Forschungsartikel

Repräsentative gezielte molekulare und genomische Charakterisierung von Virulenzgenen in Staphylococcus aureus bei diabetischen Fußinfektionen

DOI:

10.3791/71373

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29. Mai 2026

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1Department of Microbiology, College of Medicine, University of Anbar, 2Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Pharmacy, University of Anbar

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Diese Studie charakterisierte die Mechanismen der antimikrobiellen Resistenz, Virulenzdeterminanten und genomischen Merkmale von Staphylococcus aureus-Isolaten, die von diabetischen Fußinfektionen durch antimikrobielle Anfälligkeitstests, PCR-basierte Virulenzprofilierung und Ganzgenomsequenzierung genesen wurden.

Zusammenfassung

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Diabetische Fußinfektionen (DFIs) stellen ein großes Gesundheitsproblem dar, und der methicillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA) gehört zu den klinisch bedeutendsten Krankheitserregern. Diese Studie untersuchte die Prävalenz von Virulenzegenen (can und hlg), antimikrobielle Resistenzprofile und repräsentative genomische Merkmale multiresistenter S. aureus-Isolate , die bei Patienten mit DFIs gefunden wurden. Zwischen Januar und Dezember 2024 wurde eine Querschnittsbeobachtungsstudie an 125 Patienten mit diabetischen Fußinfektionen durchgeführt. Antimikrobielle Anfälligkeitstests wurden mit der Kirby–Bauer-Diskdiffusionsmethode und dem Cefoxitin-Screening gemäß den Richtlinien des Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) durchgeführt, wobei S. aureus ATCC 25923 als Qualitätskontrollstamm verwendet wurde. Die Vancomycin-Suszeptibilität wurde durch Tests zur minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) bestätigt. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde verwendet, um die Virulenzgene (can und hlg) und blaOXA-Gruppe-I-Gene nachzuweisen. Die Ganzgenomsequenzierung (WGS) wurde an zwei repräsentativen Isolaten durchgeführt, darunter ein multiresistentes (MDR)-Isolat und ein extensivresistentes (XDR)-Isolat, wobei ein de-novo-Sequenzierungsansatz zur Erstellung von Entwurfsassemblierungen verwendet wurde. Unter 125 klinischen Proben wurde in 90 Proben (72 %) ein Bakterienwachstum beobachtet, von denen 45 Isolate (50 %) als S. aureus identifiziert wurden. Unter diesen Isolaten wurden 35/45 (77,78 %) als MRSA klassifiziert, und 36/45 (80 %) als multiresistent. Das hlg-Gen wurde in allen Isolaten nachgewiesen, während das Can-Gen in 13/45 (28,89 %) Isolaten identifiziert wurde. Es wurden keine blaOXA-Gruppe-I-Gene nachgewiesen. Die genomische Analyse identifizierte mehrere resistenzassoziierte Gene, darunter blaZ, tet(38), norA und vanT, zusammen mit CRISPR-Cas-Elementen und plasmidassoziierten Resistenzdeterminanten. Diese Ergebnisse unterstreichen die hohe Prävalenz multiresistenter S. aureus in DFIs und unterstreichen die Bedeutung einer fortgesetzten genomischen Überwachung klinisch relevanter resistenter Stämme.

Einleitung

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Zahlreiche Kolonisations- und Virulenzmerkmale machen das grampositive Bakterium Staphylococcus aureus (S. aureus) zu einem weit verbreiteten opportunistischen Erreger, der eine Vielzahl von Infektionen verursachen kann, darunter Impetigo, Wundinfektionen, Furunkel, Hautabszesse, Bakteriämie und infektiöse Endokarditis1. Einige dieser Infektionen können sich zu schweren Erkrankungen entwickeln und eine Krankenhausaufnahme erfordern, insbesondere bei Patienten mit Diabetes mellitus, Immunsuppression, Malignität, Harnkatheterisation oder Infektion mit humanem Immundefizienzvirus1.

