Quantitative lebende Zellbildgebung der Kernform und der Chromatindynamik während der Entwicklung und Umweltstress in der Wurzel Arabidopsis thaliana

Summary

Dieser Prozess verwendet die Konfokalmikroskopie in Verbindung mit einer fluoreszenzmarkierten Kern- und Chromatinmarkerlinie bei Arabidopsis thaliana, um gleichzeitig die Kern- und Chromatindynamik in Arabidopsis-Wurzeln aufzuzeichnen und Veränderungen in dieser Dynamik als Reaktion auf Entwicklungs- und Umweltsignale zu untersuchen.

Abstract

Der Kern ist die charakteristische Organelle eukaryotischer Organismen. Im Gegensatz zur klassischen Lehrbuchansicht statischer Kerne ist die Kernform in lebenden Zellen dynamisch. Eine veränderte oder deformierte Kernform ist ein Markenzeichen von Krebs in tierischen Zellen und Umweltstress bei Pflanzen. Nukleäre Hüllenproteine interagieren mit Chromatin, um die Genexpression zu regulieren. Leider ist wenig über die Auswirkungen abiotischer Belastung auf die Form des Kerns, die Bewegung und die Chromatindynamik bekannt. Um diesem Problem zu begegnen, entwickelten wir eine Pipeline mit konfokaler Mikroskopie und Partikelverfolgungssoftware, um die Kern- und Chromatindynamik in Arabidopsis-Wurzeln unter Kontrolle und abiotischem Stresszustand zu quantifizieren. Diese konfokale Bildgebungsmethode verwendet eine doppelt fluoreszent markierte Markerlinie – Nuklearmembranprotein und Chromatin – um eine lebende Zellbildgebung der Wurzel in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana unter kontrollierten und salzgestressten Bedingungen durchzuführen. Diese aufgenommenen Filme werden analysiert, um Kern- und Chromatindynamiken mithilfe der Open-Source-Bildverarbeitungssoftware Fiji/ImageJ mit Hilfe des TrackMate-Plugins zu quantifizieren. Zur Validierung dieser Methode haben wir die Chromatinbewegung in Kontroll- und salzgestressten Wurzeln abgebildet und quantifiziert, was eine Abnahme der Chromatingeschwindigkeit unter salzgestressten Bedingungen zeigte. Diese Methode ermöglicht eine quantitative Live-Zell-Bildgebung der Wurzelkernform und der Chromatindynamik während der Pflanzenentwicklung und Umweltstress, wodurch die Analyse von Veränderungen in der Kern- und Chromatindynamik durch abiotische Stressoren ermöglicht wird.

Introduction

Die Kernform variiert zwischen verschiedenen Zelltypen und während der Entwicklung bei den Wurzeln von Arabidopsis thaliana ^1,2. Zum Beispiel ist die Kernform kugelförmig in den aktiv teilenden meristematischen Regionen. Im Gegensatz zur meristematischen Region sind die Kerne in der Wurzelübergangs- und Verlängerungszone weniger kugelförmig. Außerdem durchlaufen Kerne in differenzierten Zellen, wie Wurzelhaaren, die enge Wurzelhaarbasis und werden aktiv in die länglichen Kerne ^3,4,5 umgewandelt. Die dynamischen Veränderungen der Form und Bewegung des Kerns sind entscheidend für das Funktionieren der^{Zelle 6,7}. Defekte in der Kernform führen zu funktionellen Beeinträchtigungen wie einer verminderten Kernbewegung ^1,3. In Säugetierzellen korrelieren Veränderungen der Form von Zellen und Zellkern direkt mit Veränderungen in der Genexpression und Proteinsynthese⁸.

Während der Interphase ist die DNA einer Zelle als Chromatin organisiert. Die DNA im Chromatin ist um Histone gebündelt, die die DNA straffen und lockern können, um die Expression zu verändern. Ebenso sind auch die Chromatinpositionierung relativ zur Kernhülle und die Nähe zur Kernperipherie wichtig für die^{Genexpression 9}. Umweltstress, wie osmotischer Stress, verändert die Form des Kerns und verändert folglich die Expression eines Satzes berührungsempfindlicher Gene bei A. thaliana-Wurzeln ¹⁰. In diesem Zusammenhang ist es wichtig, die Kernform und die Chromatindynamik mittels Live-Zell-Zeitrafferbildgebung zu untersuchen. Ein wesentlicher Aspekt der Kerndynamik ist die Geschwindigkeit, mit der sich die Kerne bewegen, da die Kernpositionierung innerhalb der Zelle die Genexpression anregt und die Kernrepositionierung eine Kernbewegung^erfordert. Die Geschwindigkeit der Chromatinbewegung im Kern ist ebenso wichtig, da die Positionierung der Gene im Kern entscheidend für die Bestimmung der Genexpression¹² ist.

