Forschungsartikel

Netzwerkpharmakologie, maschinelles Lernen und In-vivo-Validierung der Danzhi Jiangtang-Kapsel bei diabetischer Nephropathie

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DOI:

10.3791/71328

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28. Juli 2026

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1Anhui University of Chinese Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Danzhi Jiangtang-Kapsel (DJC) kann die diabetische Nephropathie (DN) abschwächen, was durch Veränderungen der Chemokin-Signalübertragung und der Pyroptose-Marker belegt wird, die durch Bioinformatik und in vivo-Validierung unterstützt werden.

Zusammenfassung

Obwohl die Danzhi Jiangtang-Kapsel (DJC) ein traditionelles chinesisches pflanzliches Präparat ist, das klinisch bei Diabetes verwendet wird, ist noch nicht vollständig geklärt, wie sie die Niere während der diabetischen Nephropathie (DN) schützen kann. Diese Untersuchung sollte mögliche Mechanismen untersuchen, durch die DJC DN beeinflusst, mit Schwerpunkt auf der NLR-Familie Pyrin-Domänen-enthaltende 3 (NLRP3)/Caspase-1/Gasdermin D (GSDMD) pyroptosebezogene Signalkaskade.

Eine integrierte Strategie, die Netzwerkpharmakologie und maschinelles Lernen kombiniert, wurde eingesetzt. Die Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) und das Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine (BATMAN-TCM) wurden verwendet, um bioaktive Inhaltsstoffe und deren entsprechende Proteinziele von DJC zu testen. DN-assoziierte Gene wurden aus Gene Expression Omnibus (GEO), GeneCards und Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) gewonnen. Wichtige Kandidatenziele wurden mit mehreren maschinellen Lernalgorithmen gescreent und gerankt. Die Bindungsaffinität zwischen den aktiven Inhaltsstoffen von DJC und den Kernzielen wurde mittels molekularer Andockung bewertet. Schließlich wurden die therapeutische Wirksamkeit und die vorhergesagten Mechanismen bei db/db-diabetischen Mäusen bewertet.

Die Analyse der Netzwerkpharmakologie identifizierte 599 DJC-Ziele und 68 sich überlappende Gene, die mit DN geteilt wurden. Mit maschinellen Lernalgorithmen wurden das C-C-Motiv Chemokin-Ligand 2 (CCL2) und CASP1 als priorisierte Kandidatenziele identifiziert. Das molekulare Andocken sagte mögliche starke Bindungsaffinitäten zwischen den aktiven Bestandteilen des DJC und diesen Kernproteinen voraus. Funktionelle Anreicherungsanalysen (GO/KEGG) deuteten darauf hin, dass die Modulation von DJC mit entzündlichen Reaktionen und dem MAPK-Weg assoziiert ist. Die In-vivo-Validierung zeigte, dass die Behandlung mit DJC Marker für Nierenschäden und Fibrose abschwächte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass DJC DN teilweise durch Veränderungen der Pyroptose-Signalübertragung des CCL2/C-C-Motivs im Zusammenhang mit dem Chemokinrezeptor 2 (CCR2)-bezogenen Signalwechsel abschwächen könnte.

