Methodenartikel

Optogenetische Analyse des Verhaltens in der Mücke Aedes aegypti

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DOI:

10.3791/71394

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21. August 2026

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1Department of Genetics, Yale University, 2Kavli Institute for Neuroscience, Yale University, 3Howard Hughes Medical Institute, 4Wu Tsai Institute, Yale University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der Optogenetik zum Verständnis des Verhaltens der Mücke Aedes aegypti. Methoden zur Zucht, Vorbereitung, Durchführung von Tests und Analyse werden vorgestellt, um die neuronale Funktion während der Anlockung an Wirtstiere und der Blutmahlzeit zu untersuchen. Diese grundlegenden Techniken ermöglichen neuronale Schaltkreis- und Verhaltensstudien dieses wichtigen Vektors menschlicher Krankheiten.

Zusammenfassung

Die Mücke Aedes aegypti ist ein wichtiger Vektor für virale Krankheitserreger und dient als Modell für andere Vektorspezies. Krankheitserreger werden übertragen, wenn eine Mücke ein Wirtstier sticht, doch die neuronalen Schaltkreise, die das Such- und Stichverhalten steuern, sind bisher unbekannt. Diese Arbeit beschreibt Methoden zur Beeinflussung der neuronalen Aktivität bei Mücken mittels Optogenetik, einer zentralen Technik zur Bestimmung der kausalen Beziehung zwischen neuronalen Schaltkreisen und Verhalten. Zu diesen Methoden gehören die Zucht von Mücken für die Optogenetik sowie drei Tests, die unterschiedliche Schritte der Abfolge von Aktivierung, Anziehung, Proboscis-Probing und Sättigung mit Wirtsblut messen. Diese Verhaltensweisen treten in unterschiedlichen räumlichen Skalen und als Reaktion auf verschiedene sensorische Reize auf. Jeder Verhaltensversuch ist mit roten (~625 nm) LEDs zur optogenetischen Aktivierung ausgestattet. Um die Aktivierung als Reaktion auf olfaktorische Reize zu erfassen, werden Flug- und Laufverhalten quantifiziert. Zur Untersuchung von Anziehung oder Landung werden den Mücken in einer großen Versuchsanordnung eine erwärmte Blutmahlzeit präsentiert. Proboscis-Probing und Sättigung werden mit hochauflösenden Videos aufgezeichnet, wodurch die Messung von Anhängseln und Bauchgröße ermöglicht wird. Das Protokoll beschreibt Modelle der maschinellen Bildverarbeitung, um eine hochauflösende zeitliche Quantifizierung des Verhaltens sowie Endpunkt-Messungen der Nahrungsaufnahme zu ermöglichen. Diese Methoden können verwendet werden, um die Rolle beliebiger genetisch zugänglicher Neuronenpopulationen im Mückenstichverhalten zu testen, und lassen sich auf zusätzliche Verhaltensweisen erweitern.

Einleitung

Die Mücke ist eines der gefährlichsten Tiere der Welt, nicht aufgrund ihrer Wildheit oder Stärke, sondern aufgrund ihrer Effizienz als Überträger von Krankheiten. Parasiten, die Malaria verursachen, werden durch Anopheles Mücken sind jährlich für Hunderttausende von Todesfällen verantwortlich, während Aedes aegypti und Aedes albopictus sind verantwortlich für die Ausbreitung von Gelbfieber, Dengue-Fieber, Chikungunya, Zika-Fieber und vielen anderen lebensbedrohlichen Krankheiten1Mücken kommen auf allen Kontinenten außer in der Antarktis vor und stellen eine erhebliche Gefahr für die öffentliche Gesundheit dar.2. Das blutsaugende Verhalten überträgt direkt Krankheitserreger, ist aber auch ein wesentlicher Schritt im Mückenlebenszyklus Lebenszyklus, da eine Blutmahlzeit von Wirbeltieren erforderlich ist, um Eier abzulegen. Die Eindämmung von durch Mücken übertragenen Krankheiten erfordert daher das Verständnis ihrer Wirtssuchmechanismen.

Es ist gut belegt, dass weibliche Mücken lang- und kurzreichweitige Reize nutzen, um Wirte zu lokalisieren3,4. Kohlendioxid (CO2) ist ein hochflüchtiges Gas, das in der menschlichen Ausatemluft vorkommt, und stellt oft den ersten Reiz dar, den eine Mücke wahrnimmt. Es wird in olfaktorischen Sinnesneuronen von Aedes aegypti von den Proteinen Gr1, Gr2 und Gr3 erkannt, die den CO2-Rezeptor bilden5. Die Exposition gegenüber CO2 löst Start- und Flugverhalten aus, das auch als Aktivierung bekannt ist6,7, und bis zu 10–15 Minuten andauern kann, selbst wenn keine weiteren Reize vorhanden sind8. CO2 wirkt synergistisch mit Hautgeruch, um die Aktivierung und Anlockung zu verstärken5,9. Nach der Detektion von CO2 und Hautgeruch ist die Mücke darauf vorbereitet, zusätzliche, näher liegende Wirtssignale wahrzunehmen, wie Wärme, visuellen Kontrast und Luftfeuchtigkeit, die sie zur Landung auf einem geeigneten Blutmahlwirt führen5,10,11,12,13. Die Integration mehrerer sensorischer Reize ermöglicht es Mücken, ihren Wirt effektiv zu verfolgen und zu lokalisieren.

