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Forschungsartikel
* These authors contributed equally
Diese Studie kombiniert ein Modell der okularen Hypertonie von Ratten mit in-vitro-mechanischen Stämm-, Agonisten/Inhibitor- und siRNA-Experimenten in humanen skleralen Fibroblasten, um zu zeigen, dass die Expression von Piezo1 während der remodellierten skleraleren extrazellulärer Matrix erhöht ist und funktionell an der Myofibroblast-Differenzierung beteiligt ist.
Die durch mechanische Belastung induzierte Myofibroblast-Differenzierung ist ein zentraler Mechanismus, der der skleralen extrazellulären Matrix (ECM)-Remodellierung im Glaukom zugrunde liegt. Die Umwandlung mechanischer Belastung in biochemische Signale innerhalb von skleralen Fibroblasten ist jedoch weiterhin unzureichend aufgeklärt. Diese Studie hatte zum Ziel, die Rolle von Piezo1 bei der zellulären Proliferation und Differenzierung im Kontext der mechanisch-strain-induzierten Myofibroblast-Differenzierung während der skleralen ECM-Remodellierung zu untersuchen. Das Studiendesign kombiniert in vivo Expressionsbeobachtungen aus einem einwöchigen Modell der Ratten-Okulär-Hypertonie mit in vitro mechanistischen Assays unter Verwendung zyklischer mechanischer Dehnung (10 % bei 0,5 Hz bis zu 24 Stunden) und pharmakologischer Modulation von Piezo1 (Agonist Yoda1, Inhibitor GsMTx4 und siRNA-Knockdown) in primären humanen skleralen Fibroblasten (HSF-Zellen). Unsere Ergebnisse zeigen, dass Piezo1 in Skleralgewebe und HSF-Zellen exprimiert wird. Im in-vivo-Arm wurde nach einer Woche ein signifikanter Anstieg der Piezo1-Proteinspiegel in der Sklera der okulären hypertensiven Ratten beobachtet, was mit einer erhöhten Expression von Typ-I-Kollagen (COL1) und α-glattem Aktin (α-SMA) zusammenfiel. In den in-vitro-Experimenten erhöhte die mechanische Dehnung (8–24 Stunden) die Piezo1-Expression in HSF-Zellen. Darüber hinaus erleichterte die Aktivierung von Piezo1 mit Yoda1 (24 Stunden) die Proliferation von HSF-Zellen und verbesserte die Expression von α-SMA und COL1. Umgekehrt unterdrückte Knockdown oder Hemmung von Piezo1 die COL1-Expression und behinderte die Differenzierung von Myofibroblasten unter mechanischer Belastung. Zusätzlich führte die Aktivierung von Piezo1 zu einer Hochregulierung der Yes-assoziierten Proteinexpression (YAP), während die durch mechanische Belastung induzierte YAP-Expression bei Piezo1-Knockdown oder Hemmung verringert wurde. Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass Piezo1 eine Rolle bei der durch mechanische Belastung induzierten Expression wichtiger ECM-Komponenten in der Sklera im Zusammenhang mit Glaukom spielt und möglicherweise ein potenzielles therapeutisches Ziel darstellt, das eine weitere Validierung in vivo erfordert.
Glaukom ist eine der Hauptursachen für irreversible Blindheit, gekennzeichnet durch eine fortschreitende Degeneration von retinalen Ganglienzellen (RGCs) und Axonen des Sehnervkopfs (ONH), das im Jahr 2020 weltweit 76 Millionen Menschen betraf. Erhöhter Augendruck (IOP) ist der größte Risikofaktor für Glaukom3, und die IOP-Reduktion ist derzeit die einzige verfügbare Möglichkeit, die Entwicklung und Progression des Glaukoms zu verzögern4. Das ONH, die Struktur, an der die RGC-Axone das Auge verlassen, ist die Hauptstelle der Schäden beim Glaukom. Eine IOP-Erhöhung induziert mechanische Dehnung und Verschiebung im ONH, was zur Degeneration der RGC-Axone im laminaren Cribrosa (LC) führt und schließlich zur glaukomatösen Optikusneuropathie 5,6 führt.
