Methodenartikel

Konstruktion menschlicher Brustkrebsorganoide und kometentestbasierte Quantifizierung von Doxorubicin-induziertem DNA-Schaden

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DOI:

10.3791/71299

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28. Juli 2026

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1College of Life Science, North China University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, 3School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 4Thyroid and Breast Surgery, Wuzhong People's Hospital of Suzhou City, 5Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll etabliert ein Modell der menschlichen Brustkrebsorganoide (BCOs) und bewertet quantitativ den durch Doxorubicin-induzierten DNA-Schaden mittels des Kometen-Assays. Die Machbarkeit, den Kometentest auf BCOs anzuwenden, wird demonstriert, und ein reproduzierbarer, skalierbarer und betrieblicher Workflow wird bereitgestellt, um DOX-induzierte DNA-Schäden in BCOs zu erkennen.

Zusammenfassung

Brustkrebs ist die häufigste bösartige Erkrankung bei Frauen weltweit und weist erhebliche Heterogenität auf. Doxorubicin (DOX) wird häufig in der Brustkrebsbehandlung eingesetzt, und sein Hauptwirkmechanismus besteht darin, DNA-Doppelsträngbrüche auszulösen und Zelltod auszulösen. In diesem Protokoll wurde ein menschliches BCO-Modell entwickelt, um quantitativ DOX-induzierte DNA-Schäden zu bewerten. Primäre Brustkrebszellen wurden aus von Patienten abgeleiteten Tumorgeweben durch mechanische und enzymatische Dissoziation isoliert und anschließend in einer dreidimensionalen Matrix kultiviert, um BCOs zu erzeugen. Organoide wurden anschließend 2 Stunden lang mit 8 μM DOX behandelt. Nach 2 Stunden Behandlung wurde die DNA-Schädigung bewertet. Nach der Behandlung wurden Organoide in Einzelzellen dissoziiert, in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt eingebettet und unter alkalischen Bedingungen elektrophoresisiert. Nach der Elektrophorese wurden DNA-Migrationsmuster als Kometenstrukturen unter Fluoreszenzmikroskopie visualisiert und quantitativ mit OpenComet-Software analysiert, um den Prozentsatz der Schwanz-DNA (% Schwanz-DNA) zu bestimmen. Der Kometentest erkannte erfolgreich DNA-Schäden in BCOs. Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigten BCOs, die 2 Stunden lang 8 μM DOX ausgesetzt waren, verlängerte Kometenschwänze nach organoider Dissoziation und Elektrophorese. Quantitative Analysen zeigten, dass der Anteil der Schwanz-DNA in der behandelten Gruppe signifikant höher war, was auf die Induktion von DNA-Schäden hinweist. Diese hochsensible Methode unterstützt toxikologische und pharmakodynamische Untersuchungen von DOX und bietet eine robuste technische Basis zur Bewertung von DNA-Schäden in patientenabgeleiteten BCO-Systemen.

Einleitung

Brustkrebs ist ein bösartiger Tumor, der durch genetische Veränderungen, hormonelle Dysregulation und andere pathogene Faktoren aus den Epithelgeweben der Brust entsteht. Sie ist die häufigste Malignität bei Frauen weltweit und weist einzigartige epidemiologische Muster sowie eine erhebliche intratumorale Heterogenitätauf. DOX, ein Erstlinien-Chemotherapeut, interkaliert in die DNA, hemmt die Aktivität von Topoisomerase II und induziert DNA-Strängbrüche, was letztlich Apoptose in Tumorzellen3 auslöst. Traditionelle zweidimensionale Zellkultursysteme sind in ihrer Fähigkeit, die komplexe zelluläre Organisation und Heterogenität von Brusttumoren nachzubilden, eingeschränkt. Im Gegensatz dazu sind BCOs dreidimensionale Strukturen, die aus Tumorgeweben des Patienten abgeleitet sind und die Schlüsselmerkmale des ursprünglichen Tumors erhalten, darunter zelluläre Zusammensetzung, Gewebearchitektur und molekulare Phänotypen. Bemerkenswert ist, dass BCO-Modelle eine hohe Übereinstimmung mit klinischen Arzneimittelreaktionen zeigen; bei einem gegebenen therapeutischen Mittel erreicht die Konkordanz der negativen Antwort 100 % und die Konkordanz der positiven Antwort 98 % zwischen BCOs und dem entsprechenden Patienten4.

