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Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Sun Yat-sen Universität genehmigt (Genehmigungsnummer SYSU-IACUC-2026-B1278) und wurden gemäß den institutionellen Richtlinien durchgeführt.
1. Isolierung und Kultur der primären Maus-SLCs
- Untersuchen Sie Hoden von C57BL/6-Mäusen und entfernen Sie vorsichtig die Tunica albuginea.
- Zerkleinere die Hoden in kleine Stücke.
- Dissoziiere interstitielle Zellen von seminiferen Tubuli durch Inkubation in 1 mg/mL Kollagen Typ IV in DMEM/F12 bei 37 ºC für 15 Minuten.
- Fügen Sie DMEM/F12 mit 10 % fetalem Rinderserum hinzu, um die Kollagenaktivität zu stoppen.
- Zentrifugiere bei 1500 × g für 3 Minuten bei Raumtemperatur.
- Das Pellet in PBS wieder suspendieren und durch einen 70-μm-Filter filtern.
- Bereichern Sie CD51⁺-Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) mit einem Influx Cell Sortierer.
- Säen Sie die angereicherten Zellen im SLC-Kulturmedium, bestehend aus DMEM/F12, ergänzt mit: 1 nM Dexamethason, 1 ng/mL LIF, 5 μg/L Insulin-Transferrin-Natriumselenit, 5 % Hühnerembryo-Extrakt, 0,1 mM β-Mercapttoethanol, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 % N2, 2 % B27, 20 ng/mL basischen Fibroblastenwachstumsfaktor, epidermalem Wachstumsfaktor, plättchenabgeleitetem Wachstumsfaktor und Oncostatin M.
- Kultivieren Sie die SLCs unter Standardbedingungen (37 °C, 5 % CO₂), bis sie die gewünschte Dichte für das Aussäen auf Hydrogelen erreichen.
2. Zusammenbau des Glasbehälters zum Gelguss
- Inspizieren und reinigen Sie sorgfältig die spezialisierten Glasplatten und Abstandshalter, die zum Gießen von Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE)-Gelen verwendet werden, und stellen Sie sicher, dass sie frei von Staub, Schäden und Rückständen sind.
- Setzen Sie die Glasplatten, Abstandshalter und Klemmen gemäß den Anweisungen des Herstellers korrekt zusammen und sorgen Sie dafür, dass die Baugruppe gut abgedichtet ist, um Leckagen beim Gelgießen zu verhindern.
- Stellen Sie den zusammengebauten Glasbehälter sicher auf einen Labortischtisch, bereit zum Gießen.
HINWEIS: Das Gießsystem verwendet Standard-Western Blot (Natriumdodecylsulfat [SDS]-PAGE)-Glasplatten mit festen Abstandsabstandern von entweder 1,0 mm Dicke, was eine reproduzierbare Geldicke und eine flache Oberfläche für die Zellkultur gewährleistet.
3. Herstellung von PAGE-Gelmischungslösung
- Messen Sie die folgenden Reagenzien gemäß dem Versuchsdesign (siehe Tabelle 1) präzise in ein 15 mL oder 50 mL steriles Zentrifugenrohr: 40 % Acrylamid-Stocklösung, 2 % Bis-Acrylamid-Stocklösung, 1M HEPES-Puffer (pH 8,5), steril ddH₂O.
VORSICHT: Acrylamid und Bis-Acrylamid sind Neurotoxine. Tragen Sie beim Wiegen von trockenem Pulver immer Handschuhe und eine Staubmaske, um Hautkontakt und das Einatmen von Luftpartikeln zu vermeiden. Eingriffe sollten in einer Abzugshaube durchgeführt werden.
4. Hinzufügen von Initiator und Katalysator sowie Gießen des Gels
- Fügen Sie der Mischung sequentiell Folgendes hinzu: 10 % Ammoniumpersulfat (APS): Wirkt als Initiator zur Polymerisationsreaktion. N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED): Wirkt als Katalysator zur Beschleunigung der Polymerisationsreaktion. Für ein Gesamtgelvolumen von 6 ml fügen Sie 60 μL 10 % APS und 6 μL TEMED hinzu (siehe Tabelle 1 zur Skalierung).
HINWEIS: Die Polymerisationsreaktion beginnt unmittelbar nach der Zugabe von TEMED; daher müssen weitere Schritte zügig durchgeführt werden.
5. Gießen der Mischlösung
- Pipettieren oder gießen Sie die gemischte Lösung sofort an einer Kante des Glasbehälters, um Blasen zu vermeiden.
