Vom Gewebe zur Morphometrie: Ein Schritt-für-Schritt-Golgi–Cox-Workflow für die Analyse neuronaler und dendritischer Wirbelsäule bei erwachsenen Mäusen

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Golgi–Cox-Färbung bei erwachsenen Mäusen, wobei Lösungsvorbereitung, Gewebeimpregnierung, Kryoprotektion, Schnitt, Entwicklung und Montierung abgedeckt werden. Sie legt Wert auf Gewebeerhaltung und homogene, niedrig-hintergründige Färbung, was eine klare Visualisierung der neuronalen Morphologie ermöglicht. Die Methode kennzeichnet dendritische Arborren und unterstützt die quantitative morphometrische Analyse dendritischer Stacheln.

Zusammenfassung

Die Analyse neuronaler Morphologie bei Gesundheit und Krankheit ist grundlegend für das Verständnis der Gehirnfunktion und zur Bewertung der Auswirkungen experimenteller Interventionen. Golgi–Cox-Färbung bleibt eine klassische, aber sehr relevante Technik zur Darstellung vollständiger neuronaler Arboren und dendritischer Stacheln. Veröffentlichte Protokolle unterscheiden sich jedoch häufig in kritischen Verfahrensschritten und fehlen häufig wesentliche methodische Details, was zu erheblichen Unterschieden in der Färbungsqualität führt und die Standardisierung des Labors zeitaufwendig und herausfordernd macht. Hier wird ein umfassendes, schrittweises Golgi–Cox-Protokoll für erwachsene Mäuse vorgestellt, das den gesamten Arbeitsablauf von der in vivo Behandlung und Gewebeverarbeitung bis hin zur Bildgebung und morphometrischen Datenextraktion abdeckt. Es beschreibt praktische Überlegungen und häufige Fallstricke, die die Impregnationseffizienz, die Schnittintegrität und das Signal-Rausch-Verhältnis beeinflussen, und bietet methodische Leitlinien zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit. Insgesamt ermöglicht dieses Protokoll eine zuverlässige Visualisierung und quantitative Analyse ganzer Neuronen, dendritischer Segmente und dendritischer Spines. Es wird erwartet, dass diese Ressource die Umsetzung der Golgi–Cox-Färbung mit größerer Konsistenz, Transparenz und technischer Strenge erleichtert und gleichzeitig einen klaren Rahmen für die Anpassung der Methode an vielfältige Laborumgebungen bietet.

Einleitung

Das übergeordnete Ziel der Golgi–Cox-Färbungsmethode ist es, eine hochauflösende Visualisierung der vollständigen neuronalen Morphologie, einschließlich dendritischer Arborren und dendritischer Stacheln, im fixierten Hirngewebe ^1,2,3,4 zu ermöglichen. Diese Technik ermöglicht eine detaillierte strukturelle Analyse einzelner Neuronen innerhalb komplexer neuronaler Schaltkreise, was sie besonders wertvoll für Studien zur synaptischen Plastizität, Neuroentwicklung, Neurodegeneration und erfahrungsabhängiger struktureller Remodellierung ^5,6 macht.

Die Begründung für die Entwicklung und fortgesetzte Anwendung von Golgi-basierten Methoden liegt in ihrer einzigartigen Fähigkeit, eine spärliche und vollständige neuronale Impregnation^{zu erzeugen 1,2}. Ursprünglich 1873 von Camillo Golgi beschrieben und 1891 von Cox ^7,8 verfeinert, basiert die Methode auf der Präzipitation von Silberchromat innerhalb einer begrenzten Teilmenge von Neuronen, was eine vollständige morphologische Rekonstruktion ohne überlappende Markierung³ ermöglicht. Die Golgi–Cox-Modifikation ersetzt das in der ursprünglichen Golgi-Methode verwendete Silbernitrat durch Merksilberchlorid, was die Gewebepenetration und Konsistenz der Färbung^{verbessert 2}. Im Vergleich zu alternativen neuronalen Markierungstechniken wie fluoreszierender Proteinexpression, viraler Verfolgung oder Farbstofffüllung bietet die Golgi–Cox-Färbung mehrere Vorteile. Es erfordert keine genetische Manipulation, keine stereotaxischen Injektionen oder spezielle Mikroskopiegeräte und ermöglicht die Visualisierung dendritischer Stacheln mit hohem Kontrast unter der Hellfeldmikroskopie ^1,2. Obwohl moderne fluoreszenzbasierte Methoden eine Zelltyp-Spezifität bieten, bleibt die Golgi–Cox-Färbung besonders vorteilhaft für unvoreingenommene morphologische Probenahmen ^9,10 und für den Einsatz in Arten oder experimentellen Bedingungen, in denen transgene Werkzeuge nicht verfügbar sind.

