Bioinformatik und quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsanalyse von SUCNR1 und GPR37L1 bei Schizophrenie

Zusammenfassung

Diese Studie bewertet SUCNR1 und GPR37L1 als potenzielle schizophrenieassoziierte molekulare Marker durch integrierte bioinformatische Analyse des GSE54913-Datensatzes, quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsvalidierung (qRT-PCR) und Korrelationsanalyse mit verbalem Gedächtnis in einer unabhängigen Kohorte.

Zusammenfassung

Schizophrenie ist eine schwere, komplexe und multifaktorielle psychische Störung, die zahlreiche genetische Anfälligkeitselemente betrifft und zu erheblicher Behinderung, Morbidität und Mortalität führt. Trotz erheblicher Fortschritte im Verständnis ihrer Pathophysiologie und Ätiologie bleiben spezifische diagnostische Biomarker für Schizophrenie schwer zu finden. Diese Studie hatte zum Ziel, potenzielle molekulare Marker zu identifizieren, die mit Schizophrenie assoziiert sind. Eine integrierte bioinformatische Analyse wurde auf dem öffentlichen Mikroarray-Datensatz GSE54913 durchgeführt. Analysen der Gene Ontology (GO) und der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Signalwege zeigten, dass die am stärksten angereicherten GO-Begriffe mit der Kanalaktivität zusammenhingen, einschließlich passiver transmembraner Transporteraktivität, Ionenkanalaktivität, gesperrter Kanalaktivität und substratspezifischer Kanalaktivität. Die fünf wichtigsten angereicherten KEGG-Signalwege waren die Insulinsekretion, der cAMP-Signalweg, die Reparatur der Nukleotid-Exzision, der TNF-Signalweg und der Glutathionstoffwechsel. Die Validierung erfolgte mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) auf einer unabhängigen Stichprobe des Wuhan Rongjun Youfu Hospitals. Die qRT-PCR-Ergebnisse stimmten weitgehend mit der Mikroarray-Analyse überein (Pearson r = 0,89, 95%-KI: 0,66–0,97). Die Analyse des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks (PPI) identifizierte zwei Hub-Gene, SUCNR1 und GPR37L1, die signifikant mit dem GO-Begriff "Ionenkanalaktivität" assoziiert und im KEGG-Weg "Insulinsekretion" angereichert sind. Darüber hinaus zeigte die SUCNR1-Expression eine negative Korrelation zu den verbalen Gedächtniswerten (r = -0,54, P = 0,015), während GPR37L1 Ausdruck eine positive Korrelation zeigte (r = 0,59, P = 0,0034). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass veränderte Expression von SUCNR1 und GPR37L1 mit Schizophrenie assoziiert sein könnten und potenzielle molekulare Marker für weitere Untersuchungen darstellen könnten.

Einleitung

Schizophrenie ist eine chronische und komplexe psychische Störung unbekannter Ursache, gekennzeichnet durch schwere Hirnfunktionsstörungen, kognitive Beeinträchtigungen und psychosoziale Defizite^. Sie stellt eine erhebliche globale Gesundheitsbelastung dar und betrifft weltweit über 21 Millionen Menschen². Obwohl sich die diagnostischen und therapeutischen Ansätze in den letzten fünfzig Jahren erheblich weiterentwickelt haben, bleibt die Kernpathogenese unklar, und langfristige Ergebnisse mit erheblicher Behinderung, Morbidität und Mortalität haben sich nicht signifikant verbessert³. Daher ist es unerlässlich, potenzielle zentrale Gene und regulatorische Ziele zu identifizieren.

Die Pathophysiologie der Schizophrenie wird zwar nicht vollständig geklärt, wird aber weithin auf genetische Polymorphismen und Expressionsvariationen zurückgeführt⁴. Beispielsweise kann genetische Variation im Östrogen-Alpha-Gen die Anfälligkeit für Schizophrenie durch alternative Genregulation und Transkriptverarbeitung^beeinflussen. Ähnlich wurde eine funktionelle Promotorvariante von NRG1 mit Schizophrenie in Verbindung gebracht und mit einer reduzierten Expression der Typ-III-NRG1-Isoform⁶ korreliert. Postmortale Studien haben eine signifikant reduzierte Expression von PDE4B-Isoformen in schizophrenen Gehirnen gezeigt, was auf ihr prädiktives Potenzial⁷ hindeutet. Weitere Kandidaten sind der Dopamintransporter (DAT), der vesikuläre Monoamintransporter (VMAT2) und die Monoaminoxidase (MAO), die den synaptischen Dopaminspiegel regulieren und als Biomarker⁸ dienen können. Zusätzlich kann TCP1 durch eine falsche Aktinfaltung bei Schizophrenie⁹ zu zytoskelettalen Defiziten beitragen. Daher könnte die Aufklärung von Genexpressionsprofilen in der Pathogenese der Schizophrenie Einblicke in Risikovorhersage, mechanistisches Verständnis und therapeutische Bewertung liefern.