6. Ermöglicht der Polymerisation des Gels
- Lass den Gussgelbehälter unberührt bei Zimmertemperatur stehen.
HINWEIS: Die Polymerisation dauert bei Raumtemperatur (20–25 °C) üblicherweise 15–30 Minuten.
- Gehen Sie zum nächsten Schritt über, sobald eine klare Grenzfläche zwischen der unpolymerisierten Gelmischung und dem polymerisierten Gel sichtbar ist und das Gel vollständig fest ist (das Gel fließt nicht, wenn der Behälter geneigt ist).
- Unmittelbar nach dem Gießen wird vorsichtig eine dünne Schicht absoluten Ethanols (oder wassergesättigten Ethanols) auf das Gelgemisch gelegt, um atmosphärischen Sauerstoff auszuschließen, der die radikale Polymerisation hemmt. Das Ethanol hilft außerdem, eine flache Oberseite zu bilden.
- Nach der Polymerisation entfernen Sie das Ethanol, bevor Sie die Platten auseinandernehmen.
7. Auseinandernehmen des Behälters und Entnahme des Gels
- Nehmen Sie die Klemmen vorsichtig auseinander und verwenden Sie einen Kunststoffkeil oder Pfannenwender, um die Glasplatten vorsichtig auseinanderzuhebeln, sodass das polymerisierte PAGE-Gel auf einer Platte intakt bleibt.
- Bereiten Sie eine Kulturschale mit einer ausreichend Menge sterilem PBS vor.
- Ziehe das Gel vorsichtig mit einem Pfannenwender oder behandschuhten Hand von der Glasplatte und lasse es sanft in das PBS gleiten.
- Verschließen Sie die Schale mit dem Gel in PBS und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C.
HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend. Das neu vorbereitete Gel ist dehydriert und muss das Wasser vollständig aufnehmen und in PBS auf seine endgültigen Maße anschwellen. Wenn dieser Schritt übersprungen wird und das Gel direkt geschnitten wird, wird es sich im nachfolgenden Zellkulturmedium weiter ausdehnen, wahrscheinlich die Fläche des Kulturguts überschreiten und es unbrauchbar machen. Die Geldicke nach der Schwellung beträgt 1 mm. Dies ist entscheidend, da Zellen bei einer Geldicke unter 100 μm die Steifigkeit der darunterliegenden starren Kulturplatte erkennen können, was die beabsichtigten mechanobiologischen Messungen stören würde.
8. Schneiden und Übertragen des Gels auf eine Kulturplatte
- Am nächsten Tag holen Sie das Gel von 4 °C ab. Mit einem sterilen Biopsie-Punch oder Klingenschneider (mit einem Durchmesser, der der Bohrlochgröße der Kulturplatte entspricht, z. B. einer 6-Well-Platte) schneidet man das Gel unter sterilen Bedingungen.
- In einem Biosicherheitsschrank verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die geschnittene Gel-Scheibe vorsichtig aufzunehmen und in die Mitte eines leeren, sterilen Kulturbrunnens zu legen.
9. Erstwäsche und UV-Bestrahlung
- Fügen Sie ausreichend steriles PBS in den Brunnen mit dem Gel ein, um sicherzustellen, dass es vollständig untergetaucht ist.
- Weichen Sie vorsichtig die Kulturplatte, um die Geloberfläche zu reinigen.
- Aspirieren Sie das PBS mit einer Pipette.
- Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch einmal, insgesamt zwei Waschen, jeweils 3 Minuten.
- Nach dem Waschen fügen Sie ausreichend steriles PBS hinzu, um das Gel wieder zu bedecken. Stellen Sie die gesamte Kulturplatte mit leicht geöffnetem Deckel unter eine UV-Lampe (in einem Biosicherheitsschrank oder einem speziellen UV-Quervernetzer) und bestrahlen Sie 1 Stunde lang zur einfachen Sterilisation.
10. Aktivierung des Sulfo-SANPAH-Vernetzers
- Im Biosicherheitsschrank sollte man das PBS vorsichtig aus dem Brunnen absaugen.
- Vor dem Aspirieren trennen Sie das Gel vorsichtig von den Wänden und dem Boden des Brunnens mit einer Pipettspitze, um Beschädigungen des Gels durch die Flüssigkeitsspannung zu vermeiden.
- Übertragen Sie das Gel mit steriler Pinzette in einen anderen sauberen Brunnen in derselben Kulturplatte.