Einleitung

Die globale Belastung durch Diabetes mellitus (DM) nimmt weiter zu und stellt eine gewaltige Herausforderung für die öffentliche Gesundheit dar. Schätzungsweise 5,2 Millionen Todesfälle jährlich resultieren aus DM und den damit verbundenen Komplikationen1. DN gilt als schwere mikrovaskuläre Komplikation und als wesentlicher Faktor zur Entwicklung der Endstadium der Nierenerkrankung (ESRD), die etwa 30–40 % der diabetischen Bevölkerung betrifft 2,3. Mehrere miteinander verknüpfte Faktoren tragen zum pathologischen Fortschreiten von DN bei, darunter metabolische Dysfunktion, hämodynamische Remodellierung und anhaltende Entzündungsreaktionen. Pathologische Schäden, darunter hohe Glukosewerte und Hyperlipidämie, aktivieren den von NLRP3/Caspase-1/GSDMD vermittelten Pyroptose-Weg und führen zu einem entzündlichen programmierten Tod in renalen Mesangial- und tubulären Epithelzellen, gefolgt von progressiven tubulointerstitiellen Läsionen4. Pyroptose ist durch einen Plasmamembranriss gekennzeichnet, der die Freisetzung von IL-1β und IL-185 vorantreibt. Solche proinflammatorisken Faktoren erhöhen die C-C-Motiv-Transkription des Chemokin-Liganden-2 (CCL2), fördern die Makrophageninfiltration und verstärken die pyroptotische Aktivierung weiter, wodurch die Nierenschädigung6 schrittweise verschlimmert. In der klinischen Praxis äußert sich diese Erkrankung in fortschreitender Albuminurie und einer allmählichen Verringerung der glomerulären Filtrationsrate, was zu irreversiblen Nierenschäden und einer deutlichen Verschlechterung der Lebensqualität der betroffenen Personen führen kann 7,8. Trotz Fortschritten in der medizinischen Versorgung gelingt es den aktuellen therapeutischen Strategien, die hauptsächlich auf strikter glykämischer und Blutdruckkontrolle ausgerichtet sind, oft nicht daran, das Fortschreiten der Krankheit vollständig zu stoppen. Während aufkommende Pharmakotherapien, darunter SGLT2-Blockierende, GLP-1-Agonisten und Mineralokortikoidrezeptorblocker sowie Stammzelltherapien und diätetäre Interventionen, erhebliche Aufmerksamkeit erregt haben und in Praxis9 immer häufiger werden, bleibt das Restrisiko für DN hoch. Daher bleibt die Entwicklung innovativer therapeutischer Substanzen eine dringende Forschungspriorität, insbesondere solche aus der traditionellen Medizin, die mehrere pathologische Signalwege gleichzeitig ansprechen können.

Danzhi Jiangtang Capsule (DJC), eine ausschließlich im Krankenhaus erhältliche Formulierung, die am ersten angeschlossenen Krankenhaus der Anhui Universität für Chinesische Medizin entwickelt wurde (Anhui Provincial Medical Institution Preparation Approval Nr. Z20090006; Patentnummer ZL200310112845.1; Batch Nr. 20220427), ist ein vielversprechender therapeutischer Kandidat. Sie muss versiegelt, in einer trockenen, belüfteten Umgebung gelagert und vor Licht geschützt sein. Die Formel besteht aus sechs traditionellen chinesischen Kräutern: Pseudostellaria heterophylla (Radix Pseudostellariae), Whitmania pigra (Hirudo), Alisma orientale (Alismatis rhizoma), Cuscuta chinensis (Cuscutae Semen), Paeonia suffruticosa (Moutan Cortex) und Rehmannia glutinosa (Rehmanniae Radix Praeparata) (5:4:4:3:2:5)10. In der klinischen Praxis hat DJC eine signifikante hypoglykämische Wirksamkeit und die Fähigkeit nachgewiesen, Marker für Nierenschäden bei Diabetikern zu senken11. Frühere Forschungen deuten darauf hin, dass DJC renoprotektive Effekte ausüben kann, indem es den Blutzuckerspiegel und den Lipidstoffwechselreguliert. Frühere Studien zu DJC konzentrierten sich hauptsächlich auf die Validierung eines Einzelwegs mit unsystematischer Zielauswahl. Daher integrierten wir Netzwerkpharmakologie und maschinelles Lernen, um aktive Komponenten zu screenen und Kern-Hub-Gene zu identifizieren, gefolgt von einer vorläufigen in vivo Validierung, um die Analyse zu stärken.