Methicillin-resistente S. aureus (MRSA)-Stämme sind mit erheblicher Morbidität und Mortalität assoziiert, da sie schnell antimikrobielle Resistenzdeterminanten erwerben und in Gesundheitsumgebungen bestehen können1. Patienten mit Diabetes mellitus entwickeln häufig diabetische Fußulcera aufgrund von Neuropathie, vaskulärer Insuffizienz und geschwächten Immunantworten2. Diabetische Fußinfektionen (DFIs) haben eine komplexe Pathophysiologie, und klinische Ergebnisse werden sowohl von mikrobiellen als auch von wirtsassoziierten Faktoren beeinflusst, einschließlich bakterieller Virulenz3. Obwohl diabetische Fußulcera polymikrobielle Gemeinschaften aus aeroben und anaeroben Bakterien und Pilzen enthalten können, bleibt S. aureus einer der vorherrschenden Krankheitserreger, die aus diesen Infektionen isoliert werden4. Der Organismus besitzt mehrere Virulenzdeterminanten, die Immunumgehung, Gewebeinvasion, chronische Besiedlung und anhaltende Infektionen ermöglichen. Darüber hinaus hat die Erwerbung von MecA/SCCmec-vermittelter Methicillinresistenz und anderen antimikrobiellen Resistenzdeterminanten die therapeutischen Möglichkeiten für DFI-assoziierte Infektionenerheblich eingeschränkt 4,5. Frühere Studien berichteten über eine hohe Prävalenz multiresistenter (MDR) S. aureus-Isolate bei diabetischen Fußinfektionen, wobei Resistenzen häufig mit β-Laktamase-Genen assoziiert sind, darunter blaTEM, blaOXA und blaCTX-M Varianten6.

Mehrere virulenzassoziierte Gene tragen zur Pathogenität und Persistenz von S. aureus bei chronischen Wundinfektionen bei. Unter diesen codiert das hlg-Gen γ-Hämolysin, einen zytotoxischen Faktor, der mit Gewebezerstörung, Entzündung, Immunumgehung und dem Persistenz von gemeinschaftlich erworbenen MRSA-Stämmen 7,8 assoziiert ist. Das Can-Gen codiert einen kollagenbindenden Adhesin, der die bakterielle Haftung an kollagenreichen Geweben fördert und zur chronischen Besiedlung und Infektionspersistenz beiträgt8. Frühere Untersuchungen stellten eine hohe Prävalenz von HLG bei MRSA-Isolaten fest, die von diabetischen Fußinfektionen genesen wurden, was das gleichzeitige Vorkommen von Virulenz- und antimikrobieller Resistenzfaktoren in diesen Infektionen betont9. Unangemessene Exposition mit Antibiotika, längere Krankenhausaufenthalte, beeinträchtigte Gewebepenetration durch antimikrobielle Wirkstoffe und chronische Wundprogression tragen weiter zur Entstehung und Verbreitung von MDR-Organismen bei Patienten mit DFIs10 bei. Nach internationalen Definitionen zeigen multiresistente (MDR) Bakterien Resistenz gegen mindestens einen antimikrobiellen Stoff in drei oder mehr antimikrobiellen Klassen, extensive arzneimittelresistente (XDR) Bakterien bleiben nur für ein oder zwei antimikrobielle Klassen empfänglich, und pandrugresistente (PDR) Bakterien sind resistent gegen alle getesteten antimikrobiellen Klassen10. Trotz der anerkannten klinischen Bedeutung von S. aureus bei diabetischen Fußinfektionen gibt es weiterhin begrenzte integrierte molekulare und genomische Informationen, die Virulenzdeterminanten mit antimikrobiellen Resistenzprofilen in klinischen Isolaten aus dieser Region verknüpfen.

Daher zielte diese Studie darauf ab, antimikrobielle Resistenzmuster zu charakterisieren, die Prävalenz ausgewählter Virulenzgene (hlg und can) zu bestimmen, das Auftreten von Bla-OXA-Gruppe-I-Genen zu untersuchen und repräsentative Ganzgenomsequenzierungsanalysen ausgewählter multiresistenter S. aureus-Isolate von Patienten mit diabetischen Fußinfektionen durchzuführen.

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Protokoll

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1. Patienten untersuchen

Diese Studie wurde am 24. Dezember 2023 vom Ethical Approval Committee der Universität Anbar, Ministerium für Hochschulbildung und wissenschaftliche Forschung, Irak (Genehmigungsnummer 145), Stadt Ramadi, Gouvernement Anbar, Irak, genehmigt. Alle Verfahren mit menschlichen Teilnehmern wurden gemäß den institutionellen ethischen Richtlinien der Universität Anbar durchgeführt. Vor der Einschreibung wurde von allen Teilnehmern eine schriftliche informierte Zustimmung eingeholt.