Zuvor wurden Kernform und Chromatindynamik separat abgebildet und quantifiziert; infolgedessen blieb die Beziehung zwischen Kernform und Chromatindynamik unerforscht. Durch die gleichzeitige Abbildung von Kerne und Chromatin können ihre Positionen zueinander beobachtet werden, was Bewegungen wie Kernrotation und intranukleäre Chromatinbewegung offenbaren kann, die sonst schwer oder unmöglich nachzuweisen sind. In dieser Methode präsentieren wir eine Live-Zell-Bildgebungstechnik, um die Kernform mithilfe fluoreszenzmarkierter äußerer Nuklearhüllungsprotein WPP, das domäneninteragierende Protein 1 (WIP1)¹³ und Chromatin mittels zentromerischer Histon-H3 (CENH3)^14-Dynamik gleichzeitig unter Kontroll- und Salzstressbedingungen zu visualisieren und zu quantifizieren, mit dem Ziel, die Analyse von Veränderungen in der Kern- und Chromatindynamik, verursacht durch abiotische Stressoren, zu ermöglichen. Um diese Methode zu ermöglichen, haben wir eine WIP1-GFP/CENH3-mRFP-Linie von A. thaliana erstellt. Zusätzlich untersuchten wir die Chromatindynamik quantitativ mit dem TrackMate-Plugin der Open-Source-Software ImageJ/Fiji. Wir testeten eine duale fluoreszierende Linie und Chromatindynamik-Techniken, die hier unter Salzstressbedingungen präsentiert werden, und entdeckten eine Veränderung der centromerischen Foci-Morphologie und -Dynamik aufgrund von Spannungsbedingungen. Diese einfache und reproduzierbare Methode ist ideal für die Hochdurchsatzverfolgung der Kern- und Chromatindynamik in Arabidopsis-Wurzeln unter verschiedenen abiotischen Stressbedingungen.

Protocol

1. Anbau von A. thaliana-Setzlingen

1. Vorbereitung von Wachstumsmedien
   1. Geben Sie 800 ml reines Wasser in einen 1-Liter-Becher auf einer Rührplatte. Füge einen Rührstab in den Becher.
   2. Drehen Sie die Rührplatte bei 600 U/min ein.
   3. Gib 10 g Saccharose in den Becher.
   4. Gib 2,16 g Murashige und Skoog (MS) Wachstumsmedium in den Becher.
   5. Gib 5 mg Agar zu jeder der beiden 1-L-Medienflaschen.
   6. Beschrifte eine Flasche mit "1/2 MS" und die andere mit "100 mM NaCl".
   7. Beschrifte beide Flaschendeckel mit Autoklaven-Klebeband.
   8. Fügen Sie 5,84 g NaCl in die Flasche mit der Aufschrift "100 mM NaCl" hinzu.
   9. Füllen Sie den Becher mit 1 Liter reinem Wasser.
   10. Den Becher zurück auf die Rührplatte legen und warten, bis sich Saccharose und MS aufgelöst haben.
   11. Gießen Sie den Becherinhalt in einen 1-Liter-Graduiertenzylinder.
   12. Gießen Sie 500 ml des graduierten Zylinderinhalts in jede Flasche.
   13. Autoklaven-Wachstumsmedium und 250 ml reines Wasser mit einem 60-minütigen Flüssigkeitszyklus bei 121 °C.
       HINWEIS: Beim Autoklavieren von Medien und Wasser sollten die Deckel locker sein, um mögliche Explosionen zu vermeiden.
   14. Schraube die Deckel des Wachstumsmediums wieder auf.
   15. Invertiere Flaschen des Wachstumsmediums siebenmal, um sicherzustellen, dass der Agar vollständig verteilt ist.
   16. Lagern Sie das Wachstumsmedium in einem 4 °C Kühlschrank, bis Sie es brauchen, und lassen Sie es in der Mikrowelle verflüssigen.
2. Pflanzung von Wachstumsplatten und Samen
   1. In einer Durchflusshaube verwenden Sie eine Pipettenpistole, um 50 ml Wachstumsmedium in jede der zehn Platten zu pipettieren (Abbildung 1A).
   2. Während das Medium erstarrt, reinigen Sie WIP1-GFP x CENH3-mRFP-Samen, indem Sie sie 10 Minuten lang in ein Mikrozentrifugenrohr mit 1 ml 70% Ethanol füllen (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Beim Umgang mit Ethanol sollten Sie darauf achten, dass keine offenen Flammen in der Nähe sind.
   3. Nach 10 Minuten in der Flusshaube das Ethanol entfernen und die Samen zweimal mit 1 ml autoklaviertem Wasser spülen (Abbildung 1C).
   4. Sobald das Medium ausgehärtet ist, verwenden Sie eine 1000 μL Pipette, um gereinigte Samen in zwei Reihen mit je 14 Samen pro Platte auf Wachstumsplatten zu legen (Abbildung 1D).
   5. Beschriften Sie die Platten mit einem permanenten Marker und versiegeln Sie sie mit Mikroporenband, bevor Sie die Flusshaube verlassen (Abbildung 1E).
3. Keimende Setzlinge
   1. Wickeln Sie Wachstumsplatten in Alufolie und schichten Sie sie mindestens 2 Tage lang in einem Kühlschrank mit 4 °C kalt ab (Abbildung 1F).
   2. Nach der Kaltschichtung werden Teller aus dem Kühlschrank entfernt und vertikal unter Wachstumslampen (~80 μmol/m²/s) für mindestens 4 Tage gestellt (Abbildung 1G).
   3. Übertragen Sie die Hälfte der Platten auf 100 mM NaCl-Wachstumsmedium in der Durchflusshaube, dann versiegeln und beschriften Sie die Platten (Abbildung 1H).
   4. Pflanzenplatten 2 Tage lang unter Pflanzenlampen vor der Bildgebung (Abbildung 1I).