BCOs dienen als fortschrittliches In-vitro-Modell, das zentrale strukturelle und funktionelle Merkmale primärer Tumore wiederholt und wurden weit verbreitet zur Untersuchung von Tumorgenese, Krankheitsprogression und therapeutischer Resistenzeingesetzt. Die Tumorinitiierung bei Brustkrebs beruht typischerweise auf der kooperativen Inaktivierung mehrerer Tumorsuppressorgene wie TP53, PTEN, RB1 und NF1, da einzelne Genveränderungen nicht ausreichen, um eine bösartige Transformation des normalen Mammarepithels zu bewirken. Dieser Prozess geht mit Verlust der Zellpolarität, architektonischer Desorganisation und unkontrollierter Proliferation 6,7,8 einher.

Der Kometentest (auch als Einzelzell-Gelelektrophorese, SCGE bezeichnet) ist eine klassische Methode zur Beurteilung von DNA-Schäden auf Einzelzellebene. Die Technik wurde erstmals 1978 von Rydberg und Johanson eingeführt und anschließend von Ostling und Johanson verfeinert, die den neutralen Kometen-Test zur Erkennung von DNA-Doppelstrang-Brüchen etablierten. 1988 integrierten Singh und Kollegen alkalische Elektrophoresebedingungen, die den Nachweis von DNA-Einstrangbrüchen, abasischen Stellen und alkali-labilen Läsionen ermöglichten und so die Anwendbarkeit des Tests erheblich erweiterten. Das grundlegende Prinzip des Kometen-Assays ist, dass die elektrophoretische Mobilität der DNA von der DNA-Integrität abhängt. Nach der Einbettung und Lyse von Agarose zur Entfernung von Zellmembranen und Proteinen wandern beschädigte DNA-Fragmente während der Elektrophorese zur Anode und bilden einen "Kometenschwanz", während intakte DNA in der Nähe der Ladestelle verbleibt und den "Kometenkopf" bildet. Parameter wie Schwanzlänge, Prozentsatz der Schwanz-DNA (% Schwanz-DNA) und Oliv-Schwanzmoment ermöglichen eine halb-quantitative oder quantitative Bewertung von DNA-Schäden, und zeitliche experimentelle Designs können verwendet werden, um die DNA-Reparaturkapazität zu bewerten. Aufgrund seiner hohen Sensitivität, geringen Probeneingabeanforderungen und relativer prozeduraler Einfachheit wurde der Kometentest häufig in der genetischen Toxikologie, Krebsbiologie und Studien zur Arzneimittelwirkung eingesetzt, insbesondere zur Bewertung von DNA-Schäden durch Chemotherapeutika und Strahlentherapie sowie Resistenzmechanismen von Tumorzellen. Der Test ist hochsensibel für experimentelle Bedingungen und prozedurale Variabilität, und Reproduzierbarkeit sowie Vergleichbarkeit zwischen Laboren hängen von standardisierten Arbeitsabläufen und automatisierter Bildanalyseab. In den letzten Jahren hat die Integration von Hochdurchsatz-Bildgebungssoftware, Organoidmodellen und Gen-Editierungssystemen die Nützlichkeit des Kometentests bei der Untersuchung von DNA-Schäden und Reparaturmechanismen sowie bei der Bewertung von Tumorbehandlungsreaktionen weiter verbessert.