In der breiteren Literatur wurden Golgi-basierte Methoden umfangreich eingesetzt, um die Dichte und Morphologie der dendritischen Wirbelsäule in Studien zu Lernen und Gedächtnis⁵, Stress- und psychiatrischen Störungen¹¹, Alter¹² und neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer 12,13,14 zu quantifizieren. Seine fortgesetzte Anwendung über Jahrzehnte hinweg unterstreicht seine Zuverlässigkeit für die strukturelle Neuroanatomie². Diese Methode ist besonders geeignet für Forscher, die die dendritische Architektur und Wirbelsäulenmorphologie im Hirngewebe analysieren, wenn eine Ganzzellvisualisierung erforderlich ist.¹. Es eignet sich gut für vergleichende morphologische Studien zwischen experimentellen Gruppen. Allerdings könnten Forscher, die Zelltyp-Spezifität, Live-Imaging oder molekulare Kolokalisierung benötigen, mehr von fluoreszierenden oder genetisch kodierten Markierungsansätzen ^9,10 profitieren.

Protokoll

Erwachsene weibliche Wildtyp-B6129SF2/J-Mäuse (n = 3) wurden in dieser Studie verwendet. Eine ähnliche Färbung kann jedoch bei beiden Geschlechtern im Erwachsenenstadium erfolgen. Alle experimentellen Verfahren erhielten zuvor die Zustimmung des Bioethikkomitees. (#117.A, Institut für Neurobiologie (INb), Nationale Autonome Universität von Mexiko)

1. Vorbereitung von Lösungen

VORSICHT: Merkurchlorid ist hochgiftig und korrosiv. Führe sie in einer chemischen Abgashaube und trage Handschuhe, Laborkittel und Augenschutz. Entsorgen Sie Abfälle in einem gekennzeichneten Behälter für gefährliche Abfälle. Kaliumdichromat und Kaliumchromat sind toxische und krebserregende Oxidatoren. Führen Sie es in einer chemischen Abgashaube und vermeiden Sie Hautkontakt oder Einatmen.

1. Bereite Impregnionslösungen für Lagerbestände vor
   1. Wiege 15 g Kaliumdichromat. Lösen Sie es in 300 ml doppelt destilliertem Wasser, um eine 5%ige (w/v) Lösung zu erhalten.
   2. Wiege 15 g Merkursäurechlorid. Lösen Sie es in 300 ml doppelt destilliertem Wasser, um eine 5%ige (w/v) Lösung zu erhalten.
   3. Wiege 15 g Kaliumchromat. Lösen Sie es in 300 ml doppelt destilliertem Wasser, um eine 5%ige (w/v) Lösung zu erhalten.
   4. Wickeln Sie alle Behälter in Alufolie und lagern Sie sie bei Zimmertemperatur, geschützt vor Licht.
2. Bereite Golgi–Cox-Arbeitslösung vor
   1. Mische 50 ml Kaliumdichromatlösung, 50 ml Merkurchloridlösung und 40 ml Kaliumchromatlösung.
   2. Gib 100 ml destilliertes Wasser hinzu und vermische gründlich.
   3. Inkubieren Sie die Mischung 48 Stunden bei Zimmertemperatur, geschützt vor Licht.
   4. Lass den Niederschlag sich setzen. Verwenden Sie nur das Supernatant für die Gewebeimpregnierung.
      HINWEIS: Die Golgi–Cox-Lösung kann bis zu einem Monat gelagert werden, wenn sie vor Licht geschützt ist. Um den Abfall von Reagenzen zu reduzieren und die Frische der Lösung sicherzustellen, bereiten Sie nur das erforderliche Volumen sowohl der Lagerlösungen als auch der endgültigen Golgi–Cox-Lösung vor, die für das Experiment benötigt wird. Bereiten Sie mindestens 23 ml pro Gehirn vor, um nach dem Niederschlagsverlust 20 ml brauchbaren Supernatanten zu erhalten.
3. Bereite eine Kryoschutzlösung vor.
   1. Lösen Sie 300 g Saccharose in 0,1 m phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, hergestellt mit wasserfreiem Natriumphosphatdibasisk, monohydratiertem Natriumphosphat monobasisch und Natriumchlorid.
   2. Stellen Sie die Endlautstärke auf 1 L ein.
   3. Lagern Sie bis zu einer Woche bei 4 °C.