Die peripapilläre Sklera (PPS) ist das wichtigste tragende Gewebe der ONH, wobei die mechanischen Eigenschaften der PPS die ONH-Antwort auf IOP-induzierte mechanische Dehnung 7,8 bestimmen. Finite-Elemente-Modellierung und ex-vivo-Studien bestätigten, dass die LC-biomechanische Dehnung auf der Sklerusteifigkeit beruht und eine erhöhte PPS-Steifigkeit zur Verringerung der Dehnung im LC 9,10 beiträgt. Dann kann die Variation in Steifigkeit11,12 und Dicke13 von PPS die IOP-bezogenen biomechanischen Eigenschaften des ONH verändern und so die Anfälligkeit für Glaukomatöse Sehnervschädenweiter erhöhen. In biomechanischen Studien war die okulare Steifität der glaukomatösen Sklera bei postmortalen menschlichen Augen größer als normal, und eine peripapilläre Skleraversteifung wurde sowohl bei menschlichem Glaukom als auch in experimentellen Tiermodellen18,19,20 konstant beobachtet. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Versteifung der Sklera eine Schutzreaktion durch eine verringerte IOP-induzierte ONH-Deformation während des Glaukoms sein könnte.
Die biomechanischen Eigenschaften des Skleragewebes sind das Ergebnis der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix, die von Fibroblasten21 synthetisiert wird. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass mechanische Belastung, die durch erhöhtes IOP entsteht, in der Lage ist, sklerale Fibroblasten in der Sclera22 zu aktivieren, die Myofibroblast-Differenzierung23 zu fördern und zu einer ECM-Remodellierung24,25 führt. Die durch mechanische Belastung induzierte Myofibroblastentransformation ist ein Schlüsselprozess während der skleralen ECM-Umgestaltung im Glaukom, aber es ist unklar, wie der mechanische Stamm in skleralen Fibroblasten in biochemische Signale und zelluläre Reaktionen umgewandelt wird.
Piezo1 ist ein Mitglied einer neuartigen, eigenständigen, nichtselektiven kationisch-mechanosensitiven Kanalfamilie, die an der Fibrose mehrerer Organe beteiligt ist, darunter Herz- und Lungenhaut26,27. Mechanische Belastung kann die zellulären Piezo1-Kanäle aktivieren, was zu einem erhöhtenCa-2+-Zufluss28 führt, wodurch kalziumabhängige Signalübertragung zur Regulierung verschiedener zellulärer Aktivitäten zur Regulierung verschiedener zellulärer Aktivitäten führt, darunter die Proliferation, Beweglichkeit und Differenzierung von Fibroblasten29,30. Neuere Studien zeigten, dass Piezo1 unter mechanischer Belastung die Hautfibrotischen Prozesse fördert, indem es die Proliferation, Beweglichkeit und Differenzierung von Fibroblasten stimuliert31. Diese Studie umfasst zwei komplementäre Komponenten: eine beschreibende in-vivo-Studie zur Piezo1-Expression in einem Modell der okulären Hypertonie der Ratten und eine mechanistische In-vitro-Studie mit primären menschlichen skleralen Fibroblasten unter zyklischer mechanischer Belastung. Wir stellten die Hypothese auf, dass der mechanische Druck Piezo1 aktiviert, was die Differenzierung von Myofibroblasten und die Expression von ECM-Komponenten in skleralen Fibroblasten fördert, möglicherweise über YAP-Signalisierung.
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Männliche Sprague-Dawley-Ratten (8 Wochen alt) stammen aus dem Fudan University Children's Hospital Experimental Animal Center. Alle Ratten wurden ad libitum und unter SPF-Bedingungen bei 22±1 °C und einem 12-Stunden-Tag/Nacht-Zyklus untergebracht. Alle Tierversuche folgten der ARVO-Erklärung zur Nutzung von Tieren in der Augen- und Sehforschung und wurden vom Institutionellen Überprüfungsausschuss und dem Ethikausschuss des Kinderkrankenhauses der Fudan-Universität genehmigt (2022JS-EKYY-019). Menschliches sklerales Gewebe, das zur Gewinnung primärer menschlicher skleraler Fibroblasten verwendet wird, wurde gemäß institutionellen Richtlinien aus Spendersklera gewonnen, und alle zugehörigen Verfahren wurden vom Institutional Review Board der Fudan-Universität genehmigt (2024-YS-187).