Wenn eine weibliche Mücke auf einem potenziellen Wirt landet, stößt sie ihren Saugrüssel in die Oberfläche, bis eine Stelle der Haut gefunden ist, ein Vorgang, der als Tastbohrung bekannt ist14,15. Nach der Tastbohrung durchsticht der Stechapparat die Haut, lokalisiert ein Blutgefäß und nimmt gleichzeitig Blut auf, während Speichel injiziert wird, wodurch die Mücke innerhalb weniger Minuten ihr Körpergewicht verdoppeln kann16. Das Blut gelangt in den Mitteldarm, wo Proteine zur Eiproduktion verdaut werden. Interessanterweise ist eine vollständige Blutmahlzeit für die Übertragung von Krankheitserregern nicht erforderlich, da bereits die Tastbohrung allein eine Krankheitsübertragung ermöglichen kann16,17. Daher könnte das Verständnis jedes Schritts des Bissverhaltens die Entwicklung von Strategien ermöglichen, um die Wirtssuche und das Beißen weiblicher Mücken zu stören und letztlich die Ausbreitung von mückenübertragenen Krankheiten zu kontrollieren.

Zahlreiche Werkzeuge wurden in Modellorganismen entwickelt, um die neuronale Aktivität zu manipulieren. Frühe Werkzeuge wirkten konstitutiv oder durch thermische Aktivierung18,19,20,21. Obwohl nützlich, weisen diese genetischen Reagenzien bestimmte Nachteile auf. Konstitutive Werkzeuge können die Entwicklung beeinflussen und zu Phänotypen führen, die nicht ausschließlich auf der Schaltkreisfunktion der Neuronen beruhen. Mücken nutzen Körperwärme, um Wirte unter den Wirbeltieren zu identifizieren, wodurch thermisch aktivierte Kanäle für Verhaltensstudien besonders ungeeignet sind22,23. In Verhaltensstudien bezeichnet Optogenetik die Anwendung genetischer Werkzeuge, die auf bestimmte Lichtwellenlängen reagieren, um die Aktivierung von bestimmten Neuronen zu steuern. Diese Technik wurde bereits in mehreren Systemen eingesetzt, von der Untersuchung der Valenz von Durst bei Mäusen bis hin zur Erforschung des Balzverhaltens in Drosophila sowie zur Wiederherstellung des Sehverlusts bei Retinopathia pigmentosa in klinischen Studien am Menschen24,25,26. Optogenetische Kanäle funktionieren durch Absorption von Photonen und ermöglichen den Durchtritt bestimmter Ionen durch die Plasmamembran, wodurch das Neuron aktiviert oder gehemmt wird. Durch die Einführung transgener, lichtempfindlicher Protein-codierender Gene in einen Organismus kann mit dieser Technik die Aktivierung oder Hemmung spezifischer Neuronen erreicht werden, die andernfalls nicht manipulierbar wären. Die Optogenetik bietet Vorteile hinsichtlich zeitlicher und räumlicher Kontrolle sowie eine Vielzahl von Kontrollmöglichkeiten, die experimentelle Schlussfolgerungen ermöglichen.

Die Autoren beschrieben kürzlich die erste Anwendung optogenetischer Werkzeuge zur Untersuchung des Verhaltens von Mücken8. Diese Werkzeuge basieren auf dem durch rotes Licht aktivierten Kationenkanal CsChrimson, einem langwellig verschobenen Channelrhodopsin27. Mikrobielle Opsine, einschließlich CsChrimson, benötigen einen chemischen Cofaktor, all-trans Retinal, um Photonen absorbieren zu können28. CsChrimson ist mit dem fluoreszierenden Reporter tdTomato fusioniert und steht unter der Kontrolle des QF2/QUAS-binären Expressionssystems, wodurch eine flexible Kombination mit verschiedenen Treiberlinien ermöglicht wird29. Um die CO2-sensorischen Neuronen gezielt anzusteuern, wurde eine Treiberlinie verwendet, die den Transkriptionsfaktor QF2 in Neuronen exprimiert, welche die Gr3-Untereinheit des CO2-Rezeptors exprimieren30. Mücken zeigten nach Exposition gegenüber rotem Licht allein eine minimale Verhaltensreaktion8; außerdem dringt rotes Licht am effektivsten in biologisches Gewebe ein, was ein durch rotes Licht aktiviertes Opsin ideal für die Optogenetik macht25.

