Echtzeit-nicht-invasive Bewertung der Mitochondrienfunktion mittels Resonanz-Raman-Spektroskopie

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine nicht-invasive, Echtzeit-Methode zur Überwachung der Mitochondriengesundheit mittels Resonanz-Raman-Spektroskopie (RRS). Wir nutzten RRS, um mitochondriale Redoxzustände zu quantifizieren, und entwickelten eine Metrik für die mitochondriale Gesundheit, das Resonance Raman reduzierte mitochondriale Verhältnisse (3RMR), das eine schnellere Reaktion auf Veränderungen der Sauerstoffversorgung zeigt als traditionelle Blut-Gas-Analyte.

Zusammenfassung

Obwohl Mitochondrien zentral für Pathogenese und Krankheitsprogression sind, bleibt mechanistische Einsicht in die Dynamik der mitochondrialen Gesundheit kostspielig und unzugänglich. Um diese Lücke zu schließen, verwendet diese Studie Resonanz-Raman-Spektroskopie (RRS), um die mitochondriale Funktion zu bewerten, wobei ein tragbares System verwendet wird, das Echtzeit-, nicht-invasive und quantitative Messungen der mitochondrialen Cytochrom-Redoxzustände in Rattenlebern liefert. In diesem Protokoll demonstrieren wir den Einsatz dieser Technologie, einschließlich Einrichtung, Datenerfassung und Datenverarbeitung. Diese Studie präsentiert ein Proof-of-Concept-Experiment, das die Fähigkeit von RRS hervorhebt, Echtzeitänderungen des mitochondrialen Redoxzustands – und damit der mitochondrialen Funktion – zu messen. Kurzzeitig wurde das RRS-Gerät mit einer Laserpumpe sowie einem Datenerfassungscomputer verbunden und 1 cm von der Rattenleber entfernt platziert.  Die Aufnahmeparameter wurden gemäß dem Protokoll der Rattenleber ausgewählt; Redoxzustände wurden unter sauerstoffhaltigen und ischämischen Bedingungen mittels eines Sauerstoffstresstests gemessen. Veränderungen der mitochondrialen Redoxzustände wurden während des gesamten Sauerstoffstresstests verfolgt.

Einleitung

Mitochondrien spielen eine entscheidende Rolle bei der zellulären Funktion und der Homöostase. Mitochondrien sind die Haupttreiber des zellulären Stoffwechsels, da sie die ATP-Erzeugung durch oxidative Phosphorylierung regulieren. Sie dienen außerdem als Signalorganellen, die das Zellschicksal bestimmen, indem sie apoptotische Bahnen regulieren, sowie die ROS- und Ca^{+2-Signalübertragung 1}. Daher kann eine mitochondriale Dysfunktion zu verschiedenen neurodegenerativen, muskulösen und kardiovaskulären Erkrankungen ^führen. Trotz der entscheidenden Rolle, die Mitochondrien im Krankheitsverlauf spielen, kann die Bewertung der mitochondrialen Funktion invasiv, kostspielig und begrenzt sein.

Wichtige Indikatoren der mitochondrialen Funktion, wie die Sauerstoffverbrauchsrate, oxidative Phosphorylierung und die Aktivität verschiedener Komplexe innerhalb der Elektronentransportkette (ETC), werden mittels Respirometrie gemessen. Das ETC besteht aus vier Komplexen (I–IV), die in die innere mitochondriale Membran (IMM) eingebettet sind. Diese Komplexe übertragen mit Hilfe anderer Co-Enzyme Elektronen von reduzierten Substraten wie NADH und FADH2 an den Endelektronenakzeptor_O2, der dann zu Wasser reduziert wird. Die meisten zeitgenössischen Respirometrie-Assays, wie Seahorse und Orobros O2k, erfordern Gewebeverarbeitung, was ihre Anwendung für translationale Forschung^{einschränkt 4,5}. Die Messung des mitochondrialen Membranpotenzials (MMP) ist eine weitere Methode zur Bewertung der mitochondrialen Dysfunktion, die kationische lipophile Fluorophore wie JC-1 zusammen mit mikroskopischer Bildgebung verwendet, bei der gekoppelte (gesunde) und ungekoppelte (beschädigte) Mitochondrien mit unterschiedlichen Wellenlängen⁶ fluoreszieren. Diese Assays können jedoch eine geringe^{Empfindlichkeit von 5} aufweisen. Der Farbstoff selbst kann auch bei hohen Konzentrationen eine hohe Zytotoxizität^aufweisen. Schließlich erfordert diese Technik, ähnlich wie bei Respirometriemessungen, auch eine Gewebeverarbeitung. Spektroskopiebasierte Techniken wurden kürzlich als nicht-invasive Methoden zur Bewertung der Mitochondriengesundheit eingesetzt. So wurde beispielsweise die Phosphor-Magnetresonanzspektroskopie (P-MRS), eine Methode zur Bewertung des zellulären Stoffwechsels durch Messung der Konzentrationen phosphorhaltiger Metaboliten, zur Charakterisierung von künstlich hergestelltem adipogenem Gewebe während der Differenzierung⁷ verwendet. Diese Technik erfordert jedoch auch spezielle Ausrüstung und Schulung.

Unsere Gruppe hat kürzlich eine Echtzeit-, nicht-invasive und hochspezifische Technik zur Messung des mitochondrialen Redoxzustands als Marker für die Organlebensfähigkeit mittels Resonanz-Raman-Spektroskopie (RRS) demonstriert. RRS verwendet inelastische Streuung von Photonen zur Quantifizierung der Redoxzustände mitochondrialer Cytochrome. Porphyrinringe in Häm-Gruppen von Molekülen wie mitochondrialen Cytochromen, Hämoglobin und Myoglobin erzeugen je nach ihrem Oxidationszustand ein charakteristisches Raman-Spektrum bei Anregung mit einem 441-nm-Wellenlängenlaser⁸. Obwohl das RRS-System eine Wellenlänge von 441 nm verwendet, können auch Laser mit 420 nm und 405 nm Wellenlängen eingesetzt werden, von denen jeder bevorzugt einen anderen Cytochromkomplex verstärkt. Das aus einer unbekannte interessierende Probe gewonnene Spektrum wird mit voraufgezeichneten Bibliotheken vollständig oxidierter oder reduzierter intakter Mitochondrien abgeglichen, was das Verhältnis von reduzierten zu totalen Mitochondrien oder den durchschnittlichen Redoxzustand der in situ ETC-Cytochrome ergibt. Dieses Verhältnis ist als Resonanz-Raman-reduziertes Mitochondrialverhältnis (3RMR) definiert.

Es gibt drei verschiedene Berechnungen/Typen von 3RMR: mitochondriale 3RMR (mito-3RMR), komplexe III 3RMR (cIII-3RMR) und komplexe IV 3RMR (cIV-3RMR). Jeder dieser Indizes wird durch den Anteil von reduziert auf die Gesamtzahl einer gegebenen Komponente berechnet. Zum Beispiel wäre der 3RMR von cIII das Verhältnis von reduziertem cIII zur Gesamtanzahl cIII im Gewebe (cIII-R/(cIII-O+CIII-R)). Das gleiche Muster gilt für cIV. Daher würde 3RMR-cIII das Verhältnis von reduziertem cIII zur Gesamtmenge von cIII bezeichnen, und 3RMR-cIV das Verhältnis von reduziertem cIV zur Gesamtmenge an cIV. Durch Regressionsanalyse werden entweder mitochondriale Redoxzustände (mito-3RMR) unter Verwendung von spektralen Bibliotheken intakter Mitochondrien berechnet, oder einzelne komplexe Redoxzustände (cIII-3RMR und cIV-3RMR) werden mit cIII- und cIV-Spektralbibliotheken berechnet. Eine aktuelle Veröffentlichung⁹ zeigte, dass Mito-3RMR repräsentativ für den gewichteten Durchschnitt der cIII- und cIV-Redoxzustände (oder cIII-3RMR und cIV-3RMR) ist. Es ist wichtig zu beachten, dass cI und cII weder Raman-aktiv noch resonant verstärkt über die 441-nm-Wellenlänge sind. Folglich werden sie bei der Berechnung des Mito-3RMR nicht berechnet.

Unter Nutzung dieser Arten von 3RMR definieren wir den optimalen Bereich von 3RMR. In "gesunden" Organen sind die Mitochondrien intakt und verfügen über ausreichende Sauerstoffversorgung. Im Gegensatz dazu können beschädigte Organe eine unzureichende Sauerstoffzufuhr oder -nutzung aufweisen, wodurch ETC-Komplexe Elektronen ansammeln. Die Elektronenansammlung verursacht "reduktive Spannung", wodurch die Mitochondrien vom oxidierten in den reduzierten Zustand verschoben werden und die 3RMR-Werte steigen. Mehrere Studien^{8, 9, 10, 11, 12}, die von Herzen und Lebern in Nagetier- und Schweinemodellen reichen, haben begonnen, den optimalen "gesunden" Bereich für 3RMR zu beleuchten, der zwischen 10 und 30 liegen soll. So untersetzten Perry et al. Säugetierherzen Hypoxie, wobei ein 3RMR von 30 % das optimale Gleichgewicht für Sensitivität und Spezifität zur Detektion von hypoxischem Gewebe⁸ lieferte. Dieser Trend wurde in weiteren Studien mit Herzgewebe^11,12 und Lebertransplantaten¹⁰ bestätigt. Außerdem zeigten Nyugen et ^al.9, dass 3RMR-Werte für Gewebe, in denen der Stoffwechsel gestoppt ist, auf sehr niedrige (oxidierte) Werte sinken, mit 3RMR-Werten (7,667 ±± 4,926) nicht transplantierbarer warm-ischämischen Lebern nach 3 Stunden normotherm Maschinenperfusion, verglichen mit 3RMR-Werten über 10 (~12–15) für frische und transplantierbare warm-ischämische Lebern⁹.