Jüngste rechnergestützte Ansätze haben die Identifikation krankheitsassoziierter Gene durch integrierte Netzwerkanalyse und maschinelles Lernen vorangebracht 10,11,12. Trotz zahlreicher genetischer Studien wurden keine zuverlässigen, blutbasierten diagnostischen Biomarker in die klinische Praxis der Schizophrenie übertragen. Um diese Lücke zu schließen, verwendete die vorliegende Studie einen integrierten bioinformatischen Ansatz, um den GSE54913-Datensatz neu zu analysieren, der blutbasierte transkriptomische Daten von gut charakterisierten Patienten mit Schizophrenie und gesunden Kontrollpersonen enthält. Der Datensatz wurde ausgewählt, weil (1) periphere Blutproben minimalinvasiv und klinisch praktikabel sind, (2) er eine relativ große Stichprobengröße unter öffentlich zugänglichen Schizophrenie-Mikroarray-Datensätzen enthält und (3) Rohdaten für eine Neuanalyse verfügbar waren. Die Ziele dieser Studie waren: (1) differenziell exprimierte Gene bei Schizophreniepatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen anhand des GSE54913-Datensatzes zu identifizieren; (2) Durchführung funktioneller Anreicherung und PPI-Netzwerkanalysen zur Identifizierung von Hub-Genen; (3) Validierung der Expression von Kandidatengenen durch qRT-PCR in einer unabhängigen Kohorte; und (4) die Korrelation der Hub-Genexpression mit der Leistung des verbalen Gedächtnisses zu untersuchen. Nach Kenntnis der Autoren ist dies die erste Studie, die SUCNR1 und GPR37L1 als mögliche blutbasierte molekulare Marker für Schizophrenie identifiziert.

Protokoll

Diese Studie wurde vom Ethikausschuss des Wuhan Rongjun Youfu Krankenhauses (Projektidentifikationscode, YF-IRB202310215) genehmigt und gemäß den Grundsätzen der Helsinkier Erklärung durchgeführt. Alle Teilnehmer waren Bewohner der chinesischen Gemeinde und gaben schriftliche informierte Einwilligung.

Studienpersonen und Blutproben
Zehn Erwachsene mit Schizophrenie und zehn gesunde Kontrollfreiwillige ohne familiäre Vorgeschichte psychischer Erkrankungen innerhalb von drei Generationen wurden aufgenommen. Einschlusskriterien für Schizophreniepatienten: (1) Diagnose der Schizophrenie gemäß den DSM-5-Kriterien, bestätigt von zwei unabhängigen leitenden Psychiatern; (2) 18–65 Jahre alt; (3) keine Änderung des Antipsychotikums für mindestens 4 Wochen vor der Blutentnahme; (4) Bereitschaft, schriftliche informierte Zustimmung zu geben. Ausschlusskriterien: (1) Begleiterkrankungen schwerer medizinischer Erkrankungen (z. B. Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Krebs); (2) Substanzmissbrauch oder Abhängigkeit in den letzten 6 Monaten; (3) geistige Behinderung; (4) Schwangerschaft oder Laktation. Einschlusskriterien für gesunde Kontrollpersonen: (1) keine persönliche oder familiäre Vorgeschichte (innerhalb von drei Generationen) einer psychischen Erkrankung; (2) keine aktuelle oder frühere Verwendung von Antipsychotika; (3) Alters- und Geschlechtsübereinstimmung mit der Schizophreniegruppe; (4) keine schweren medizinischen Erkrankungen. Die mittlere Krankheitsdauer bei Schizophreniepatienten betrug 12,5 ± 6,8 Jahre; Alle Patienten erhielten stabile antipsychotische Medikamente (6 mit Risperidon, 4 mit Olanzapin); der mittlere PANSS-Gesamtscore lag bei 76,4 ± 12,3. Die Kontrollgruppen wurden hinsichtlich Alter (±5 Jahre) und Geschlecht (5 Männer, 5 Frauen pro Gruppe) abgeglichen. Das verbale Gedächtnis wurde anhand des Gesamtabrufs im Hopkins Verbal Learning Test–Revised (HVLT-R) bewertet. Alle Probanden wurden zwischen dem 1. Januar und dem 31. Juli 2025 vom Wuhan Rongjun Youfu Hospital rekrutiert. Die Basisdemografie ist in Tabelle 1 zusammengefasst.

Die Stichprobengröße wurde mittels einer Stichprobengrößenberechnungssoftware für einen zweiseitigen unabhängigen t-Test mit einer Effektgröße von 1,2, α = 0,05 und Leistung (1-β) = 0,80 bestimmt, was mindestens neun Probanden pro Gruppe ergibt.

Venöses Blut wurde in EDTA-antikoagulierte Röhren entnommen und ohne Verzögerung verarbeitet. Periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs) wurden anschließend durch Dichtegradientenzentrifugation mit einem Dichtegradientenmedium von den Proben getrennt. Kurz gesagt wurde das Blut 1:1 mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) verdünnt, auf das Dichtegradientenmedium gelegt und bei 400 × g für 30 Minuten bei 20 °C mit ausgeschalteter Bremse zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde die PBMC-enthaltende Schnittstelle vorsichtig auf ein neues Rohr übertragen. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gespült, wobei jede Wäsche von einer Zentrifugation bei 300 × g für 10 Minuten bei 4 °C gefolgt war, und das letzte Pellet wurde in PBS suspendiert. Die Viabilität wurde mit der Trypan-blauen Farbstoff-Ausschlussmethode bewertet, und es wurden nur Präparate mit ≥95 % lebensfähigen Zellen verwendet. Isolierte PBMCs wurden aliquotiert und maximal 3 Monate bei −80 °C gelagert, bevor die RNA-Extraktion erfolgte.