In diesem Artikel werden Protokolle für drei Assays beschrieben, die unterschiedliche Aspekte des Wirtssuch- und Blutmahlverhaltens in Kombination mit optogenetischer Stimulation messen (Abbildung 1A). Zunächst wird ein Protokoll zur Zucht optogenetischer Mückenlinien bereitgestellt. Der zweite Abschnitt beschreibt den Opto-Thermocycler, einen modifizierten PCR-Thermocycler, der zur Verfolgung von Erregung und Probierverhalten verwendet werden kann, wenn Mücken Temperatur- und Lichtreizen ausgesetzt werden. Der Opto-Thermocycler-Assay ist darauf ausgelegt, diese Suchverhaltensweisen über längere Zeiträume hinweg zu messen, wobei Treiberstämme eingesetzt werden, um neuronale Aktivität mittels Optogenetik zu steuern. Der dritte Abschnitt beschreibt den Blutdeckel-Assay, bei dem die Mücken kontinuierlichen Zugang zu einer dünnen künstlichen Blutmahlzeit auf der Basis eines modifizierten Thermocyclers haben, wodurch Flug, Probieren und Sättigung unter variierenden Licht- und Temperaturbedingungen verfolgt werden können. Der auf dem Opto-Thermocycler basierende Blutdeckel-Assay ermöglicht die Quantifizierung der Sättigung mit einer künstlichen Blutmahlzeit und erlaubt so die Untersuchung des Fressverhaltens von Mücken unter präzise zeitlich gesteuerten optogenetischen und thermischen Reizen. Der letzte Abschnitt beschreibt den Opto-Membranfütterer, bei dem den Mücken eine warme Blutmahlzeit in einem Behälter präsentiert wird, wodurch sowohl die Anziehung zu einer Blutquelle als auch die Sättigung unter Einwirkung von Lichtreizen verfolgt werden können. Der Opto-Membranfütterer-Assay dient der Untersuchung der vollständigen Verhaltenssequenz der Wirtssuche und des Blutverzehrs in einem Freiflugsystem. Zusätzlich zu den erwarteten Ergebnissen für jeden Assay werden Modelle der maschinellen Bildverarbeitung beschrieben, um Körperteile der Mücken zu verfolgen und Verhaltensweisen während der Assays zu identifizieren. Die Assays mit dem Opto-Thermocycler, dem Blutdeckel und dem Opto-Membranfütterer ermöglichen die Messung unterschiedlicher Phasen des Blutverzehrsverhaltens von Mücken, während die neuronale Aktivität mittels Licht beeinflusst wird. Diese innovativen Techniken erlauben die Erforschung, wie neuronale Schaltkreise von Mücken Verhaltensweisen steuern, die eine Gefahr für die öffentliche Gesundheit darstellen.

Protokoll

In diesem Protokoll verwendete Mücken enthalten Transgene und müssen gemäß den Vorschriften des United States Department of Agriculture in Arthropod Containment Level II-Einrichtungen gezüchtet werden32. Die Mücken werden unter Kontrolle gehalten, um ein Entweichen zu verhindern, und als biohazard-Pflichtmüll entsorgt. Die Biosicherheits- und Arthropodenkontainmentsprotokolle wurden von der Yale Environmental Health & Safety geprüft und genehmigt. Diese Arbeit verwendet keine menschlichen oder tierischen Versuchspersonen. Der Mückengenotyp kann mittels fluoreszierender Marker (3xP3-dsRed für Gr3-QF2 und 3xP3-CFP für QUAS-CsChrimson) oder durch PCR für das eingefügte Konstrukt bestätigt werden8. Alle in dieser Studie verwendeten Materialien sind in der Tabelle der Materialien aufgelistet.