Die Netzwerkpharmakologie bietet eine effektive Strategie zur Analyse komplizierter pflanzlicher Verschreibungen. Dieses Framework integriert bioinformatische und systematische biologische Ansätze, computergestützte Chemie und Pharmakologie, um die "Multi-Komponenten-, Multi-Ziel- und Multi-Weg"-Mechanismen der Wirkstoffe zu entschlüsseln 15,16,17. Dieser ganzheitliche Ansatz ermöglicht eine strukturierte Untersuchung der komplexen Wechselwirkungen zwischen pflanzlichen Verbindungen und krankheitsspezifischen Netzwerken und deckt die synergistischen Effekte des TCM18 auf. Allerdings kann die traditionelle Netzwerkpharmakologie manchmal zu übermäßigem Rauschen in den Daten führen. Um dies zu überwinden, ermöglicht die Integration von Machine-Learning-Algorithmen eine präzise Auswertung von Kerncharakteristik-Genen aus groß angelegten Datensätzen. Darüber hinaus bietet das molekulare Andocken eine intuitive, dynamische Perspektive zur Vorhersage potenzieller Bindungsaffinitäten zwischen Arzneimittel und Biomolekül19.

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Protokoll

Screening auf bioaktive Verbindungen und potenzielle Ziele von DJC

Bioaktive Verbindungen der sechs Kräuter in DJC, Pseudostellaria heterophylla (Radix Pseudostellariae), Paeonia suffruticosa (Moutan Cortex), Cuscuta chinensis (Cuscutae Semen), Alisma orientale (Alismatis Rhizoma), Rehmannia glutinosa (Rehmanniae Radix Praeparata) und Whitmania pigra (Hirudo), wurden aus der TCMSP-Datenbank abgerufen. Das Screening erfolgte basierend auf pharmakokinetischen Parametern: orale Bioverfügbarkeit (OB) ≥ 30 % und Arzneimittelähnlichkeit (DL) ≥ 0,18. Für Whitmania pigra, das keine Daten im TCMSP enthält, wurden seine aktiven Verbindungen und Ziele aus dem BATMAN-TCM gewonnen, wobei ein Wert ≥ 20 und ein P-Wert < 0,05 als Auswahlkriterien verwendet wurden. UniProt wurde angewendet, um alle gesammelten Ziele in eine standardisierte Gennomenklatur zu vereinheitlichen.

Erwerb von DN-bezogenen Genen

DN-bezogene Gene wurden aus drei Quellen gesammelt. Zuerst wurden GeneCards und OMIM mit "diabetische Nephropathie" als Suchbegriff durchsucht. Gene von GeneCards mit einem Relevanzwert > 1 wurden beibehalten. Zweitens wurden drei Mikroarray-Profile (GSE30529, GSE104948, GSE96804) aus dem GEO-Repository gewonnen. Die Proben in GSE30529 stammten aus Nierentubuli, während die in GSE104948 und GSE96804 aus Nierenglomeruli stammten. Alle Datenbanksuchen wurden am 15. Dezember 2024 durchgeführt. Differenziell exprimierte Gene (DEGs) zwischen DN-Patienten und gesunden Kontrollpersonen im GSE30529-Datensatz wurden mit dem Limma-Paket in der R-Software identifiziert. Die Screening-Kriterien wurden auf einen angepassten p-Wert < 0,05 gesetzt und |log2(Fold Change)| > 0,5. Vulkandiagramme und Heatmaps zeigten unterschiedlich exprimierte Gene.

Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele von DJC für DN

Die Analyse des Venn-Diagramms identifizierte gemeinsame Loci zwischen dem DJC-Zielpool und DN-assoziierten Genen von GeneCards, OMIM und GSE30529 DEGs. Diese gemeinsamen Loci dienten als therapeutische Kandidaten für alle nachgelagerten Forschungsverfahren.

Aufbau und Profilierung von Proteininteraktionsnetzwerken (PPI)

Mutmaßliche therapeutische Loci wurden in STRING hochgeladen, um ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk zu konstruieren, mit einem Interaktions-Cutoff, der über einem Konfidenzwert von 0,4 gesetzt wurde. Cytoscape verarbeitete die Netzwerkdatensätze zur visuellen Darstellung. Topologische Indizes wie Degree wurden über das CytoNCA-Plugin berechnet, um Kernknoten im gesamten Netzwerk zu identifizieren.