2. Lebende Zellbildgebung von A. thaliana-Wurzelkernen und Chromatin

1. Objektträgervorbereitung
   1. Pipetten Sie 60 μL reines Wassers auf eine Glasfolie (Abbildung 2A).
   2. Legt drei 6 Tage alte A. thaliana-Setzlinge ins Wasser (Abbildung 2B).
   3. Setzen Sie eine 22 mm × 22 mm große #1,5 Folienabdeckung über die Wurzeln, ohne die Blätter zu bedecken (Abbildung 2C).
2. Konfokalmikroskop-Einstellungen
   1. Stelle die Belichtungszeit des Lasers auf 1000 ms (1 s) ein.
   2. Im Laser-Kombinator wird der 488-nm-Laser auf 50 % für grünes fluoreszierendes Protein (GFP) und 561 nm auf 50 % für rotes fluoreszierendes Protein (RFP) eingestellt (Abbildung 2D). Bild mit 20× Objektiv ohne optischen Zoom. Wenn Sie länger als 10 Minuten aufnehmen, verringern Sie die Intensität, um das Photobleaching zu reduzieren.
   3. Stelle die Z-Schnitt-Schrittgröße auf 0,3 μm ein.
   4. Setze das Intervall auf 1 Minute und die Gesamtdauer auf 10 Minuten.
3. Bildgebung
   1. Finden Sie Wurzeln und wählen Sie bis zu 20 Z-Slices aus und nehmen Sie 16-Bit-Bilder auf.
   2. Starte Zeitraffer.
   3. Speichere Zeitraffer als TIFF-Datei mit verlustfreier Kompression.
   4. Übertrage die Daten zur Analyse an einen Computer.

3. Nachverfolgung und Analyse von Daten

HINWEIS: Man benötigt die Fiji-Version der Open-Source-Software ImageJ (empfohlene Version 1.54), die mit TrackMate vorinstalliert ist.