1. Optogenetische Haltung

  1. Züchten Sie die Mücken gemäß Standardprotokoll31, mit folgenden Ausnahmen, um die Reaktion optogenetischer Linien während der Experimente zu maximieren.
  2. Erzeugen Sie Kreuzungen unter Verwendung homozygoter Gr3-QF2-, QUAS-CsChrimson- und wildtypischer Liverpool-Stämme, um die heterozygoten experimentellen Linien Gr3-QF2/+, QUAS-CsChrimson/+ und Gr3>CsChrimson zu erhalten.
  3. Züchten Sie die Mücken in einem lichtdichten Inkubator bei 28 °C und 80 % Luftfeuchtigkeit im 14-Stunden-Blaulicht-(450 nm)-10-Stunden-Dunkel-Wechsel (Abbildung 1B).
    HINWEIS: Die Verwendung von Blaulicht minimiert die Aktivierung rotem Licht empfindlicher Kanäle wie CsChrimson. Alle Zuchtschritte außerhalb des Inkubators sollten unter schwachen Lichtverhältnissen durchgeführt werden.
  4. Beginnen Sie die Experimente frühestens eine Woche nach der Imaginalschlupf bei adulten Mücken.
    HINWEIS: Obwohl das ideale Alter für Verhaltensversuche 2–3 Wochen beträgt, können Mücken bis zu 4 Wochen nach dem Schlupf verwendet werden. Kontroll- und experimentelle Genotypen sollten gleich alt sein und in Tagen nach dem Schlupf angegeben werden. Um das Alter der Tiere zu standardisieren, sollten alle Eier am selben Tag geschlüpft werden.
  5. Zwei Tage vor den Experimenten saugen Sie gepaarte, nicht blutmehlgefütterte weibliche Mücken vorsichtig aus den Käfigen ab und betäuben Sie sie bei 4 °C. Überführen Sie sie mithilfe einer Feder oder eines Aspirators vorsichtig in die experimentellen Behälter, je nach verwendeter Assay-Methode.
  6. Bereiten Sie eine 0,2 M-Aliquotlösung von all-trans-Retinal (ATR) in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor und lagern Sie sie bei -20 °C. Stellen Sie 10 % Saccharose und 400 µM ATR über angefeuchtete Wattepolster auf dem Gitter des Behälters bereit. Die Tiere können 1–3 Tage im Dunkeln von dieser Nahrung fressen.
    HINWEIS: Die Fütterung im Dunkeln verhindert im Vergleich zur Fütterung unter Blaulicht das Ausbleichen des ATR (Abbildung 1B). Zudem wurden die Mücken in allen Schritten des Protokolls durch Exposition bei 4 °C für 5–10 Minuten bis zur Bewegungslosigkeit betäubt. Am Ende jedes Experiments wurden die Mücken durch 24-stündige Exposition bei -20 °C euthanasiert.
    ACHTUNG: All-trans-Retinal kann schwere Reizungen bei Haut- und Augenkontakt verursachen. Tragen Sie beim Umgang geeignete PSA wie Laborkittel, Handschuhe und Augenschutz. Dimethylsulfoxid ist eine brennbare Flüssigkeit, die bei Hautkontakt resorbiert werden kann und in trockener Umgebung unter Verwendung geeigneter PSA und Augenschutzes gehandhabt werden muss. DMSO sollte außerdem in feuerfesten Chemikalienschränken gelagert werden.
  7. Ein Tag (20–24 h) vor den Experimenten ersetzen Sie die Saccharosefutterquellen durch neue, die destilliertes Wasser und 400 µM ATR enthalten. Die Tiere verbleiben bis zum Experiment im Dunkeln (Abbildung 1B). Fahren Sie mit Abschnitt 2, 3 oder 4 fort.
    HINWEIS: Die Experimente sollten während der Tageslichtphase der Mücken durchgeführt werden, um die Reaktionsrate zu maximieren.