HINWEIS: Beim Übertragen des Gels kann das erste Hinzufügen einer kleinen Menge PBS in den Reinigungsbrunnen helfen, Luftblasen zwischen dem Brunnenboden und dem Gel beim Einlegen auszustoßen und dient außerdem als zusätzlicher Wasch.
- Stellen Sie eine Quervernetzungslösung vor: Bereiten Sie frisch eine 0,2 mg/mL Sulfo-SANPAH-Arbeitslösung vor, indem Sie die Grundlösung (siehe Tabelle 1) mit sterilem Wasser oder dem empfohlenen Puffer (z. B. PBS) verdünnen.
HINWEIS: Schützen Sie die Lösung vor Licht.
- Fügen Sie ausreichend Sulfo-SANPAH-Arbeitslösung hinzu, um das Gel zu bedecken (z. B. 250 μL für eine 12-Well-Platte, 500 μL für eine 6-Well-Platte), um sicherzustellen, dass das Gel vollständig abgedeckt ist.
- Platziere die Platte unter 365 nm Wellenlänge /120 mJ/cm 2 UV-Licht und bestrahle 1 Stunde lang.
HINWEIS: Dieser Schritt aktiviert Sulfo-SANPAH, wodurch es an funktionelle Gruppen auf der Geloberfläche binden kann.
11. Crosslinker-Aktivierung und Endwäschen
- Nach der Bestrahlung wird die Sulfo-SANPAH-Lösung aus dem Brunnen im Biosicherheitsschrank abgesaugt.
- Fügen Sie ausreichend steriles PBS in den Brunnen hinzu, spülen Sie die Geloberfläche vorsichtig und aspirieren Sie das PBS.
- Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch einmal, insgesamt zwei Waschen, jeweils 3 Minuten, um nicht reagierte Sulfo-SANPAH gründlich zu entfernen.
12. Vorbereitung einer Kollagen-Arbeitslösung für Rattenschwanz Typ I
- Verwenden Sie eine 0,02 M Essigsäurelösung als Lösungsmittel, um die Kollagen-Lösung des Typ I des Rattenschwanzes zu verdünnen.
- Stellen Sie die Endkonzentration der Arbeitslösung auf 60–100 μg/mL an. Wenn beispielsweise die Kollagenkonzentration 4 mg/mL beträgt, fügen Sie 15–25 μL Stock zu 985–975 μL 0,02 M Essigsäure hinzu, um 1 mL Arbeitslösung zu erhalten.
13. Kollagenbeschichtung und Inkubation
- Fügen Sie jedem Bohrloch, das das aktivierte Gel enthält, je nach Plattentyp das passende Volumen Kollagen-Arbeitslösung hinzu: Fügen Sie 2 ml für eine 6-Well-Platte oder 1 mL für eine 12-Well-Platte hinzu.
- Bewegen Sie die Kulturplatte vorsichtig, damit die Kollagenlösung das Gel und den Brunnenboden gleichmäßig bedeckt.
- Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie über Nacht in einem 37 °C, 5 % CO₂-Inkubator, damit sich das Kollagen mittels Sulfo-SANPAH-Vernetzung an der Geloberfläche binden kann.
14. Sekundäre UV-Bestrahlung und -Fixierung
- Am nächsten Tag entferne ich die Platte und bestrahle erneut unter etwa 120 mJ/cm2 UV-Licht für 1 Stunde.
15. Entfernen ungebundener Kollagen- und Samenzellen
- Im Inneren des Biosicherheitsschranks werden die Kollagen-Arbeitslösung des Rattenschwanzes Typ I vorsichtig aus den Brunnen aspiriert.
- Gib steriles PBS in die Brunnen, wiege vorsichtig, um die Geloberfläche zu waschen, und aspiriere das PBS.
- Wiederholen Sie die Wäsche noch einmal, insgesamt zwei Waschen, jeweils 3 Minuten.
- Nach dem Waschen ist die Gelmatrix fertig. Suspendieren Sie die vorbereiteten Stamm-Leydig-Zellen erneut im vollständigen SLC-Kulturmedium (Zusammensetzung detailliert in Schritt 1).
- Säe die Zellsuspension direkt auf die Geloberfläche. Die empfohlene Aussaatdichte beträgt 2 × 104 Zellen/cm² (z. B. etwa 2 × 105 Zellen pro Bohrloch für eine Standardplatte mit 6 Brunnen).
- Inkubieren Sie die Kulturplatten bei 37 °C in einem befeuchteten 5%-CO₂-Inkubator.
- Um eine optimale Zelllebensfähigkeit und steroidogene Funktion aufrechtzuerhalten, wird das Kulturmedium alle 48 Stunden gewechselt.