Im Vergleich zu traditionellen DNA-Schadensanalysen wie γ-H2AX-Immunfluoreszenzfärbung oder Durchflusszytometrie bietet der Kometentest eine direkte Möglichkeit, physische DNA-Strängbrüche auf Einzelzellebene zu quantifizieren. Da diese Methodik unabhängig von spezifischer Proteinexpression oder Antikörperspezifität funktioniert, eliminiert sie effektiv falsch-negative Ergebnisse, die durch Variationen der Zellzykluszustände oder Aberrationen in DNA-Schadens-Response-Wegenentstehen 12. Darüber hinaus reproduziert das in dieser Studie verwendete dreidimensionale Organoid-Modell im Gegensatz zu herkömmlichen zweidimensionalen Monoschichtkulturen die komplexe räumliche Architektur, extrazellulären Matrixinteraktionen und Wirkstoffpermeationsgradienten von in vivo Tumoren genauer. Während traditionelle Zelllinienmodelle die Genotoxizität aufgrund künstlicher Medikamentenexposition häufig überschätzen, bewertet die Organoid-Plattform DOX-induzierte DNA-Schäden in einer Mikroumgebung, die klinischen physiologischen Bedingungen nahekommt, und erhöht so die Zuverlässigkeit und den translationalen Wert dieses Screening-Paradigmas13 erheblich.

Trotz der erheblichen Vorteile des organoid-integrierten Kometen-Assays, der in dieser Studie zur Bewertung von DNA-Schäden etabliert wurde, erfordert seine praktische Umsetzung eine sorgfältige Berücksichtigung mehrerer technischer Einschränkungen und Anwendbarkeitsparameter im Zusammenhang mit der Probeneingabe. Das Protokoll erfordert eine gründliche, aber sanfte enzymatische Dissoziation der Organoide, um eine hochwirksame Einzelzell-Suspension zu erzeugen. Eine Aussaatdichte von 15.000–20.000 primären Brustkrebszellen pro 100 μL der Basalmembranmatrix (~200 Zellen/1 μL) erhält die interzelluläre parakrine Signalübertragung, die für die robuste Kugelbildung notwendig ist, während sie zentrale Nekrose durch Hyperdichte und schnelle Nährstoffentnahme verhindert. Bezüglich des therapeutischen Fensters erfordert dieser Test eine sorgfältige Kalibrierung der DOX-Konzentration und Expositionsdauer, um übermäßigen Zelltod zu verhindern (>20–30%). Die supralethale Drogenexposition erzeugt eine Fülle von "Igel"-Kometen, die echte DNA-Schadenssignale verschleiern und die Dateninterpretation verwirren. Bezüglich der Assay-Einschränkungen macht der von Natur aus niedrige Durchsatz des Standard-alkalischen Kometentests ihn unzureichend für das Hochdurchsatz-Medikamentenscreening. Darüber hinaus erfordert diese Technik eine strenge Standardisierung experimenteller Verfahren – einschließlich Gelhaftstabilität, alkalischer Unwicklungsdauer und elektrophoretischer Gleichmäßigkeit –, da selbst winzige Betriebsabweichungen erhebliche systemische Fehler verursachen können.

Abschließend stellt dieses Protokoll menschliche BCOs fest und demonstriert die Machbarkeit, den Kometentest zur Quantifizierung von DOX-induzierten DNA-Schäden anzuwenden. Nach einer 8 μM DOX-Behandlung vollständig etablierter BCOs wurde der DNA-Schaden mittels des Kometentests bewertet. Dieser Ansatz ermöglicht eine stabile und direkte Bewertung von DOX-induzierten DNA-Schäden.

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Protokoll

Die Studie wurde vom Ethikausschuss des Suzhou Wuzhong Volkskrankenhauses genehmigt (Genehmigungsnummer 20251w03) und gemäß den ethischen medizinischen Standards durchgeführt. Alle Probanden dieser Studie haben schriftliche informierte Zustimmung eingeräumt.