Anreicherungsanalyse

Um die biologischen Rollen und Signalkaskaden, die mit Kandidatenzielen verbunden sind, abzugrenzen, wurde die funktionale Anreicherung in R mit dem clusterProfiler-Paket unter Verwendung von org. Hs.eg.db für Annotation und ggplot2 für Visualisierung. Genontologieterme (GO) wurden in den Kategorien biologischer Prozesse (BP), zellulärer Komponenten (CC) und molekularer Funktion (MF) bewertet. Die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-Wege wurden beibehalten, als der P-Wert der Anreicherung < 0,05 betrug.

Anwendung des CytoHubba-Algorithmus

Das CytoHubba-Plugin in Cytoscape wurde verwendet, um für jeden Netzwerkknoten vier topologische Zentralitätsindizes zu berechnen. Degree, die Anzahl der direkt verbundenen Nachbarn, spiegelt die Breite der Wechselwirkungen jedes Proteins wider. Die maximale Nachbarschaftskomponente (MNC), eine Metrik, die die Größe der größten zusammenhängenden Komponente im Nachbarschafts-Subgraphen des Knotens quantifiziert, misst den lokalen regulatorischen Einfluss. Die kantenperkolierte Komponente (EPC) bewertet die globale strukturelle Bedeutung mittels simulierter zufälliger Kantenentfernung und Quantifizierung der durchschnittlichen verbundenen Bauteilgröße. Gene, die zu den Top 20 für jeden Index gehörten, wurden gekreuzt, um die End-Hub-Gene zu erhalten.

Maschinelles Lernen basiertes Kerngen-Screening

Drei maschinelle Lernansätze wurden auf Expressionsprofile aus dem GSE30529-Datensatz angewandt, um zuverlässige Hub-Gene unter Kandidatenzielen zu identifizieren.

(1) LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator): Der Regularisierungsparameter λ wurde durch fünffache Kreuzvalidierung abgestimmt, wobei der optimale Wert durch die durchschnittliche Leistung über Faltungen hinweg bestimmt wurde. Eingabe-Genexpressionsmerkmale wurden automatisch mit Z-Score standardisiert, um Effekte der Expressionsgröße zu eliminieren. Mit dem Strafparameter α für die reine LASSO-Regularisierung auf 1 festgelegt, wurde für das Screening ein vordefiniertes Panel mit 100 λ-Werten verwendet. Die L1-Strafe schrumpfte die Koeffizienten von gering relevanten Features auf null, was eine gleichzeitige Merkmalsauswahl und Komplexitätskontrolle ermöglichte, während die cross-validation-abgestimmte Regularisierungsstärke das Risiko von Overfitting minderte.

(2) SVM-RFE (Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination): Ein zweischichtiges 5-faches Cross-Validing-Framework wurde eingesetzt, um eine robuste Feature-Screening sicherzustellen. Fünf nicht überlappende Teilmengen wurden durch stochastische Aufteilung des gesamten Datensatzes generiert, wobei vier für das Training und einer für Tests über fünf Iterationen verwendet wurden; Faltenweise Mittelwertung minderte Verzerrung durch Einzelstichproben-Splitting. Rekursive Feature-Elimination wurde angewendet, um die Feature-Dimensionalität zu reduzieren und die Modellkomplexität einzuschränken, wodurch Overfitting entging. Die Fehlerquote und Genauigkeit der Klassifikation dienten als Leistungskennzahlen, um die optimale Anzahl von Merkmalen zu bestimmen.

(3) Random Forest (RF): Ein anfänglicher 500-Baum-Random Forest wurde konstruiert, wobei die optimale Baumnummer durch die minimale Out-of-Bag-Klassifikationsfehlerrate bestimmt wird, um das endgültige Modell neu zu trainieren. Alle verbleibenden Hyperparameter, einschließlich der zufälligen Feature-Teilmengengröße bei jedem Knotensplit, wurden auf den Standardeinstellungen des Pakets beibehalten. Die Gen-Wichtigkeitswerte aus dem Endmodell wurden in absteigender Reihenfolge sortiert, um den Krankheitssignatur-Gensatz zu erzeugen. Der endgültige Satz der Kerngene wurde durch das Zusammenschneiden der Ergebnisse dieser drei Algorithmen bestimmt.