2. Gewebesammlung und Befruchtung

1. Durchführung einer intrakardialen Perfusion
   1. Betäuben Sie das Tier mit Natriumpentobarbital (252 mg/kg, I.P.). Bestätigen Sie vor dem Fortfahren eine ausreichende Tiefe der Anästhesie, da kein Pedalabzug erfolgt.
   2. Führen Sie eine intrakardiale Perfusion mit etwa 30 ml 0,1 M PBS (pH 7,4) durch, bis das Abwasser klar ist, um eine vollständige Entfernung des Blutes aus dem Hirngewebe sicherzustellen. Es wurde kein Fixativ verwendet; die Golgi–Cox-Lösung selbst dient als Fixativ in diesem Workflow.
   3. Entfernen Sie das Gehirn vorsichtig und spülen Sie es in destilliertem Wasser. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn ordnungsgemäß durchströmt und frei von Restblutvorfällen ist (Abbildung 1A).
2. Gewebe imprägnieren
   1. Teile das Gehirn mit einer Gehirnmatrix in Hemisphären oder koronale Blöcke (~3 mm dick) auf, um die Befruchtung zu verbessern. Kleinere Gewebeblöcke ermöglichen eine gleichmäßigere Befruchtung und verringern die Variabilität, während größere Proben längere Inkubationszeiten benötigen und weniger homogene Färbungen aufweisen können.
   2. Lege das Gehirn in eine 10-mL Golgi–Cox-Lösung. Vor Licht schützen.
      HINWEIS: Ein Volumen von 10 ml Golgi–Cox-Lösung reicht für ein ganzes erwachsenes Maushirn aus. Bei Verwendung einer einzelnen Hemisphäre oder kleineren koronalen Blöcken (~3 mm Dicke) kann das Lösungsvolumen proportional reduziert werden, sofern das Gewebe vollständig eingetaucht bleibt. Wenn das gesamte Gehirn verwendet wird, wird empfohlen, es zu schneiden und dabei den relevanten Bereich zu erhalten, um eine optimale Reagenzpenetration und homogene Befruchtung zu gewährleisten.
   3. Inkubiere 24 Stunden bei Zimmertemperatur.
   4. Ersetzen Sie durch 10 ml frische Golgi–Cox-Lösung. Inkubieren Sie 10–14 Tage bei 22–25 °C im Dunkeln.
      PAUSENPUNKT: Gewebe in Golgi–Cox-Lösung bis zu 15 Tage ohne größeren Verlust der Viabilität aufbewahren.
      HINWEIS: Nach der Golgi–Cox-Befruchtung entwickelt das Gehirn ein dunkelgoldenes Aussehen und wird hochempfindlich; daher sollten Sie es mit Vorsicht behandeln (Abbildung 1B). Die Verwendung von Kunststoffpinzetten zur Manipulation wird empfohlen, um chemische Reaktionen mit Stahlmaterialien zu vermeiden.

3. Kryoschutz

1. Transferiere das Gewebe in eine 10 ml kryoprotektive Lösung (30 % Saccharose (W/V) in 0,1 m PBS, pH 7,4, hergestellt in Schritt 1,3).
2. 24 Stunden (4 °C) inkubieren.
3. Bei derselben Temperatur (4 °C) ersetzen Sie sie durch eine frische kryoprotektive Lösung und inkubieren Sie sie mindestens 4–7 Tage.
   PAUSENPUNKT: Vor der Sektion werden Gewebe bis zu 3 Wochen in kryoprotektiver Lösung bei 4 °C gelagert.