Über diese Demonstrationen hinaus, wie 3RMR die Gewebelebensfähigkeit messen kann, machen die Sensitivität, Spezifität und Benutzerfreundlichkeit von RRS es für viele andere Forschungsarten sehr anwendbar, bei denen der zelluläre Stoffwechsel und die mitochondriale Funktion beeinflusst sind. In früheren Studien wurde RRS eingesetzt, um Makuladegeneration und Glaukom bei Mäusen zu erkennen, indem die metabolische Aktivität von unmyelinisierten Axonen von retinalen Ganglienzellen am Sehnervkopf¹³ bewertet wurde. Zusätzlich wurde es verwendet, um eine Koarktation der Aorta (CoA) in einem Rattenmodell der angeborenen Herzerkrankungen nachzuweisen, eine Diagnose, die bei Neugeborenen-Herzuntersuchungen^oft übersehen wird. Diese Technologie wurde genutzt, um die Organfunktion und -viabilität unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu verstehen, die im Bereich der Organtransplantation relevant sind, einschließlich Studien, die die Organlebensfähigkeit auf ex vivo Maschinenperfusion^10,11 bewerten, die Reoxygenierung poststatische Kaltlagerung^bewerten oder Reperfusionsschäden von warmischämischen Lebern mindern⁹.

Dieses Papier zielt darauf ab, RRS als ein Echtzeit-sensibles Instrument zur Bewertung der Mitochondriengesundheit zu etablieren. Ganze Lebern aus einem Rattenmodell wurden als Belastungstest unterschiedlich stark auf Ischämie und Sauerstoffreperfusion untersucht, um die mitochondriale Reaktion zu bewerten. Bei diesem Sauerstoff-Stresstest werden frische Lebern 5 Minuten initialem Perfusionsfluss, 5 Minuten Ischämie und 5 Minuten Reperfusion unterzogen. Während des gesamten Stresstests wurden 3RMR-Messungen sowie Laktat-, K+- und Sauerstoffpartialdruckmessungen (pO2) durchgeführt. Eine schnellere Reaktion auf Veränderungen der Sauerstoffversorgung wurde mit 3RMR im Vergleich zu herkömmlichen Blutgasanalyten beobachtet. Mit diesen Experimenten wird der Einsatz von RRS nicht nur für mechanistische Studien, sondern auch als diagnostische Methode sowie als therapeutisches Testfeld hervorgehoben. Daher kann das gemeinsame Protokoll für verschiedene Forscher, die mit Mitochondrien arbeiten, nützlich sein. Insgesamt könnte RRS mit seiner nichtinvasiven, Echtzeit- und hochspezifischen Natur einen erheblichen Einfluss auf den zellulären Stoffwechsel haben.

Protokoll

Alle Tiere für die Experimente wurden gemäß den Richtlinien des National Research Council gehalten und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Massachusetts General Hospital (Boston, MA, USA) genehmigt.

1. Einrichtung und Nutzung von RRS

1. Gerätebeschreibung:
   HINWEIS: Das tragbare RRS-System (Pendar Technologies; das Produkt dient ausschließlich Forschungszwecken) verwendet einen 441-nm-Laser, da das Raman-Spektrum mitochondrialer Cytochrome mit dieser Wellenlänge resonant verstärkt wird. Der Laser arbeitet zwischen 4 mW und 8 mW.
   1. Verbinden Sie eine Laseranregungsquelle über ein Glasfaserkabel mit einer speziell gebauten Sonde. Die Sonde richtet einen 2 mm großen Laserpunkt auf das Gewebe und sammelt zudem das emittierte Spektrum. Das Spektrum passiert dann einen Bandpassfilter und wird von einem Charge-Coupled Device (CCD)-Array erfasst. Das Spektrum wird jede Sekunde über einen Zeitraum von 180 Sekunden gesammelt und gemittelt, um ein rohes, rauschreduziertes Spektrum für die Analyse zu erzeugen.
   2. Die Software vergleicht dieses erhaltene Spektrum mit vorgemessenen Spektralbibliotheken mittels einer Regressionsanalyse.
2. Verfahren für Voraufnahme-Bibliotheken
   HINWEIS: Für die in diesem Artikel vorgestellten Experimente wurden reduzierte und oxidierte Formen von Mitochondrien, Bibliotheken des Komplexes III sowie des Komplexes IV, Hämoglobins und Myoglobins erstellt und genutzt. Die RRS-Signale aller Bibliotheken wurden in einer Black Box bei Raumtemperatur (21 °C) empfangen. Diese Bibliotheksdateien werden separat mit der Analysesoftware bereitgestellt. Je nach interessierendem Gewebe und dem Vorhandensein anderer Raman-aktiver Moleküle könnten jedoch auch andere Bibliotheken geschaffen werden, indem das folgende Protokoll entsprechend angepasst wird. Rohe RRS-Spektren der Hämoglobin-, Myoglobin- und oxidierten/reduzierten Komplex-III/IV-Bibliotheken werden bereitgestellt in Ergänzende Abbildung 1.
   1. Hämoglobinbibliotheken (Ergänzende Abbildung 1C):
      1. Frisches Nagetierblut durch Tierexsanguination sammeln. Oxygenieren Sie das gesammelte Blut mit 100 % Sauerstoff oder deoxygenieren Sie es mit 100 % Stickstoff in einer Glascuvette und fügen Sie Natriumdithionat hinzu.
      2. Messen Sie die RRS jedes Zustands 10 Minuten lang durch die Glaskuvettewand, wobei die RRS-Sonde 9 mm von der Glascuvette entfernt positioniert ist.
      3. Verwenden Sie spektrale Peaks bei 1356 ^cm-1 , um den sauerstoffarmen Zustand zu überprüfen, und verwenden Sie Peaks bei 1376 ^cm-1 , um den sauerstoffreichen Zustand zu bestätigen.
   2. Reduzierte/oxidierte mitochondriale Bibliotheken (Abbildung 1)
      1. Isolieren Sie Mitochondrien aus homogenisierten und gereinigten Nagetierherzen in einer Glascuvette. Platzieren Sie die Raman-Sonde 9 mm von der Glaskuvette entfernt und messen Sie die Spektren dieser Mitochondrien durch die Glaswand.
      2. Schaffen Sie vollständig oxidierte Bedingungen, indem Sie den Mitochondrien einen 100%igen Sauerstofffluss zuführen. Überprüfen Sie den oxidierten Zustand durch das Fehlen des reduzierten RR-Peaks bei 1357 ^cm-1.
      3. Schaffen Sie vollständig reduzierte Bedingungen, indem Sie die Mitochondrien 100 % Stickstoff mit kleinen Mengen Schwefelwasserstoff aussetzen. Verifizieren Sie die reduzierten Bedingungen durch das Fehlen eines oxidierten RR-Marker-Peaks bei 1371 ^cm-1.
   3. Oxidierter/reduzierter Komplex III/IV (Ergänzende Abbildung 1A,B):
      1. Isoliere Komplex III und IV, wie anderswo beschrieben 9,15,16,17. Kurz gesagt, verwenden Sie eine Lagerprobe isolierter Mitochondrien (entsprechend 200 Nanomol Cytochrom a) als Ausgangsmaterial.
      2. Verdünnen Sie die Mitochondrien auf 10 nmol Cytochrom A/mL im eiskalten Puffer C (50 mM Tris, 1 mM MgSO_4, pH 8,45). Dann geben Sie 10 % mit W/v n-β-D-Dodecyl-Maltosid (DM) tropfen für tropfen zu einer Endkonzentration von 1 %, während Sie vorsichtig auf Eis mischen.
      3. Zentrifugieren Sie den Extrakt bei 40.000 × g für 40 Minuten bei 4 °C. Trage das Überstandsmittel auf eine 2,5 cm × 20 cm große Glassäule auf, die zuvor mit einem Austauschharz gefüllt wurde, das mit 5 Spaltenvolumina Puffer C (mit 0,02 % w/v DM) ausgeglichen ist.
      4. Nach dem Waschen mit 2 Säulenvolumina des Puffers C elutieren mitochondriale Komplexe durch Anwendung eines linearen NaCl-Gradienten von 0–400 mM im selben Puffer und sammeln das Elut in 4 mL-Fraktionen.
      5. Grüne Fraktionen, die Komplex IV enthalten, eluierten nahe der Mitte des Gradienten (~180 mL NaCl), vor den rötlichen Brüchen mit Komplex III. Konzentrieren Sie die zusammengefassten Fraktionen, die jeden Komplex enthalten, auf 20–30 nmol Cytochrom a/mL.
      6. Sobald die einzelnen Komplexe isoliert wurden, setzen Sie jeden oxidierenden und reduzierenden Bedingungen aus. Reduzieren Sie eine 11 mM große Probe des Komplexes III im Tris-Puffer mit 2 mL Ascorbat (1 M), um Cytochrom c1 und 2 mL HS (Hydrosulfit) zu reduzieren, um Cytochrome b_L und b_H vollständig zu reduzieren.
      7. Reduzieren Sie eine 18,67 mM lange Probe des Komplexes IV im Tris-Puffer in mehreren Schritten, da Komplex IV einen mehrstufigen katalytischen Oxidationsprozess durchläuft. Um den komplexen IV vollständig zu reduzieren, fügen Sie zwei 2 mL H₂O₂ (10 mM) hinzu, gefolgt von 2 mL HS.
      8. Sammle nach jeder Addition Bibliotheksspektren, um jeden Schritt des Zyklus zu erfassen. Fügen Sie vollständig oxidierte und reduzierte Spektren zur endgültigen Referenzbibliothek hinzu, um die stationären Zustände des komplexen IV darzustellen.
      9. Bereiten Sie alle Proben in einem 1-mL Glasfläschchen vor, halten Sie sie in einer festen Position 9 mm von der Sondenlinse entfernt und schließen Sie sie in eine schwarze Box, um Lichtkontamination zu verhindern. Sammeln Sie RRS-Spektren für 600 s für jeden Komplex und Oxidationszustand.
      10. Validieren Sie die Reinheit von isolierten cIII und cIV, wie zuvor^{beschrieben 17}, und validieren Sie die Angemessenheit isolierter cIII- und cIV-Spektralbibliotheken zur Erklärung der vollständigen mitochondrialen Spektren, wie sie in einer aktuellen Studie beschrieben^sind. 9.
   4. Myoglobinbibliotheken (Ergänzende Abbildung 1D):
      1. Mit ähnlichen Sauerstoff- und Stickstoffflüssen (mit gelöstem Natriumdithionit) variieren Sie die Oxymyoglobinsättigung des myokardialen Myoglobinextrakts zwischen 0 % und 100 %. Überprüfen Sie die Raman-Spektren durch Markierungsspitzen bei 1355 ^cm-1 und 1376 ^cm-1.

