Ein standardisiertes In-vitro-Verfahren zur Bewertung von Veränderungen der Oberflächenmikrohärte in Nanohybridharz-Verbundwerkstoffen nach der Exposition von Molkenproteingetränken

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte In-vitro-Methode zur Bewertung der Auswirkungen von Molkenproteingetränken auf die Mikrohärte von Harzkompositen. Der Ansatz ermöglicht eine kontrollierte Bewertung der Nahrungsexposition mittels zyklischer Immersion und Vickers-Tests und liefert ein reproduzierbares Modell zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Nährstoffen und restaurativen Biomaterialien.

Abstract

Ziel dieser In-vitro-Studie war es, die Wirkung verschiedener Molkenproteingetränke auf die Oberflächenmikrohärte von drei Nanohybridharz-Kompositen zu bewerten. Insgesamt wurden 90 scheibenförmige Proben aus drei nanohybriden Harzverbundmaterialien (n = 30 pro Material) hergestellt und je nach Immersionsmedium in drei Gruppen (n = 10) unterteilt: Molkenkonzentrat, Molkenisolat und destilliertes Wasser. Die Exemplare wurden zweimal täglich für 10 Minuten für 30 Tage eingetaucht. Die Oberflächenmikrohärte wurde am Ausgangspunkt und nach der Immersion mit einem Vickers-Mikrohärtetester gemessen, und die Härteänderung wurde als ΔVHN berechnet. Die Daten wurden mit zweiseitigen wiederholten Messungen ANOVA und Post-hoc-Tests analysiert. Die Analyse zeigte, dass der Komposittyp, die Immersionslösung und deren Wechselwirkung statistisch signifikante Auswirkungen auf ΔVHN-Werte hatten (S. < 0,0001). Der höchste Härteverlust wurde im injizierbaren Verbundwerkstoff beobachtet, der Molkenkonzentrat ausgesetzt war (ΔVHN: 10,4 ± 2,1), während die geringste Veränderung im stark gefüllten Verbundwerkstoff in destilliertem Wasser (ΔVHN: 0,9 ± 0,4) festgestellt wurde. Das Eintauchen in Molkenkonzentrat führte zu einem signifikant größeren Härteverlust in allen Verbundstoffen im Vergleich zu destilliertem Wasser (S. < 0,05). Molkenisolat verursachte außerdem in allen Verbundwerkstoffen mit Ausnahme des stark gefüllten Verbundwerkstoffs einen signifikant größeren Härteverlust, bei dem kein statistisch signifikanter Unterschied beobachtet wurde (p = 0,076). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Molkenproteingetränke die Oberflächenmikrohärte von Harzkompositen verringern können, wobei das Ausmaß des Abbaus sowohl von der Materialzusammensetzung als auch der Getränkezusammensetzung abhängt.

Introduction

Der langfristige Erfolg von Restaurierungen von Harzkompositen hängt von ihrer Widerstandsfähigkeit gegenüber komplexen oralen Umweltherausforderungen ab, einschließlich mechanischer Belastung, diätetischer Exposition und chemischer Degradierung ^1,2. Nanohybridharz-Verbundstoffe werden aufgrund ihrer günstigen ästhetischen und mechanischen Eigenschaften, insbesondere der Oberflächenmikrohärte, weit verbreitet eingesetzt, die als wichtiger Indikator für Verschleißfestigkeit und strukturellen Verfall^dient.

Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Exposition gegenüber sauren Getränken wie Fruchtsäften, kohlensäurehaltigen Getränken und Energiegetränken die Restaurierungen von Verbundwerkstoffen negativ beeinflussen kann, indem sie die Oberflächenmikrohärte reduziert und die Oberflächenintegrität^verändert 5,6,7,8. Diese degradierenden Effekte werden von mehreren Faktoren beeinflusst, darunter pH-Wert, Belichtungszeit und Füller-Matrix-Zusammensetzung. Die meisten bestehenden experimentellen Modelle basieren jedoch auf hochsauren Lösungen, die die chemischen Herausforderungen der zeitgenössischen Ernährungsgewohnheiten möglicherweise nicht genau widerspiegeln.

Im Gegensatz dazu haben Molkenproteingetränke aufgrund ihres Nährwerts und des steigenden Konsums unter fitnessorientierten Menschen^große Beliebtheit erlangt ^9,10. Trotz ihres nahezu neutralen pH-Werts enthalten diese Getränke Laktose, Proteine und andere organische Bestandteile, die mit der Harzmatrix interagieren und die Materialstabilität beeinflussen können. Daher erfordert die Bewertung ihrer Wirkung ein Protokoll, das nicht nur die Säure, sondern auch die organische Zusammensetzung und wiederholte Expositionsmuster berücksichtigt.