Versuchsdesign
Die vorliegende Studie verwendete sowohl in vivo- als auch in vitro-Ansätze, die konzeptionell durch mechanische Belastung miteinander verbunden sind, um den Beitrag von Piezo1 zur skleralen ECM-Remodellierung zu untersuchen. In vivo verwendeten wir ein Modell der okulären Hypertonie von Ratten, um die Expression von Piezo1 bei erhöhtem IOP zu untersuchen. In vitro unterzogen wir primäre humane sklerale Fibroblasten einer zyklischen mechanischen Dehnung, um die mechanische Belastung der Sklera im Glaukom zu modellieren, und manipulierten die Piezo1-Aktivität mit pharmakologischem Agonisten (Yoda1), Inhibitor (GsMTx4) und siRNA-Knockdown.
Experimentelles Modell der chronischen okulären Hypertonie (OHT)
Insgesamt wurden 18 männliche SD-Ratten eingesetzt. Bei jeder Ratte erhielt das rechte Auge eine Karbomerinjektion, um die okulare Hypertonie (OHT) auszulösen, wobei das kontralaterale linke Auge als Kontrollgruppe (NT) diente. Drei unabhängige biologische Replikationen des gesamten Experiments wurden durchgeführt, was insgesamt 18 Augen pro Gruppe ergibt. Die experimentelle Einheit war das einzelne Auge. Forscher, die IOP-Messungen und Western-Blot-Analysen durchführten, wurden gegenüber der Gruppenzuweisung blind.
Ein experimentelles chronisches OHT-Modell wurde bei Ratten erstellt, wie zuvorbeschrieben 25. Kurz gesagt wurden die Ratten mit 10 % Chloralhydrat betäubt, und nach der pupillaren Erweiterung durch Tropicamid wurde eine Carbomerlösung (0,3 %, 20 μL) in die vordere Augenkammer injiziert. Chlortetracyclinhydrochlorid wurde zur Verhinderung von Infektionen aufgetragen. IOP-Messungen wurden nach 3 und 7 Tagen mit einem Rebound-Tonometer durchgeführt. Gewebe aus der Sklera wurden eine Woche nach der Etablierung des Modells entnommen.
Die skleralen Gewebe wurden isoliert, wie zuvor in Detail25 beschrieben. Nach der Anästhesie wurden die Ratten transkardial mit 4 % Formaldehyd in PBS perfundiert. Aus dem Globus wurde das äußere Orbitalgewebe seziert, und die vorderen Segmentstrukturen (Hornhaut, Iris, Linse) sowie der Glaskörper wurden vorsichtig entfernt. Netzhaut und Choroidus wurden vorsichtig von der inneren Skleralwand abgekratzt. Das hintere Skleragewebe wurde entnommen und durch pathologische H&E-Färbung identifiziert.
Zellkultivierung
Primäre humane sklerale Fibroblasten (HSF-Zellen) waren eine zuvor etablierte Zelllinie aus der humanen Spendersklera32. Für jedes Experiment wurden drei unabhängige biologische Replikate (Zellen von drei verschiedenen Spendern) verwendet. HSF-Zellen wurden in DMEM erhalten, ergänzt mit 15 % fetalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin unter Standardkulturbedingungen (37 °C, 5 % CO2, befeuchtete Atmosphäre). Alle vier Tage wurden Kulturen geteilt, und HSF-Zellen zwischen Durchgängen 5 und 9 wurden für alle Experimente eingesetzt. HSF-Zellen wurden durch Immunfluoreszenz unter Verwendung von Kollagen-Typ-I- und α-glatten Muskel-Aktin-Markern bestätigt.
