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Forschungsartikel
Diese Studie bewertet SUCNR1 und GPR37L1 als potenzielle schizophrenieassoziierte molekulare Marker durch integrierte bioinformatische Analyse des GSE54913-Datensatzes, quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsvalidierung (qRT-PCR) und Korrelationsanalyse mit verbalem Gedächtnis in einer unabhängigen Kohorte.
Schizophrenie ist eine schwere, komplexe und multifaktorielle psychische Störung, die zahlreiche genetische Anfälligkeitselemente betrifft und zu erheblicher Behinderung, Morbidität und Mortalität führt. Trotz erheblicher Fortschritte im Verständnis ihrer Pathophysiologie und Ätiologie bleiben spezifische diagnostische Biomarker für Schizophrenie schwer zu finden. Diese Studie hatte zum Ziel, potenzielle molekulare Marker zu identifizieren, die mit Schizophrenie assoziiert sind. Eine integrierte bioinformatische Analyse wurde auf dem öffentlichen Mikroarray-Datensatz GSE54913 durchgeführt. Analysen der Gene Ontology (GO) und der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Signalwege zeigten, dass die am stärksten angereicherten GO-Begriffe mit der Kanalaktivität zusammenhingen, einschließlich passiver transmembraner Transporteraktivität, Ionenkanalaktivität, gesperrter Kanalaktivität und substratspezifischer Kanalaktivität. Die fünf wichtigsten angereicherten KEGG-Signalwege waren die Insulinsekretion, der cAMP-Signalweg, die Reparatur der Nukleotid-Exzision, der TNF-Signalweg und der Glutathionstoffwechsel. Die Validierung erfolgte mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) auf einer unabhängigen Stichprobe des Wuhan Rongjun Youfu Hospitals. Die qRT-PCR-Ergebnisse stimmten weitgehend mit der Mikroarray-Analyse überein (Pearson r = 0,89, 95%-KI: 0,66–0,97). Die Analyse des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks (PPI) identifizierte zwei Hub-Gene, SUCNR1 und GPR37L1, die signifikant mit dem GO-Begriff "Ionenkanalaktivität" assoziiert und im KEGG-Weg "Insulinsekretion" angereichert sind. Darüber hinaus zeigte die SUCNR1-Expression eine negative Korrelation zu den verbalen Gedächtniswerten (r = -0,54, P = 0,015), während GPR37L1 Ausdruck eine positive Korrelation zeigte (r = 0,59, P = 0,0034). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass veränderte Expression von SUCNR1 und GPR37L1 mit Schizophrenie assoziiert sein könnten und potenzielle molekulare Marker für weitere Untersuchungen darstellen könnten.
Schizophrenie ist eine chronische und komplexe psychische Störung unbekannter Ursache, gekennzeichnet durch schwere Hirnfunktionsstörungen, kognitive Beeinträchtigungen und psychosoziale Defizite. Sie stellt eine erhebliche globale Gesundheitsbelastung dar und betrifft weltweit über 21 Millionen Menschen2. Obwohl sich die diagnostischen und therapeutischen Ansätze in den letzten fünfzig Jahren erheblich weiterentwickelt haben, bleibt die Kernpathogenese unklar, und langfristige Ergebnisse mit erheblicher Behinderung, Morbidität und Mortalität haben sich nicht signifikant verbessert3. Daher ist es unerlässlich, potenzielle zentrale Gene und regulatorische Ziele zu identifizieren.