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine standardisierte und reproduzierbare In-vitro-Methode bereitzustellen, um die Auswirkungen von Molkenproteingetränken, insbesondere von Konzentrierten und Isolierungen, auf die Oberflächenmikrohärte von Nanohybridharz-Verbundstoffen zu bewerten. Diese Methode ermöglicht eine kontrollierte Simulation der täglichen Nahrungsaufnahme durch zyklische Immersion und verbessert dadurch die experimentelle Relevanz von In-vitro-Testbedingungen .

Im Vergleich zu herkömmlichen Modellen der sauren Getränkeexposition bietet dieses Protokoll mehrere Vorteile. Erstens ermöglicht es die Untersuchung des Materialabbaus unter nahezu neutralen pH-Bedingungen und ermöglicht so die Bewertung der Materialreaktionen über säurebedingte Effekte hinaus. Zweitens spiegelt das zyklische Immersionsdesign die realen Konsummuster besser wider. Drittens erleichtert die Methode die vergleichende Bewertung verschiedener Verbundzusammensetzungen basierend auf strukturellen Eigenschaften wie Füllstoffgehalt und Harzmatrixzusammensetzung.

Dieses Protokoll eignet sich besonders für Forscher, die die chemische Stabilität von restaurativen Materialien unter ernährungsrelevanten Bedingungen bewerten wollen, sowie für Studien, die die Wechselwirkung zwischen Nahrungskomponenten und zahnärztlichen Biomaterialien untersuchen. Es kann auch angepasst werden, um alternative Getränkeformulierungen, Oberflächenbehandlungen oder neu entwickelte Verbundwerkstoffe zu testen.

Protocol

Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Probenvorbereitung

1. Bereiten Sie insgesamt 90 scheibenförmige Proben aus drei nanohybriden Harz-Verbundwerken vor (n = 30 pro Material).
2. Stellen Sie Proben mit zylindrischen klaren Silikonformen (6 mm Durchmesser × 2 mm Dicke) her, um standardisierte Maße zu gewährleisten.
3. Geben Sie das Verbundmaterial in einem einzigen Schritt (2 mm Dicke) in die Formen und bedecken Sie die Oberfläche mit einem durchsichtigen Objektträger, um eine ebene Oberfläche zu erhalten.
4. Polymerisieren Sie die Probe mit einer blauen LED-Lichthärtungseinheit (≈440–480 nm Emissionsspektrum), die etwa 1 mm von der Oberfläche entfernt mit einer Ausgangsintensität von 1000 mW/cm^² für 20 Sekunden positioniert ist.
5. Überprüfen Sie die Aushärtung der Lichtintensität mit einem Radiometer vor jedem Polymerisationszyklus, um eine gleichmäßige Lichtbelastung sicherzustellen.
6. Die vorbereiteten Proben werden 24 Stunden lang in destilliertem Wasser bei 37 °C gelagert, um die Postpolymerisation zu ermöglichen und die anfänglichen oralen Bedingungen zu simulieren.
   HINWEIS: Proben können bis zu 24 Stunden in destilliertem Wasser bei 37 °C gelagert werden, bevor sie weiterverarbeitet werden.

2. Fertigstellungs- und Polierungsverfahren

1. Lackieren und polieren Sie die Oberseiten aller Proben mit aluminiumoxidimprägnierten Polierscheiben. Alle Polierungsverfahren sollten von einem einzigen Bediener durchgeführt werden, um eine Oberflächenstandardisierung sicherzustellen.
2. Wenden Sie das Polieren sequentiell mit mittelen, feinen und superfeinen Scheiben für jeweils 10 Sekunden unter Wasserkühlung bei etwa 10.000 U/min mit geringem Druck und einer einseitigen Drehbewegung auf.
3. Polierscheiben werden nach jeweils fünf Proben ersetzt, um eine gleichbleibende Abrasionseffizienz zu gewährleisten und eine Oberflächenstandardisierung sicherzustellen.
4. Nach jedem Polierungsschritt spülen Sie die Proben 10 Sekunden lang mit destilliertem Wasser, um Rückstände zu entfernen, und lassen Sie sie vorsichtig 5 Sekunden an der Luft trocknen, bevor Sie zur nächsten Scheibe übergehen.
5. Markieren Sie die unpolierte Oberfläche jedes Probens mit einem eindeutigen Identifikationscode, um bei den nachfolgenden Tests eine einheitliche Ausrichtung zu gewährleisten.
6. Bewahren Sie Proben 24 Stunden lang in destilliertem Wasser bei 37 °C auf, bevor die Basis-Mikrohärteprüfung durchgeführt wird.
   HINWEIS: Proben können bis zu 24 Stunden vor der Basisuntersuchung in destilliertem Wasser bei 37 °C gelagert werden.