Anwendung mechanischer Stimulation
Das zyklisch-mechanische Dehnungssystem wurde verwendet, um mechanische zyklische Dehnung herzustellen. Für HSF-Zellen, die in Sechs-Wellen-Platten mit kollagenbeschichteten, flexiblen Böden wurden eine Aussaatdichte von 2×105 Zellen/mL verwendet. Die Zellen der Stretchgruppe wurden mit 10 % Amplitude und 0,5 Hz einer zyklischen Dehnung ausgesetzt, wie in unserer vorherigen Studie32 beschrieben. Zellen, die in Dehnplatten kultiviert wurden, aber statisch gelassen wurden, dienten als Kontrollen. Piezo1 siRNA-Knockdown-Experiment: Die Zellen erhielten vor der mechanischen Dehnung eine 48-stündige Transfektion von Piezo1 siRNA oder negativer Kontroll-siRNA. Nach der Transfektion unterzogen sich die Zellen einer zyklischen mechanischen Dehnung für 24 Stunden. Vier Gruppen wurden eingeschlossen: (A) kontrollierte siRNA-transfektierte Zellen ohne Dehnung; (B) Kontrolle von siRNA-transfektierten Zellen mit Stretch; (C) Piezo1 siRNA-transfizierte Zellen ohne Dehnung; (D) Piezo1 siRNA-transfektierte Zellen mit Stretch. Piezo1-Inhibitor (GsMTx4)-Experiment: Die Zellen wurden vor und während der mechanischen Dehnung mit 5 μM GsMTx4 behandelt. Vier Gruppen wurden eingeschlossen: (A) unbehandelte Zellen ohne Dehnung; (B) unbehandelte Zellen mit Dehnung; (C) GsMTx4-behandelte Zellen ohne Dehnung; (D) GsMTx4-behandelte Zellen mit Dehnung (wobei GsMTx4 durchgehend vorhanden ist). Piezo1-Agonistenexperiment (Yoda1): Zellen wurden in Anwesenheit von 5 μM Yoda1 für 24 Stunden kultiviert. Zwei Gruppen wurden eingeschlossen: (A) unbehandelte (Fahrzeug-)Kontrolle; (B) Yoda1-behandelte Zellen.
Westliche Blotting
Die Proteinwerte wurden mittels Western Blotting nach routinemäßigen Verfahren bewertet. Kurz gesagt, haben wir sklerule oder kultivierte Fibroblastenproben im RIPA-Puffer lysiert. Das Protein (20 μg) wurde durch SDS-PAGE aufgelöst und anschließend auf Nitrocellulosemembranen abgetupfert. Die Membranen wurden anschließend mit 5 % BSA für 1 Stunde bei Umgebungstemperatur blockiert, gefolgt von einer nächtlichen Inkubation bei 4 °C mit den entsprechenden primären Antikörpern. Zu den verwendeten Antikörpern gehörten Piezo1, Kollagen Typ I, α-glatte Musculus Aktin, YAP und GAPDH. Der Piezo1-Antikörper wurde vom Hersteller auf Western Blot und Immunfluoreszenz in Ratten- und menschlichem Gewebe validiert, wobei Knockout-/Knockdown-Daten auf dem Produktblatt verfügbar sind. Nach drei Waschen mit TBST inkubierten wir die Membranen mit geeigneten HRP-konjugierten sekundären Antikörpern (Anti-Kaninchen oder Anti-Maus) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Bandintensitäten wurden anschließend mit Bildanalysesoftware gemessen, und das Signal jedes Zielbandes wurde auf das GAPDH-Signal derselben Spur normalisiert. Die resultierenden Daten werden als Falt-Änderung relativ zur Kontrollbedingung dargestellt.
Zellproliferation
Die Zellproliferation wurde durch einen kolorimetrischen Viabilitätstest nach dem bereitgestellten Protokoll bewertet. Wir fügten jedem Brunnen eine Tetrazoliumverbindung (10 μL/mL) hinzu und inkubierten die Platten 2 Stunden unter Standardkulturbedingungen (37 °C, 5 % CO2). Die Absorption wurde dann mit 450 nm gemessen.
Kleine interferierende RNA-Transfektion
Die Piezo1-siRNA-Transfektion wurde wie zuvor beschriebendurchgeführt. Die Sequenzen waren wie folgt: Piezo1-siRNA, 5'-AGAAGAAGAUCGUCAAGUATT-3' (Sinn) und 5'-UACUUGACGAUCUUCUUCUTT-3' (Antisense), negative Kontrolle (NC) siRNA, 5'-GUGAGCGUCUAUAUACCAUTT-3' (Sinn) und 5'-AUGGUAUAUAGACCUCACTT-3' (Antisense).