2. Opto-Thermocycler

  1. Zusammenbau der Bestandteile des Assays
    1. Stellen Sie die Acrylplatten zur Aufnahme der Mücken her (Abbildung 2). Siehe Abbildung 2A  für ein Diagramm, Abbildung 2B  für elektronische Komponenten, und Abbildung 2C  für ein Bild der Acrylplatte. Die Vorlagen finden Sie in den Dateien unter (https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0).
      1. Schneiden Sie zur Herstellung der Wände eine 3 mm dicke Acrylplatte mit einem Laserschneider in vier Rechtecke mit den Maßen 10 cm × 1 cm und sechs Rechtecke mit den Maßen 7 cm × 1 cm. Verkleben Sie die Rechtecke mit Acrylkleber zu einer Matrix aus fünf mal drei Einheiten, wobei jede Einheit eine Kammer mit den Maßen 17 mm × 17 mm × 10 mm bildet. Die Vorlage für diese Teile befindet sich in der Datei „14_animal_thick_v3.ai“.
        ​ACHTUNG: Acrylkleber ist brennbar und kann Atemwegs- sowie Augenreizungen verursachen. Bei der Handhabung von Acrylkleber ist geeignete PSA zu tragen, wie Handschuhe, Laborkittel und Schutzbrille. Der Kleber sollte zudem in gut belüfteten Räumen und fern von offener Flamme verwendet werden.
      2. Schneiden Sie eine 1,5 mm dicke Acrylplatte für den Boden der Kammer auf die Maße 6,985 cm × 10,16 cm zu, wobei die rechte untere Kammer ausgespart bleibt. Schneiden Sie eine weitere 1,5 mm dicke Acrylplatte auf die Maße 6,985 cm × 10,16 cm für den Deckel zu. Die Vorlage für diese Teile lautet „14_animal_thin_v3.ai“.
    2. Schneiden Sie ein UV-beständiges schwarzes Maschennetz auf die gleiche Größe wie das Acrylstück für den Boden (Abbildung 2C). Legen Sie das Netz zwischen die Wände der Platte und das Bodenstück und verkleben Sie es mit Acrylkleber. Entfernen Sie das Netz aus der rechten unteren Kammer, sodass das Loch unversperrt bleibt.
  2. Aufbau eines Rahmens zur Halterung von Kamera und LEDs (Abbildung 2A).
    1. Bauen Sie einen Rahmen mit vier Säulen an jeder Ecke des Thermocyclers unter Verwendung von 60,96 cm langen, 25 mm quadratischen optischen Konstruktionsprofilen. Verbinden Sie die vordere rechte Säule mit der hinteren rechten Säule und die vordere linke Säule mit der hinteren linken Säule jeweils 30 cm über der Laborbank mittels zweier 22,86 cm langer, 25 mm breiter Konstruktionsprofile.
    2. Verbinden Sie die rechte und linke Säule vorne mit einem 30,48 cm langen, 25 mm breiten Konstruktionsprofil, das 24 cm über der Laborbank angebracht ist, und hinten mit einem gleichartigen Profil, das 42 cm über der Laborbank positioniert ist.
    3. Befestigen Sie optische Stative mit einer Länge von 30,48 cm an den Konstruktionsprofilen auf der linken und rechten Seite des Rahmens. Befestigen Sie an jedem Stativ sechs in Reihe geschaltete 627 nm (rot) emittierende LEDs, die 24 cm über dem PCR-Block des Thermocyclers angebracht sind.
      HINWEIS: Obwohl die Wellenlänge, die die maximale Aktivität von CsChrimson hervorruft, bei etwa 590 nm liegt, ermöglichen Wellenlängen um etwa 625 nm eine Balance zwischen der Aktivierung von CsChrimson und der Vermeidung lichtbedingter Verhaltensreaktionen in genetischen Kontrollen27. Befestigen Sie an jeder LED einen Kühlkörper und eine Linse, um das Licht auf den PCR-Block des Thermocyclers zu fokussieren.
    4. Befestigen Sie ein 30,48 cm langes optisches Stativ an der Oberseite der beiden vorderen Konstruktionsprofile. Verwenden Sie eine Winkelklemme in der Mitte des Statives, um ein 15,24 cm langes optisches Stativ nach innen über dem PCR-Block des Thermocyclers zu befestigen. Befestigen Sie eine Kamera mit einem Infrarot-Longpassfilter am Ende, die nach unten gerichtet 40 cm über dem Block positioniert ist.
    5. Erstellen Sie mithilfe optischer Stative einen Rahmen, der sich als Rechteck um den PCR-Block herum von den Konstruktionsprofilen aus erstreckt und knapp über der Oberfläche angebracht ist. Befestigen Sie einen Streifen aus Infrarot-LEDs, der auf den PCR-Block gerichtet ist, um die Mücken im rechten Winkel zur Kamera auszuleuchten.