1. Initialisierung
   1. Bild öffnenJ/Fiji.
   2. Klicken Sie auf und ziehen Sie eine .vsi-Datei in das Hauptfenster der ImageJ/Fiji-Anwendung (Abbildung 3A).
   3. Ein Prompt mit dem Titel Bio-Formats Import Options erscheint; Klicken Sie unten rechts auf Ok (Abbildung 3B).
   4. Ein Prompt mit dem Titel Bio-Formate Serienoptionen erscheint. Stellen Sie sicher, dass Serie 1 ausgewählt ist, und klicken Sie unten links auf Ok (Abbildung 3C).
      HINWEIS: Die Datei kann eine Minute zum Laden benötigen, besonders wenn sie viele Z-Schichten oder Zeitpunkte hat.
   5. Sobald das Bild geöffnet ist (Abbildung 3D), teilen Sie die Signale auf, indem Sie im Hauptfenster ImageJ navigieren, um Bild > Farbe zu bilden > Kanäle zu teilen (Abbildung 3E). Dadurch entstehen zwei separate Fenster, eines für GFP-markierte Kerne und eines für RFP-markiertes Chromatin (Abbildung 3F).
2. Vorverarbeitungschromatin
   1. Bestimmen Sie, welches der beiden Fenster dem Chromatin entspricht.
   2. Klicken Sie auf das Chromatin-Fenster (Abbildung 3F) und wenden Sie die Z-Projekt-Operation an, indem Sie im Hauptfenster ImageJ navigieren, um > Stacks > Z-Projekt abzubilden (Abbildung 4A).
   3. Ändere den Projektionstyp auf Maximale Intensität und stelle sicher, dass Alle Zeitrahmen aktiv ist, dann klicke auf Ok (Abbildung 4B).
   4. Öffnen Sie das Kontrastmenü, indem Sie Strg+Shift+C drücken oder im Hauptfenster ImageJ navigieren, um das Bild zu bilden > > Helligkeit/Kontrast anzupassen (Abbildung 4C).
   5. Schieben Sie den zweiten Balken (mit Maximum beschriftet) nach links, bis das Chromatin gut sichtbar ist (Abbildung 4D).
3. Tracking-Chromatin
   1. Navigiere zu Plugins (Abbildung 5A).
   2. Klicken Sie auf den Pfeil nach unten im Plugin-Menü, um zur Tracking-Option zu scrollen (Abbildung 5A).
   3. Klicken Sie auf Tracking, dann auf TrackMate.
   4. Die Anfangseinstellungen erscheinen. Bestätigen Sie, dass die Kalibrierungseinstellungen korrekt sind, und klicken Sie dann auf Nächst (Abbildung 5B).
   5. Wählen Sie Schwellendetektor und klicken Sie auf Nächst (Abbildung 5C).
   6. Im Bildfenster gehen Sie zum letzten Bild des Zeitraffers (Abbildung 5D).
   7. Neben der Intensitätsschwelle klicken Sie auf Auto und dann auf Vorschau.
   8. Stellen Sie die Intensitätsschwelle ein und klicken Sie auf Vorschau. Stellen Sie den Schwellenwert immer wieder an und prüfen Sie die Vorschau, bis die Vorschau ausschließlich Chromatin enthält und nur minimale Rauschen enthält, und klicken Sie dann auf Nächst (Abbildung 5D).
   9. Die anfängliche Schwellenwerterkennung findet statt; klicken Sie auf Nächstes (Abbildung 5E).
   10. Manuell die Schwelle erhöhen, bis nur noch Chromatin sichtbar ist, dann auf Nächstes klicken (Abbildung 5F).
   11. Diese Seite erlaubt das Filtern von Spots. Ignoriere dies und klicke auf Nächst (Abbildung 6A).
   12. Wählen Sie Simple LAP Tracker und klicken Sie auf Nächst (Abbildung 6B). Der LAP-Tracker ist anwendbar, wenn sich verfolgte Objekte nicht verschmelzen oder aufteilen.
   13. Stellen Sie den maximalen Verbindungsabstand auf 5 Mikrometer, den Gap-schließenden Max-Abstand auf 15 Mikrometer und den gap-schließenden Max-Frame-Abstand auf 1 ein. Klicken Sie auf Nächstes (Abbildung 6C).
   14. Tracking wird erfolgen. Spuren erscheinen im ursprünglichen Bildfenster. Klicken Sie auf Nächstes (Abbildung 6D).
   15. Diese Seite ermöglicht das Filtern von Spuren. Drücken Sie unten links die grüne + Taste, um einen Filter zu erstellen, wählen Sie dann die Anzahl der Plätze im Streckenmodus und drücken Sie Auto (Abbildung 6E).
   16. Stellen Sie sicher, dass der Modus auf Above eingestellt ist. Dadurch werden Flecken eliminiert, die schnell auftauchen und wieder verschwinden.
   17. Weiter klicken (Abbildung 6E).
   18. Die Anzeigeoptionsseite ermöglicht den Export von Daten als CSV-Datei. Am unteren Rand der Seite klicken Sie auf die Schaltfläche Spuren und dann auf CSV exportieren (Abbildung 7A).
   19. Diese Seite ermöglicht integriertes Plotten; Ignoriere es und klicke auf Nächstes.
   20. Auf der letzten Seite speichere das Video mit dem Capture-Overlay und drücke auf Ausführen. Klicken Sie darauf und navigieren Sie dann zur Datei > speichern Sie als GIF > (Abbildung 7B).
4. Grundlegende Geschwindigkeitsanalyse
   1. Öffnen Sie die Tracks-CSV in einer Tabellenkalkulationssoftware.
   2. Löschen Sie alle Spalten außer TRACK_ID, POSITION_X, POSITION_Y, POSITION_T, FRAME und RADIUS.
   3. Die Plätze in jedem Track sind nicht in der richtigen Reihenfolge. Um sie zu ordnen, friere zuerst die obersten vier Zeilen ein und erstelle dann eine neue Spalte mit dem Titel TRACK_FRAME und kopiere und füge diese Formel in die Spalte ein: =concatenate(A4, "_", if(E4>9, E4, concatenate("0", E4))).
   4. Wählen Sie die TRACK_FRAME Spalte aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste darauf und klicken Sie dann auf Sortierblatt A–Z. Die Plätze innerhalb jeder Strecke sollten jetzt in der richtigen Reihenfolge sein.
   5. Um sicherzustellen, dass in der Mitte irgendeiner Spuren keine Punkte fehlen, erstellen Sie eine neue Spalte und verwenden Sie diese Formel: =if(E4>E3, E4-E3, "NA"). Stellen Sie sicher, dass der erste Platz jeder Spur "NA" und der Rest 1 zurückgibt.
   6. Erstellen Sie eine Spalte für Geschwindigkeit (Mikron/Bild) und fügen Sie folgende Formel ein: =if(H4="NA", "NA", sqrt((B4-B3)^2 + (C4-C3)^2)). Dabei wird der Satz des Pythagoras verwendet, um den Abstand zwischen zwei Punkten zu berechnen.
   7. Um dies in Geschwindigkeit (Mikron/Sekunde) zu übersetzen, erstellen Sie eine neue Spalte und fügen Sie folgende Formel ein: =IF(I5="NA", "NA", I5/(D5/E5)). Dadurch werden die Sekunden/Frames gefunden und die Mikrometer entsprechend übersetzt.