Mikroarray-Daten
Der Arbeitsablauf der Studie ist in Abbildung 1 dargestellt. Der GSE54913 Microarray-Datensatz wurde aus der GEO-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) heruntergeladen. Dieser Datensatz wurde ausgewählt, weil (1) er transkriptomische Daten aus peripheren Blutproben enthält, die minimal invasiv und klinisch für die Biomarkerentdeckung geeignet sind; (2) es umfasst eine relativ große Stichprobe unter öffentlich zugänglichen Schizophrenie-Mikroarray-Datensätzen (18 Patienten, 12 Kontrollen); (3) Die Rohdaten standen für eine Neuanalyse zur Verfügung. Laut dem GEO-Datensatz wurden die Proben aus peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMCs) gewonnen, nicht aus Plasma. Die ursprüngliche Beschreibung 'Plasmaproben' in der vorherigen Version war ein Fehler und wurde korrigiert.

Datenvorverarbeitung und differentiell exprimierte Gen-(DEG)-Screening
Rohdaten (. CEL-Dateien) wurden mit Mikroarray-Vorverarbeitungssoftware vorbearbeitet. Die Hintergrundkorrektur wurde mit der Robust Multichip Average (RMA)-Methode durchgeführt, gefolgt von Quantilnormalisierung und log2-Transformation. Sonden ohne Genannotation wurden herausgefiltert. Sonden mit >20 % fehlenden Werten in den Stichproben wurden ausgeschlossen; Fehlende Werte für die verbleibenden Sonden wurden mit dem k-nächsten Nachbarn-Algorithmus (k = 10) imputiert, der in fehlenden Wert-Imputationssoftware implementiert wird. Batch-Effekte waren nicht vorhanden, da alle Proben gemäß dem GEO-Datensatz in einer einzigen Charge verarbeitet wurden. Nach der Vorverarbeitung wurden Expressionswerte für 17.200 Gene für die nachgelagerte Analyse ermittelt. DEGs zwischen Schizophreniepatienten und gesunden Kontrollpersonen wurden mit Software zur differentiellen Expressionsanalyse identifiziert. Gene mit einer False Discovery Rate (FDR) < 0,05, absoluter Faltungsänderung (FC) > 1,2 und P < 0,05 wurden als differenziell exprimiert betrachtet. Ein relativ niedriger FC-Schwellenwert (absoluter FC > 1,2) wurde gewählt, da Schizophrenie eine komplexe psychiatrische Störung ist, bei der individuelle Genexpressionsunterschiede oft subtil statt dramatisch sind.

GO- und Signalweganreicherungsanalysen
Funktionelle Anreicherungsanalysen für Genontologie (GO)-Begriffe und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) wurden mit funktioneller Anreicherungsanalysesoftware durchgeführt. Der Hintergrundgensatz bestand aus allen Genen, die die Vorverarbeitung bestanden haben (17.200 Gene). Anreicherungsterme und -wege mit rohen P-Werten < 0,05 wurden gemeldet. Da für GO- und KEGG-Anreicherungsausgaben rohe P-Werte verwendet wurden, sollten diese Ergebnisse als explorativ interpretiert werden.

PPI-Netzwerkanalyse und Hub-Gen-Identifikation
Eine Protein-Protein-Interaktionsdatenbank wurde verwendet, um ein PPI-Netzwerk zu erstellen, wobei ein kombinierter Interaktionswert > 0,9 als Schwelle festgelegt wurde. Das Netzwerk wurde mit Netzwerkvisualisierungssoftware visualisiert. Hub-Gene wurden mithilfe eines Hub-Gen-Identifikations-Plugins mit dem Degree-Algorithmus identifiziert. Die 10 besten Knoten mit den höchsten Gradwerten wurden als Hub-Gene ausgewählt. Das Subnetzwerk der Schlüssel-Hub-Gene wurde mit einem Subnetzwerk-Extraktions-Plugin mit Standardparametern extrahiert (Grad-Cutoff = 2, Knoten-Score-Cutoff = 0,2, K-Core = 2, maximale Tiefe = 100).

Totale RNA-Isolierung und qRT-PCR
β-Actin wurde als internes Referenzgen (Haushaltsgen) verwendet. Die Stabilität der β-Aktin-Expression über die Proben hinweg wurde durch keinen signifikanten Unterschied in den CT-Werten zwischen der Schizophrenie- und Kontrollgruppe bestätigt (P > 0,05). Die relative Quantifizierung wurde mit der 2^{−ΔΔCt-Methode} durchgeführt. Alle Reaktionen wurden in Dreifachform durchgeführt, und der mittlere Ct-Wert wurde für die Berechnung verwendet (siehe Primer-Sequenzen in Tabelle 2). Die zehn wichtigsten DEGs (fünf am stärksten hochregulierten und fünf am stärksten durch Faltänderung herunterreguliert) wurden für die erste qRT-PCR-Validierung ausgewählt, um die Gesamtzuverlässigkeit der Mikroarray-Daten zu bestätigen. Anschließend wurden SUCNR1 und GPR37L1 für eine fokussierte Validierung anhand von drei Kriterien ausgewählt: (1) sie wurden als Hub-Gene in der PPI-Netzwerkanalyse identifiziert (Grad ≥ 7); (2) sie waren signifikant mit dem Top-angereicherten GO-Begriff 'Ionenkanalaktivität' und dem KEGG-Weg 'Insulinsekretion' assoziiert; (3) beide kodieren GPCRs, die bekannte Medikamentenziele bei Schizophrenie sind.