Unabhängige, datenbasierte Verifikation der Hub-Genexpression

Zwei unabhängige externe Datensätze, GSE104948 und GSE96804, wurden verwendet, um die Transkriptniveaus der Hub-Gene zu validieren. Genexpressionsdatensätze wurden normalisiert; Expressionsunterschiede zwischen DN-Fällen und gesunden Probanden wurden mit den ggplot2- und ggsignif-Toolkits von R dargestellt.

Molekulare Andockung

Die 3D-Konformierungen der Hub-Zielproteine (CASP1, PDB ID: 3E4C; CCL2, PDB ID: 7S00) wurden aus der Protein Data Bank gewonnen. Bioaktive 3D-Konformierungen wurden über PubChem beschafft. Ursolsäure, 3β-Hydroxyure-12-en-28-oic-Säure und Quercetin wurden für das Andocken ausgewählt, da die Netzwerkpharmakologie Wechselwirkungen zwischen diesen Wirkstoffen und den Kernzielen CCL2 oder CASP1 vorhersagte. Proteinstrukturen wurden vorbehandelt, indem native Liganden und Wassermoleküle entfernt wurden, polare Wasserstoffe eingeführt und anschließend mit AutoDock Vina molekularandockt wurden. Die Bindungsaffinität, dargestellt durch den Andockwert (in kcal/mol), diente dazu, die Stärke der Wechselwirkungen zu bewerten. Eine Bindungsenergieschwelle von −5,0 kcal/mol wurde festgelegt, um stabile intermolekulare Wechselwirkungen zu definieren. Die angedockten Konformierungen wurden mit PyMOL visualisiert.

Tiere und Versuchsdesign

Die vorliegende Studie verwendete 30 8 Wochen alte männliche db/db-Mäuse mit spezifischer pathogenfreier (SPF) Qualität sowie 10 altersgemässe männliche SPF-db/m-Mäuse . Alle experimentellen Mäuse wurden in einer SPF-Einrichtung unter einer 12-Stunden-Hell-Dunkel-Photoperiode aufgezogen und unter stabilen Bedingungen gehalten: 22 ± 2 °C, 50–70 % relative Luftfeuchtigkeit und uneingeschränkter Zugang zu regelmäßigem Futter und Trinkwasser. Die ethische Zulassung für alle in vivo experimentellen Protokolle wurde vom Tierethikkomitee der Anhui University of Chinese Medicine erteilt (Genehmigungsnummer AHUCM-mouse-2023059).

Nagetiere durchliefen eine 7-tägige Anpassungsphase vor einer zufälligen Gruppierung (je 6 Tiere) und 8 Wochen täglicher Intervention. Der Nüchternblutzucker wurde bei allen Versuchstieren gemessen; Tiere wurden mittels einer Zufallszahlentabelle zugeordnet, und Histologie, IHC und Western-Blot-Quantifizierung wurden unter blinder Untersuchung durchgeführt.

Normale Kontrollgruppe (CTL): db/m-Mäuse , die Kochsalzlösung durch orale Gavage erhalten.

Modellgruppe (M): db/db-Mäuse , die Kochsalzlösung durch orale Gavage erhalten.

DJC-Medium Dose (DJC-M) Gruppe: db/db-Mäuse erhalten DJC mit 0,78 g/kg (entspricht der klinischen Tagesdosis bei Erwachsenen).

DJC-High Dose (DJC-H) Gruppe: db/db-Mäuse erhalten DJC mit 1,56 g/kg (doppelt so viel klinische Tagesdosis wie Erwachsene).

Dosierungsvorbereitung

Die Dosisskalierung von Mensch zu Maus wurde mit dem Ansatz der Körperoberflächennormalisierung abgeleitet, wie in Methodology of Pharmacological Experiments beschrieben, mit einem Umwandlungskoeffizienten von 9,1. Die klinische Tagesdosis von DJC betrug 6 g für einen 70-kg-Erwachsenen (0,0857 g/kg), was Maus-äquivalente Dosen von 0,78 g/kg (1-fache klinische Dosis) und 1,56 g/kg (2-fache klinische Dosis) ergab. Alle Mäuse erhielten eine intragastrische Verabreichung mit einem konstanten Volumen von 10 ml/kg. DJC-Pulver wurde präzise gewogen und in 0,5 % CMC-Na-Lösung suspendiert, um einheitliche Suspensionen bei 78 mg/mL (mittlere Dosis) und 156 mg/mL (hohe Dosis) zu bilden.

