated CharcoralVet Equip Vapor Guard Activated Charcoal931401Zum Filtern überschüssiger Dämpfe während der Anästhesie
BSA Sigma-Aldrich A7906Perfusatzusammensetzung
Bubble Trap Radnoti130149
DexamethasoneSigma-AldrichD2915Perfusatzusammensetzung
Glutamax Thermo Fisher Scientific35050061Perfusatzusammensetzung
Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G)Fisher Scientific 13-200-292Zum Durchfließen des Perfusats durch die Leber
Masterflex peristaltic pumps Cole Parmer, Vernon Hill, IL7528-30 Zum Durchfließen des Perfusats durch die Leber
Membrane Oxygenator Radnoti130144Zum Sauerstoffen des Perfusats. 
Penicillin-streptomycinSigma-AldrichP4458Perfusatzusammensetzung
RAPIDPoint 500 Blood Gas SystemSiemens Healthineers41115805Für Blutgasanalyse
Resonance Raman System  Pendar TechnologiesA4D441Kontaktieren Sie Pendar Technologies für Anfragen zu diesem Produkt

Referenzen

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