1. Bau menschlicher BCOs

  1. Transport und Lagerung von Brustkrebsgewebe
    1. Setzen Sie sofort frisch reseziertes menschliches Brustkrebsgewebe in eine vorgekühlte Gewebekonservierungslösung (4 °C).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Gewebe während des Transports vollständig untergetaucht bleibt.
  2. Mechanische Dissoziation des Brustkrebsgewebes
    1. Führen Sie alle Verfahren in einem Biosicherheitsschrank durch. Geben Sie das Brustkrebsgewebe in eine 6 cm große Kulturschale und entfernen Sie sichtbares Fettgewebe mit sterilen Skalpellen und Pinzetten.
    2. Gib 3 ml PBS in die 6 cm Kulturschale und wasche das Gewebe dreimal.
    3. Aspirieren und entsorgen Sie die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).
    4. Wiederhole die Schritte 1.2.2 und 1.2.3 zweimal weiter.
    5. Übertragen Sie das Brustkrebsgewebe in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr mit steriler chirurgischer Schere und schneiden Sie das Gewebe in kleine Fragmente von etwa 2 x 5 mm.
  3. Enzymatische Verdauung von Brustkrebsgewebe
    1. Geben Sie 1 ml Organoid-Dissoziationslösung in das 1,5-mL-Mikrozentrifugenrohr und übertragen Sie die Suspension in ein 15-mL-Zentrifugenrohr.
    2. Fügen Sie zusätzlich 8 ml Organoid-Dissoziationslösung in das 15 mL Zentrifugenrohr hinzu.
    3. Inkubieren Sie das 15-mL-Zentrifugenrohr bei 37 °C für 40 Minuten.
    4. Während der Verdauung bewegt man den Schlauch alle 10 Minuten auf einem Shaker.
    5. Nach 40 Minuten werden 6 ml PBS in das 15 mL Zentrifugenrohr gegeben, um die Verdauung zu beenden.
      HINWEIS: PBS direkt zur Verdauungsmischung hinzufügen, um die enzymatische Aktivität zu stoppen.
  4. Isolierung primärer Brusttumorzellen und Organoid-Einbettung
    1. Setzen Sie ein 100 μm Zellsieb auf ein 50 mL Zentrifugenrohr.
    2. Gib 1 ml vollständiges Zellkulturmedium auf das Zellsieb.
      HINWEIS: Bereiten Sie das vollständige Zellkulturmedium mit 500 ml Basalmedium, 50 ml fetalem Rinderserum und 5 ml Penicillin-Streptomycin vor.
    3. Aspirieren Sie 1 ml der verdauten Gewebesuspension aus dem 15-mL-Zentrifugenrohr und tragen Sie es auf das Zellsieb auf.
    4. Wiederhole Schritt 1.4.3, bis die gesamte Federung durch das Sieb gelaufen ist.
    5. Spülen Sie das Zellsieb mit einem zusätzlichen 1 ml vollständigen Zellkulturmediums.
    6. Zentrifugiere das 50-mL-Zentrifugenrohr bei 350 × g für 3 Minuten bei 4 °C.
    7. Aspiriere und entsorge das Supernatantant.
    8. Setzen Sie das Zellpellet in 1 mL vollständigen Zellkulturmedium wieder auf und übertragen Sie es in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr.
    9. Zentrifugiere die Suspension bei 370 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
    10. Aspiriere und entsorge das Supernatantant.
    11. Fügen Sie 100 μL der Basalmembranmatrix in das 1,5 mL Mikrozentrifugenrohr hinzu und mischen Sie gründlich.
      HINWEIS: Halten Sie eine Aussaatdichte von 15.000–20.000 primären Brustkrebszellen pro 100 μL der Basalmembranmatrix (200 Zellen/1 μL) aufrecht. Dies erhält die interzelluläre parakrine Signalübertragung für eine robuste Kugelbildung und verhindert zentrale Nekrose.
    12. Geben Sie 25 μL des Basalmembran-Matrix-Zell-Gemisch in jede Mulde einer 24-Well-Platte.
    13. Invertieren Sie die 24-Well-Platte und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 10 Minuten, um eine Polymerisation der Basalmembranmatrix zu ermöglichen.
    14. Fügen Sie 500 μL BCO-Kulturmedium zu jedem Brunnen der 24-Well-Platte hinzu.
      HINWEIS: Culture BCOs verwenden ein kommerzielles Fertigmedium mit einer proprietären Formulierung.
    15. Inkubieren Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂.
      HINWEIS: Nach der Aussaatung in der extrazellulären Matrix wurden die BCOs 7–10 Tage lang kultiviert, um eine ordnungsgemäße 3D-Strukturentwicklung zu ermöglichen. Die Organoide galten als vollständig etabliert und bereit für die medikamentöse Behandlung, als sie dichte, kugelförmige 3D-Morphologien aufwiesen und einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 50–100 μm erreichten, ohne Anzeichen einer zentralen Nekrose. Nachdem diese Endpunktkriterien erfüllt waren, wurden die BCOs anschließend mit DOX behandelt.