Die Pathophysiologie der Schizophrenie wird zwar nicht vollständig geklärt, wird aber weithin auf genetische Polymorphismen und Expressionsvariationen zurückgeführt4. Beispielsweise kann genetische Variation im Östrogen-Alpha-Gen die Anfälligkeit für Schizophrenie durch alternative Genregulation und Transkriptverarbeitungbeeinflussen. Ähnlich wurde eine funktionelle Promotorvariante von NRG1 mit Schizophrenie in Verbindung gebracht und mit einer reduzierten Expression der Typ-III-NRG1-Isoform6 korreliert. Postmortale Studien haben eine signifikant reduzierte Expression von PDE4B-Isoformen in schizophrenen Gehirnen gezeigt, was auf ihr prädiktives Potenzial7 hindeutet. Weitere Kandidaten sind der Dopamintransporter (DAT), der vesikuläre Monoamintransporter (VMAT2) und die Monoaminoxidase (MAO), die den synaptischen Dopaminspiegel regulieren und als Biomarker8 dienen können. Zusätzlich kann TCP1 durch eine falsche Aktinfaltung bei Schizophrenie9 zu zytoskelettalen Defiziten beitragen. Daher könnte die Aufklärung von Genexpressionsprofilen in der Pathogenese der Schizophrenie Einblicke in Risikovorhersage, mechanistisches Verständnis und therapeutische Bewertung liefern.
Jüngste rechnergestützte Ansätze haben die Identifikation krankheitsassoziierter Gene durch integrierte Netzwerkanalyse und maschinelles Lernen vorangebracht 10,11,12. Trotz zahlreicher genetischer Studien wurden keine zuverlässigen, blutbasierten diagnostischen Biomarker in die klinische Praxis der Schizophrenie übertragen. Um diese Lücke zu schließen, verwendete die vorliegende Studie einen integrierten bioinformatischen Ansatz, um den GSE54913-Datensatz neu zu analysieren, der blutbasierte transkriptomische Daten von gut charakterisierten Patienten mit Schizophrenie und gesunden Kontrollpersonen enthält. Der Datensatz wurde ausgewählt, weil (1) periphere Blutproben minimalinvasiv und klinisch praktikabel sind, (2) er eine relativ große Stichprobengröße unter öffentlich zugänglichen Schizophrenie-Mikroarray-Datensätzen enthält und (3) Rohdaten für eine Neuanalyse verfügbar waren. Die Ziele dieser Studie waren: (1) differenziell exprimierte Gene bei Schizophreniepatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen anhand des GSE54913-Datensatzes zu identifizieren; (2) Durchführung funktioneller Anreicherung und PPI-Netzwerkanalysen zur Identifizierung von Hub-Genen; (3) Validierung der Expression von Kandidatengenen durch qRT-PCR in einer unabhängigen Kohorte; und (4) die Korrelation der Hub-Genexpression mit der Leistung des verbalen Gedächtnisses zu untersuchen. Nach Kenntnis der Autoren ist dies die erste Studie, die SUCNR1 und GPR37L1 als mögliche blutbasierte molekulare Marker für Schizophrenie identifiziert.
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Diese Studie wurde vom Ethikausschuss des Wuhan Rongjun Youfu Krankenhauses (Projektidentifikationscode, YF-IRB202310215) genehmigt und gemäß den Grundsätzen der Helsinkier Erklärung durchgeführt. Alle Teilnehmer waren Bewohner der chinesischen Gemeinde und gaben schriftliche informierte Einwilligung.