Nach 8 Wochen täglicher Verabreichung wurde bei allen Versuchsmäusen eine Anästhesie mit 1 % Natriumpentobarbital eingeleitet. Blutproben wurden über die Bauchaorta entnommen und zentrifugiert, um die Supernatanten für kitbasierte biochemische Tests zu isolieren. Stoffwechselkäfige wurden verwendet, um Urinproben der Maus zu entnehmen. Partielle Nierengewebe wurden in 4%igen Paraformaldehyden fixiert, um Hämatoxylin-Eosin (HE) und Masson-Färbung zu erhalten. Im flüssigen Stickstoff gefroren, wurden Restnierengewebe bei −80 °C für nachgelagerte analytische Tests konserviert.

Histologische Analyse

Nach der Fixierung in 4%-Paraformaldehyd wurden die Nierengewebe graduiert mit Ethanol ausgetrocknet, beseitigt, Paraffin-Einbettung und 4-μm-Serienschnitt für die anschließende HE und Masson-Trichrom-Färbung durchgeführt. Die HE-Färbung erfolgte nach Standardverfahren (Deparaffinisierung, Rehydration, Hämatoxylin-Nuklearfärbung, Differentiation und Bläuung von versauertem Ethanol, Eosin-Gegenfärbung, Dehydration, Clearing und neutrales Balsam-Mounting), um die histopathologischen Veränderungen der Nierenregion zu beobachten. Die Schnitte wurden 3 Minuten in Hämatoxylin-Flecken eingetaucht, gefolgt von einer Eosin-Gegenfarbe für 15 Sekunden. Bei der Masson-Trichrom-Färbung wurden die Schnitte einer Deparaffinisation, Rehydratisierung, sequentieller Färbung, Differenzierung und Farbtrennung von Essigsäure unterzogen, gefolgt von Dehydrierung, Reinigung und Montage, um die Kollagenansammlung der Nierenbildung und fibrotische Veränderungen zu beurteilen. Eine Hellfeldmikroskopie wurde eingesetzt, um alle gefärbten Gewebeschnitte mit 200× Vergrößerung zu inspizieren und zu fotografieren. HE-gefärbte Abschnitte wurden mit dem Glomerularen Skleroseindex (GSI) bewertet. Für Massons Trichrom-Färbung wurde das Masson-Trichrome-Preset angewendet, um den blauen Kollagenkanal zu isolieren, und das Verhältnis von Kollagenfläche zu rot gefärbtem Gewebe wurde berechnet.

Immunhistochemie (IHC)

Nach der 24-Stunden-Fixierung mit 4 % Paraformaldehyd wurden Gewebeproben durch serielle Ethanolgradienten dehydriert, anschließend mit Paraffin eingebettet und in aufeinanderfolgende 5-μm-Abschnitte geschnitten. Nach der Deparaffinisierung wurden die Abschnitte antigenentnahme und endogene Peroxidase-Blockierung durchgeführt. Nach der Blockierung wurden Gewebeobjektträger über Nacht mit verdünnten primären Antikörpern bei 4 °C in einer feuchten Kammer inkubiert. Die Objektträger erhielten eine sekundäre Antikörper-Inkubation bei Raumtemperatur nach PBS-Waschungen, gefolgt von einer DAB-chromogenen Reaktion, bis die optimale Färbungsintensität erreicht war. Anschließend wurden die Schnitte sequentiell mit Hämatoxylin gefärbt, differenziert, gebräunt, ausgetrocknet, geräumt, auf Deckdecken montiert und mikroskopisch im Hellfeld fotografiert. Die Antigenentnahme erfolgte 10 Minuten durch Autoklavierung, gefolgt von natürlicher Abkühlung auf Raumtemperatur. Nach 60 Minuten Blockieren mit 5 % Ziegenserum bei Raumtemperatur wurden Abschnitte mit Primärantikörpern (1:200 Verdünnung) und anschließend HRP-konjugiertem Ziegenanti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:300 Verdünnung) jeweils 60 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Die chromogene DAB-Reaktion wurde 3–5 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt, mikroskopisch überwacht und durch Spülen mit destilliertem Wasser beendet. Die Bilder wurden mit ×200 Vergrößerung aufgenommen, und der Prozentsatz der positiven Färbungsfläche wurde mit ImageJ quantifiziert.