Statistische Analyse
Die Normalität wurde mit dem Shapiro–Wilk-Test bewertet. Variablen mit einer ungefähren Normalverteilung (P > 0,05) wurden mit parametrischen Methoden analysiert, darunter Student's t-Test für Zweigruppenvergleiche und Einweg-ANOVA für Vergleiche mit mehr als zwei Gruppen. Wenn die Normalitätsannahme nicht erfüllt war, wurden je nach Bedarf Mann–Whitney U - oder Kruskal–Wallis-Tests verwendet. Alle statistischen Tests waren zweiseitig. Für mehrere Vergleiche (z. B. bei ANOVA Post-hoc-Tests) wurde die Benjamini-Hochberg-Falschentdeckungsrate (FDR)-Methode angewandt, mit einem FDR-Schwellenwert von 0,05. Bei Korrelationsanalysen wurde keine Mehrfachvergleichskorrektur angewendet, da nur zwei Korrelationen durchgeführt wurden; die rohen P-Werte werden mit Vorsicht angegeben.

Ergebnisse

Identifikation von DEGs und hierarchischer Clustering
Die Analyse des GSE54913-Datensatzes identifizierte 473 differenziell exprimierte Gene (DEGs), darunter 357 hochregulierte und 116 herunterregulierte Gene, zwischen Schizophreniepatienten und Kontrollpersonen (Abbildung 2A,B). Die hierarchische Clusterbildung dieser DEGs unterschied Schizophrenieproben von Kontrollen (Abbildung 2C).

Funktionale Anreicherungsanalyse von DEGs
Die GO-Anreicherungsanalyse identifizierte Begriffe, die mit der Kanalaktivität zusammenhängen, darunter passive transmembrane Transporteraktivität, Ionenkanalaktivität, Gated Channel-Aktivität und substratspezifische Kanalaktivität (rohes P < 0,05; Tabelle 3). Die KEGG-Signalweganalyse identifizierte die Insulinsekretion, den cAMP-Signalweg, die Reparatur der Nukleotid-Exzision, den TNF-Signalweg und den Glutathionstoffwechsel als die am besten angereicherten Signalwege (rohes P < 0,05; Abbildung 3C und Tabelle 4).

Validierung der besten DEGs durch qRT-PCR
Die fünf obersten herunterregulierten Gene (HCN3, OLFML2A, NOX1, MRGPRX1 und BRIP1) und die fünf obersten Gene (CCL22, PNMA2, TBX20, ERAS und C12orf68) wurden durch qRT-PCR validiert. Die validierten Gene und die entsprechenden Microarray-LogFC-Werte sind in Tabelle 5 aufgeführt, die qRT-PCR-Validierung ist in Abbildung 4 dargestellt und die rohen CT-Werte sind in der ergänzenden Tabelle S1 dargestellt. Die qRT-PCR-Faltenänderungen waren richtungsmäßig mit Mikroarray-Daten für alle zehn Gene konsistent (alle P < 0,05 laut Mann-Whitney U-Test). Die Pearson-Korrelation zwischen Microarray-logFC und qRT-PCR-logFC betrug r = 0,89 (95%-KI: 0,66–0,97, P = 0,0004), was auf eine starke Übereinstimmung hinweist. Unterschiede in der Expression von SUCNR1 und GPR37L1 wurden ebenfalls bestätigt (Abbildung 5A,B).

PPI-Netzwerkanalyse
Ein PPI-Netzwerk wurde aus allen DEGs aufgebaut (Interaktionswert > 0,9; Abbildung 6A). Die zehn wichtigsten Hubproteine basierend auf dem Grad der Konnektivität waren RTP5 (Grad = 14), CXCL1 (Grad = 8), CXCL10, GPR37L1, HCAR1, OPRL1, P2RY4, SSTR4, SUCNR1 (Grad = 7) und ATM (Grad = 5) (Abbildung 6B und Tabelle 6). Ein Subnetzwerk von Schlüssel-Hub-Genen wurde mit einem Subnetzextraktions-Plugin mit Standardparametern extrahiert. Der Subnetz-Extraktionsalgorithmus identifizierte einen dicht verbundenen Cluster, der RTP5, CXCL1, CXCL10, GPR37L1, HCAR1, OPRL1, P2RY4, SSTR4 und SUCNR1 mit einem Cluster-Wert von 6,2 umfasste. ATM war nicht im Subnetz enthalten, da die Verbindung zum Kerncluster geringer war (Abbildung 6C).