      HINWEIS: Die zur Videobildaufnahme verwendete Infrarotbeleuchtung erwärmt die Versuchsarena nicht messbar, da die Oberfläche des Thermocyclers während des gesamten Experiments bei 24 °C gehalten wird.
    6. Drapiere einen Verdunkelungsvorhang über die gesamte Konstruktion, um Störungen durch Umgebungslicht zu vermeiden.
    7. Bedecke die Oberfläche und Seiten des PCR-Blocks mit einer einzigen Schicht Verdunkelungsband, um eine ebene, gleichmäßige Oberfläche mit dunklem Hintergrund zu schaffen.
    8. Platziere den Thermoelementfühler in der rechten unteren Ecke des PCR-Blocks und sichere ihn mit Verdunkelungsband. Überprüfe die gleichmäßige Lichtverteilung über den PCR-Block mithilfe eines Leistungsmessgeräts. Passe die Spannung oder den Strom der Stromversorgung so an, dass eine Bestrahlungsstärke von 12 µW/mm2 erreicht wird.
    9. Platziere eine Infrarot-LED am Rand des PCR-Blocks, um das Video mit dem Stimulus-Ausgabesignal zu synchronisieren (Abbildung 2C). Bedecke die Oberfläche mit schwarzem Band, sodass das Licht erfasst werden kann, ohne eine Blendung in der Kamera zu verursachen.
    10. Verdrahte das Thermoelement, die Synchronisations-LED und die roten Licht-LEDs gemäß dem Diagramm in Abbildung 2B. Lade die erforderliche Software herunter (SpinView (Version 1.27.0.48), CoolTerm (Version 2.0.1), Arduino IDE (Version 1.8.12)). Lade den Arduino-Code und das Thermocycler-Programm aus dem GitHub-Repository herunter.
      ​HINWEIS: Der Arduino-Code ist so programmiert, dass er rotes Licht, körpertemperaturähnliche Wärme und die Kombination beider Reize auslöst. Es stehen sieben Stimulusprogramme zur Verfügung, deren Reihenfolge zufällig variiert wird und die als Ressourcen bereitgestellt werden. Diese können angepasst werden, um unterschiedliche Reize zu liefern. Pro Experiment werden neun Reize gegeben: drei mit nur Wärme, drei mit nur Licht und drei mit Wärme und Licht gleichzeitig. Die Reizdarbietung erfolgt dadurch, dass der Arduino Temperaturänderungen an der Oberfläche des PCR-Blocks über das Thermoelement erfasst und dann Lichtreize zu den vorgegebenen Zeitpunkten auslöst. Weitere Details finden sich in den Kommentaren innerhalb der Stimulusprogramme.
  3. Vorbereitung des Versuchs
    1. Züchte die Mücken gemäß dem Optogenetik-Zuchtprotokoll; siehe Abschnitt 1 und Abbildung 1B.
    2. Zwei Tage vor dem Experiment überführe 14 weibliche Mücken mit einem Aspirator in einen separaten Behälter. Gib den Mücken ATR gemäß Schritt 1.6. Wenn mehrere Genotypen verglichen werden, sollten diese für den Versuchsleiter verblindet sein.
      ​HINWEIS: Sobald die Mücken ATR erhalten haben, sollten sie im gedämpften Licht behandelt werden.
    3. Ein Tag vor dem Experiment (20–24 h), sauge jeweils 14 weibliche Mücken pro Acrylplatte mit einem Aspirator ab und betäube sie bei 4 °C. Platziere vorsichtig jeweils eine einzelne Mücke mit einer Feder oder dem Aspirator in jede Kammer.
    4. Befestige die Seite der Acrylplatte mit Tesafilm, um den Deckel zu fixieren. Falte den Klebeband nicht über die Ober- oder Unterseite der Acrylplatte, da dies die Sicht der Kamera behindern würde.
    5. Lege die Acrylplatte auf drei parallele Wattebäusche, die mit 400 µM ATR in destilliertem Wasser getränkt sind (siehe Schritt 1.6). Richte jede der drei Reihen an einem Wattebausch aus, sodass alle Mücken Zugang zur Wasser-ATR-Lösung haben. Stelle die Acrylplatte über Nacht in einen dunklen Inkubator.
  4. Durchführung des Versuchs
    1. Verbinde Kamera, LEDs und Arduino mit dem Computer. Schalte die Stromversorgung ein. Reinige die Oberfläche des Opto-Thermocyclers mit 70 %igem Ethanol und lasse sie trocknen.
      ​ACHTUNG: Ethanol ist entzündlich und kann schwere Augenreizungen verursachen. Bei der Handhabung von Ethanol ist geeignete PSA zu tragen. Vermeide zudem offene Flammen.