ELISA-Detektion

Die Testschritte entsprachen den offiziellen Protokollen, die von Kit-Anbietern bereitgestellt werden. Waschpuffer und seriell verdünnte Standards wurden im Voraus vorbereitet. Leer-, Standard- und Probenbrunnen wurden mit Reagenzien beladen und im Dunkeln inkubiert. Die Platten wurden nach der Inkubation gründlich gewaschen und dann im Dunkeln mit dem Enzym konjugiert. Nach dem Waschen wurde ein chromogenes Substrat für eine lichtgeschützte Farbreaktion hinzugefügt, die mit einem Stoppuffer beendet wurde, sobald in den Standardbohrungen deutliche Blauverläufe sichtbar wurden. Die Absorptionsfähigkeit (OD) jedes Bohrlochs wurde an der Zielwellenlänge mit einem Mikroplattenleser gemessen. Die Serumkonzentrationen von IL-1β und IL-18 wurden mithilfe von Kalibrierungskurven quantifiziert, die aus OD-Werten der Standardkonzentrationen erzeugt wurden (unverdünnte Serumproben; Absorption gemessen bei 450 nm; acht technische Replikationsbohrungen pro Probe). Urinkreatinin und 24-Stunden-Harnprotein wurden in unverdünnten Urinproben gemessen, die mit 24-Stunden-Stoffwechselkäfigen entnommen wurden (Absorption bei 546 nm; acht technische Replikaten pro Probe).

Echtzeit-quantitative PCR (RT-qPCR)

Die Gesamt-RNA wurde aus Nierengeweben isoliert, und ihre Reinheit sowie Konzentration wurden mittels Spektrophotometrie bestimmt. Gereinigte RNA wurde rückwärts transkribiert, um cDNA-Vorlagen zu erzeugen. RT-qPCR wurde auf einem Echtzeit-PCR-Gerät mit folgendem thermischen Zyklusprogramm durchgeführt: 5 Minuten Vordenaturierung (95 °C), gefolgt von 40 Verstärkungsrunden: 15 Sekunden bei 95 °C, 1 Minute bei 60 °C. RT-qPCR wurde in einer 10-μL-Reaktion durchgeführt, die 5 μL SYBR Green Master Mix, 0,2 μL Vorwärtsprimer und 0,2 μL Rückwärtsprimer enthielt, 1 μL cDNA-Vorlage und 3,6 μL RNase-freies Wasser. Die Reverse-Transkription zur cDNA-Synthese wurde in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 μL durchgeführt. Eine Schmelzkurvenanalyse wurde durchgeführt, um die Amplifikationsspezifität zu bestätigen, und jede Probe wurde in drei technischen Replikaten untersucht. Die Transkriptwerte wurden mittels 2⁻ΔΔCq-Normalisierung auf β-Actin bewertet, wobei alle Primer-Sequenzen in Tabelle 1 aufgeführt sind.