Verbindung zwischen verbalem Gedächtnis und SUCNR1/GPR37L1
Die Expression von SUCNR1 war signifikant erhöht, während GPR37L1 Expression bei Patienten mit Schizophrenie im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen reduziert war (Abbildung 5A,B). Der Ausdruck von SUCNR1 zeigte eine negative Korrelation mit den verbalen Gedächtniswerten (r = -0,54, 95%-KI: -0,79 bis -0,13, R² = 0,287, P = 0,015; Abbildung 5C), während GPR37L1 Ausdruck eine positive Korrelation mit verbalen Gedächtniswerten zeigte (r = 0,59, 95%-KI: 0,20 bis 0,82, R² = 0,349, P = 0,0034; Abbildung 5D). Korrelationsanalysen wurden an allen 20 Probanden durchgeführt, darunter 10 Schizophreniepatienten und 10 gesunde Kontrollpersonen. Mit einer Stichprobengröße von 20 hatte die Studie 80 % Leistung, um einen Korrelationskoeffizienten von |r| zu erkennen. > 0,6 bei α = 0,05. Angesichts der moderaten Stichprobengröße sind diese korrelativen Ergebnisse vorläufig und erfordern eine Validierung in größeren, unabhängigen Kohorten.

Datenverfügbarkeitserklärung
Der in dieser Studie analysierte GSE54913 Datensatz ist öffentlich im Gene Expression Omnibus verfügbar. Rohwerte des qRT-PCR Ct sind in der ergänzenden Tabelle S1 angegeben. Die Analyseskripte, DEG-Ausgabedateien, Anreicherungsergebnisse, PPI-Netzwerkdateien und Figurenquellendateien sind bei https://sandbox.zenodo verfügbar.org/records/514960 oder 10.5072/zenodo.514960.

Abbildung 1: Flussdiagramm: Datenerhebung, Vorverarbeitung, Analyse und Validierung. mRNA-Mikroarray-Analysen an PBMCs, die aus GSE54913 gewonnen wurden. Funktions- und Signalweganreicherungsanalysen wurden an den DEGs durchgeführt. Die Top 10 Gene, die nach Faltenänderung gerankt sind, wurden zur Validierung von Mikroarray-Daten mittels qRT-PCR ausgewählt. Die Analyse des PPI-Netzwerks identifizierte zwei Hub-Gene. Abschließend wurde eine ex-vivo-Analyse der beiden Hub-Gene SUCNR1 und GPR37L1 durchgeführt. Abkürzungen: DEGs = differentiell exprimierte Gene; mRNA = Boten-RNA; PBMCs = periphere mononukleare Blutzellen; qRT-PCR = quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion; PPI = Protein-Protein-Wechselwirkung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: DEG-Auswahl und hierarchische Clustering-Analyse. (A) Vulkan-Plot von DEGs. Die horizontale Achse steht für log₂ (Faltungsänderung), und die vertikale Achse für –log₁₀(P-Wert). Grüne und rote Punkte stehen für differenziell exprimierte Gene, schwarze Punkte für nicht-differenziell exprimierte Gene. (B) Anzahl von downregulierten und hochregulierten DEGs. (C) Wärmekarte differenziell exprimierter Gene. Rot steht für Upregulation und Grün für Downregulation. Abkürzung: DEGs = differenziell exprimierte Gene. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen von DEGs. (A,B) GO-Anreicherung und (C) KEGG-Anreicherung werden auf Basis von rohen P-Werten dargestellt. Abkürzungen: DEGs = differentiell exprimierte Gene; GO = Genontologie; KEGG = Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes; BP = biologischer Prozess; CC = zelluläre Komponente; MF = molekulare Funktion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Validierung von Microarray-Daten für die zehn störregulierten Gene mit qRT-PCR. (A) Downregulierte Top fünf DEGs. (B) Hochregulierte Top fünf DEGs. Die Daten sind Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts. P-Werte werden in den entsprechenden Panels angezeigt. Abkürzungen: DEGs = differentiell exprimierte Gene; qRT-PCR = quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Expression von SUCNR1 und GPR37L1 bei Patienten mit Schizophrenie und gesunden Kontrollpersonen. (A) SUCNR1 und (B) GPR37L1 Expression bestimmt durch qRT-PCR. Korrelation zwischen verbalem Gedächtnis und (C) SUCNR1 sowie (D) GPR37L1 Ausdruck. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts angezeigt, wo zutreffend. P-Werte für Korrelationen werden in den entsprechenden Panels dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Analyse des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks. (A) PPI-Netzwerk analysiert mit einer Protein-Protein-Interaktionsdatenbank. (B) Proteine, geordnet nach Assoziationsgrad im PPI-Netzwerk. (C) Subnetz visualisiert mit Netzwerkvisualisierungssoftware nach Analyse der Subnetzextraktion. Abkürzung: PPI = Protein-Protein-Interaktion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Variable	Kontrollpersonen (n = 10)	Schizophrenie-Patienten (n = 10)
Alter (Jahr)	36,5 ± 10,6	44,5 ± 9,5
Weibliches Geschlecht, n (%)	5 (50)	5 (50)
Tägliche Schlafzeit (h)	5.4 ± 3.1	7.5 ± 1.2
Body-Mass-Index (BMI; kg/m²)	25.2 ± 4.1	22.9 ± 2.3
Verbaler Gedächtniswert	61 ± 18	30.2 ± 10.8
Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung oder Zahl (%) präsentiert.