Von Januar bis Dezember 2024 wurde eine querschnittsübergreifende Beobachtungsstudie in den Lehrkrankenhäusern von Ramadi und angeschlossenen Privatkliniken im Gouvernement Anbar, Irak, durchgeführt. Während des Studienzeitraums wurden insgesamt 125 aufeinanderfolgende berechtigte Patienten mit diabetischen Fußinfektionen (DFIs) aufgenommen. Die Stichprobengröße wurde anhand der Anzahl der während des Studienzeitraums verfügbaren berechtigten Patienten bestimmt und nicht anhand statistischer Berechnungen. Klinisch wurde DFI definiert als das Vorhandensein eines Fußgeschwürs jeglicher Art bei Patienten mit Typ-1-Diabetes mellitus (T1DM) oder Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM). Männliche und weibliche Patienten mit unterschiedlichen Geschwürschweregraden wurden eingeschlossen.

Die Patienten waren berechtigt, wenn sie ein klinisch diagnostiziertes diabetisches Fußgeschwür hatten, die teilnehmenden Gesundheitseinrichtungen besuchten und eine informierte Zustimmung gaben. Ausschlusskriterien umfassten Fußulcera, die nicht mit Diabetes mellitus zusammenhängen (z. B. traumatische Geschwüre), Überweisung aus anderen Gesundheitseinrichtungen, Unfähigkeit zur informierten Einwilligung aufgrund einer kritischen Erkrankung, Antibiotikatherapie innerhalb von 48 Stunden vor der Probenentnahme sowie polymikrobielle Infektionen. Patienten mit polymikrobiellen Infektionen wurden ausgeschlossen, um eine genaue phänotypische, molekulare und genomische Charakterisierung von Staphylococcus aureus-Isolaten sicherzustellen. Demografische und klinische Daten, darunter Alter, Geschlecht, diabetische Komplikationen, Dauer des Diabetes mellitus, Antibiotikaanamnese und Begleiterkrankungen, wurden mithilfe eines strukturierten Fragebogens erhoben.

Die klinischen Proben wurden innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme unter gekühlten Bedingungen (4 °C) mit sterilen Transportabstrichen mit Amies-Medium ins mikrobiologische Labor transportiert und sofort für die mikrobiologische Analyse verarbeitet. Alle Verfahren mit klinischen Proben, Bakterienkulturen, antimikrobiellen Anfälligkeitstests, Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und UV-Visualisierung wurden unter Biosafety Level 2 (BSL-2) Laborbedingungen gemäß institutionellen Biosicherheitsrichtlinien durchgeführt. Das Laborpersonal trug geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA), darunter Laborkittel, Einweghandschuhe, chirurgische Masken und bei Bedarf Augenschutz. Strenge aseptische Verfahren wurden in allen mikrobiologischen und molekularen Verfahren eingehalten, um Kontaminations- und Expositionsrisiken zu minimieren. Spezielle Arbeitsbereiche wurden für die Handhabung von Bakterienkulturen und DNA-Amplifikationsverfahren genutzt, um Kreuzkontaminationen zu verhindern. Kontaminierte Materialien, darunter Kulturplatten, Abstriche, Pipettenspitzen und Einwegmaterialien, wurden bei 121 °C und 15 psi für 15–20 Minuten vor der Entsorgung autoklaviert. Scharfe Gegenstände wurden in ausgewiesenen, punktresistenten Biohazard-Behältern entsorgt. Biologischer Abfall wurde gemäß institutionellen Protokollen zur Entsorgung biomedizinischer Abfälle verwaltet. Diese Biosicherheitsmaßnahmen gewährleisteten den sicheren Umgang mit multiresistenten Organismen, einschließlich MRSA und vancomycinresistenten Isolaten (Abbildung 1).

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Abbildung 1: Überblick über den in der Studie verwendeten klinischen, mikrobiologischen, molekularen, ganzgenomischen und bioinformatischen Arbeitsablauf. Die Abbildung fasst die Probenentnahme, mikrobiologische Kultur, antimikrobielle Anfälligkeitstests, PCR-basierte molekulare Detektion, Ganzgenomsequenzierung und nachgelagerte bioinformatische Analysen zusammen. Diese Abbildung wurde mit Unterstützung der KI-basierten Designplattform Gamma Pro (Gamma App) erstellt und anschließend von den Autoren auf wissenschaftliche Genauigkeit überprüft, überarbeitet und validiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Die Daten wurden mit SPSS-Software Version 22.0 analysiert. Deskriptive Statistiken, einschließlich Mittelwerte und Prozentsätze, wurden berechnet. Die Zusammenhänge zwischen kategorialen Variablen wurden mit dem Chi-Quadrat-Test analysiert. Ein p-Wert <0,05 galt als statistisch signifikant.