4. Einbettung und Sektionierung

1. Gewebe einbetten
   1. Bereiten Sie 8 % (mit W/V) Agarose in heißem destilliertem Wasser her. Lassen Sie es auf etwa 40 °C abkühlen.
   2. Legen Sie das Gewebe in Einbettformen und richten Sie es entsprechend aus.
   3. Gießen Sie Agarose über das Gewebe und lassen Sie es 1 Stunde bei Zimmertemperatur oder 30 Minuten bei 4 °C festigen (Abbildung 1C).
   4. Überschüssiges Agarose vom Block abschneiden (Abbildung 1D).
2. Schnittgewebe
   1. Befestigen Sie den Agaroseblock mit Klebstoff auf der Vibratoom-Stufe. (Abbildung 1E)
   2. Füllen Sie die Schneidkammer mit einer kryoprotektiven Lösung.
   3. Gewebe mit 100–200 μm Dicke schneiden. Dünnere Schnitte (z. B. 100–120 μm) werden für die Analyse der dendritischen Wirbelsäule empfohlen, um die Bildgebungsauflösung zu verbessern, während dickere Schnitte (z. B. 150–200 μm) für die Rekonstruktion des gesamten Neurons verwendet werden können. In dieser Studie wurden Schnitte bei 120 μm zugeschnitten (Abbildung 1F).
   4. Sammle Abschnitte mit einem weichen Pinsel.
      HINWEIS: Notieren Sie die Vibratom-Einstellungen in der Materialtabelle. Spülen Sie die Objektträger unter keinen Umständen, sobald die Abschnitte montiert sind. Die Saccharose schützt das Gewebe bis zum Entwicklungsschritt.

5. Montage

1. Herstellung von gelatinebeschichteten Objektträgern
   1. Eine Beschichtungslösung wird hergestellt, indem 0,5 g Gelatine in 100 mL (0,5 % w/v) destilliertem Wasser gelöst und bis zum Kochen erhitzt wird.
   2. Rühren Sie um, bis die Gelatine vollständig gelöst ist, und lassen Sie die Lösung auf Zimmertemperatur abkühlen.
   3. Gib 0,05 g Chrom-Kaliumsulfat (0,05 % W/V) hinzu und mische, bis es vollständig gelöst ist. Entfernen Sie bei Bedarf Rückstände von Schaum.
   4. Filtern Sie die Gelatinelösung durch Filterpapier, um ungelöste Partikel und Schaumreste zu entfernen und so eine gleichmäßige Beschichtung der Objektträger zu gewährleisten.
   5. Waschglas mit neutralem Waschmittel und Wasser gleiten, gründlich abspülen und dann mit destilliertem Wasser.
   6. Immerse rutscht in 96 % Ethanol, bis keine sichtbaren Tröpfchen mehr übrig sind.
   7. Trocknen Sie sie im Ofen bei 50–60 °C für 30 Minuten oder bis sie vollständig trocken sind.
   8. Tauchen Sie die Glitten in die Gelatinelösung und lassen Sie die überschüssige Lösung ablaufen.
   9. Stellen Sie die Folien für 30 Minuten oder bis sie vollständig trocken sind, in einen Ofen bei 50–60 °C.
   10. Wiederholen Sie den Beschichtungs- und Trocknungsprozess mindestens fünfmal, um eine ordnungsgemäße Haftung sicherzustellen.
   11. Nach dem letzten Trocknungsschritt lassen Sie die Objektträger in einer staubfreien Umgebung (z. B. in einer chemischen Abzughaube) auf Raumtemperatur abkühlen und lagern Sie sie in einem sauberen, geschlossenen Behälter bis zur Gebrauchszeit.
       HINWEIS: Bereiten Sie nur das Volumen der Gelatinelösung vor, das für die Anzahl der zu beschichteten Objektträger erforderlich ist. Reagenzmengen können proportional skaliert werden, wobei die angegebenen Konzentrationen (w/v) beibehalten werden.
2. Schichte Abschnitte mit einem weichen Pinsel auf gelatinebeschichtete Objektträger
   HINWEIS: Verwenden Sie Mikroskopobjektträger, die mit mindestens fünf Schichten 0,5%-Gelatine beschichtet sind. Bereiten Sie die Objektträger frisch vor, um die Gewebeintegrität während der Entwicklung zu gewährleisten. Elektrogeladene Objektträger wurden in diesem Protokoll nicht getestet.
3. Weichen Sie das saugfähige Papier mit einer kryoschützenden Lösung ein und legen Sie es über die Abschnitte.
4. Drücken Sie vorsichtig mit der Handfläche, um Luftblasen zu beseitigen und einen gleichmäßigen Kontakt zwischen dem Gewebeschnitt und dem mit Gelatine beschichteten Objektträger zu gewährleisten, was eine stabile Haftung während der anschließenden Bearbeitung fördert.
   HINWEIS: Sanfter Druck verbessert die Haftwirkung, indem er den Kontakt zwischen Schnitt und Gelatineschicht maximiert und so das Risiko einer Ablösung während der wässrigen Entwicklung verringert.
5. Entfernen Sie das Papier vorsichtig und lassen Sie die Objektträger 2–3 Tage bei Zimmertemperatur im Dunkeln trocknen.
   HINWEIS: Das Trocknen in einer Umgebung mit niedriger Luftfeuchtigkeit ist entscheidend für eine stabile Haftwirkung. Der Schutz vor Licht minimiert photochemische Veränderungen von Golgi–Cox-imprägniertem Gewebe, das aufgrund des Vorhandenseins von Chromatsalzen lichtempfindlich ist. Außerdem stört Restagarose den Entwicklungsprozess nicht signifikant und kann im entwickelten Abschnitt um das Gewebe herum beobachtet werden (Abbildung 2A). Das Vorhandensein von Agarose erleichtert die sichere Handhabung des Gewebes während der Montage, da Golgi–Cox-imprägniertes Gewebe sehr empfindlich ist. Falls gewünscht, kann überschüssiges Agarose vorsichtig manuell entfernt werden, nachdem die Abschnitte auf Objektträger montiert wurden.
   PAUSENPUNKT: Haltet die Folien vor Licht geschützt.