Tabelle 1: Ausgangsmerkmale von Patienten mit Schizophrenie und Kontrollpersonen.

Gensymbol	Vorwärts-Zündersequenz (5'→3')	Umgekehrte Zünderfolge (5'→3')
HCN3	GTCCGCCGGGGCCTGGAT	CCTCCCACTGGTGTATGTAGC
OLFML2A	CAGGCAGAGCGGGCGAAG	AATATTTGCGGGGGGGTCA
NOX1	CACCCCAAGTCTGTAGTGGGAG	CCAGACTGGAATATCGGTGACA
MRGPRX1	CTAGGGTACCACGGAGGAGGATT	TGGTTCTGGAGGCTCCTTGC
BRIP1	CAGATGAGGGCG-TAAGTGA	CGTCCTCCGGAGCTCTCTAG
CCL22	TCCATCATCTCTCTTCTGACTCTGA	CTGTGGGTCAGAGTCAGAAGAGA
PNMA2	GCGGGTCAATTCTCGGGACA	GTCCTGCCCCCAGGTGGTTT
TBX20	GAGGGAAAGTGTGGAGAGCC	AAGGCTGACCCTCGATTTGG
ERAS	AGTCTATTATTATTCGGGCACC	CCTTCGTGGTTCCCTGAGAC
C12orf68	TTCAACCCCTACACCGAGTT	CTTGAACGTGGACTGCAGC
GPR37L1	ATGTTTCTTGCCGAGCAGTG	CCACATGGAATCGGTCTAT
SUCNR1	ACAGAAGCCGACAGCAGAAT	GCACAGGAAAGCAAAAGTCAG
β-Actin	CTAAAGGCCAACCGTGAAAAG	GCATACAGGGACAACACAG
qRT-PCR: quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion.

Tabelle 2: PCR-Primer für qRT-PCR.

GO ID	Begriff	Roher P-Wert	Graf
LOS: 0015267	Kanalaktivität	0.000000056	13
GEH:0022803	passive transmembrane Transporteraktivität	5.78E-08	13
LOS: 0005216	Ionenkanalaktivität	0.000000127	12
LOS: 0022839	Ionengesteuerte Kanalaktivität	0.000000131	11
GEH:0022836	Aktivität im geschlossenen Kanal	0.000000136	11
GEH:0022838	Substratspezifische Kanalaktivität	0.00000017	12
LOS: 0005261	Aktivität des Kationenkanals	0.00000668	9
LOS: 0015276	Ligandengesteuerte Ionenkanalaktivität	0.000315	5
LOS: 0022834	Ligandgesteuerte Kanalaktivität	0.000315	20
GO:0022890	Aktivität des anorganischen Kationen-Transmembrantransporters	0.000487	20
GEH:0008324	Aktivität von Kationentransmembrantransportern	0.0009	18
LOS: 0099094	Ligandgesteuerte Kationenkanalaktivität	0.00128	16
GO:0005244	Spannungsgesteuerte Ionenkanalaktivität	0.001382	16
GO:0022832	Spannungsgesteuerte Kanalaktivität	0.001382	18
LOS: 0046873	Aktivität des Transmembrantransporters von Metallionen	0.001836	21
LOS: 0022824	Aktivität des sendergesteuerten Ionenkanals	0.002762	19
LOS: 0022835	Sender-gesperrte Kanalaktivität	0.002762	13
Hinweis: P-Werte sind roh und unangepasst; Bedeutung wurde als rohes P < 0,05 definiert.

Tabelle 3: Genontologieanalyse differenziell exprimierter Gene (rohes P < 0,05).

ID	Beschreibung	Roher P-Wert	Graf
hsa04911	Insulinsekretion	0.007066	6
hsa04024	cAMP-Signalwege	0.010661	10
hsa03420	Nukleotid-Exzisionsreparatur	0.013724	4
hsa04668	TNF-Signalweg	0.023694	6
hsa00480	Glutathion-Stoffwechsel	0.02466	4
hsa04740	Olfaktorische Transduktion	0.032104	15
hsa05222	Kleinzelliger Lungenkrebs	0.03572	5
hsa00590	Stoffwechsel der Arachidonsäure	0.035991	4
HSA04080	Neuroaktive Ligand-Rezeptor-Interaktion	0.037546	12
hsa05031	Amphetaminabhängigkeit	0.045653	4
hsa05203	Viruskarzinogenese	0.046404	8
hsa04933	ALTERS-RAGE-Signalweg bei diabetischen Komplikationen	0.04831	5
Hinweis: P-Werte sind roh und unangepasst; Bedeutung wurde als rohes P < 0,05 definiert.

Tabelle 4: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Anreicherungsanalyse von Genen (rohe P < 0.05).