HINWEIS: Die oben beschriebenen spektralen Komponenten, wie Hämoglobin oder oxidierte/reduzierte Mitochondrien, sind hämhaltige Moleküle und werden mit derselben Wellenlänge angeregt. Dieses RRS-System vermeidet Signalüberlappungen, indem es für jedes Molekül eine Regressionsbibliothek basierend auf seinem einzigartigen spektralen Signal erstellt. Die erhaltenen gestreuten Spektren werden durch einen Regressionsalgorithmus gegen die ausgewählten Bibliotheken durchgeführt. Der Regressionsalgorithmus liefert für jedes Bibliotheksspektrum einen Faktor, der die bestpassende Schätzung seines relativen Beitrags im aufgezeichneten Spektrum und damit seiner relativen Konzentration im Gewebe darstellt. Da der Algorithmus die beste Anpassung über einen Bereich von Wellenzahlen verwendet, ermöglichen kleine Unterschiede in der Position oder Intensität der spektralen Peaks der verschiedenen Bibliothekskomponenten der Regression, selbst eng verwandte Chromophoren zu erkennen. Durch den Regressionsalgorithmus und Spektralbibliotheken kann das RRS-System das gesamte, gestreute Signal je nach ihren einzigartigen spektralen Peaks in verschiedene Komponenten zerlegen und so Signalüberlappungen durch hämhaltige Moleküle vermeiden. Um die Beziehung zwischen Hämoglobin und Mitochondrien zu zeigen, ist die ergänzende Abbildung 2 enthalten, die Bilder von Spektren aus einer Leberperfusion zeigt, aufgeteilt in das gemessene Signal, die Linie der besten Passung und den unerklärten Rest, der durch Unterschiede in den einzelnen spektralen Peaks entsteht. In Panel A werden reduzierte und oxidierte Hämoglobinbibliotheken sowie reduzierte und oxidierte Mitochondrienregressionsbibliotheken ausgewählt. Die Linie der besten Passung, die durch die Bibliotheken und die Regressionsanalyse kuratiert wird, überschneidet sich sauber mit dem gemessenen Signal, und es gibt kaum unerklärte Residuen. In Panel B werden nur oxidierte und reduzierte Mitochondrienbibliotheken ausgewählt. Da eine große, unerklärliche Reststruktur vorliegt, ist der mitochondriale spektrale Peak um mehrere Wellenzahlen von dem des Hämoglobins verschoben, das in der Regressionsanalyse nicht berücksichtigt wurde. Darüber hinaus erklären die Autoren in den ergänzenden Abbildungen von Nguyen et al. ⁹ die Beziehung zwischen Mitochondrien und den einzelnen Komplexen (cIII und cIV) sowie die Beziehung zwischen einzelnen Komplexen¹⁶, wobei Komplex III schärfere, niedrigfrequentere Spitzen aufweist, während Komplex IV breitere, hochverschobene Bänder aufweist. Außerdem zeigen die Autoren, dass die reduzierten Bibliotheken des Komplexes III und Komplex IV das gemessene Spektrum der reduzierten ganzen Mitochondrien vollständig erklären, was zu minimalen unerklärten Residuen führt.

Abbildung 1: Spektralbibliotheken vollständig oxidierter und reduzierter Mitochondrien. RRS-Bibliotheksspektren wurden erhalten, nachdem isolierte Mitochondrien mit (A) 100 % Sauerstoff bzw. 100 % Stickstoff (B) versorgt wurden, um oxidierte bzw. reduzierte Zustände zu erreichen. Diese Zustände wurden durch das Vorhandensein von RR-(C)-oxygenierten und reduzierten (D)-Marker-Peaks bestätigt. Die Verschiebung dieser Spitzen entspricht Veränderungen der molekularen Schwingungsmoden in Anwesenheit von Sauerstoff. Die Intensität jedes Peaks wird auf eine beliebige Intensitätseinheit (AU) normalisiert, da die Verstärkung des reduzierten Zustands unter Verwendung dieser 441 nm Anregungswellenlänge größer ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