3. Basismessung der Mikrohärte

1. Führen Sie den Vickers-Mikrohärtetest (VHN) nach zuvor veröffentlichten Protokollen mit einem Vickers-Mikrohärtetester¹¹ durch.
2. Trage eine Ladung von 200 g für 15 Sekunden auf.
3. Mach pro Exemplar drei Einkerbungen mit mindestens 1 mm Abstand. Führen Sie Einkerbungen auf der zentralen Oberfläche jedes Probestücks vor, um Kanteneffekte zu vermeiden.
4. Berechnen Sie VHN mit mittlerem Ausgangswert.
5. Führen Sie Messungen durch einen einzelnen kalibrierten Operator durch, um die Variabilität zu minimieren.
   HINWEIS: Proben können bis zu 24 Stunden vor dem Eintauchen in destilliertem Wasser bei 37 °C gelagert werden.

4. Vorbereitung von Immersionsmedien

1. Bereiten Sie zwei Molkenprotein-Formulierungen vor: Molkenproteinkonzentrat (WC) und Molkenproteinisolat (WI) mit handelsüblichen Pulvern.
2. 25 g Molkenproteinpulver in 200 ml destilliertes Wasser (0,125 g/mL) auflösen, um die Immersionslösungen herzustellen.
3. Die Lösungen werden 60 Sekunden lang mit einem Laborshaker gemischt, bis die vollständige Auflösung erreicht ist.
4. Lassen Sie die Lösungen 5 Minuten bei Raumtemperatur ausgleichen, um die Schaumbildung zu minimieren und die Homogenität zu gewährleisten.
5. Missen und erfassen Sie den pH-Wert jeder Lösung mit einem kalibrierten digitalen pH-Meter vor dem Eintauchen.
6. Bereiten Sie frische Molkenlösungen vor jedem Immersionszyklus vor, um eine gleichbleibende chemische Zusammensetzung zu gewährleisten und einen Proteinabbau zu vermeiden.
7. Verwenden Sie pro Probe 10 ml Immersionslösung, um während jedes Zyklus ein vollständiges Eintauchen sicherzustellen.

5. Immersionsverfahren

1. Teile jede zusammengesetzte Gruppe in drei Untergruppen (n = 10).
2. Tauchen Sie die Proben für 10 Minuten zweimal täglich in die zugewiesenen Lösungen ein. Wählen Sie die Immersionsdauer und -häufigkeit basierend auf zuvor etablierten In-vitro-Getränkeexpositionsmodellen , die darauf ausgelegt sind, wiederholte tägliche Konsummuster zu simulieren⁷.
3. Nach jedem Eintauchzyklus spülen Sie die Proben mit destilliertem Wasser ab und geben Sie sie 10 Minuten lang in künstlichen Speichel, um eine kurzfristige Speichelexposition zu simulieren.
4. Lagern Sie die Proben zwischen den Immersionszyklen bei 37 °C in destilliertem Wasser bis zum nächsten Belichtungszyklus.
5. Wenden Sie dieses Verfahren nur auf die molkenexponierten Gruppen an. Die Kontrollgruppe wird während des gesamten Versuchszeitraums kontinuierlich in destilliertem Wasser (DW) bei 37 °C gehalten.
   HINWEIS: Das Immersionsprotokoll kann zwischen den Zyklen pausiert und am folgenden Tag ohne Beeinträchtigung der experimentellen Konsistenz fortgesetzt werden.
6. Führe das Immersionsprotokoll für 30 Tage fort.

6. Mikrohärtemessung nach der Immersion

1. Proben mit destilliertem Wasser abspülen und vorsichtig trocknen.
2. Führen Sie Vickers-Mikrohärtetests mit denselben Parametern durch (200 g, 15 s).
3. Zeichnen Sie drei Einzüge auf und berechnen Sie den mittleren VHN nach der Immersion.
4. Bestimmen Sie den ΔVHN für jede Probe.

7. Statistische Analyse

1. Analysieren Sie die Mikrohärtewerte von Vickers mit einem ANOVA-Modell für wiederholte Messungen, wobei Zeitpunkte (Ausgangspunkt und Nachimmersion) als Faktor innerhalb des Subjekts und Composite-Typ und Immersionslösung als Zwischen-Subjektfaktoren gelten.
2. Wenn angebracht, berechnen Sie ΔVHN-Werte als beschreibende Ergebnismaße, um die Größe der Mikrohärteänderung für jede Probe anzugeben.
3. Führen Sie nachträglich paarweise Vergleiche mit Tukeys Honestly Significant Difference (HSD) Test durch.
4. Berechnen Sie 95%-Konfidenzintervalle für alle Gruppenmittelwerte.
5. Berichte über Effektgrößen mit teilweisen ETA-Quadraten (η²p) für ANOVA-Ergebnisse.
6. Vergleichen Sie pH-Werte zwischen Molkenproteinlösungen mit dem Welchschen T-Test.
7. Setzen Sie das statistische Signifikanzniveau auf p < 0,05.
8. Zusätzlich zu absoluten ΔVHN-Werten wird die prozentuale Mikrohärteänderung mit folgender Formel berechnet: [(Basis-VHN − Post-Immersion VHN) / Basis-VHN] × 100.