6. Entwicklung

VORSICHT: Xylol ist entflammbar und giftig beim Einatmen. Führe es in einer chemischen Abzugshaube und vermeide offene Flammen. Ammoniak ist ätzend und erzeugt reizende Dämpfe. Handle in einer Abzugshaube.

1. Rehydrate-Abschnitte
   1. Folien 5 Minuten in destilliertes Wasser eintauchen.
   2. 5 Minuten in frisch destilliertes Wasser übergeben.
   3. 50 % Ethanol in 50 % eintauchen.
      HINWEIS: Der 50%-Ethanol-Schritt ermöglicht einen allmählichen Übergang von wässrigen Bedingungen zur Dehydrierung, erleichtert die Penetration der Reagenz und trägt zur Erhaltung der Gewebeintegrität vor dem Entwicklungsschritt bei.
2. Entwicklungsfärbung
   1. Inkubieren Sie Objektträger in wässriger Ammoniaklösung, die durch Vermischung von 2 Bänden 25 % Ammoniak und 1 Volumen destilliertem Wasser (2:1, v/v) für 8 Minuten hergestellt wird
   2. Waschen Sie sie 5 Minuten in destilliertem Wasser.
   3. Waschen Sie erneut 5 Minuten in destilliertem Wasser.
   4. Inkubiere in 5 % (w/v) Natriumthiosulfat in destilliertem Wasser für 10 Minuten im Dunkeln.
   5. 1 Minute in destilliertem Wasser waschen.
   6. Waschen Sie erneut 1 Minute in destilliertem Wasser.
      HINWEIS: Schließen Sie den Entwicklungsprozess ohne Unterbrechung ab, sobald er begonnen hat.
3. Dehydrieren und Klarmachen
   1. Immerse Slides in 70 % Ethanol für 5 Minuten.
   2. Immerse-Slides in 96 % Ethanol für 5 Minuten.
   3. Immerse-Slides in 100 % Ethanol für 5 Minuten.
   4. Folien für mindestens 6 Minuten in Xylol übertragen.

7. Dauerhafte Montage

1. Trage Permount-Montagemedium® (Brechungsindex ~1,52) auf jeden Abschnitt auf.
   HINWEIS: Der Brechungsindex des Montagemediums sollte mit Ölimmersionsobjektiven kompatibel sein, um eine optimale Bildqualität zu gewährleisten.
2. Legen Sie vorsichtig einen Deckmantel an, um Luftblasen zu vermeiden.
3. Versiegeln Sie die Ränder mit klarem Nagellack.
4. Lassen Sie die Objektträger 48 Stunden bei Zimmertemperatur im Dunkeln trocknen.

8. Bildgebung

HINWEIS: Bildgebende Modalitäten und Aufnahmekonfigurationen variieren je nach Mikroskopmarke; Die optimalen Einstellungen sollten für jedes System festgelegt werden.

1. Schalt das Mikroskop ein.
2. Öffnen Sie die Mikroskopsoftware
3. Stell einen Objektträger auf die Mikroskopbühne.
4. Nehmen Sie ein 2D-Weitansichtsbild des Gehirnabschnitts mit einem niedrigen Vergrößerungsobjektiv wie 1X/0,04 N.A. oder 4x/0,10 (Abbildung 2A, B) auf.