2. Datenerhebung mittels RRS

1. Geräteeinrichtung:
   1. Verbinden Sie das Spektrometergerät (in einer kompakten Box untergebracht) mit dem Gleichstrom (DC) und mit dem Netzteil über die mitgelieferten Kabel. Die Spektrometereinheit besitzt einen runden Plug mit Ausrichtungseindrücken.
   2. Richten Sie die Vertiefungen des runden Steckers mit denen des Kabels aus, das an den Netzteil angeschlossen wird. Vor dem Anschluss der Ports ist keine Reinigung erforderlich.
   3. Schließen Sie den Computer, der die Analyse durchführt, mit demselben Netzadapter an, der auch das Spektrometer und die Stromversorgung mit den mitgelieferten Kabeln verbindet.
   4. Setze die Lasersonde in den Halter der Sonde. Passen Sie die Position dieser Sonde zu Beginn des Experiments an.
   5. Öffnen Sie die Spektrometer-Steuerungssoftware (Cellular Energetics Software).
2. Software-Einrichtung:
   HINWEIS: Einstellungsdateien und Regressionsbibliotheken für verschiedene Gewebetypen werden dem System mitgeliefert. Diese Dateien enthalten Informationen darüber, welche Bibliotheken das RRS-System in der Regression enthalten sollte, wie viele Spektren im Regressionsfenster enthalten sind und weitere Parameter wie die Laserleistung. Standardeinstellungen können geändert und eine neue Einstellungsdatei für zukünftige Experimente gespeichert werden. Screenshots der unten beschriebenen Software sind in ergänzender Abbildung 3 dargestellt.
   1. Beim Öffnen der Spektrometer-Steuerungssoftware erscheint ein Diagramm mit Prozent 3RMR, Sauerstoffsättigung (StO₂) und Myoglobinsättigung. Auf diesem Bildschirm werden diese Kennzahlen, falls ausgewählt, in Echtzeit während der Messungen angezeigt. Klicken Sie auf den Tab Einstellungen unten links auf der Seite.
   2. Unter dem Info-Tab geben Sie die Sitzungsinformationen unter Sitzungsnamen ein und alle notwendigen Details unter dem Reiter Sitzungsbeschreibung .
   3. Es gibt zwei Modi zur Datenerfassung. Verwenden Sie den Spot-Check-Modus , um Spektren zu sammeln, bis bestimmte Qualitätsmetriken erreicht sind (z. B. Ziel-Sigma oder Regressionsfenster/Anzahl der Spektren), und beenden Sie die Aufzeichnung. Verwenden Sie den kontinuierlichen Modus, um Spektren aufzunehmen, bis die Stopptaste gedrückt wird. In beiden Modi werden alle Daten, sowohl 3RMR-Ergebnisse als auch einzelne Spektren, automatisch gespeichert. Dieses Experiment nutzt den kontinuierlichen Modus.
   4. Sobald alle Sitzungsinformationen eingegeben sind, klicken Sie auf den Reiter System .
   5. Wählen Sie unter Settings File das für das Projekt geeignete Protokoll aus (für azelluläre Rattenleberperfusionen wählen Sie das Rat Liver Acellular Protocol). Dies passt automatisch den Messtyp, die durchschnittliche Messlänge (Regressionsfenster) sowie das Zielsigma an.
      1. Um eine neue Einstellungsdatei zu erstellen, passen Sie eine der oben genannten Komponenten an und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Speichern . Diese Parameter sollten als separate Einstellungsdatei gespeichert werden, die dann ins System importiert werden kann.
      2. Um eine neue Einstellungsdatei zu importieren, klicken Sie auf das Dropdown-Menü neben Default (Mod) und wählen Sie die Datei Neue Einstellungen importieren. Klicken Sie auf die neue Einstellungsdatei , um importiert zu werden.
   6. Unter Regressionsbibliotheken wählen und bestätigen Sie die Kombination der Bibliotheken, die für Datenerfassung und -analysen verwendet werden sollen. Die Bibliotheken für reduzierte und oxidierte Mitochondrien [nur Mito] wurden für dieses Experiment ausgewählt. Andere Nutzer können sich entscheiden, Bibliotheken zu verwenden, die auch Hämoglobin, Myoglobin oder andere Komplexe unter der Erweiterten Bibliothek enthalten.
   7. Wählen Sie den bevorzugten Fensterbreitenmodus aus und bestätigen Sie.
      1. Adaptiver Breitenmodus: Verwenden Sie den adaptiven Breitenmodus , um einzelne Spektren zum gemittelten Spektrum hinzuzufügen, bis das maximale Sigma-Ziel erreicht ist. Wenn das Sigma-Ziel nicht erreicht wird, wird die Aufzeichnung gestoppt, sobald sie die obere Grenze des gesetzten Regressionsfensters erreicht (d. h. die maximale Anzahl der Spektren, die ihm aufgezeichnet wurde). Die Messergebnisse werden auf dem Bildschirm angezeigt, nachdem das Mindest-Sigma-Ziel erreicht wurde.
      2. Modus mit fester Breite: Verwenden Sie den Modus mit fester Breite , um einzelne Spektren zum gemittelten Spektrum hinzuzufügen, bis die Zielanzahl der Spektren (unter der durchschnittlichen Länge eingestellt) enthalten ist.
   8. Sobald die Systemeinstellungen abgeschlossen sind, klicken Sie auf den Reiter Plot .
   9. Wählen Sie unter Hauptreihe die Komponenten aus, die während der Messungen auf dem Bildschirm angezeigt und angezeigt werden.
   10. Bestätigen Sie, dass alle ausgewählten Messkomponenten dem relevanten Protokoll entsprechen.
3. Datenerfassung:
   HINWEIS: Raman-Messungen sollten in einem dunklen Raum durchgeführt werden. Vor Beginn der Datenerhebung sollten Sie sicherstellen, dass der Arbeitsplatz so licht wie möglich geschützt ist. Wenn der Raum nicht vollständig von Licht abgeschirmt werden kann, wird das RRS-System mit einer schwarzen Abdeckung mit einer rechteckigen Öffnung in der Mitte geliefert (siehe in Abbildung 2), durch die die Lasersonde platziert werden kann. Die Box kann die Probe/den Bereich des Organs abdecken, aus dem RRS-Messungen entnommen werden. Bei der Arbeit mit dem RRS-Laser sollten Sie direkte oder längere Augenexposition vermeiden. Blenden Sie keinen Laser direkt ins Auge oder auf reflektierende Oberflächen. Aktiviere den Laser nur, wenn er direkt auf dem interessierenden Gewebe positioniert ist. Der RRS-Laser ist ein Klasse 3R-Laser bei 4 mW und Klasse 3B bei 10 mW. Der Laser ist sicher für Gewebekontakt.
   1. Wählen Sie die passenden, vorgespeicherten Einstellungen, Aufnahmeparameter und Bibliotheksdateien aus.
   2. Platziere die Lasersonde direkt über dem interessierten Gewebe/Organ. Positioniere die Sonde so senkrecht wie möglich und 1 cm vom Gewebe entfernt. Verwenden Sie ein Lineal, um genau 1 cm von der Oberfläche des Orgels zu messen. Stellen Sie die Sonde so ein, dass sie näher als 1 cm entfernt ist, wenn das Signal nicht klar ist. Achten Sie jedoch darauf, dass die Sonde das Gewebe niemals berührt.
      HINWEIS: Die Sonde kann auch von Hand gehalten werden, aber es wird empfohlen, einen verstellbaren Sondenhalter/-ständer zu verwenden, der stabil bleibt. Positioniere die Sonde so senkrecht wie möglich und 1 cm vom Gewebe entfernt. Ein Lineal konnte verwendet werden, um genau 1 cm von der Orgeloberfläche zu messen. Die Sonde könnte so eingestellt werden, dass sie näher als 1 cm entfernt ist, wenn das Signal nicht klar ist. Die Sonde sollte jedoch niemals das Gewebe berühren.
   3. Bestätigen Sie, dass der Laserpunkt am linken lateralen Lappen liegt, so nah wie möglich an der Pfortvene.
   4. Bestätigen Sie, dass alle ausgewählten Bibliotheken, Regressionseinstellungen, Ziel-Sigma, Regressionsfenster und Erwerbsmodi korrekt und wie gewünscht sind.
      1. Achte darauf, dass der Raum so dunkel wie möglich ist. Überprüfen Sie, dass die Sonde keine Kontamination, insbesondere Blut, am Fenster aufweist. Im Falle einer Kontamination verwenden Sie ein fusselfreies, nicht abrasives Tuch mit 70 % Isopropylalkohol, um das Quarzfenster zu reinigen, gefolgt von gründlichem Trocknen mit einem trockenen Tuch, bevor Sie fortfahren.
      2. Bei starker Kontamination wischen Sie die Sonde so gründlich wie möglich ab, wie oben beschrieben. Kalibriere dann das Gerät, indem du den Laser in ein dunkles Gehäuse mit schwarzem Klebeband stellst und den Take Dark-Knopf drückst. Die Kalibrierung dauert etwa 5–10 Minuten. Unabhängig von Kontamination kalibrieren Sie das Gerät einmal im Monat, und es sendet automatische Erinnerungsnachrichten.
         HINWEIS: Die Erläuterungen jeder Qualitätskontrollmetrik, Beispiele solcher QC-Metriken sowie das rohe spektrale Signal, das aus optimalen und suboptimalen Aufzeichnungen gewonnen wird (Supplementary File 1, Abbildung 3, Supplementary Abbildung 3). Diese Qualitätskontrollkriterien wurden für ganze Lebern aus dem Rattenmodell optimiert. Jedes neu entwickelte Protokoll, das ein anderes Organ-/Tiermodell verwendet, sollte diese Metriken entsprechend verfeinern und anpassen.
   5. Klicken Sie auf der Hauptseite auf die Start-Taste, um mit der Datenerhebung zu beginnen. Je nach gewählten Einstellungen nimmt die Software Aufnahmen auf, bis der Zielfehlerwert (Sigma) oder 180 Sekunden erreicht ist. Die Datenerfassung ist nun abgeschlossen.
      1. Aus diesen Diagrammen und Werten werden die Qualität des RRS-Signals abgeleitet, um eine Anpassung der Sondenposition oder der Messbedingungen zu ermöglichen (Abbildung 3). Wenn das erhaltene RRS-Signal diese Qualitätskontrollkriterien nicht erfüllt, wird die Sonde so senkrecht wie möglich und etwa 9 mm von der Oberfläche bis zum Sondenfenster eingestellt.
   6. Sobald das Datenerfassungs- bzw. experimentelle Protokoll abgeschlossen ist, entsorgen Sie die gesamte Leber/das gesamte Gewebe in einen Biohazard-Behälter. Reinige jedes System oder jede Oberfläche, die mit dem Organ/Gewebe in Kontakt war, mit 70 % Ethanol.
      1. Bei der Arbeit mit einem Perfusionssystem werden DI-Wasser mit enzymatischem Reiniger (7,8 ml verdünnt in 1 L deionisiertem [DI]-Wasser, gefolgt von sauberem DI-Wasser, betrieben.
         HINWEIS: Jede Aufnahme wird als separate Analysedatei unter einer neuen Sitzungsdatei gespeichert. Ergebnisse für 3RMR und mitochondriale Signalstärke (r3RMR) werden im Hauptfenster dargestellt. Das Rohspektrum kann ebenfalls dargestellt werden. Weitere Qualitätskontrollkennzahlen, wie Restsignalstärke und Gesamtsignalstärke, werden unter dem Reiter Spectrum angezeigt.
4. Datenanalyse:
   1. Sobald die Datenerfassung abgeschlossen ist, klicke auf den Review-Ordner am unteren Bildschirmrand, um die experimentelle Datei zu öffnen und die Ergebnisse zu sehen.
   2. Alternativ können Sie eine Textdatei mit den Ergebnissen öffnen. Wählen Sie die interessante Sitzungsdatei aus. Eine Analysedatei mit allen erhaltenen Messungen öffnet sich. Jeder Parameter und sein Sigma-Wert haben eine eigene Spalte. Zum Beispiel werden 3RMR-Werte, die jede Sekunde erhalten werden, unter der Spalte "3RMR" aufgeführt, und ihr Sigma-Wert unter "sigma_3RMR".
   3. Die letzte Zeile jeder Spalte enthält die Endwerte für jeden Parameter dieser Sitzungsdatei. Verwenden Sie diesen Wert zum Plotten.
   4. Wiederholen Sie die Schritte für jede Sitzungsdatei/jede Aufnahme. Die Werte wurden wie gewünscht dargestellt.