2. Nachweis von DOX-induzierten DNA-Schäden in BCOs mittels des Kometentests

Das experimentelle Protokoll wurde von etablierten Richtlinien angepasst und weiter auf spezifische Laborbedingungen optimiert14.

VORSICHT: Führen Sie alle DOX-Handhabungsverfahren – einschließlich Trockenpulverwiegen, Lagerlösungsvorbereitung und serielle Verdünnung der Arbeitslösungen – ausschließlich in einem zertifizierten Bio-Sicherheitsschrank der Klasse II oder einer chemischen Abzughaube durch. Vermeiden Sie jegliche Manipulation auf offenen Laborbänken strikt. Tragen Sie doppellagige Nitrilhandschuhe und schützen Sie das Medikament während aller Eingriffe vor Licht. Schließlich werden alle DOX-kontaminierten Verbrauchsgüter (z. B. Pipettenspitzen und Mikrozentrifugenröhren) streng als 'zytotoxischer Abfall' für die spezialisierte Entsorgung abgetrennt; Mischen Sie diese Gegenstände niemals mit routinemäßigen biologisch gefährlichen Abfällen.

  1. DOX-Behandlung von BCOs
    1. Aspiriere und entsorge das verbrauchte Kulturmedium.
    2. Fügen Sie 500 μL frisches BCOs-Kulturmedium zu jedem Brunnen hinzu
    3. Entferne und entsorge 4 μL des Mediums aus jedem Bohrloch
    4. Fügen Sie jedem Bohrloch 4 μL 1 mM DOX Stocklösung hinzu.
      HINWEIS: Um eine endgültige Arbeitskonzentration von 8 μM zu bestimmen, bestimmen Sie das erforderliche Lagervolumen mit der Standardverdünnungsgleichung: C1V1 = C2V2. Dabei stellt C1 die anfängliche DOX-Bestandskonzentration (1 mM) dar, C2 die Zielkonzentration (8 μM) und V2 das Endvolumen des Bohrlochs (500 μL). Die Lösung für V1 ergibt 4 μL. Folglich erfordert das Protokoll, dass pro Bohrloch 4 μL des 1 mM DOX-Lagers zu den verbleibenden 496 μL Kulturmedium hinzugefügt und anschließend gründlich gemischt wird, um eine homogene Verteilung sicherzustellen.
    5. Inkubieren Sie die Platte in einem 37°C-Inkubator mit 5 % CO₂ für 2 Stunden.
  2. Dissoziation von BCOs
    1. Aspiratiere und entsorge das BCO-Kulturmedium von der 24-Well-Platte.
    2. Fügen Sie jedem Bohrloch 500 μL Organoid-Dissoziationslösung hinzu.
    3. Pipettieren Sie wiederholt auf und ab, um die Basalmembranmatrix und die organoiden Strukturen vollständig zu zerstören.
    4. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 10 Minuten.
    5. Übertragen Sie 500 μL der resultierenden Suspension aus jedem Brunnen in ein 15-mL Zentrifugenrohr.
    6. Zentrifugiere die Suspension bei 350 × g für 3 Minuten bei 4 °C.
    7. Aspiriere und entsorge das Supernatantant.
    8. Fügen Sie 1 ml vollständiges Kulturmedium in das 15 mL Zentrifugenrohr ein, um das Zellpellet wieder aufzuhängen, und übertragen Sie anschließend die resultierende Suspension in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenrohr.
    9. Zentrifugiere die Suspension bei 350 × g für 3 Minuten bei 4 °C.
    10. Aspiriere und entsorge das Supernatantant.
      HINWEIS: Nach der Zentrifugation bleibt das Organoid-Pellet im Zentrifugenrohr.
  3. Zellresuspension und Agarose-Einbettung
    1. Heizen Sie den Metallheizblock auf 95 °C vor.
    2. Geben Sie 1 ml Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) in einen Metallheizblock und inkubieren Sie sie 10 Minuten, um das vollständige Schmelzen sicherzustellen.
    3. Pipette 100 μL geschmolzenes, 0,5 % mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit BCOs.
    4. Sofort werden die Proben in ein 37 °C Wasserbad übertragen und 10 Minuten lang ausgeglichen.
    5. Sorgfältig und sofort 50 μL der Zell-Agarose-Suspension auf einen Objektträger pipettieren.
  4. Zelllyse und DNA-Entwicklung