    2. Überführe die Acrylplatte mit den Mücken mithilfe eines dunklen Behälters in die Mitte des PCR-Blocks. Bedecke den Opto-Thermocycler mit einem Verdunkelungsvorhang.
    3. Öffne SpinView auf dem Computer. Klicke auf den Namen der Kamera, um die Kameraperspektive zu öffnen. Stecke die Infrarot-Beleuchtung ein und vergewissere dich, dass PCR-Block und Acrylplatte in der Kameraperspektive sichtbar sind.
    4. Falls nötig, justiere die Acrylplatte so, dass sie ausgerichtet und zentriert ist und das Thermoelement in der rechten unteren Ecke der Acrylplatte sichtbar ist. Stelle sicher, dass das Synchronisationslicht im Bildausschnitt ist (Abbildung 2C).
    5. Passe die Kamera- und SpinView-Einstellungen so an, dass ein scharfes, beschnittenes Video der Acrylplatte entsteht. Im Reiter Bildformat passe die Optionen Breite, Höhe, Offset X und Offset Y so an, dass Acrylplatte und Synchronisationslicht sichtbar sind. Im Reiter Einstellungen setze Aufnahmefrequenz aktivieren auf wahr und Aufnahmefrequenz auf 30 fps.
    6. Schalte Belichtungsautomatik und Verstärkungsautomatik aus. Passe die Werte für Belichtungszeit und Verstärkung so an, dass ein klarer Kontrast zwischen dem schwarzen Hintergrund und den Mücken entsteht. Klicke auf die rote Aufnahmetaste in der oberen rechten Ecke, um ein separates Fenster zum Speichern der Videodatei zu öffnen.
    7. Im Popup-Fenster stelle den Dateipfad oben ein: Klicke auf Durchsuchen, navigiere zum Versuchsordner, klicke auf Neuer Ordner und benenne ihn mit dem Versuchsnamen. Stelle die Anzahl der aufzunehmenden Bilder auf den für den Versuch geeigneten Wert ein (z. B. 43.500) oder auf 0, um die Aufnahme manuell zu beenden.
    8. Im Reiter Videos stelle folgende Felder ein: Videoaufzeichnungsart: MJPG, Videodatei-Aufteilungsgröße: 1000 MB, JPEG-Komprimierungsqualität: 65. Öffne das Programm „optothermo_lightheat_random1“ auf dem Thermocycler und starte es. Der Thermocycler sollte mit einem Halteschritt bei 25 °C beginnen.
    9. Öffne das entsprechende Programm „TC_optothermo_lightheat_random1.ino“ in der Arduino IDE und lade es auf die Platine. Öffne den seriellen Monitor und stelle sicher, dass die Temperatur etwa 25 °C beträgt.
    10. Schließe den seriellen Monitor in der Arduino IDE. Öffne CoolTerm, um die serielle Monitor-Ausgabe des Arduino aufzuzeichnen. Stelle sicher, dass der serielle Port und der Kanal mit denen in der Arduino IDE übereinstimmen. Die Ausgabe erscheint nun im CoolTerm-Fenster.
    11. Beginne mit der Aufzeichnung der Arduino-Ausgabe in eine Text-/Binärdatei. Starte die Videoaufnahme in SpinView. Klicke auf Fortsetzen, um den Halteschritt des Thermocyclers zu beenden. Beobachte die Arduino-Ausgabe in CoolTerm, um zu prüfen, ob die Temperatur auf 18 °C absinkt und der Stimuluszähler auf 1 ansteigt, wodurch der Versuch initiiert wird. Lasse den Assay laufen, bis der Versuch abgeschlossen ist.
  5. Aufräumen
    1. Beende die Videoaufnahme und die Aufzeichnung der CoolTerm-Ausgabe. Schließe beide Programme. Beende das Thermocycler-Programm. Entferne die Acrylplatte mit den Mücken vom Thermocycler und lege sie über Nacht in einen -20 °C-Tiefkühler, um die Mücken zu töten.
      ​ACHTUNG: Bei der Tötung transgener Mücken ist sicherzustellen, dass sie mindestens 24 Stunden lang in einer Umgebung von -20 °C verbleiben, bevor sie in einer Biorisikomülltonne entsorgt werden, um den sicheren Tod zu gewährleisten.
    2. Falls ein weiterer Versuch durchgeführt wird, wiederhole Abschnitt 2.3. Ziehe die Kabel der Kamera und des Arduino ab. Schalte die Stromversorgung aus. Ziehe die Infrarot-LEDs ab. Reinige die Acrylplatten, indem du das Tesafilm entfernst und die toten Mücken entsorgst.
    3. Sprühe Deckel und Acrylplatte mit 70 %igem Ethanol ein und wische vorsichtig mit einem behandschuhten Finger alle Seiten der Kammern und des Netzes ab. Spüle gründlich mit entionisiertem Wasser nach und staple die Acrylplatten zur Lagerung, wobei die Deckel durch ein Papiertuch getrennt werden, um Kratzer zu vermeiden.