Abbildung 2: Einrichtung des RRS-Geräts. Ein Schaltplan des RRS-Systemaufbaus. Die Sonde ist über ein Glasfaserkabel mit dem RRS-System verbunden, das die Laseranregungsquelle und das Spektrometer enthält. Dieses Setup verbindet sich dann mit jedem Laptop, der die Spektrometer-Steuerungs-App für Datenerfassung und -analyse enthält. Sowohl der Computer als auch das Spektrometergerät sind an eine Steckdose angeschlossen. RRS-Messungen sollten im Dunkeln durchgeführt werden. Wenn der Raum nicht vollständig vor Licht abgeschirmt werden kann, verfügt das RRS-System über eine schwarze Abdeckung mit einer rechteckigen Öffnung in der Mitte, an der die Lasersonde platziert werden kann. Die Box umfasst die Probe/den Bereich der Orgel, von der aus die RRS-Messungen entnommen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Beispielspuren und Qualitätskontrollkennzahlen für suboptimale und optimale Qualitätsspuren. Das Restsignal (Rauschen) ist mit einer orangen Klammer markiert, das mitochondriale Signal mit einer grünen Klammerung. (A) Beispielspur aus einem suboptimalen Raman-Signal. Das Restsignal ist zu groß, um sich vom mitochondrialen Signal zu unterscheiden. Spektralspitzen sind im gesamten gemessenen Signal nicht zu unterscheiden. (B) Beispielspur aus dem optimalen Raman-Signal. Das mitochondriale Signal ist sichtbar größer und unterscheidet sich vom Restsignal. Spektrale Peaks aus der erhaltenen Messung sind unterscheidbar. (C) QC-Metriken, die von jedem Signal erhalten werden. Insgesamt ist das insgesamt erhaltene Signal bei der suboptimalen Messung geringer als die optimale Messung. Im Vergleich zur suboptimalen Aufzeichnung werden mehr mitochondriale Signale gemessen, wobei das mitochondriale Signal jeweils 17 % bzw. 14 % des Gesamtsignals ausmacht. Das Signal wurde bei der optimalen Messung mit einem Fehler von 4,3 % gemessen, im Gegensatz zu 18,5 % bei der suboptimalen Messung. Ebenso macht das unerklärte Restsignal 11 % des Gesamtsignals in der suboptimalen Aufzeichnung aus, während es im optimalen Signal 3,6 % ausmacht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

3. Bewertung der mitochondrialen Gesundheit mittels RRS

HINWEIS: Die Resonanz-Raman-Spektroskopie (RRS)-Technologie wurde eingesetzt, um eine mitochondriale Viabilitätsmetrik (3RMR) zu entwickeln, die die Lebensfähigkeit von Transplantationsorganen angibt. Diese Studie soll zeigen, wie Veränderungen der Sauerstoffversorgung – und damit der zellulären Atmung – im Vergleich zu traditionellen Schadensbiomarkern wie Laktat und K⁺ in 3RMR-Trends widergespiegelt werden. Hier wird ein Sauerstoff-Stresstest verwendet, bei dem nach 5 Minuten kontinuierlicher Perfusion der sauerstoffhaltige Perfusionsfluss für 5 Minuten pausiert und dann für 5 Minuten fortgesetzt wird. RRS-Messungen sowie Ein- und Ausströmungsproben werden während des gesamten Stresstests durchgeführt.

1. Leberbeschaffung:
   1. Beruhige Tiere in einer Induktionskammer mit 3–5 % Isofluran. Filtern Sie überschüssigen Dampf mit Aktivkohle.
   2. Führen Sie eine vollständige Hepatektomie an männlichen Lewis-Ratten durch (150 g). Verbinde die Äste der Pfortader. Injiziere 50 Μ Natriumheparin durch die IVC. Kanylieren Sie die Pfortvene während der Operation mit einem 16-G-Katheter und spülen Sie die Leber mit 50 ml Kochsalzlösung.
   3. Legen Sie die beschafften Lebern in eine Petrischuel mit 30 ml Lösung der University of Wisconsin (UW) auf Eis.
2. Subnormotherme Machine Perfusion (SNMP) Aufbau und Resonanz-Raman-Messungen:
   1. Richte das RRS-Gerät wie zuvor beschrieben ein. Stellen Sie das Acellular Rat Liver Protocol in der Spektrometer-Steuerungssoftware ein, die automatisch den Breitenmodus auf adaptive Breite, die durchschnittliche Länge auf 180 und das Ziel-Sigma auf 1,5 setzt. Es wählt außerdem 3RMR und Fluoreszenz als Messparameter sowie Mito nur als Regressionsbibliothek aus. Stellen Sie den Erfassungsmodus auf kontinuierlichen Modus ein.
   2. Richte das SNMP-System wie an anderer Stelle beschrieben^{ein 18}.
      1. Kurz gesagt, stellen Sie sicher, dass das Perfusionssystem aus einer Perfusionskammer, einer Peristaltikpumpe, einem Membranoxygenator und einer Blasenfalle besteht.
      2. Abgabe von Sauerstoff mit einer atmosphärischen Mischung (95_{% O2} und 5 %_CO2); Halte pO₂ zwischen 400–500 mmHg. Überwachen Sie den intrahepatischen Druck mit einem Drucksensor und halten Sie ihn zwischen 3–5 mmHg. Sammeln Sie die Proben durch Probenports.
   3. Sobald die Software und das Perfusionssystem eingerichtet sind, verbinden Sie die Kanüle, die in die PV eindringt, mit dem Zuflussrohr der Perfusionsmaschine. Lassen Sie das Organ, das Perfusationsmittel und die Perfusionseinrichtung bei Raumtemperatur (21 °C) aufbewahren, ohne ein Wasserbad.
   4. Geben Sie das Perfusat über die Kanüle im PV mit einer peristaltischen Pumpe an das Organ.
      1. Zur Herstellung des Perfusats mischen Sie 500 ml Phenol-rotfreies Williams' Medium mit 5 g Bovines Serumalbumin (BSA), 12 mg wasserlöslichem Dexamethason, 5 ml Penicillin-Streptomycin, 5 ml L-Glutamin, 2,5 μL Insulin und 1000 U Heparin.
      2. Rühren Sie alle Komponenten etwa 20 Minuten auf einer Rührplatte um oder bis alle Komponenten sich aufgelöst haben. Erhöhen Sie die Perfusionsströme, um Drücke von 3–5 mmHg zu erreichen.
   5. Dann wird die RRS-Laserquelle in den Sondenhalter gelegt und 1 cm über dem größten Leberlappen positioniert, so nah wie möglich am PV. Den Perfusionsfluss nach 5 Minuten (T₅) pausieren und nach 10 Minuten (T₁₀) wieder aufnehmen. Führe den Stresstest bei 15 Minuten durch (T₁₅).
   6. Nehmen Sie während des gesamten Stresstests RRS-Messungen durch; Nehmen Sie alle 5 Minuten Ein- und Abflussmessungen vor, beginnend bei T₀ (Abbildung 4). Zeichnen Sie die 3RMR-Werte sowie die Ausflusswerte von K⁺ und Laktatwerten für T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ (n = 3) (Abbildung 5) dar.
   7. Berechnen Sie die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) bei T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ , indem Sie den Ein- und Ausflusspartialdruck von Sauerstoff (pO₂) mit dem Löslichkeitskoeffizienten von Sauerstoff im Plasma multiplizieren (0,00314). Plotten Sie die OCR für T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ (Abbildung 5).
      HINWEIS: Beispielale Resonanz-Raman-Spektralspuren bei perfizierten (T₅), ischämischen (T₁₀) und reperfierten (T₁₅) Zuständen einer Leber sind dargestellt (Abbildung 6)

Abbildung 4: Diagramm, das den experimentellen Fluss darstellt. Eine vollständige Hepatektomie wurde bei weiblichen Lewis-Ratten durchgeführt. Die beschaffte Leber wurde auf eine subnormotherme Perfusionsmaschine gesetzt und für die ersten 5 Minuten mit sauerstoffreichem Perfusat versorgt. Das Perfusat fließt durch die Pfortader in die Leber und zirkuliert durch die peristaltische Pumpe (Perfusionsfluss dargestellt mit blauen Pfeilen). Die sauerstoffreiche Perfusion wurde bei T5 für die nächsten 5 Minuten pausiert und bei T10 für weitere 5 Minuten wieder gestartet. 3RMR-Messungen wurden während des Belastungstests durchgeführt (dargestellt als Laser). Perfusatproben wurden bei T0, T5, T10 und T15 entnommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergebnisse

Frische Lebern wurden mit einem Sauerstoff-Stresstest Phasen von Ischämie und Reperfusion unterzogen. Anschließend wurden die Echtzeitänderungen des 3RMR während des Stresstests mit der Sauerstoffverbrauchsrate, dem Ausflusslaktat und dem Kalium aus der Perfusatanalyse bei T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ verglichen. Unter gesunden Bedingungen werden 3RMR-Werte zwischen 10 % und 30 % erwartet (Abbildung 5A). Wie erwartet liegen die 3RMR-Werte bei T₀ und T₅ in diesem Bereich, da die Leber zwischen diesen Zeitpunkten kontinuierlich mit sauerstoffreichem Perfusat versorgt wurde (Abbildung 5A). Der 3RMR-Wert am Ende der ischämischen Periode (T₁₀) liegt jedoch außerhalb des optimalen Bereichs (Abbildung 5A). Dieser Anstieg deutet darauf hin, dass sich die Mitochondrien in ihren reduzierten Zustand verlagern, da sich die Elektronen durch die Sauerstoffentsättigung in der gesamten Transportkette ansammeln. Bei T₁₀ wird der sauerstoffreiche Fluss wieder aufgenommen; Die Reperfusionsphase beginnt. Am Ende der Reperfusionsperiode (T₁₅) kehren die 3RMR-Werte auf optimale Werte zurück (Abbildung 5A), da die Aktivität des ETC mit der Wiedereinführung von Sauerstoff als finalem Elektronenakzeptor wiederhergestellt wird. Diese Veränderungen im Sauerstofffluss sind auch in den Rohspektren sichtbar. Rohe RRS-Spektren bei T₀ und T₁₅ weisen spektrale Eigenschaften auf, die denen oxidierter Mitochondrien ähneln (Abbildung 6A,C), wie zum Beispiel ein Spektralmarker-Peak bei 1371 ^cm-1 (Abbildung 6D,F). Ähnlich zeigen die rohen Raman-Spektren bei T₁₀ (Abbildung 6B) reduzierte RR-Marker, wie zum Beispiel einen Spektralmarker-Peak bei 1357 ^cm-1 (Abbildung 6E). Zusammenfassend identifiziert RRS die Verschiebungen der mitochondrialen Redoxzustände in Echtzeit, was sowohl im rohen spektralen Signal als auch als Maßstab für die mitochondriale Gesundheit (3RMR) nachgewiesen wird.