Gensymbol	Offizieller vollständiger Name	logFC	Roher P-Wert
Downreguliert
HCN3	Hyperpolarisationsaktivierter zyklischer nukleotidgesteuerter Kanal 3	-1.489	0.0001
OLFML2A	Olfactomedin-ähnliches Protein 2A	-1.521	0.0042
NOX1	NADPH-Oxidase 1	-1.522	0.0022
MRGPRX1	Mas-bezogenes G-Protein-gekoppeltes Rezeptormitglied X1	-1.526	0.0003
BRIP1	Fanconi-Anämie-Gruppe-J-Protein	-1.699	0.0018
Hochreguliert
CCL22	C-C-Motiv Chemokin 22	2.517	0.0041
PNMA2	Paraneoplastische Ma-Antigene	2.159	0.0062
TBX20	T-Box Transkriptionsfaktor TBX20	1.866	0.0001
ERAS	GTPase-Ären	1.846	0.0008
C12orf68	Coiled-Coil-Domäne mit 184	1.839	0.0002
Hinweis: LogFC und rohe P-Werte stammen aus der Mikroarray-Differentialexpressionsanalyse.

Tabelle 5: Die zehn besten DEGs nach Faltenänderung der hochregulierten und herunterregulierten Gene.

Gensymbol	Beschreibung	Kogene (n)	P-Wert
RTP5	Rezeptortransporterprotein 5	14	0.000276
CXCL1	Wachstumsreguliertes Alpha-Protein 1	8	0.011423
CXCL10	C-X-C-Motiv Chemokin 10	7	0.046144
GPR37L1	Prosaposinrezeptor GPR37L1	7	0.003792
HCAR1	Hydroxycarboxylsäurerezeptor 1	7	0.046572
OPRL1	Nociceptinrezeptor 1	7	0.039753
P2RY4	P2Y Purinoceptor 4	7	0.001279
SSTR4	Somatostatinrezeptor Typ 4	7	0.006742
SUCNR1	Succinatrezeptor 1	7	0.000105
GELDAUTOMAT	Serin-Protein-Kinase im Moment	5	0.004961
PPI: Protein-Protein-Interaktion; DEGs: differentiell exprimierte Gene.

Tabelle 6: Top 10 Hub-Gene, die im PPI-Netzwerk für DEGs identifiziert wurden.

Ergänzende Tabelle 1: Rohe qRT-PCR CT-Werte, vollständiger Bioinformatik-Analyse-Workflow und verarbeitete Ergebnisse (DEG, GO/KEGG und PPI) für die Studie Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Schizophrenie ist eine schwere, multifaktorielle Störung, die zahlreiche genetische Anfälligkeitsfaktoren^betrifft. Obwohl Fortschritte bei der Pathophysiologie erzielt wurden, fehlen weiterhin zuverlässige diagnostische Biomarker. In dieser Studie identifizierte ein integrierter bioinformatischer Ansatz 473 DEG in Blutproben von Patienten mit Schizophrenie. GO- und KEGG-Analysen hoben die Anreicherung von kanalaktivitätsbezogenen Begriffen und Signalwegen hervor, einschließlich Insulinsekretion, cAMP-Signalübertragung, Reparatur der Nukleotid-Exzision, TNF-Signalübertragung und Glutathionstoffwechsel. Die Analyse des PPI-Netzwerks identifizierte zudem SUCNR1 und GPR37L1 als Hub-Gene, deren Expression mit der verbalen Gedächtnisleistung assoziiert war, was auf ihre potenzielle Relevanz als schizophrenieassoziierte molekulare Marker hindeutet.

Die Bereicherung der "Kanalaktivitäts"-Begriffe der GO entspricht früheren Forschungen zur Schizophrenie. Spannungsgesteuerte Calciumkanäle (z. B. CACNA1C, CACNB2) und Kaliumkanäle (z. B. Kv3, Kv2.1) wurden mit der Anfälligkeit für Schizophrenie und neuronaler Erregbarkeit 15,16 in Verbindung gebracht. Ebenso stimmen die wichtigsten identifizierten KEGG-Pfade mit der bestehenden Literatur überein. Hyperinsulinämie und Insulinsekretionsstörungen werden bei früher Schizophrenie¹⁷ berichtet. Der cAMP-Signalweg ist zunehmend mit der Krankheitspathophysiologie¹⁸ verbunden. Nukleotid-Exzisionsreparaturmechanismen, einschließlich der Modifikation der Histonvariante H2AX, könnten ebenfalls eine Rolle spielen ^19,20,21,22. Darüber hinaus sind TNF-Signalübertragung und Glutathionstoffwechsel mit der Schizophrenie-Pathogenese^23,24 in Verbindung gebracht.

Eine verbale Gedächtnisstörung ist ein zentrales kognitives Defizit bei Schizophrenie, tritt bereits zu Beginn der Krankheit auf und ist mit funktionellen Ergebnissen verbunden. Der Hopkins Verbal Learning Test–Revised (HVLT-R) ist ein gut validiertes Maß für verbales Lernen und Gedächtnis. Die Bewertung der Korrelation zwischen der Expression des Kandidatenmarkers und der Leistung des verbalen Gedächtnisses hilft, die klinische Relevanz zu etablieren, da kognitive Beeinträchtigung ein wesentlicher Faktor für Behinderung bei Schizophrenie ist.