    1. Tauchen Sie die Objektträger in eine kalte Lyselösung ein und inkubieren Sie sie 12 Stunden bei 4 °C im Dunkeln.
    2. Nehmen Sie die Objektträger aus der Lyselösung und tauchen Sie sie sofort in alkalische Entwickellösung.
      HINWEIS: Zur Herstellung der alkalischen Entwicklungslösung lösen Sie 0,6 g NaOH in 4,975 mL ultrareines Wasser auf und fügen Sie dann 250 μL 200 mM EDTA hinzu. Um den alkalischen Elektrophoresepuffer herzustellen, lösen Sie 12 g NaOH in 995 mL ultrareines Wasser auf und fügen dann 5 mL 200 mM EDTA hinzu.
      VORSICHT: NaOH im Kometen-Puffer ist eine hochkorrosiv starke Basis, die schwere kutane und okulare Verbrennungen verursachen kann. Während der Lösungsvorbereitung werden die festen NaOH-Pellets langsam, schrittweise und unter kontinuierlichem magnetischem Rühren ins Wasser gegeben. Gießen Sie niemals Wasser direkt auf die trockenen Pellets, da die heftige exotherme Reaktion dazu führen kann, dass die ätzende Flüssigkeit kocht und spritzt. Außerdem sollten Sie das gesamte trockene Pulver ausschließlich in einer chemischen Dampfhaube ausführen, um das Einatmen von ätzendem Staub zu verhindern.
    3. Tauchen Sie die Objektträger in eine Lyselösung ein und inkubieren Sie sie 1 Stunde lang bei 4 °C im Dunkeln.
  5. Elektrophorese
    1. Übertragen Sie die Objektträger von der alkalischen Entwicklungslösung in die Elektrophoresekammer.
    2. Fügen Sie 1 Liter alkalische Elektrophorese-Puffer in den Elektrophoresetank ein, um eine vollständige Untertauchung der Objektträger sicherzustellen.
    3. Führe Elektrophorese bei 25 V und 300 mA für 30 Minuten durch.
  6. Scheibenwäsche und Fixierung
    1. Tauchen Sie die Objektträger in 5 ml 70 % Ethanol ein und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Ethanol stellt eine schwerwiegende Entflammbarkeitsgefahr dar. Bei der Durchführung großer Volumenpräparate oder der Gewebedehydrierung sollten Sie eine robuste Belüftung in der experimentellen Umgebung aufrechterhalten. Isolieren Sie das Betriebsgebiet strikt von allen Zündquellen, einschließlich offener Flammen (wie Alkoholbrenner) und elektrostatischen Funken. Nach dem Gebrauch versiegeln Sie die Reagenzienbehälter sofort und sichern Sie sie in einem speziellen explosionsfesten brennbaren Lagerschrank.
    2. Stellen Sie die Objektträger in einen 37 °C Inkubator und lassen Sie sie 15 Minuten trocknen.
  7. DNA-Färbung und Bildgebung
    1. Fügen Sie 1 μL Nukleinsäure-Fluoreszierfarbe zu 10 ml ultrareinem Wasser hinzu.
      VORSICHT: Behandeln Sie diese Nukleinsäure-Interkalationsmittel als potenzielle Mutagene und behandeln Sie sie mit strengen Vorsichtsmaßnahmen. Um Kreuzkontaminationen in Routinearbeitsplätzen zu vermeiden, sollte eine eigene 'Nukleinsäurefärbungszone' eingerichtet werden, die mit speziellen Pipetten ausgestattet ist. Wenn Sie geschmolzene Agarose mit Farbstoffen ergänzen, lassen Sie das Gel auf etwa 60 °C abkühlen, bevor Sie es hinzufügen, um das Einatmen gefährlicher, farbstoffhaltiger Dämpfe zu verhindern. Schließlich entsorgen Sie alle verbrauchten Färbungslösungen und Abfallgele strikt in die vorgesehenen Nukleinsäure-Gefahrenbehälter.
    2. Tauchen Sie die Objektträger in die in Schritt 2.7.1 hergestellte Färbelösung ein und bekubieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.
    3. Führen Sie eine einzige 5-minütige Wäsche mit 5 ml ultrareinem Wasser durch.
    4. Die Objektträger 15 Minuten in einem 37 °C Inkubator an der Luft trocknen.
    5. Visualisieren Sie Kometenstrukturen mit einem Fluoreszenzmikroskop mit grünem Anregungsfilter und erkennen Sie rote Fluoreszenz.