2. Verarbeitung und Entnahme von Proben

Proben wurden aus dem tieferen Teil diabetischer Fußulkus mittels der Tiefenabstrichtechnik entnommen. Zwei sterile mit steriler Brühe vorbefeuchtete Wattestäbchen wurden nach der Entschädigung mit einem sterilen Skalpell und der Reinigung mit steriler Kochsalzlösung fest über die Wundbasis gedreht, um eine Kontamination durch kolonisierende Mikroorganismen zu minimieren. Ein Abstrich wurde für die Gram-Färbung verwendet, während der zweite für die mikrobiologische Kultur verwendet wurde. Direkte Gram-gefärbte Abstriche wurden mikroskopisch untersucht.

Knochengewebeproben wurden von Patienten mit klinisch vermuteter Osteomyelitis unter sterilen Bedingungen nach chirurgischer Debridement entnommen. Vor der Probenentnahme wurden die Geschwüroberflächen mit sterilem Kochsalzlösungsmittel gereinigt, um oberflächliche Kontaminationen zu reduzieren. Knochengewebeproben wurden aseptisch mit sterilen chirurgischen Instrumenten entnommen und sofort in sterile Behälter zur mikrobiologischen Verarbeitung überführt.

Die Proben wurden unter sterilen Bedingungen homogenisiert oder fein gehackt und auf Blutagar, Mannitol Salt Agar (MSA), MacConkey Agar und Nährstoffagar geimpft. Die Platten wurden aerob bei 37 °C für 18–24 Stunden inkubiert. Blutagar und Nährstoffagar unterstützten das Wachstum von grampositiven und gramnegativen Organismen, während MSA zur selektiven Isolierung und Differenzierung von Staphylococcus-Arten , einschließlich S. aureus, verwendet wurde. MacConkey-Agar wurde zur Bergung von gramnegativen Bakterien verwendet. Kulturplatten wurden nach der Inkubation untersucht, und Exemplare ohne sichtbares Wachstum nach 48 Stunden wurden als "kein Wachstum" gemeldet.

Die vorläufige bakterielle Identifizierung erfolgte auf Basis der Koloniemorphologie, Gram-Färbung und biochemischen Eigenschaften, gefolgt von molekularer Bestätigung von S. aureus mittels PCR-Amplifikation des Nuc-Gens . Die biochemische Identifikation umfasste Katalasa-Tests, Proben der Slide- und Tubekoagulase, Mannitolfermentation und DNase-Tests. Bestätigte Isolate wurden weiter mit dem VITEK 2 Compact-System und der VITEK 2 GP-Identifikationskarte identifiziert. Identifikationsergebnisse wurden nur akzeptiert, wenn das Konfidenzniveau ≥95 % betrug. Disharmonische oder niedrige Konfidenzergebnisse wurden erneut mit wiederholten biochemischen Analysen und wiederholten VITEK-Tests getestet. Reine Isolate wurden in 20 % Glycerol, die in einer Gehirnherzinfusion (BHI)-Brühe (BHI) hergestellt wurden, für weitere molekulare und genomische Analysen konserviert (Abbildung 1).

3. Antimikrobielle Anfälligkeitstests

Antimikrobielle Anfälligkeitstests wurden mit der Kirby–Bauer-Diskdiffusionsmethode gemäß den Richtlinien des Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 2022 durchgeführt. Tests wurden am Mueller–Hinton-Agar mit einer standardisierten Agartiefe von 4 mm durchgeführt. Frische Bakterienkulturen wurden vor der Impfung mit einem Densitometer auf einen 0,5-McFarland-Standard angepasst. Sterile Abstriche wurden verwendet, um Agarflächen gleichmäßig zu impfen.

Folgende antimikrobielle Scheiben wurden verwendet: Ampicillin (10 μg), Gentamicin (10 μg), Amikacin (30 μg), Cefoxitin (30 μg), Cefuroxim (30 μg), Piperacillin/Tazobactam (100/10 μg), Meropenem (10 μg), Amoxicillin–Klavulansäure (30 μg), Oxacillin (1 μg), Levofloxacin (5 μg), Clindamycin (2 μg), Tigecyclin (15 μg), Ciprofloxacin (5 μg), Erythromycin (15 μg), Trimethoprim–Sulfamethoxazol (25 μg), Linezolid (30 μg), und Vancomycin (30 μg). Die Platten wurden aerob bei 37 °C für 16–18 Stunden inkubiert. Zonendurchmesser wurden anhand von CLSI-Breakpoints interpretiert.

Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA) wurde mittels Cefoxitin-(30 μg)-Screening gemäß den CLSI-Empfehlungen identifiziert. Die Qualitätskontrollprüfung erfolgte mit S. aureus ATCC 25923. Alle Experimente wurden doppelt durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen. Multiarzneimittelresistente (MDR), extensiv arzneimittelresistente (XDR) und pandrugresistente (PDR) Isolate wurden nach internationalen Standarddefinitionen auf Basis von antimikrobiellen Resistenzprofilen klassifiziert (Abbildung 1).

4. Nachweis von Methicillin-resistentem S. aureus (MRSA)

Ein Cefoxitin-(30 μg) Scheibendiffusionstest wurde als phänotypisches Verfahren zur MRSA-Detektion verwendet. Isolate mit Hemmungszonen ≥22 mm wurden als Methicillin-sensitives S. aureus (MSSA) klassifiziert, während Isolate mit Hemmungszonen ≤21 mm gemäß den CLSI-Kriterien als MRSA klassifiziert wurden (Abbildung 1).

5 Bestimmung der Vancomycin-Resistenz durch Tests zur minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC)

Die minimalen inhibitorischen Konzentrationen (MICs) von Vancomycin wurden mit der Brühe-Mikroverdünnungsmethode gemäß den CLSI-Richtlinien11 bestimmt. Serielle, zweifache Verdünnungen von Vancomycin (4–512 μg/mL) wurden in Mueller–Hinton-Brühe hergestellt. Bakterielle Suspensionen wurden auf einen 1,5 McFarland-Standard angepasst und auf etwa 1 × 105 CFU/ml verdünnt.

Nach der Inkubation bei 37 °C für 24 Stunden wurde die MIC als die niedrigste Konzentration definiert, bei der kein sichtbares Bakterienwachstum beobachtet wurde. Die Vancomycin-Suszeptibilität wurde gemäß den CLSI-Kriterien wie folgt interpretiert: anfällig (≤2 μg/mL), intermediär (4–8 μg/mL) und resistent (≥16 μg/mL)11,12 (Abbildung 1).

6. Molekulare Detektion

6.1 DNA-Extraktion

Staphylococcus aureus-Isolate wurden 24 Stunden lang in Herzbrühe (BHI) bei 37 °C kultiviert. Bakterielle genomische DNA wurde mit einem kommerziellen Kit und einem automatisierten Nukleinsäureextraktionssystem extrahiert. Die extrahierte DNA wurde bis zur Verwendung bei −20 °C aufbewahrt. Die DNA-Konzentration wurde mit einem Fluorometer gemessen, um die Eignung für eine PCR-Amplifikation zu bewerten. Die mittlere DNA-Konzentration betrug 85 ± 8,2 ng/μL.

Primer, die sich auf die Can-, HLG- und Klasse-D-β-Laktamase-(blaOXA-Gruppe I)-Gene konzentrieren, wurden kommerziell gewonnen und für die PCR-Amplifikation verwendet, wie in Tabelle 1 13,14,15,16 aufgeführt.

Tabelle 1: Primer-Sequenzen, die für die PCR-Amplifikation von Zielgenen verwendet wurden, die in dieser Studie untersucht wurden. Die Tabelle fasst die Zielgene, Primer-Sequenzen, erwartete Amplicongrößen, Annealing-Temperaturen und Referenzen zusammen, die für die PCR-Amplifikation von Nuc-, MecA-, hlg-, can- und bla-OXA-Gruppe-I-Genen in Staphylococcus aureus-Isolaten verwendet werden, die von diabetischen Fußinfektionen genesen wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

6.2 Molekulare Detektion von Virulenz- und Klasse-D-β-Lactamase-(blaOXA-Gruppe I)-Genen mittels PCR

Die in dieser Studie verwendeten Primer-Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die PCR-Amplifikation von MecA-, Nuc-, virulenzassoziierten Genen und Klasse-D-β-Laktamase-Genen (blaOXA-Gruppe I) wurde in 25 μL-Reaktionsmischungen durchgeführt, die 12,5 μL GoTaq Green Master Mix (2×), 0,5 μL MgCl2, 3 μL genomische DNA-Vorlage, jeweils 1 μL Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 pmol/μL) sowie 7 μL nukleasefreies Wasser enthielten.

Die thermischen Zyklenbedingungen bestanden aus einem anfänglichen Denaturierungsschritt bei 95 °C für 5 Minuten, gefolgt von 30–35 Amplifikationszyklen, darunter Denaturierung bei 95 °C für 30 S–1 Minuten, Glühen bei 50–62 °C für 30 S–1 Minuten, abhängig vom Primer-Satz, und Verlängerung bei 72 °C für 30 S–1 Minuten. Die letzte Verlängerung erfolgte bei 72 °C für 7–19 Minuten.