Studienpersonen und Blutproben
Zehn Erwachsene mit Schizophrenie und zehn gesunde Kontrollfreiwillige ohne familiäre Vorgeschichte psychischer Erkrankungen innerhalb von drei Generationen wurden aufgenommen. Einschlusskriterien für Schizophreniepatienten: (1) Diagnose der Schizophrenie gemäß den DSM-5-Kriterien, bestätigt von zwei unabhängigen leitenden Psychiatern; (2) 18–65 Jahre alt; (3) keine Änderung des Antipsychotikums für mindestens 4 Wochen vor der Blutentnahme; (4) Bereitschaft, schriftliche informierte Zustimmung zu geben. Ausschlusskriterien: (1) Begleiterkrankungen schwerer medizinischer Erkrankungen (z. B. Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Krebs); (2) Substanzmissbrauch oder Abhängigkeit in den letzten 6 Monaten; (3) geistige Behinderung; (4) Schwangerschaft oder Laktation. Einschlusskriterien für gesunde Kontrollpersonen: (1) keine persönliche oder familiäre Vorgeschichte (innerhalb von drei Generationen) einer psychischen Erkrankung; (2) keine aktuelle oder frühere Verwendung von Antipsychotika; (3) Alters- und Geschlechtsübereinstimmung mit der Schizophreniegruppe; (4) keine schweren medizinischen Erkrankungen. Die mittlere Krankheitsdauer bei Schizophreniepatienten betrug 12,5 ± 6,8 Jahre; Alle Patienten erhielten stabile antipsychotische Medikamente (6 mit Risperidon, 4 mit Olanzapin); der mittlere PANSS-Gesamtscore lag bei 76,4 ± 12,3. Die Kontrollgruppen wurden hinsichtlich Alter (±5 Jahre) und Geschlecht (5 Männer, 5 Frauen pro Gruppe) abgeglichen. Das verbale Gedächtnis wurde anhand des Gesamtabrufs im Hopkins Verbal Learning Test–Revised (HVLT-R) bewertet. Alle Probanden wurden zwischen dem 1. Januar und dem 31. Juli 2025 vom Wuhan Rongjun Youfu Hospital rekrutiert. Die Basisdemografie ist in Tabelle 1 zusammengefasst.
Die Stichprobengröße wurde mittels einer Stichprobengrößenberechnungssoftware für einen zweiseitigen unabhängigen t-Test mit einer Effektgröße von 1,2, α = 0,05 und Leistung (1-β) = 0,80 bestimmt, was mindestens neun Probanden pro Gruppe ergibt.
Venöses Blut wurde in EDTA-antikoagulierte Röhren entnommen und ohne Verzögerung verarbeitet. Periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs) wurden anschließend durch Dichtegradientenzentrifugation mit einem Dichtegradientenmedium von den Proben getrennt. Kurz gesagt wurde das Blut 1:1 mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) verdünnt, auf das Dichtegradientenmedium gelegt und bei 400 × g für 30 Minuten bei 20 °C mit ausgeschalteter Bremse zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde die PBMC-enthaltende Schnittstelle vorsichtig auf ein neues Rohr übertragen. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gespült, wobei jede Wäsche von einer Zentrifugation bei 300 × g für 10 Minuten bei 4 °C gefolgt war, und das letzte Pellet wurde in PBS suspendiert. Die Viabilität wurde mit der Trypan-blauen Farbstoff-Ausschlussmethode bewertet, und es wurden nur Präparate mit ≥95 % lebensfähigen Zellen verwendet. Isolierte PBMCs wurden aliquotiert und maximal 3 Monate bei −80 °C gelagert, bevor die RNA-Extraktion erfolgte.
Mikroarray-Daten
Der Arbeitsablauf der Studie ist in Abbildung 1 dargestellt. Der GSE54913 Microarray-Datensatz wurde aus der GEO-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) heruntergeladen. Dieser Datensatz wurde ausgewählt, weil (1) er transkriptomische Daten aus peripheren Blutproben enthält, die minimal invasiv und klinisch für die Biomarkerentdeckung geeignet sind; (2) es umfasst eine relativ große Stichprobe unter öffentlich zugänglichen Schizophrenie-Mikroarray-Datensätzen (18 Patienten, 12 Kontrollen); (3) Die Rohdaten standen für eine Neuanalyse zur Verfügung. Laut dem GEO-Datensatz wurden die Proben aus peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMCs) gewonnen, nicht aus Plasma. Die ursprüngliche Beschreibung 'Plasmaproben' in der vorherigen Version war ein Fehler und wurde korrigiert.