Immunfluoreszenz
Zur Immunfluoreszenz wurden kultivierte Zellen mit 4 % Paraformaldehyd fixiert (20 min, Raumtemperatur), permeabilisiert mit 0,1 % Triton X-100 (40 min) und anschließend mit 10 % BSA blockiert. Gewebeschnitte wurden über Nacht in 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur fixiert, gefolgt von Permeabilisierung und Blockierung. Die Proben wurden mit primären Antikörpern gegen Piezo1 und α-SMA inkubiert. Anschließend trugen wir fluoreszierende, farbstoffkonjugierte sekundäre Antikörper auf: grün markierte Anti-Maus (für α-SMA) und rot-markierte Anti-Kaninchen (für Piezo1), jeweils mit 1:500 Verdünnung. Die Kerne wurden mit DAPI gegenfärbt, und die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen.
Behandlung von Agonisten und Inhibitoren
HSF-Zellen wurden mit 5 μM GsMTx4 und 5 μM des Piezo1-Agonisten Yoda1 behandelt, basierend auf früheren Studien33.
Statistische Analyse
Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) präsentiert. Für Vergleiche zwischen zwei Gruppen haben wir einen zweiseitigen Schüler-t-Test angewendet. Mehrere Gruppenvergleiche wurden mit einseitiger ANOVA durchgeführt, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test. Die Normalität der Daten wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test überprüft, und die Homogenität der Varianzen wurde mit dem Levene-Test bewertet. Die statistische Signifikanz wurde als p < 0,05 definiert. Alle statistischen Analysen wurden mit spezieller Statistiksoftware durchgeführt.
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Piezo1 wird in Rattensklerageweben und HSF-Zellen exprimiert.
Zunächst untersuchten wir die Piezo1-Expression sowohl in Ratten-Skleralgewebe (in vivo) als auch in kultivierten humanen skleralen Fibroblasten (in vitro). Um die gewebespezifische Expression von Piezo1 zu untersuchen, wurde die BioGPS-Genannotationsdatenbank34 verwendet. Die BioGPS-Analyse zeigte, dass Piezo1 in verschiedenen Augengeweben, darunter Netzhaut...
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Erhöhter intraokularer Druck (IOP) induziert mechanische Belastung im Kopf des Sehnervs und im laminaren Cribrosa und trägt zur Degeneration der retinalen Ganglienzellen38,39 bei. Die peripapilläre Sklera (PPS) ist ein bedeutendes belastendes Gewebe, das die ONH-Biomechanikbeeinflusst 40. Frühere Studien haben gezeigt, dass mechanische Belastung die Differenzierung von skleralen Fibroblasten zu Myofibrobla...
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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.
Diese Arbeit wurde von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung Chinas unterstützt (Zuschuss Nr. 82401257).
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0.3% carbomer solution (Carbomer 940 polymer) | Solarbio, Shanghai, China | — | 20 μL |
| 10% chloral hydrate | Macklin, Shanghai, China | — | 3 mL/kg |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | — | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | — | |
| BioFlex six-well culture plates (coated with collagen I) | Flexcell Int Corp, Hillsborough, NC, USA | — | |
| Chlortetracycline hydrochloride | Zhenhua Pharmaceutical, Yunnan, China | — | |
| COL1 primary antibody | Novus Biologicals, CO, USA | — | |
| DMEM | Gibco, Grand Island, NY, USA | — | |
| FBS | Gibco Life Technologies, Australia | — | |
| GAPDH primary antibody | Bioworld, MN, USA | — | |
| GraphPad Prism version 8.4 | Inc., San Diego, CA, USA | — | |
| Nikon Eclipse E800 microscope | Nikon, Melville, NY, USA | — | |
| Nitrocellulose membranes | Pierce, Rockford, IL, USA | — | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, South Logan, UT, USA | — | |
| Piezo1 primary antibody | Novus Biologicals, CO, USA | — | |
| Rebound tonometer (TonoLab) | Icare, Espoo, Finland | — | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific, Shanghai, China | — | |
| The Flexcell FX-5000 Tension System | Flexcell International Corporation | — | Used to apply mechanical cyclic stretch to HSF cells. |
| Tropicamide | Bausch Lomb Freda, Shandong, China | — | |
| YAP primary antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, USA | — | |
| α-SMA primary antibody | Abcam, Cambridge, UK | — |
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