Verstärkte PCR-Produkte wurden auf 1,5–2 % Agarose-Gelen getrennt, die mit Safe Red gefärbt und unter ultravioletter Beleuchtung mit einem Gel-Dokumentationssystem visualisiert wurden. Negative Kontrollgruppen wurden bei jedem PCR-Lauf einbezogen, um die Validität der Amplifikation zu bestätigen.

7. Ganzgenom-Sequenzierung (WGS)

Die Ganzgenomsequenzierung (WGS) wurde an zwei repräsentativen klinischen Staphylococcus aureus-Isolaten durchgeführt, die aus Knochengewebeproben von Patienten mit diabetischen Fußinfektionen gewonnen wurden. Die ausgewählten Isolate umfassten ein multiresistentes (MDR) und ein umfangreich arzneimittelresistentes (XDR) Isolat, die durch phänotypische antimikrobielle Anfälligkeitstests und MIC-bestätigte Resistenzprofile identifiziert wurden. Diese Strategie ermöglichte eine repräsentative genomische Charakterisierung klinisch relevanter resistenter Isolate (Abbildung 1).

Die Qualität, Konzentration und Integrität der genomischen DNA wurden vor der Sequenzierung bewertet, um die Eignung für die Bibliotheksvorbereitung und die nachgelagerte bioinformatische Analyse sicherzustellen. Die DNA wurde mittels eines Fluorometers quantifiziert, und die Integrität wurde durch 1 % Agarosegel-Elektrophorese bei 150 V für 40 Minuten überprüft. DNA-Fragmente von etwa 200–400 bp Länge wurden mittels magnetischer Perlenreinigung, gefolgt von Endreparatur, 3′-Adenylierung und Adaptorligierung ausgewählt.

Einsträngige zirkuläre DNA-Moleküle wurden durch Amplifikation, Reinigung und Zirkularisierung adaptor-ligierter Fragmente mittels Schienenoligonukleotide erzeugt. DNA-Nanobälle (DNBs) wurden anschließend durch rollende Kreisamplifikation erzeugt. Die Sequenzierung erfolgte auf der DNBSEQ-Plattform unter Verwendung der kombinatorischen Probe-Anchor-Synthese (cPAS)-Chemie.

Rohsequenzierungslesungen wurden Qualitätskontrollverfahren unterzogen, um minderwertige Lesungen, Adapterkontaminationen, mehrdeutige Lesungen und doppelte Sequenzen zu entfernen. Für nachgelagerte Analysen wurden saubere Lesungen verwendet. Die Genomassemblage wurde durchgeführt, um Genomgröße, GC-Gehalt und Sequenzierungsabdeckungstiefe zu schätzen. Die endgültigen Entwurf-Genomassemblierungen wurden in FASTA-, GenBank- und NCBI-Einreichungsformaten erstellt.

Die Genomannotation identifizierte kodierende Sequenzen (CDS), Transfer-RNA (tRNA), ribosomale RNA (rRNA) und kleine RNA (sRNA)-Gene. Die funktionale Annotation vorhergesagter Gene wurde mit mehreren Datenbanken durchgeführt, darunter Swiss-Prot, COG, KEGG, CAZy, VFDB, ARDB und CARD, für virulenz- und antimikrobielle resistente Gene für virulenz- und antimikrobielle Resistenz-assoziierte Gene.

8. Bioinformatik-Analyse

Die Genomassemblierung und -Annotation erfolgte mit dem Bacterial and Viral Bioinformatics Resource Center (BV-BRC). Phylogenetische Analysen wurden mit PATRIC-Werkzeugen durchgeführt. Zirkuläre Genomvisualisierungskarten wurden erstellt, um kodierende Sequenzen, GC-Inhalt, GC-Streuung, antimikrobielle Resistenzdeterminanten, virulenzassoziierte Gene und mobile genetische Elemente zu illustrieren.

Phylogenetische Beziehungen wurden mithilfe von PATRIC Global Protein Families (PGFams) bestimmt, die aus den nächstgelegenen Referenzgenomen mittels Mash/MinHash-Analyse identifiziert wurden. Protein-Ausrichtungen wurden mit MUSCLE erzeugt, und entsprechende Nukleotid-Ausrichtungen wurden auf Proteinfamilien abgebildet. Phylogenetische Bäume wurden mit RAxML und schneller Bootstrapping-Analyse konstruiert (Abbildung 1).