3. Datenverarbeitung

  1. Führen Sie automatisierte quantitative Analysen von Kometen-Assay-Bildern mit dem OpenComet-Plugin in Fidschi (offizieller Verteilung) durch, um DNA-schadensbezogene Parameter zu erhalten.
    HINWEIS: Bezüglich der statistischen Analyse umfasste diese Arbeit ausschließlich hochauflösende, klar abgebildete Kometen, die eine intakte Morphologie und keine Überlappung aufweisen. Umgekehrt schloss das Screening-Protokoll 'Igel'- oder 'Geisterkometen' aus (die einen verkleinerten Kopf und einen ausgedehnten Schwanz zeigen, was auf schwere Apoptose oder Nekrose hinweist) sowie Bilder mit verschwommenen Rändern, Zellclustering oder Hintergrundartefakten.
    1. Öffnen Sie die Fiji-Software (ergänzende Abbildung 1A).
    2. Klicken Sie in der Menüleiste auf Plugins (ergänzende Abbildung 1A).
    3. Wählen Sie OpenComet (ergänzende Abbildung 1B).
    4. Klicken Sie unter Eingabedateien auf Durchsuchen und wählen Sie die Kometen-Assay-Bilder zur Analyse aus (ergänzende Abbildung 1C).
    5. Klicken Sie unter Ausgabeverzeichnis auf Durchsuchen und definieren Sie den Zielordner für die Ausgabedateien (ergänzende Abbildung 1C).
    6. Klicken Sie auf Ausführen, um die automatisierte Analyse zu starten (ergänzende Abbildung 1C). Dieser Schritt schließt den Datenverarbeitungs- und Analyse-Workflow ab.
      HINWEIS: Für jede Versuchsgruppe quantifizierte diese Studie den Prozentsatz der Schwanz-DNA (%Schwanz-DNA) aus einer randomisierten Auswahl von mindestens 50 Zellen. Die anschließende statistische Analyse verwendete eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) zum Vergleich von Gruppenmitteln, wobei p < 0,05 als statistisch signifikant angesehen wurde.

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Ergebnisse

Gründung von BCOs

Diese Studie etablierte erfolgreich Brustkrebsorganoide aus primären Tumorgewebeproben. Im Anfangsstadium der Kultur wurden deutlich eine große Anzahl von Einzelzellen oder Kleinzellclustern beobachtet, wobei die Zellen relativ verstreut verteilt waren und keine offensichtliche dreidimensionale kugelförmige Organisation aufwiesen. Einige Zellen wiesen runde oder nahezu runde Morphologien auf, was darauf hindeutet, dass tumora...