Western-Blot-Analyse

Aus jeder Mauskohorte wurden etwa 40 mg Nierengewebeproben entnommen, auf Eis gehackt und vollständig in einem Protein-Lysepuffer homogenisiert. Nach einer 15-minütigen Drehung bei 12.000 U/min bei 4 °C wurde das gesamte proteinhaltige Supernatant aus Gewebehomogenaten gesammelt, alicitiert und bei −80 °C kryokonserviert. Der Protein-Supernatant wurde mit einem Ladepuffer vermischt und durch Kochen in einem Wasserbad denaturiert. Etwa 10 μL normalisierte Proteinprobe wurden pro Lane geladen und auf 10%igen SDS-Polyacrylamid-Gelen getrennt. Zielproteine wurden durch Nass-Elektroblotting in Nitrocellulosefilter übertragen. Der Transfer erfolgte mit einem festen Strom von 400 mA in einem Eisbad für 30–45 Minuten. Nach dem Transfer wurden die Blots 2 Stunden lang in kalter fettarmer Milch inkubiert und dann über Nacht bei 4 °C mit 1:1.000 Primärantikörpern inkubiert. Gewaschene Flecken wurden mit passenden sekundären Antikörpern (1:10.000) bei 4 °C für 2 Stunden bedeckt, und lumineszente Bandsignale wurden mit der ImageJ-Software aus Blot-Fotos aufgezeichnet und quantifiziert. Für GSDMD-N wurde Tubulin als Laststeuerung verwendet, da sein erwartetes Molekulargewicht (~35 kDa) mit dem von GAPDH (~36 kDa) überlappt. Alle Western-Blot-Experimente wurden mit drei unabhängigen biologischen Replikaten durchgeführt.

Statistische Analyse

Quantitative Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) präsentiert. Die Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurden mit einem ungepaarten Student's t-Test analysiert, während Vergleiche zwischen mehreren Gruppen durch eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) und anschließend Tukeys Post-hoc-Test bewertet wurden. Ein p-Wert < 0,05 galt als statistisch signifikant.

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Ergebnisse

DJC-bioaktive Komponente und Zielerkennung

Insgesamt wurden 66 bioaktive Verbindungen identifiziert, die die Screening-Kriterien erfüllten (OB ≥ 30 % und DL ≥ 0,18), aus den sechs Kräutern aus DJC. Dazu gehörten 26 Verbindungen von Pseudostellaria heterophylla, 6 von Paeonia suffruticosa, 8 von Cuscuta chinensis, 6 von Alisma orientale, 10 von Rehmannia glutinosa und 10 von Whitmania pigra....

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Diskussion

DN bleibt eine Hauptursache für ESRD und zeichnet sich durch eine komplexe und multifaktorielle Pathogenese aus, die noch nicht vollständig verstandenist 20,21. Obwohl DJC eine vielversprechende klinische Wirksamkeit bei der Verbesserung des DN gezeigt hat, sind die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen weitgehend schwer fassbargeblieben 22. In dieser Studie nutzten wir ein Multi-Omics-Analyseverfahren...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch die Key Research Projects der Provinzuniversitäten der Provinz Anhui unterstützt (Zuschussnummer 2024AH050968).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Creatinin (CRE) Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC011-2-1
ECLBiosharpBL520B
Eosin FärbesetServicebioG1002
Goat anti-rabbit IgG-HRP KonjugatAbbkineA21020
Hämatoxylin FärbesetServicebioG1004
Masson's Trichrom FärbesetServicebioG1006
Mouse IL-1β ELISA KitMeiMianMM-0040M1
Mouse IL-18 ELISA KitMeiMianMM-0169M1
Rabbit anti-mouse Caspase1 AntikörperAffinityAF5418
Rabbit anti-mouse CCL2 AntikörperAbcamab315478
Rabbit anti-mouse cleaved-Caspase-1 AntikörperAffinityAF4005
Rabbit anti-mouse GAPDH AntikörperZenbioR380626
Rabbit anti-mouse GSDMD-N AntikörperAbcamab219800
Rabbit anti-mouse NLRP3 AntikörperAbcamab263899
Rabbit anti-mouse Tubulin AntikörperAffinityAF7011
Reverse Transkriptase KitBiosharpBL696A
RIPA Lysis BufferBeyotime BiotechnologyP0013
RIPA Lysis BufferLeagenePS0013
RNA Isolation ReagenzServicebioG3013-100ML
SYBR Green Master MixServicebioG3326-05
Urinary Protein Quantifizierung KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC035-2-1
SoftwarenameVersion
AutoDock Vina1.2.3
Cytoscape Software3.10.0
GraphPad Prism9.0
ImageJJava 1.8.0_345
PyMOL2.5
R Software4.2.0

Referenzen

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