Genomkontigs wurden zusätzlich mit Pathogenwatch zur Artbestätigung und zum Nachweis antimikrobieller Resistenzgene analysiert. Virulenzassoziierte Gene wurden mit ABRicate analysiert. Der PATRIC Genome Annotation Service verwendete einen k-mer-basierten Ansatz, um antimikrobielle Resistenzgene zu identifizieren und funktionelle Annotationen, antimikrobielle Klassen und Resistenzmechanismen zuzuweisen. Zirkuläre Genomvisualisierungen repräsentativer MDR- und methicillinresistenter S. aureus-Isolate wurden wie zuvor beschriebenerzeugt 17. Ergänzende Tabelle 1 fasst alle bioinformatischen Werkzeuge, Softwareversionen, Datenbanken und analytischen Parameter zusammen, die in den genomischen Analysen verwendet werden.

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Ergebnisse

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Probenverarbeitung und Kulturpositivität

In dieser Studie wurden insgesamt 125 klinische Proben entnommen und analysiert. Bakterienwachstum wurde in 90 von 125 Proben (72 %) beobachtet. Diese kulturpositiven Proben wurden anschließend zur bakteriellen Identifizierung und antimikrobiellen Anfälligkeitstests untersucht. Deskriptive Statistiken, einschließlich Häufigkeit und Prozentsätze, wurden verwendet, um die Verteilung bakterieller Isolate u...

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Diskussion

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Diabetische Fußinfektionen (DFIs), verursacht durch multiresistente (MDR) Mikroorganismen, nehmen weltweit zu, wobei schlechte glykämische Kontrolle und unzureichende Fußhygiene zu einer erhöhten Morbidität und Sterblichkeit beitragen 18,19,20,21. Obwohl DFIs häufig polymikrobiell sind, bleibt Staphylococcus aureus einer der vorherrschenden Krankheitse...

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Offenlegungen

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Die Autoren geben an, dass sie keine bekannten konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die die in dieser Studie berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.

Autorschaftsbeitrag:

Shaymaa H. Al-Kubaisy trug zur Konzeptualisierung, Methodikentwicklung, Untersuchung, formalen Analyse und Vorbereitung des ursprünglichen Manuskripts bei. Rawaa A. Hussein trug zur Validierung, Untersuchung und Vorbereitung des ursprünglichen Manuskripts bei. Mushtak T.S. Al-Ouqaili trug zur Konzeption, Aufsicht, Projektverwaltung, Untersuchung sowie zur Manuskriptprüfung und -redaktion bei.