RRS kann auch 3RMR-Werte basierend auf den Redoxzuständen cIII und cIV berechnen. Ein ähnliches Muster wurde in den cIII- und cIV-3RMR-Werten beobachtet (Abbildung 5B). Bei T₀ wurden vollständig oxidierte 3RMR-Werte für cIV und 3RMR-Werte im optimalen Bereich für cIII beobachtet. Dieses Redox-Gleichgewicht zwischen den Komplexen ist physiologisch, da Elektronen von cIII zu cIV fließen und schnell oxidiert werden. Beim Beginn der Ischämie wurde ein Anstieg der 3RMR-Werte für jeden Komplex beobachtet. Während der ischämischen Periode erhöht eine Ansammlung von Elektronen durch das ETC die reduktive Spannung auf cIII und cIV, was wiederum cIII-3RMR und cIV-3RMR erhöht. Bei der Wiedereinführung von Sauerstoff sinken jedoch die 3RMR-Werte beider Komplexe wieder auf optimale Werte: vollständig oxidierte cIV und physiologisch reduzierte cIII (Abbildung 5B). Die 3RMR-Trends in beiden Komplexen zeigen, dass die Sauerstoffaufhörung das gesamte ETC beeinflusst und kein einzelner Komplex besonders anfällig für No-Flow-Ischämie ist.

Andererseits spiegelten sich die Veränderungen in der Sauerstoffdynamik nicht in Schadensbiomarkern und Blutgasanalyten wider, die aus der Perfusatanalyse gewonnen wurden. Beim Beginn der Ischämie wird erwartet, dass Laktat und K⁺ steigen, da die Zelle auf aerobe Atmung angewiesen ist und langsam abbaut, um interzelluläres K⁺ freizusetzen. Wir erwarten außerdem, dass die OCR abnimmt, da die Zellen nicht genügend Energie produzieren, um die zelluläre Atmung fortzusetzen. Selbst nach einer Phase ohne Durchfluss-Ischämie zeigten die Sauerstoffverbrauchsraten keine Anzeichen von Schäden. Der Ausfluss von Laktat- und K^+- Werten bleibt während des gesamten Belastungstests trotz der Veränderungen der Sauerstoffversorgung (Abbildung 5D–E) relativ konstant.

Abbildung 5: Veränderungen der 3RMR und Schadensbiomarker während des Sauerstoffstresstests. Beginn von Ischämie und Reperfusionsphasen werden durch gestrichelte Linien bei Minuten 5 bzw. 10 dargestellt. Zusätzlich werden Phasen des sauerstoffhaltigen Flusses mit blauen Linien dargestellt, und Perioden der Ischämie mit roten Linien. (A) 3RMR-Werte während des gesamten mitochondrialen Tests. Die 3RMR-Werte steigen, wenn der sauerstoffhaltige Fluss pausiert wird, und sinken bei Wiederaufnahme des Flusses wieder auf optimale Werte. (B) 3RMR-Werte von Komplex III und Komplex IV. Das Stoppen des Durchflusses führt zu einer Verringerung beider Komplexe. (C) Durchschnittliche Ausflusswerte K⁺ während des Stresstests. K^+-Werte bleiben während des gesamten Stresstests konstant, trotz Veränderungen in der Sauerstoffdynamik. (D) Durchschnittlicher Abfluss von Laktathalten während des Stresstests. Die Laktatproduktion bleibt während des gesamten Stresstests konstant. (E) Sauerstoffverbrauch bei T₀, T₁₀, T₁₅. Da pO2-Werte flussbasierte Messungen sind, könnte OUR für eine Periode ohne Flussischämie nicht berechnet werden. Es wurden keine signifikanten Veränderungen beobachtet (p-Wert: 0,2500) (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Beispielhafte rohe spektrale Spuren einer frischen Rattenleber während des Stresstests. Vollständige spektrale Profile einer Leber in (A) oxidierten, (B) ischämischen und (C) reperfierten Zuständen. Der Wechsel vom sauerstoffreichen RR-Marker zum reduzierten RR-Marker ist sichtbar, wenn man auf den spektralen Gipfel der Mitochondrien zoomt, der in jedem Spektralprofil mit einem roten Feld markiert ist. (D–F) Oxidierte RR-Markerspitzen (1371 ^cm-1) befinden sich in (D) oxidierten und (F) reperfierten Zuständen und sind mit einer roten gestrichelten Linie markiert. Der reduzierte RR-Marker-Peak (1357 ^cm-1) ist im (E)-ischämischen Zustand vorhanden und mit einer blau gestrichelten Linie markiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Abbildung 1: Spektrale Spuren von reduziertem und oxidiertem Komplex III, Komplex IV, Hämoglobin und Myoglobin. (A) C-OmplexIII, (B) Komplex IV, (C) Hämoglobin und (D) Myoglobin. Die Regressionsanalyse vergleicht die gesammelten Spektren mit diesen Spektralbibliotheken (sofern ausgewählt) und liefert für jedes Bibliotheksspektrum einen Faktor, der die beste Schätzung seines relativen Beitrags im aufgezeichneten Spektrum und damit seiner relativen Konzentration im Gewebe darstellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Beispiel für die Nutzung von Regressionsbibliotheken zur Zerlegung überlappender hämhaltiger Moleküle (Hämoglobin und oxidierte/reduzierte Mitochondrien). (A) Rohe spektrale Spuren aus Lebergewebe, das mit zellulärem Perfusat perfundiert wurde, mit allen notwendigen Regressionsbibliotheken wie Hämoglobin, oxidiertem Hämoglobin, reduzierten Mitochondrien und oxidierten Mitochondrien, wurden ausgewählt. Es ist klar, dass die Linie der besten Passung, abgeleitet aus den Bibliotheken und der Regressionsanalyse, sauber mit dem gemessenen Signal überlappt, mit wenig unerklärlichen Residuen. (B) Rohe spektrale Spur desselben Gewebes, jedoch mit ausschließlich oxidierten und reduzierten Mitochondrienbibliotheken. Da es eine große, unerklärte Reststruktur gibt, ist klar, dass der mitochondriale spektrale Peak um mehrere Wellenzahlen gegenüber dem des Hämoglobins verschoben ist, das in der Regressionsanalyse nicht berücksichtigt wurde. Diese Abbildung zeigt, dass das hochauflösende Spektrometer und die Regressionsanalyse des gesamten Spektrums in der Lage sind, eng verwandte Spektren zu unterscheiden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Bildschirmaufnahmen der Software. (A) Hauptfenster, das Messwerte über die Zeit hinweg anzeigt. 3RMR, StO2 und alle anderen ausgewählten Serien werden hier während der Messung angezeigt. Zusätzlich wird die Signalstärke jeder Serie als gestrichelte Linie im Diagramm angezeigt und ein Wert darunter auf der rechten Seite des Bildschirms. Zum Beispiel stellt die hier erfasste Durchschnittslinie das 3RMR eines Gewebes dar, und die gestrichelte Linie stellt r3RMR (Signalstärke von 3RMR) dar. Wenn man die Qualität der aufgenommenen Spektren sehen wollte, konnte man auf den Reiter "Spektrum" anzeigen (lila eingekreist) klicken. (B) Bildschirm, der die rohen Spektren des Gewebes anzeigt. Dies ist der Tab, in dem man die Qualität des Signals anhand der Stärke der gemessenen Spektren im Vergleich zum Restrauschen bewerten kann. (C) Tab, der Trends in Serien im gesamten Experiment zeigt. Wenn beispielsweise während eines Experiments mehrere 3RMR-Messungen durchgeführt werden, wird jede Messung zeitlich in diesem Tab angezeigt. Trends in anderen Serien, falls ausgewählt, werden hier ebenfalls angezeigt. Dieser Tab konnte durch Klicken auf die Schaltfläche Trends auf dem Hauptbildschirm (grün auf A eingekreist) aufgerufen werden. (D) Info-Reiter, in dem man experimentelle Informationen wie Sitzungsnamen und -beschreibung eingeben kann. (E) System-Reiter, wo man vorinstallierte Protokolle hochladen kann. Wenn beispielsweise das Protokoll LiverContAcell ausgewählt wird, legt dieses Protokoll die Regressionsbibliothek, das Zielregressionsfenster und das Sigma gemäß dem azellulären Perfusionsprotokoll für Rattenlebern fest. Um ein Protokoll zu importieren, kann man auf Einstellungen importieren aus der Datei klicken und das betreffende Protokoll importieren. Wenn man ein eigenes Protokoll erstellen möchte, kann man die notwendigen Bibliotheken im (F) Regression Library-Dropdown-Menü auswählen, Ziel-Sigma und Regressionsfenster sowie Alarme anpassen und unten links auf Save (dargestellt durch eine Disc) klicken. (F) Plot-Reiter, in dem man auswählen kann, welche Serie im Hauptfenster angezeigt werden soll. Wenn man ein Spektrum neu analysiert und mehr Serien zu seinen bisherigen Messungen hinzufügen möchte, kann man die interessante Serie unter dem Recal-Abschnitt auswählen. Während der Rekalibrierung (Recal) analysiert die Software die gemessenen Rohspektren erneut und zeigt die Ergebnisse der neu ausgewählten Serie an. Man kann auch auswählen, um die Signalstärke ausgewählter Serien über diesen Tab anzuzeigen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Erklärungen zu jeder Qualitätskontrollkennzahl.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Diese Studie zeigt eine nicht-invasive, Echtzeit- und hochsensible Methode zur Quantifizierung der Mitochondriengesundheit mittels eines tragbaren Resonanz-Raman-Spektroskopiesystems, das aus einem Laser in einer kompakten Sonde besteht, der über ein Glasfaserkabel mit einer Laserpumpe verbunden ist. Bei dieser Methode wurde ein 441-nm-Laser verwendet, um Mitochondrien anzuregen, die je nach Oxidationszustand eindeutige spektrale Signale erzeugen. So kann RRS jeden Zustand von Mitochondrien anhand ihrer spektralen Signaturen quantifizieren und die emittierten Spektren mit vorgemessenen spektralen Bibliotheken mittels Regressionsanalyse vergleichen. Anschließend wurde eine Mitochondriengesundheitsmetrik erstellt, die auf dem Verhältnis von reduzierten zu Gesamtmitochondrien basiert: dem Reduced Resonance Raman Mitochondrial Ratio (3RMR).