9. Bildgebung ganzer Neuronen

1. Erfassung hochauflösender Bildstapel des Bereichs mit dem interessierenden Neuron mit einem 10x/0,25 N.A. oder 20x/0,40 N.A.-Objektiv (Abbildung 2C).
   HINWEIS: Die für die Analyse ausgewählten Neuronen sollten eine vollständige und homogene Golgi–Cox-Impregnation aufweisen, mit klar definierten dendritischen Arborren und minimaler Hintergrundfärbung. Cells mit abgeschnittenen Prozessen, unvollständiger Impregnierung, überlappenden Strukturen oder starkem Hintergrundsignal sollten ausgeschlossen werden, um eine genaue morphometrische Analyse zu gewährleisten.
2. Fokussiere das Bild und passe die Kameraeinstellungen an, einschließlich Belichtung und Weißabgleich.
3. Setzen Sie die oberen und unteren Grenzen für den Bildstapel.
4. Stellen Sie den Schrittabstand innerhalb des Bildaufnahmefensters auf 0,5 μm ein.
5. Erfassen Sie den Bildstack mit dem Softwarebefehl zur Stack-Erfassung.
6. Wiederholen Sie die obigen Schritte, um jeden Interessensbereich zu erfassen.
7. Speichere die Datendatei und alle Bilddateien. TIFF-Format für externe Verarbeitung.

10. Bildgebung der dendritischen Stacheln

1. Erfassung hochauflösender Bildstapel des Bereichs mit dem interessierten Neuron mit einem 63x/1,4 N.A.-Ölimmersionsobjektiv in einem geeigneten Hellfeldmikroskop (Abbildung 2D).
   HINWEIS: Im vorliegenden Manuskript wurden hochauflösende Bilder der in Abbildung 2D gezeigten dendritischen Stacheln mit dem Hellfeldmodus eines konfokalen Mikroskops, des Zeiss-Modells LSM 780, erstellt. Andere Hellfeldmikroskope können jedoch dazu dienen, 63-fach hochwertige Z-Stack-Bilder zu erhalten, deren Parameter von jedem Labor standardisiert werden sollten.
2. Tragen Sie 1–2 Tropfen Immersionsöl auf den Objektträger auf und legen Sie das Objektiv über den Objektträger, wobei Sie darauf achten, dass Objektiv und Öl Kontakt herstellen.
3. Fokussiere das Bild und passe die Kameraeinstellungen an, einschließlich Belichtung und Weißabgleich.
4. Setzen Sie die oberen und unteren Grenzen für den Bildstapel.
5. Stellen Sie den Schrittabstand innerhalb des Bildaufnahmefensters auf 0,3 μm ein.
6. Erfassen Sie den Bildstack mit dem Softwarebefehl zur Stack-Erfassung.
7. Wiederholen Sie die oben genannten Schritte, um jeden interessanten Bereich zu erfassen
8. Speichere die Datendatei und speichere alle Bilddateien im TIFF-Format für externe Verarbeitung.
   HINWEIS: Für die Schritte 9 und 10. Ist das Mikroskop nicht mit einer motorisierten Stufe für die Z-Stack-Aufnahme ausgestattet, können Bilder manuell durch Anpassung des mikrometrischen Fokus aufgenommen werden. Allerdings ist der Abstand zwischen den optischen Abschnitten möglicherweise weniger präzise. In diesem Fall können Z-Stacks anschließend in Bildverarbeitungssoftware (z. B. ImageJ) aus der aufgenommenen Bildsequenz rekonstruiert werden.

11. Morphometrische Analyse

HINWEIS: Für diesen Zweck können verschiedene Ansätze und spezialisierte Softwareprogramme verwendet werden. Einige kostenlos zugängliche Werkzeuge zur Analyse der dendritischen Wirbelsäule sind ImageJ oder, wie in dieser Studie, PyReconstruct¹⁵. Für eine detailliertere Beschreibung von PyReconstruct und seiner Funktionalität für neuronale Rekonstruktion und morphometrische Analyse siehe die referenzierte Quelle.