Datenvorverarbeitung und differentiell exprimierte Gen-(DEG)-Screening
Rohdaten (. CEL-Dateien) wurden mit Mikroarray-Vorverarbeitungssoftware vorbearbeitet. Die Hintergrundkorrektur wurde mit der Robust Multichip Average (RMA)-Methode durchgeführt, gefolgt von Quantilnormalisierung und log2-Transformation. Sonden ohne Genannotation wurden herausgefiltert. Sonden mit >20 % fehlenden Werten in den Stichproben wurden ausgeschlossen; Fehlende Werte für die verbleibenden Sonden wurden mit dem k-nächsten Nachbarn-Algorithmus (k = 10) imputiert, der in fehlenden Wert-Imputationssoftware implementiert wird. Batch-Effekte waren nicht vorhanden, da alle Proben gemäß dem GEO-Datensatz in einer einzigen Charge verarbeitet wurden. Nach der Vorverarbeitung wurden Expressionswerte für 17.200 Gene für die nachgelagerte Analyse ermittelt. DEGs zwischen Schizophreniepatienten und gesunden Kontrollpersonen wurden mit Software zur differentiellen Expressionsanalyse identifiziert. Gene mit einer False Discovery Rate (FDR) < 0,05, absoluter Faltungsänderung (FC) > 1,2 und P < 0,05 wurden als differenziell exprimiert betrachtet. Ein relativ niedriger FC-Schwellenwert (absoluter FC > 1,2) wurde gewählt, da Schizophrenie eine komplexe psychiatrische Störung ist, bei der individuelle Genexpressionsunterschiede oft subtil statt dramatisch sind.
GO- und Signalweganreicherungsanalysen
Funktionelle Anreicherungsanalysen für Genontologie (GO)-Begriffe und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) wurden mit funktioneller Anreicherungsanalysesoftware durchgeführt. Der Hintergrundgensatz bestand aus allen Genen, die die Vorverarbeitung bestanden haben (17.200 Gene). Anreicherungsterme und -wege mit rohen P-Werten < 0,05 wurden gemeldet. Da für GO- und KEGG-Anreicherungsausgaben rohe P-Werte verwendet wurden, sollten diese Ergebnisse als explorativ interpretiert werden.
PPI-Netzwerkanalyse und Hub-Gen-Identifikation
Eine Protein-Protein-Interaktionsdatenbank wurde verwendet, um ein PPI-Netzwerk zu erstellen, wobei ein kombinierter Interaktionswert > 0,9 als Schwelle festgelegt wurde. Das Netzwerk wurde mit Netzwerkvisualisierungssoftware visualisiert. Hub-Gene wurden mithilfe eines Hub-Gen-Identifikations-Plugins mit dem Degree-Algorithmus identifiziert. Die 10 besten Knoten mit den höchsten Gradwerten wurden als Hub-Gene ausgewählt. Das Subnetzwerk der Schlüssel-Hub-Gene wurde mit einem Subnetzwerk-Extraktions-Plugin mit Standardparametern extrahiert (Grad-Cutoff = 2, Knoten-Score-Cutoff = 0,2, K-Core = 2, maximale Tiefe = 100).
Totale RNA-Isolierung und qRT-PCR
β-Actin wurde als internes Referenzgen (Haushaltsgen) verwendet. Die Stabilität der β-Aktin-Expression über die Proben hinweg wurde durch keinen signifikanten Unterschied in den CT-Werten zwischen der Schizophrenie- und Kontrollgruppe bestätigt (P > 0,05). Die relative Quantifizierung wurde mit der 2−ΔΔCt-Methode durchgeführt. Alle Reaktionen wurden in Dreifachform durchgeführt, und der mittlere Ct-Wert wurde für die Berechnung verwendet (siehe Primer-Sequenzen in Tabelle 2). Die zehn wichtigsten DEGs (fünf am stärksten hochregulierten und fünf am stärksten durch Faltänderung herunterreguliert) wurden für die erste qRT-PCR-Validierung ausgewählt, um die Gesamtzuverlässigkeit der Mikroarray-Daten zu bestätigen. Anschließend wurden SUCNR1 und GPR37L1 für eine fokussierte Validierung anhand von drei Kriterien ausgewählt: (1) sie wurden als Hub-Gene in der PPI-Netzwerkanalyse identifiziert (Grad ≥ 7); (2) sie waren signifikant mit dem Top-angereicherten GO-Begriff 'Ionenkanalaktivität' und dem KEGG-Weg 'Insulinsekretion' assoziiert; (3) beide kodieren GPCRs, die bekannte Medikamentenziele bei Schizophrenie sind.