Dieses Paper konzentriert sich darauf, Echtzeit-Veränderungen des 3RMR als Funktion der Sauerstoffversorgung mit nativem Gewebe zu demonstrieren, ohne dass eine Probenverarbeitung erforderlich ist. Dies wurde durch einen Sauerstoff-Stresstest erreicht: Nach 5 Minuten kontinuierlicher sauerstoffhaltiger Perfusion wird der Perfusionsfluss für 5 Minuten pausiert und für weitere 5 Minuten neu gestartet. Während des gesamten Stresstests werden 3RMR-Messungen durchgeführt. Ein Stresstestmodell, bei dem wir zwischen ischämischen und sauerstoffreichen Perioden wechseln, ermöglicht es uns, kontinuierliche Veränderungen der mitochondrialen Redoxzustände – und damit der mitochondrialen Funktion – zu verfolgen. Mit anderen Worten: Der Sauerstoff-Stresstest ermöglicht es uns, die Trends im 3RMR als Funktion der Sauerstoffversorgung zu verfolgen. Unsere Gruppe hat die steigende 3RMR-Werte auf ischämische Bedingungen zurückgeführt, die den Perfusionsfluss stören, wodurch sich Elektronen, die durch das ETC passieren, ansammeln,_{da O2} nicht als Endelektronenakzeptor verfügbar ist. Diese Ansammlung von Elektronen führt zu einem reduzierten Zustand, was zu einem Anstieg der 3RMR-Werte führt. Nach der Wiedereinführung von_O2 wird jedoch erwartet, dass gesunde Mitochondrien die ETC-Aktivität wieder aufnehmen und sich zu physiologischen Redoxzuständen erholen, da ihre strukturellen und funktionellen Elemente intakt sind.

Wie erwartet wurde in der vorliegenden Studie ein Echtzeit-kontinuierlicher Anstieg des 3RMR während der ischämischen Periode beobachtet (Abbildung 5A). Ähnlich kehrt 3RMR während der Reperfusionsperiode allmählich auf optimale Werte zurück (Abbildung 5A). Diese Echtzeitänderung der mitochondrialen Redoxzustände ist auch im spektralen Graphen sichtbar, da der mitochondriale Peak während der ischämischen Periode von oxidierten (1371 ^cm-1) zu reduzierten (1357 ^cm-1) Zuständen wechselt und am Ende der Reperfusion wieder oxidiert ist (Abbildung 6). Auch während der ischämischen Periode treten weitere reduzierte RR-Marker-Spitzen auf. Im Gegensatz zu traditionellen mitochondrialen Gesundheitstests ist Resonance Raman empfindlich genug, um die Redoxzustände von Komplex III und Komplex IV zu quantifizieren, was mechanistische Einblicke in die spezifischen Auswirkungen von Ischämie-Reperfusionsverletzungen auf das ETC bieten könnte und bereits geliefert hat. In gesunden Mitochondrien werden Elektronen durch verschiedene Komplexe im ETC geleitet, beginnend mit Komplex I, bis sie O₂ als finalen Elektronenakzeptor erreichen. Eine Pause im Sauerstofffluss kann jeden Komplex in einen reduzierten Zustand versetzen, da Elektronen entlang des ETC zurückstauen. Wie erwartet wurde bei Beginn der Ischämie ein Echtzeitanstieg der 3RMR-Werte von cIII und cIV beobachtet. Dies zeigt, dass das Fehlen von_O2 das gesamte ETC beeinflusst und nicht einen bestimmten Komplex (Abbildung 5B). Wie wir im Folgenden erläutern werden, erleichtert die Sensitivität von RRS detaillierte mechanistische Studien und informiert die Entwicklung gezielter Therapien für IRI.

Traditionell erwarten wir außerdem erhöhte Laktatwerte in ischämischen Organen, da sie bei Sauerstoffabwesenheit auf einen anaeroben Stoffwechsel angewiesen sind, um ATP zu produzieren. Ebenso wurde ein Anstieg der K^+-Spiegel in geschädigten Organen erwartet, da die Membranintegrität der Zellen gestört wird und ein Ausstoß von interzellulärem K⁺ möglich ist. Schließlich können schwer geschädigte Zellen einen niedrigeren Stoffwechsel haben, da ihre Stoffwechselwege durch ischämiebedingte Stoffwechselabfälle und ROS beeinträchtigt werden, was zu einem verringerten Sauerstoffverbrauch führt. Es werden jedoch keine Veränderungen im Laktat-, K⁺- oder Sauerstoffverbrauch während oder nach der ischämischen Periode beobachtet. Tatsächlich zeigen die Werte keine Stopp des Sauerstoffflusses an, da sie während des gesamten Stresstests relativ konstant bleiben (Abbildung 5B–D). Im Wesentlichen zeigt diese Studie mithilfe eines Sauerstoff-Stresstests, dass 3RMR-Werte Veränderungen der mitochondrialen Redoxzustände während der Ischämie-Reperfusion schneller, in Echtzeit und empfindlicher widerspiegeln als traditionelle Schadensbiomarker (Abbildung 5). Wir erkennen an, dass diese Studie die 3RMR-Dynamik mit indirekten Indikatoren der Mitochondriengesundheit wie Laktat und OCR verglichen hat, anstatt mit direkteren nachgelagerten Komparatoren wie NAD+/NADH und ATP. Obwohl diese Studie Veränderungen von 3RMR nicht explizit mit ATP/NADH-Konzentrationen korreliert, haben frühere Arbeiten ^9,14 gezeigt, dass 3RMR die Veränderungen dieser nachgelagerten Biomarker voraussagt. So zeigten Nguyen et ^al.9, dass 3-Stunden-warmischämische (WI)-Lebern mit niedrigen 3RMR-Werten (<10 %) signifikant niedrigere ATP-Konzentrationen und NAD/NADH-Verhältnisse aufweisen als 1-Stunden-WI-Lebern (3RMR-Werte von ~15 %). Außerdem stellten Jain et ^al.14 keine signifikanten Unterschiede im NAD+/NADH-Verhältnis oder EC in Gruppen fest, die keine signifikanten Unterschiede in ihrem 3RMR hatten. Sie beobachteten außerdem, dass die NAD+/NADH-Verhältnisse und die EC bei 24-Stunden-kaltischämischen (KI)-Lebern bei azellulärer Perfusion signifikant unterschiedlich waren im Vergleich zur zellulären Perfusion, die ebenfalls statistisch signifikante 3RMR-Werte zeigte. Zusammen zeigen diese Ergebnisse 3RMR-Werte, um Veränderungen direkterer Messgrößen der mitochondrialen und ETC-Funktion widerzuspiegeln.