Results

Lebendzellbildgebung der Kernhülle und der Chromatindynamik
Wir erzeugten eine duale fluoreszierende Markerlinie, die das äußere Kernhüllenprotein WIP1-GFP und das zentromerische Chromatin CENH3-mRFP umfasst (Abbildung 8). 4 Tage alte Setzlinge wurden für 2 Tage auf die Kontrollplatte oder 100 mM NaCl-haltige Platten übertragen. Nach 2 Tagen Inkubation wird bei der Salzbehandlung eine deutliche Hemmung des Wurzelwachstums beobachtet, wie ...

Discussion

Die hier vorgestellte Methode ist ideal, um die Chromatindynamik zu verfolgen. Im Vergleich zu früheren Lebendzellbildgebungsverfahren mit separater Bildgebung ermöglicht die gleichzeitige Bildgebung von Kernen und Chromatin die Erforschung der Beziehung zwischen Kern- und Chromatindynamik. Dies kann Bewegungen wie Kernrotation und intranukleare Chromatinbewegung offenbaren, die sonst schwer nachzuweisen sind.

Als Methode zur Bildgebung von lebenden Zellen ist...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
½ Murashige und Skoog (MS) Medien	bioWorld	30630058
3M-Mikroporen-Bänder	Amazon	A-1530-0
Akquisitionssoftware	Olympus/Offensichtlich	CellSens
Agar	bioWorld	40100072
CENH3-mRFP	ABRC	CS799459
Deckungszettel	Genesee	29-116
Glasrutsche	Genesee	29-101
Bild/Fidschi	Open Source	https://imagej.net/software/fiji/downloads
Mikroskop	Olympus/Offensichtlich	IX83
Natriumchlorid	Fisher Scientific	BP358-212
Drehende Scheibe	Yokogawa	CSU-W1
Quadratische Petrischalen	Simport	26-275
Sucrose	bioWorld	41900152
WIP1-GFP	ABRC	CS39987