1. Verfahren zur morphometrischen Analyse der dendritischen Wirbelsäule
   1. Sobald die Datei in ImageJ geöffnet ist, ändere das Format auf RGB, indem du Bild > Type > RGB Color auswählst.
   2. Konvertiere die Z-Stacks in eine Bildsequenz in ImageJ: Klicke auf Datei > Speichern > Bildsequenz. Speichere jede Bildsequenz in einem separaten Ordner für die spätere Analyse. In PyReconstruct laden Sie die Bildsequenz, indem Sie auf Datei > Neue > aus Bildern klicken.
   3. Ein Dialogfenster erscheint, das die Zuweisung eines Namens an die Datei auffordert (z. B. WTVR1N1 – Wild-Type Vehicle Mouse 1 Neuron 1).
   4. Drei aufeinanderfolgende Dialogfenster erscheinen dann. Im ersten Fenster geben Sie den Kalibrierungswert (μm/px) ein. Diese Informationen sind in den Z-Stack-Metadaten verfügbar und können in ImageJ abgerufen werden.
   5. Im zweiten Fenster wird die Dicke jedes aufeinanderfolgenden optischen Abschnitts (μm) eingegeben. Abschließend beginnt die Bildserie automatisch zu laden (ergänzende Abbildung 1A).
   6. Sobald das Interessensegment gemäß den vom Forscher definierten Einschlusskriterien identifiziert wurde, wird mit der Nachverfolgung fortgesetzt, um quantitative Daten zu erhalten.
   7. Weisen Sie jedem Trace-Typ einen eigenen Namen und eine Domain zu. Finden Sie die Domänen im unteren Panel, wo sie durch unterschiedlich farbige geometrische Formen dargestellt werden (ergänzende Abbildung 1B).
   8. Zeichnen Sie mit dem Bleistiftwerkzeug eine Linie, die der gewünschten Probenlänge entspricht. Dann erzeugen Sie eine zweite Spur durch den Z-Stack entlang des dendritischen Segments mit dem Z-Werkzeug.
   9. Verwenden Sie die Anfangsspur, um die passende Segmentlänge zu bestimmen, und überprüfen Sie diese unter Listen > Z-Trace List (ergänzende Abbildung 1B).
   10. Navigieren Sie durch den Z-Stack und identifizieren Sie dendritische Wirbelsäulenköpfe mit optimalem Fokus. Mit dem Bleistiftwerkzeug zeichnen Sie den breitesten distalen Bereich jedes Wirbelsäulenkopfes nach. Dann verwenden Sie das Z-Werkzeug, um den Wirbelsäulenhals durch den gesamten Z-Stack zu verfolgen (ergänzende Abbildung 1C, D). Wiederholen Sie dieses Verfahren, bis alle Wirbelsäulenköpfe und -hälse innerhalb des ausgewählten dendritischen Segments nachgezeichnet sind.
2. Export-Wirbelsäulenkopfmessungen
   1. Öffnen Sie die Listen mit Maßen der Wirbelsäulen-Kopfbreite und -länge. Greifen Sie auf diese unter Lists > Trace List (für Breite) bzw. Lists > Z-Trace List (für Länge) zu.
   2. Exportiere die Daten an den gewünschten Ort auf dem Computer. Es werden zwei separate Excel-Dateien erstellt, die jeweils die entsprechenden Messdaten enthalten.
3. Klassifizieren Sie die Wirbelsäulenmorphologie und berechnen Sie die Dichte
   1. Extrahieren Sie die Breiten- und Längenmessungen von Wirbelsäulenköpfen und -hälsen aus den zuvor generierten Excel-Dateien.
   2. Die Daten sollten in die entsprechenden Spalten mit der Bezeichnung Breite und Länge für die morphologische Klassifikation nach^{folgenden Kriterien organisiert} werden: Filopodien (>2 μm), dünn (< 2 μm), stumpig (Länge-Kopf-Breite-Verhältnis ≤1) und Pilz (Kopfbreite >0,6 μm). (Ergänzende Abbildung 1E). Filopodia wurden in den analysierten dendritischen Segmenten selten beobachtet und daher nicht in die Analyse einbezogen.
   3. Die Gesamtzahl der Stacheln pro analysiertem dendritischem Segment wird in diesem Stadium bestimmt, zusammen mit der Wirbelsäulendichte (Stacheln pro linearer μm) sowie dem Typ und der Anzahl jedes Stachel-Subtyps. Die Excel-Vorlage¹⁶ , die für diese Analyse verwendet wird, ist in der referenzierten Quelle verfügbar. Mit dieser Methode wurde die Dichte der basalen dendritischen Wirbelsäule im CA1-Bereich des Hippocampus bei 12 Monate alten weiblichen Mäusen quantifiziert.
   4. Exportieren Sie quantifizierte Daten und generieren Sie Diagramme mit spezialisierten wissenschaftlichen Softwareanwendungen, die für Datenanalyse, Grafiken und Statistiken entwickelt wurden. Hier wurde der Graph in Abbildung 3 mit der GraphPad Prism-Software erstellt.