Obwohl dieses Papier RRS während einer 15-minütigen Perfusion verwendet, um die Leistung des Systems zu demonstrieren, haben andere veröffentlichte Studien den Nutzen von RRS in Längsschnittstudien nachgewiesen. Genauer gesagt haben wir in einer früheren Arbeit gezeigt, dass RRS traditionelle Biomarker über längere Organdurchsetzungen hinweg ergänzt, da es Einblicke in die Gesundheit und Funktion der Mitochondrien liefert, die sich deutlich von traditionellen Methoden unterscheiden. Beispielsweise nutzte die Studie RRS, um die Lebensfähigkeit von transplantierbaren (24 h SCS) und nicht transplantierbaren (72 h SCS) kaltischämischen Rattenlebern während der subnormothermen^{Perfusion 10} zu bewerten. Obwohl die anfängliche Reaktion auf die Sauerstoffversorgung in beiden Gruppen ähnlich war, stieg der 3RMR der nicht transplantierbaren Lebern mit der Perfusion, während der 3RMR der transplantierbaren Leber über SNMP konstant blieb. Ähnlich waren die Kaliumwerte und die Gesamtgewichtszunahme bei 72-Stunden-KI-Lebern während der gesamten SNMP höher als bei 24-Stunden-KI-Lebern. Die Studie zeigte den Nutzen von RRS zur Ergänzung traditioneller Biomarker über lange Perfusionen hinweg. In einer weiteren Studie nutzten wir RRS, um die Reoxygenierungsdynamik und die metabolische Wiederherstellung von kaltischämischen (KI) Rattenlebern¹⁴ zu verstehen. Wir perfundierten minimal ischämische (15 Minuten kaltischämische Lebern) und 24-Stunden-kaltischämische Leber entweder mit einem azellulären oder einem mit Rauen verpackten Perfusat (pRBC). Wenn 24-Stunden-KI-Lebern mit azellulärem Perfusat perfundiert wurden, beobachteten wir einen latenten Rückgang der 3RMR im Vergleich zur Perfundation mit pRBC. Die Studie führte diesen verzögerten Anstieg des 3RMR auf die Ansammlung von Elektronen an den mitochondrialen Cytochromen während einer kalten Ischämie zurück, die im Fall des pRBC-basierten Perfusats schnell auf die reichlich vorhandenen Sauerstoffmoleküle übertragen werden können. In Kombination mit anderen Verletzungsmarkern beobachten wir jedoch einen stärkeren Leberschaden in 24-Stunden-KI-Lebern, die mit pRBCs perfundiert sind. Die Studie kam zu dem Schluss, dass die Messung der mitochondrialen Sauerstoffversorgung in Echtzeit mittels RRS Einblicke in die mitochondriale Erholung geben kann, was bei der Optimierung der langen Perfusionsstrategien vorteilhaft sein könnte. Im Wesentlichen zeigen die Ergebnisse, dass die Integration traditioneller Biomarker (z. B. Laktat, OCR, ATP) mit RRS-gesteuerten Einblicken in mitochondriale Redoxzustände und Sauerstoffdynamik eine umfassendere Bewertung der mitochondrialen Erholung ermöglicht.

Andere Studien haben RRS als Testplattform für Therapeutika verwendet, die Ischämie-Reperfusionsschäden an ETC⁹ mildern können. Bei längeren Ischämieperioden sammeln sich Elektronen im ETC an, wobei Elektronen durch die verschiedenen Komplexe entweichen können, insbesondere während der Reperfusion. Das Verständnis des Redoxzustands einzelner Komplexe als Funktion der Ischämie-Reperfusion kann ein tieferes Verständnis der Verletzungsorte ermöglichen, mit Potenzial für gezieltere Interventionen. So hat unsere Gruppe beispielsweise RRS genutzt, um therapeutische Interventionen für komplex-III-Dysfunktion in warmischämischen Schweinelebern zu entwickeln. In einer Studie von Nguyen et al. (2026)⁹ wurden 1 Stunde und 3 Uhr WI-Leber für 3 Stunden auf SNMP gesetzt. Wie bereits erwähnt, ist bekannt, dass dreistündige WI-Lebern Schäden am ETC erleiden, was zu Überoxidation und reduziertem Stoffwechsel führt. Obwohl die 3RMR-Werte für frische und 1-Stunden-WI-Leber während der gesamten Perfusion im optimalen Bereich lagen, beobachteten wir, dass 3RMR-Werte von 3-Stunden-WI-Lebern kontinuierlich sanken und nach 3 Stunden unter den optimalen Bereich (10 %) reichten. Zusätzlich beobachteten wir keine Unterschiede in den 3RMR-Werten von cIV zwischen beiden Gruppen, wobei cIV in jeder Gruppe vollständig oxidiert war. Die Hyperoxidation von cIII, kombiniert mit einem gesunden Redoxzustand, der in cIV beobachtet wurde, weist auf eine reperfusionsinduzierte Überoxidation am Komplex III hin. Mit diesem Wissen konnten Nyugen et al. (2026)⁹ein Medikament auswählen, das die Funktionsstörung von cIII überwinden kann: Methylenblau (MB), das als Elektronenshuttle zwischen cI und Cytochrom c wirkt, cIII umgeht und Elektronen direkt zu cIV überträgt. Die 3RMR-Ergebnisse spiegelten die therapeutische Wirkung von MB auf die Mitochondrien wider, da die 3RMR-Werte während SNMP der 3-Stunden-WI-Leber zunahmen, um den direkten Transport von Elektronen zu cIV und dem Wiederstart des Leberstoffwechsels zu reflektieren. Die abschwächende Wirkung von MB wurde auch durch eine Verringerung des Laktatabflusses und eine Verbesserung der Sauerstoffaufnahmen bestätigt. Im Wesentlichen ermöglichte die Spezifität von RRS die Entwicklung eines therapeutischen Weges, der auf mitochondriale Bedürfnisse nach warmer Ischämie zugeschnitten ist.

In diesem Artikel stellen wir die Resonanz-Raman-Spektroskopie als nicht-invasive, Echtzeit- und hochspezifische Methode zur Messung der Mitochondriengesundheit vor. Die Studie zeigt, wie RRS subtile Veränderungen der Redoxzustände messen kann, ohne das Gewebe zu stören, bevor solche physiologischen Veränderungen nachgelagerte Auswirkungen haben. Es ist jedoch wichtig, die verschiedenen Einschränkungen des Resonanz-Raman-Systems zu beachten. Erstens verlangt RRS, dass alle Moleküle, die resonant verstärkt in einem Gewebe sind, identifiziert und in der Regression berücksichtigt werden, wobei jedes Molekül unterschiedliche Verstärkungsfaktoren besitzt, um die relative Signalstärke zu berücksichtigen. Obwohl wir Spektralbibliotheken für alle solchen Komponenten bei einer gegebenen Wellenlänge und eines bestimmten Gewebes erstellt haben, muss der Benutzer möglicherweise neue Bibliotheken für jedes interessierte Gewebe und jede Wellenlänge erstellen und validieren. Außerdem können einige Gewebe komplexe spektrale Elemente enthalten, was es schwierig machen kann, mitochondriale Cytochrome in niedrigeren Konzentrationen zu messen. Zum Beispiel enthalten Schwein- oder menschliche Leber Beta-Carotin, und Blut enthält Hämoglobin, die beide starke spektrale Signale besitzen, die die Anzahl der spektralen Signaturen erhöhen, die RRS in der Regression berücksichtigen muss. Schließlich hat der für diese Messungen verwendete 441-nm-Laser einen Strahldurchmesser von 2 mm und eine Durchschlagstiefe von weniger als 1 mm. Solche lokalisierten Oberflächenmessungen können den Stichprobenfehler fördern, da Unterschiede im Redoxzustand in anderen Organteilen übersehen werden können. Um solche Herausforderungen zu bewältigen, könnten Messungen anhand von Biopsien aus dem Kern des Organs durchgeführt werden, oder ein Multi-Laser-System könnte Messungen über eine größere Oberfläche ermöglichen, um ein umfassenderes Verständnis der Gesundheit des gesamten Organs zu ermöglichen.

Abschließend zeigen wir, dass die Resonanz-Raman-Spektroskopie im Vergleich zu Blutgasanalyten empfindlich auf subtile Veränderungen der mitochondrialen Dynamik reagiert. Eine ausführliche Erklärung zum Einrichten und Betrieb des Systems findet sich hier. Wir heben die nicht-invasive, hochspezifische und Echtzeitbewertung von RRS hervor und erklären, wie sie als diagnostischer und mechanistischer Ansatz eingesetzt werden könnte. Wir betonen auch seinen Einsatz bei der Entwicklung spezifischer therapeutischer Wege für mitochondriale Dysfunktionen. Zukünftige Studien könnten sich darauf konzentrieren, das RRS-System anzupassen, um die Mitochondriengesundheit anhand von Biopsien, präzisionsgeschnittenen Gewebeschnitten oder anderen gewebebasierten Produkten, einschließlich menschlichem Gewebe, für translationale Forschung zu bewerten. Die Einführung von RRS bietet einen kraftvollen Ansatz in der Stoffwechselforschung, der unser Verständnis zellulärer bioenergetischer Prozesse mit größerer Leichtigkeit verbessert als traditionelle Methoden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
16 G Catheter	BD Insyte Authoguard	381454	Zum Kanülieren der Pfortader verwendet
Activated Charcoral	Vet Equip Vapor Guard Activated Charcoal	931401	Zum Filtern überschüssiger Dämpfe während der Anästhesie
BSA	Sigma-Aldrich	A7906	Perfusatzusammensetzung
Bubble Trap	Radnoti	130149
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	Perfusatzusammensetzung
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061	Perfusatzusammensetzung
Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G)	Fisher Scientific	13-200-292	Zum Durchfließen des Perfusats durch die Leber
Masterflex peristaltic pumps	Cole Parmer, Vernon Hill, IL	7528-30	Zum Durchfließen des Perfusats durch die Leber
Membrane Oxygenator	Radnoti	130144	Zum Sauerstoffen des Perfusats.
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Perfusatzusammensetzung
RAPIDPoint 500 Blood Gas System	Siemens Healthineers	41115805	Für Blutgasanalyse
Resonance Raman System	Pendar Technologies	A4D441	Kontaktieren Sie Pendar Technologies für Anfragen zu diesem Produkt