Obwohl die mit qRT-PCR validierten DEGs Mikroarray-Daten übereinstimmten, stimmten sie nicht eng mit den primären GO/KEGG-Befunden überein. Im Gegensatz dazu waren SUCNR1 (hochreguliert) und GPR37L1 (herunterreguliert) signifikant mit "Ionenkanalaktivität" assoziiert und mit "Insulinsekretion" angereichert. Beide Gene codieren für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), die kritische Ziele von Antipsychotika sind und die Ionenkanalaktivität²⁵ modulieren.

SUCNR1 (GPR91) verbindet metabolischen Stress mit Insulinsekretion und Resistenz ^26,27, und Insulinresistenz ist ein bekannter Risikofaktor für Schizophrenie²⁸. GPR37L1, ein im Gehirn hoch exprimierter Orphanrezeptor, ist an der Entwicklung des Kleinhirns und der motorischen Funktion²⁹ beteiligt und wurde mit Parkinson³⁰ und dem nierenen Natriumtransport³¹ in Verbindung gebracht. Seine Rolle bei Schizophrenie kann die Modulation der Ionenkanalaktivität beinhalten.

Verbale Gedächtnisstörung ist ein zentrales Merkmal der Schizophrenie und spiegelt genetische Haftung sowie Schwere der Krankheit^wider. Die umgekehrte Korrelation der SUCNR1-Expression und die positive Korrelation der GPR37L1-Expression mit verbalen Gedächtniswerten stützt ihre potenzielle Relevanz bei Schizophrenie zusätzlich.

Mehrere Einschränkungen sollten anerkannt werden. Erstens war die Stichprobengröße der Validierungskohorte (n = 10 pro Gruppe) klein, was die statistische Stärke und Generalisierbarkeit einschränkt. Zweitens erhielten alle Schizophreniepatienten antipsychotische Medikamente, sodass die beobachteten Ausdrucksänderungen eher auf die Wirkung der Medikamente als auf die Krankheitspathologie zurückzuführen sein könnten. Zukünftige Studien sollten medikamentennaive Erstepisodenpatienten einbeziehen. Drittens fehlte der Validierungskohorte RNA-seq-Bestätigung; Eine transkriptomweite Sequenzierung in größeren unabhängigen Kohorten ist gerechtfertigt. Viertens schließt das Querschnittsdesign die Bewertung kausaler Zusammenhänge zwischen Biomarker-Niveaus und Krankheitsprogression aus. Fünftens waren die Korrelationsanalysen mit verbalem Gedächtnis explorativ und erfordern eine Replikation. Sechstens wurde der GSE54913-Datensatz auf einer Mikroarray-Plattform erzeugt, die eine geringere Sensitivität als RNA-Seq aufweist. Zukünftige Richtungen umfassen longitudinale Studien zur Verfolgung von SUCNR1- und GPR37L1-Niveaus während Krankheit und Behandlung, funktionelle Studien zur Aufklärung der mechanistischen Rollen dieser GPCRs in der Pathophysiologie der Schizophrenie sowie die Entwicklung eines klinisch validierten Tests für diese Biomarker.

Zusammenfassend legt diese integrierte Analyse nahe, dass veränderte SUCNR1- und GPR37L1-Expression mit Schizophrenie und verbaler Gedächtnisleistung assoziiert ist. Diese Gene könnten potenzielle schizophrenieassoziierte molekulare Marker darstellen. Zu den Einschränkungen gehören jedoch eine relativ kleine Stichprobe und die teilweise Einschätzung der Schwere der Schizophrenie durch verbales Gedächtnis. Weitere Studien sind erforderlich, um diese Ergebnisse zu bestätigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
affy	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/affy/	microarray preprocessing software. Description: R package for microarray preprocessing
clusterProfiler	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	functional enrichment analysis software. Description: R package for functional enrichment analysis
CytoHubba	National Institute of Bioinformatics	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba	hub gene identification plugin. Description: Cytoscape plugin for hub gene identification
Cytoscape	Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/	network visualization software. Description: Software for network visualization and analysis
G*Power	Heinrich Heine University Düsseldorf	https://www.psychologie.hhu.de/arbeitsgruppen/allgemeine-psychologie-und-arbeitspsychologie/gpower	sample size calculation software. Description: Sample size calculation software
GraphPad Prism	GraphPad Software	https://www.graphpad.com/	statistical analysis and graphing software. Description: Statistical analysis and graphing software
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	density gradient medium. Description: Density gradient medium for PBMC isolation
impute	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/impute/	missing-value imputation software. Description: R package for missing-value imputation
Limma	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/limma/	differential expression analysis software. Description: R package for differential expression analysis
MCODE	Cytoscape app	https://apps.cytoscape.org/apps/mcode	subnetwork extraction plugin. Description: Cytoscape plugin for subnetwork extraction
R/Bioconductor	R Foundation	https://www.r-project.org/	statistical computing environment. Description: Statistical computing environment
STRING	EMBL	https://string-db.org/	protein-protein interaction database. Description: Protein-protein interaction database
SYBR Green	Takara	RR820A	fluorescent dye for qRT-PCR. Description: Fluorescent dye for qRT-PCR
TRIzol	Takara	9109	RNA extraction reagent. Description: Reagent for RNA extraction