Results

Deskriptive Statistiken

Die mittleren ΔVHN (±SD) Werte der zusammengesetzten Lösungskombinationen sind in Tabelle 1 dargestellt.

Harzverbund	Lösung	ΔVHN (Mittelwert ± SD)	95%-KI	n

Discussion

Das vorliegende Protokoll bietet einen standardisierten Ansatz zur Bewertung der chemischen Auswirkungen von Molkenproteingetränken auf die Mikrohärte von Harzkompositen. Kritische Schritte umfassen eine einheitliche Probenherstellung, kontrollierte Lichthärtungsbedingungen und standardisierte Vickers-Testparameter. Die Einhaltung konstanter Abmessungen und Aushärtungsintensität ist unerlässlich, da Variationen den Grad der Umwandlung und mechanische Stabilität beeinflussen können. Darüb...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminiumoxid-Polierscheiben	RubyPlaton, Inci Dental Tibbi Malz. San. ve Tic. Ltd. Sti., Istanbul, Türkei	5714	Mittel, fein, superfein, wird zum Fertigstellen und Polieren verwendet
Analysenwaage			Zum Wiegen von Materialien verwendet
Künstliche Speichellösung	DIN 53160-1, Testonic Laboratory, Istanbul, Türkei		Zur Aufbewahrung zwischen Eintauchzyklen verwendet
Digitales pH-Meter	Hanna Instruments, Woonsocket, RI, USA	HI2211	Messung des pH-Werts von Getränken
Destilliertes Wasser	Nicht angegeben	Nicht zutreffend	Wird als Kontrolllösung und zur Probenaufbewahrung verwendet
Glasmikroskop-Objektträger	Ningbo Trueline Imp. & Exp. Co., Ltd, Zhejiang, China	7102	Wird verwendet, um eine flache Probenoberfläche während der Composite-Platzierung zu erhalten
Gesticheltes Messzylinder	Nicht angegeben	Nicht zutreffend	Zum Messen von Flüssigkeitsvolumina verwendet
Hochgefüller Nano-Hybrid-Resin-Komposit (EA)	Estelite Asteria (Tokuyama Dental, Tokio, Japan)	10942	Wird als Restaurationsmaterial verwendet; unterscheidet sich in Füllung und Harzmatrixzusammensetzung
Inkubator	Memmert Universal, Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Deutschland	UN55	Zur Aufbewahrung bei 37 °C verwendet
Injizierbares Nano-Hybrid-Resin-Komposit (GUI)	G-ænial Universal Injectable (GC Corporation, Tokio, Japan)	12365	Wird als Restaurationsmaterial verwendet; unterscheidet sich in Füllung und Harzmatrixzusammensetzung
Laborbecher	Nicht angegeben	Nicht zutreffend	Zur Herstellung von Molkenproteinlösungen verwendet
Laborschüttler	Nicht angegeben	Nicht zutreffend	Zum Mischen und Homogenisieren von Lösungen verwendet
LED-Lichthärtegerät und Radiometer	Woodpecker LED-Härtungseinheit (Guilin Woodpecker Medical Instrument Co., Ltd., Guangxi, China)	FD-300	Polymerisation und  Überprüfung der Lichtintensität
Mikromotor-Handstück	FX205, NSK Ltd., Kanuma, Japan	C1056002	In der Polierprozedur verwendet
Mäßig gefülltes Nano-Hybrid-Resin-Komposit (FU)	Filtek Universal (3M ESPE, St. Paul, MN, USA)	6570A2	Wird als Restaurationsmaterial verwendet; unterscheidet sich in Füllung und Harzmatrixzusammensetzung
Silikonform	Nicht angegeben	Nicht zutreffend	Scheibchenförmig, 6 mm Durchmesser × 2 mm Dicke, wird zur Probenherstellung verwendet
Vickers Mikrohärteprüfer	HMV, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan	HMV-G31	Vickers Härteprüfung (VHN)
Molkenproteinkonzentratpulver	Molkenprotein Erdbeergeschmack, Proteinocean Gida AS., Ankara, Türkei		Lactose-Gehalt: ~1–2%, Proteingehalt: ~85–90%
Molkenproteinisolatpulver	Isolate Whey Schokoladengeschmack, Proteinocean Gida AS., Ankara, Türkei		Lactose-Gehalt: ~4–6%, Proteingehalt: ~70–80%