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Diskussion

Der Kometentest stellt einen bedeutenden Fortschritt in den Methoden zur Bewertung der Genotoxizität dar. Aufgrund ihrer Einzelzellauflösung und der direkten Visualisierung von DNA-Schadensmustern basierend auf elektrophoretischer Migration bietet diese Technik klare Vorteile gegenüber herkömmlichen Genotoxizitätstests15.

Mehrere kritische Schritte während des experimentellen Verfahrens beeinflussen die Reproduzierbarkeit und Dateninter...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

Diese Studie wurde vom Projekt des Engineering Research Centre für molekulare Zieltherapie und Begleitdiagnostik in der Onkologie der Provinz Jiangsu (SGK2202319), dem innovativen Forschungsteam für Wissenschaft und Technologie der Jiangsu Hochschule (2021), dem Programm des Engineering Technology Research Centre des Jiangsu Vocational College (2023), der Naturwissenschaftlichen Schlüsselstiftung der Jiangsu Higher Education Institutions of China (Zuschussnummer 24KJA310008) unterstützt. die Schlüsselprogramme des Suzhou Berufsgesundheitskollegs (szwzy202406), des Projekts des Staatlichen Schlüssellabors für Strahlenmedizin und -schutz, Soochow Universität (Nr. GZK1202506), das Dongwu Health Talent Program (DWWS2024002, DWWS2025009, DWWS2025013).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100 μm ZellsiebBIOLOGIX15-1100
15 mL Zentrifuge-RöhrchenBIOFILKeine15 mL Zentrifuge-Röhrchen
1 mL PipettenspitzenZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808633
200 μL PipettenspitzenZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808214
24-Well-PlattenCorning Incorporated3524
50 mL Zentrifuge-RöhrchenBIOFILKeine50 mL Zentrifuge-Röhrchen
Breast Cancer Organoid Kit PlusMogenel Biotechnology MA-0807T011LPBCO-Kulturmedium
Comet-SchieberR&D SYSTEMS4250-050-03
Trockenkugel-ThermostatHangzhou Ruiyi Science and Technology Trading Co., Ltd.DH100-2Heizblock
Dulbecco’s modifiziertes Eagle-MediumgibcoC11995500BTVollständiges Zellkulturmedium
EDTATREVIGEN4250-050-04
Elektrischer Wasserbadthermostat mit konstanter TemperaturShanghai Mulang Instrument Manufacturing Co., Ltd.MSY-24Wasserbad
ElektrophoresegerätBIO-RAD1645052
Fetal bovine serumEallBio03.U16001DC
FluoreszenzmikroskopWEIDAIM-300LD4
PinzetteBeyotimeFS019
GelRedBeyotimeD0140
GraphPad Prism 8.0GraphPad SoftwareStatistische Analysesoftware
ImageJNational Institutes of Health, NIH1.54pBildverarbeitungssoftware / Bild
LMA-GaroseR&D SYSTEMS4250-050-02Niedrig schmelzende Agarose 
Niedertemperatur-HochgeschwindigkeitszentrifugeAnhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTDKDC-40Zentrifuge
LyselösungTREVIGEN4250-050-01Lyselösung
MatrigelMogenel Biotechnology82755Die Basalmembranmatrix
NaOHDAMAO1588
OpenComet-SoftwareOpen-Source ImageJ-Plugin, National University of Singapore, Singapurv1.3.1
Organoid-DissoziationslösungMogenel BiotechnologyMB-0818L01L
Penicillin – StreptomycinBeyotimeCO22
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (1x PBS)Fdbio Science Biotech Co.,LtdFD7032PBS
PipettenRaininPipet-Lite XLS
SchereBeyotimeFS001
Gewebe-VerdauungslösungMogenel BiotechnologyMB-0818L06L/MB-0818L06SOrganoid-Dissoziationslösung

Referenzen

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