Danksagungen

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Die Autoren erkennen die Nutzung der KI-basierten Designplattform Gamma Pro (Gamma App) zur Erstellung von Abbildung 1 an. Alle generierten Inhalte wurden von den Autoren sorgfältig überprüft, bearbeitet und validiert, um wissenschaftliche Genauigkeit, Konsistenz und Integrität sicherzustellen. Die Autoren erhielten keine finanzielle Unterstützung für Forschung, Autorenschaft und/oder Veröffentlichung dieses Artikels.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Abricate SoftwareGitHub (T. Seemann)Open SourceNachweis von Virulenzgenen
AgaroseInvitrogen, USA16500-500Gelelektrophorese
Agencourt AMPure XP-KitBeckman CoulterA63881DNA-Reinigung und Größenauswahl
Amikacin (30 & Mikro; g) ScheibeOxoid, GroßbritannienCT0107BAST
Antibiotische Bandscheiben (Ampicillin 20 und Mikro; g)Oxoid, GroßbritannienCT0003BAntimikrobielle Anfälligkeitstests
Blood Agar BasisOxoid, GroßbritannienCM0055Isolierung von grampositiven und gramnegativen Bakterien
Brain Heart Infusion (BHI) BrüheOxoid, GroßbritannienCM1135Kultivierung und Lagerung von Isolaten
Cefoxitin (30 & Mikro; g) ScheibeOxoid, GroßbritannienCT0119BMRSA-Nachweis
Cefuroxim (30 & Mikro; g) ScheibeOxoid, GroßbritannienCT0026BAST
Ciprofloxacin (5 & Mikro; g) ScheibeOxoid, GroßbritannienCT0425BAST
Clindamycin (2 & Mikro; g) ScheibeOxoid, GroßbritannienCT0064BAST
DNBSEQ-PlattformBGI, ChinaVerschiedeneGanzgenomsequenzierung
Erythromycin (15 & mikro; g) ScheibeOxoid, GroßbritannienCT0020BAST
FastQCSimon Andrews am Babraham Institute (Babraham Bioinformatik)NAWarteschlangensystem
Gel-DokumentationssystemBio-Rad, USAGel Doc™ XR+Bildgebung von Elektrophorese-Gelen
Gentamicin (10 & Mikro; g) ScheibeOxoid, GroßbritannienCT0024BAST
Glycerol (Molekularqualität)Sigma-AldrichG5516Verwendet mit 20 % zur Langzeitkonservierung von Isolaten
GoTaq Green Master Mix (2& mal;)Promega, USAM7122PCR-Verstärkungsmix
Levofloxacin (5 & Mikro; g) ScheibeOxoid, GroßbritannienCT1587BAST
Linezolid (30 & Mikro; g) ScheibeOxoid, GroßbritannienCT1716BAST
MacConkey AgarOxoid, GroßbritannienCM0007Selektives Medium für gramnegative Bakterien
Mannitol Salt Agar (MSA)Oxoid, GroßbritannienCM0085Selektives/differenziertes Medium für Staphylococcus-Arten.
Meropenem (10 & Mikro; g) ScheibeOxoid, GroßbritannienCT0774BAST
MgCl2 LösungPromega, USAVerschiedenePCR-Reaktionskomponente
Mueller-Hinton AgarOxoid, GroßbritannienCM0337Verwendet für Kirby– Bauer-Scheibendiffusionstest
MUSCLE-AusrichtungstoolOpen SourceVerschiedeneProteinsequenz-Ausrichtung
Nukleasefreies WasserPromega, USAP1193PCR-Reaktionskomponente
NährstoffagarOxoid, GroßbritannienCM0003Allzweckwachstumsmedium
Oxacillin (1 & Mikro; g) ScheibeOxoid, GroßbritannienCT0159BAST
PathogenWatchWellcome Sanger InstitutOnline-ToolArtenerkennung & AMR-Gendetektion
PATRIC / BV-BRCBakterielles Bioinformatik-RessourcenzentrumOnline-PlattformGenomassemblierung & Annotation
Piperacillin/Tazobactam (100/10 & Mikro; g) ScheibeOxoid, GroßbritannienCT1628BAST
Proksee-GenomvisualisierungstoolUniversität TorontoOnline-ToolGenomkartenvisualisierung
Quantus-FluorometerPromega, USAE6150DNA-Quantifizierung
Qubit-FluorometerThermo Fisher ScientificQ33238DNA-Quantifizierung für WGS
RAxML-SoftwareOpen SourceVerschiedenePhylogenetische Analyse
S. aureus ATCC 25923ATCC, USA25923Qualitätskontroll-Belastung für AST
Sicherer roter FleckiNtRON BiotechnologieVerschiedeneDNA-Gel-Färbung
SaMag Bakterien-DNA-ExtraktionssetSacace Biotechnologies, ItalienVerschiedeneGenomische DNA-Extraktion
SaMag-12 Automatisiertes ExtraktionssystemSacace Biotechnologies, ItalienSMG-12Automatisierter Nukleinsäureextraktor
Sterile BaumwolltröcherVerschiedene HerstellerVerschiedeneVerwendet für die Probenentnahme in der Tiefenabstrichtechnik
Sterile normale KochsalzlösungVerschiedene HerstellerVerschiedeneVerwendet zum Waschen der Geschwüroberflächen vor der Probenahme
Sterile SkalpellklingenVerschiedene HerstellerVerschiedeneZur Geschwürdebridation vor der Probenahme verwendet
Tigecyclin (15 & Mikro; g) ScheibeOxoid, GroßbritannienCT1849BAST
Trimethoprim-Sulfamethoxazol (25 & Mikro; g) ScheibeOxoid, GroßbritannienCT0052BAST
UV-TransilluminatorVerschiedene HerstellerVerschiedeneVisualisierung von PCR-Produkten
Vancomycin (30 & Mikro; g) ScheibeOxoid, GroßbritannienCT0588BAST
VITEK 2 CompactBioM&eakut; Rieux, FrankreichVerschiedeneAutomatisiertes Identifikationssystem
VITEK 2 GN-ID-KartenBioM&eakut; Rieux, FrankreichVerschiedeneIdentifizierung gramnegativer Bakterien

Referenzen

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  1. Wang, X., Yuan, C. X., Xu, B., Yu, Z. Diabetic foot ulcers: Classification, risk factors and management. World J Diabetes. 13 (12), 1049-1065 (2022).
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