Statistische Analyse
Die Normalität wurde mit dem Shapiro–Wilk-Test bewertet. Variablen mit einer ungefähren Normalverteilung (P > 0,05) wurden mit parametrischen Methoden analysiert, darunter Student's t-Test für Zweigruppenvergleiche und Einweg-ANOVA für Vergleiche mit mehr als zwei Gruppen. Wenn die Normalitätsannahme nicht erfüllt war, wurden je nach Bedarf Mann–Whitney U - oder Kruskal–Wallis-Tests verwendet. Alle statistischen Tests waren zweiseitig. Für mehrere Vergleiche (z. B. bei ANOVA Post-hoc-Tests) wurde die Benjamini-Hochberg-Falschentdeckungsrate (FDR)-Methode angewandt, mit einem FDR-Schwellenwert von 0,05. Bei Korrelationsanalysen wurde keine Mehrfachvergleichskorrektur angewendet, da nur zwei Korrelationen durchgeführt wurden; die rohen P-Werte werden mit Vorsicht angegeben.
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Identifikation von DEGs und hierarchischer Clustering
Die Analyse des GSE54913-Datensatzes identifizierte 473 differenziell exprimierte Gene (DEGs), darunter 357 hochregulierte und 116 herunterregulierte Gene, zwischen Schizophreniepatienten und Kontrollpersonen (Abbildung 2A,B). Die hierarchische Clusterbildung dieser DEGs unterschied Schizophrenieproben von Kontrollen (Abbildung 2C).
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Schizophrenie ist eine schwere, multifaktorielle Störung, die zahlreiche genetische Anfälligkeitsfaktorenbetrifft. Obwohl Fortschritte bei der Pathophysiologie erzielt wurden, fehlen weiterhin zuverlässige diagnostische Biomarker. In dieser Studie identifizierte ein integrierter bioinformatischer Ansatz 473 DEG in Blutproben von Patienten mit Schizophrenie. GO- und KEGG-Analysen hoben die Anreicherung von kanalaktivitätsbezogenen...
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Diese Studie wurde vom Noncommunicable Chronic Diseases-National Science and Technology Major Project of China (2025ZD0549004) unterstützt.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| affy | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/affy/ | microarray preprocessing software. Description: R package for microarray preprocessing |
| clusterProfiler | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/ | functional enrichment analysis software. Description: R package for functional enrichment analysis |
| CytoHubba | National Institute of Bioinformatics | https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba | hub gene identification plugin. Description: Cytoscape plugin for hub gene identification |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | https://cytoscape.org/ | network visualization software. Description: Software for network visualization and analysis |
| G*Power | Heinrich Heine University Düsseldorf | https://www.psychologie.hhu.de/arbeitsgruppen/allgemeine-psychologie-und-arbeitspsychologie/gpower | sample size calculation software. Description: Sample size calculation software |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | https://www.graphpad.com/ | statistical analysis and graphing software. Description: Statistical analysis and graphing software |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | density gradient medium. Description: Density gradient medium for PBMC isolation |
| impute | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/impute/ | missing-value imputation software. Description: R package for missing-value imputation |
| Limma | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/limma/ | differential expression analysis software. Description: R package for differential expression analysis |
| MCODE | Cytoscape app | https://apps.cytoscape.org/apps/mcode | subnetwork extraction plugin. Description: Cytoscape plugin for subnetwork extraction |
| R/Bioconductor | R Foundation | https://www.r-project.org/ | statistical computing environment. Description: Statistical computing environment |
| STRING | EMBL | https://string-db.org/ | protein-protein interaction database. Description: Protein-protein interaction database |
| SYBR Green | Takara | RR820A | fluorescent dye for qRT-PCR. Description: Fluorescent dye for qRT-PCR |
| TRIzol | Takara | 9109 | RNA extraction reagent. Description: Reagent for RNA extraction |
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