Ergebnisse

Gewebeimprägnierung und Schnitt
Das hier beschriebene Golgi–Cox-Protokoll führte zu einer zuverlässigen und homogenen neuronalen Färbung im Gehirngewebe erwachsener Maus. Nach der Befruchtung in Golgi–Cox-Lösung erhielt das Gehirn eine charakteristische dunkelgoldene Färbung, was auf eine erfolgreiche Diffusion der Färbungslösung im gesamten Gewebe hinweist. Die Vibratomschnitte bewahrten die strukturelle Integrität neuronaler Somaten und dendritischer Prozesse.

<...

Diskussion

Die Golgi–Cox-Färbungsmethode bleibt eine der am weitesten verbreiteten Techniken zur Visualisierung neuronaler Morphologie und dendritischer Stacheln im fixierten Hirngewebe ^3,4. Durch die Befruchtung einer kleinen, zufälligen Teilmenge von Neuronen ermöglicht diese Methode die Visualisierung vollständiger dendritischer Bäume mit minimaler Hintergrundfärbung. Im vorliegenden Protokoll ermöglichte die Technik eine klare Visualisi...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agarose	Lebenstechnologien	15510-027	CAS 9012-56-6
Ammoniaklösung: 25 %	Merck	208380	CAS 1336-21-6. Gefährlich.
Wasserfreies Natriumphosphat-Dibasisch	Sigma-Aldrich	S3264	CAS 7558-79-4
Hellfeldmikroskop	Nikon	Eclipse Ci
Chromkaliumsulfat	Sigma-Aldrich	243361
Konfokalmikroskop	Zeiss	LSM 780
Digitales Waagengewicht	Accuris-Instrumente	W3200-1200
Einbettformen	Merck	E6032	Maße: 22x22 mm
Ethanol	Meyer	394
Versuchstiere	Das Jackson-Labor	2124-01	B6129SF2/J-Mausstamm
Gelatinepulver	Sigma-Aldrich	G2500
GraphPad-Prisma-Software	GraphPad Software Inc.		Version 8.0.2
ImageJ Fiji Software	US-amerikanisches Nationalinstitut für Gesundheit		Version 1.54p, https://imagej.net/software/fiji/downloads
Merkurchlorid	J.T. Baker	2594-01	CAS 7487-94-7. Gefährlich.
Mikroskopkamera	Nikon	DS-Vi1
Mikroskopobjektiv (10x)	Nikon	93183	Plan 10x/0,25 N.A.
Mikroskopobjektiv (1x)	Nikon	93180	Plan UW 1x/0,04 N.A.
Mikroskopobjektiv (20x)	Nikon	93184	Plan 20x/0.40 N.A.
Mikroskopobjektiv (4x)	Nikon	93182	Plan 4x/0.10 N.A.
Mikroskopobjektiv (63x)	Zeiss	420782-9900-799	Plan APO 63x/1.4 N.A. Öl-DIC
Objektträger mit dem Mikroskop	Sigma-Aldrich	S8902
Monohydratiertes Natriumphosphat-Monobas	J.T. Baker	3818-05	CAS 10049-21-5
Nagellack	SÜNDIGE FARBEN	BOLD COLOR	Transparent
Permontierte Montagemedien	Fisher Scientific	SP15-500
Kaliumchromat	Productos Quí micos Monterrey	2784	CAS 7789-00-6. Gefährlich.
Kaliumdichromat	Sigma-Aldrich	207802	CAS 7778-50-9. Gefährlich.
PyReconstruct-Software	Universität von Texas, Austin		Version 1.19.0, https://github.com/SynapseWeb/PyReconstruct
Natriumchlorid	Fermont	24912	CAS 7647-14-5
Natriumthiosulfat	Productos Quí micos Monterrey	7291	CAS 7772-98-7. Gefährlich.
Sucrose	J.T. Baker (Avantor)	4072-05	66,55 Grad; Spezifische Rotation, ACS-Reagenz
Vibratom	Leica Biosystems	VT1200S	GESCHWINDIGKEIT 20 mm/s, AMPL & NDASH; 0,60 mm
Xylen	CTR Wissenschaftlich	CTR05128	CAS 1330-20-7. Gefährlich.