3. Blutdeckel-Assay

  1. Zusammenbau der Bestandteile des Assays (Abbildung 3)
    1. Bauen Sie den opto-thermocycler-Assay wie in Abschnitt 2.1 beschrieben zusammen. Beziehen Sie sich auf die Abbildungen für den Assay (Abbildung 3A), den thermischen Reiz (Abbildung 3B) und die Aluminiumplatte (Abbildung 3C).
    2. Stellen Sie eine Aluminiumplatte zur Blutmahlzeiten-Fütterung her, wie in Abbildung 3C dargestellt.
      1. Stellen Sie die obere und untere Platte mithilfe eines Laserschneiders oder Wasserstrahlschneiders her. Schneiden Sie die Unterseite der Platte aus einem 0,8 mm dicken Aluminiumblech mit den Maßen 90 mm × 134 mm zu. Schneiden Sie die Oberseite aus einem 1,6 mm dicken Aluminiumblech mit den Maßen 90 mm × 134 mm zu. Schneiden Sie 15 rechteckige Öffnungen (17,2 mm × 18,6 mm) in die obere Platte. Die Vorlagendateien finden Sie im Blood-Blanket-GitHub-Repository (https://github.com/sorrellslab/bloodblanket) unter „Vorlagen für Aluminiumplatte“.
      2. Platzieren Sie zwischen den Aluminiumteilen eine dünne Silikondichtung (0,5 mm Dicke), um Leckagen zu verhindern. Schneiden Sie diese mit einem Laserschneider so zu, dass sie der Form der oberen Aluminiumplatte entspricht.
      3. Verbinden Sie die Schichten mithilfe von acht 0,47625 cm langen, gewölbten Sechskantschrauben (4–40 Standard). Verwenden Sie einen Gewindeschneider, um in den Metallteilen Gewinde für die Schrauben herzustellen. Befestigen Sie diese mithilfe runder und „W“-förmiger Unterlegscheiben an der Unterseite der Platte, um zusätzliche Sicherheit zu gewährleisten, wenn die Platte auf dem Thermocycler-Block platziert wird.
    3. Laden Sie den Arduino-Code und das Thermocycler-Programm für den Blood-Blanket-Assay aus dem GitHub-Repository herunter (https://github.com/sorrellslab/bloodblanket).
    4. Bereiten Sie Aliquots von 20 mM ATP in 25 mM NaHCO3 vor und lagern Sie diese bei -20 ˚C bis zur Verwendung.
      ​HINWEIS: Bereiten Sie alle sechs Monate eine frische ATP-Lösung zu. Vermeiden Sie wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen. Bereiten Sie 1 M NaHCO3 und 5 M NaCl vor (jeweils bei Raumtemperatur lagern). NaHCO3 ist in Lösung nur sieben Tage stabil.
  2. Vorbereitung des Experiments
    1. Züchten Sie die Mücken und überführen Sie sie in Acrylplatten, wie in den Abschnitten 1 und 2.2 beschrieben. Falls Vergleiche zwischen verschiedenen Genotypen durchgeführt werden sollen, sollten diese für den Experimentator verblindet sein.
    2. Am Tag des Experiments bereiten Sie eine 10 mL minimale künstliche Blutmahlzeit (110 mM NaCl, 20 mM NaHCO3 und 1,5 mM ATP) zu, indem Sie 750 µL 20 mM ATP, 220 µL 5 M NaCl und 200 µL 1 M NaHCO3-Stammlösung zu 8,83 mL entionisiertem Wasser hinzufügen. Mischen Sie gründlich durch Umstülpen.
      HINWEIS: Stellen Sie die künstliche Blutmahlzeit vor jedem Experiment frisch her.
    3. Richten Sie die SpinView-Aufzeichnung gemäß den Schritten 2.3.4 bis 2.3.8 ein.
    4. Öffnen Sie die Arduino-Datei „Red-light-Only__BB_.ino“ (oder die gewünschte Stimulusdatei) für das Experiment.
  3. Durchführung der Versuche
    1. Pipettieren Sie 650 µL der minimalen künstlichen Blutmahlzeit in jedes Loch der Platte, wobei sichergestellt werden muss, dass die Mahlzeit jedes Loch vollständig füllt, ohne überzulaufen.
    2. Spannen Sie ein 10,2 cm × 10,2 cm großes Parafilm-Quadrat über einen 20,3 cm Durchmesser großen Ring. Legen Sie das Parafilm über die Platte und drücken Sie die Ränder fest, bis es haftet. Schneiden Sie mithilfe eines Skalpells einen 1,3 cm breiten Rand rund um die Platte ab und falten Sie das überschüssige Parafilm unter die Platte, um die Mahlzeit abzudichten.
    3. Platzieren Sie die Platte direkt auf dem PCR-Block, um einen maximalen Wärmeübergang zu ermöglichen (Abbildung 3A).
      HINWEIS: Auf der Oberfläche des PCR-Blocks wird für den opto-thermocycler schwarzes Abklebeband verwendet, jedoch nicht für das Blood Blanket.
    4. Platzieren Sie das Thermoelement auf der Oberfläche des Parafilms in der rechten unteren Ecke der Aluminiumplatte. Schließen Sie die Kamera, die LEDs und den Arduino an den Computer an. Schalten Sie die Stromversorgung ein. Starten Sie das Programm „BB_thermocycler_program.x50prog“ auf dem Thermocycler.
      HINWEIS: Die Geschwindigkeit der Temperaturänderung entspricht der maximalen Rampengeschwindigkeit des Thermocyclers und wurde gewählt, um das Landen einer Mücke auf einem Wirt zum Füttern bestmöglich nachzuahmen.
    5. Überführen Sie die Acrylplatte mit den Mücken unter Verwendung eines dunklen Behälters und bei gedimmtem Raumlicht, um die Lichteinwirkung zu minimieren, auf die Aluminiumplatte, wobei sichergestellt werden muss, dass jedes Loch mit den Mücken ausgerichtet ist. Stellen Sie sicher, dass das Thermoelement in der rechten unteren Ecke der Platte liegt und mit dem Parafilm in Kontakt steht, um die Temperatur der künstlichen Blutmahlzeit zu messen.
    6. Starten Sie das Programm, indem Sie das „Red-light-Only__BB_.ino“-Programm in der Arduino-IDE erneut hochladen. Schließen Sie den seriellen Monitor. Drücken Sie in CoolTerm auf Verbinden, um die aktuelle Temperatur anzuzeigen. Passen Sie anhand dieser Starttemperatur die Auslösetemperatur im Arduino-Skript auf etwa 0,6 °C darunter an.
    7. Wählen Sie im CoolTerm-Fenster Aufzeichnung in Text-/Binärdatei und beginnen Sie mit der Datensammlung. Starten Sie die Videoaufzeichnung im Aufzeichnungsfenster von SpinView. Klicken Sie auf Fortsetzen, um die Haltephase des Thermocyclers zu beenden. Beobachten Sie die Arduino-Ausgabe in CoolTerm, um sicherzustellen, dass der Temperaturabfall erkannt wurde und der Versuch begonnen hat.
    8. Nach Ablauf der Versuchsdauer klicken Sie auf Aufzeichnung beenden. Wählen Sie in CoolTerm im Reiter Aufzeichnung in Text-/Binärdatei die Option Beenden, um die Aufzeichnung der seriellen Ausgabe zu stoppen.
    9. Entfernen Sie die Mückenplatte von der Blood-Blanket-Platte und bringen Sie sie in den Kühlraum, um die Mücken zu betäuben. Zählen Sie die Anzahl der Mücken mit aufgeblähten Abdomina, die die künstliche Blutmahlzeit enthalten, als vollgesogen, einschließlich derjenigen, die teilweise gefüttert haben.
    10. Zwischen den Versuchen reinigen Sie die Oberfläche des PCR-Blocks, indem Sie sie mit einem mit 70 % Ethanol angefeuchteten Kimwipe abwischen. Entfernen Sie das Parafilm und spülen Sie die Aluminiumplatte mit entionisiertem Wasser ab. Wiederholen Sie Abschnitt 3.3 für weitere Versuche. Drehen Sie die Reihenfolge der Versuche zwischen den Tagen, um den Einfluss zirkadianer Aktivitätszyklen zu minimieren.
  4. Aufräumen
    1. Beenden Sie alle Aufzeichnungen und schließen Sie die Programme. Ziehen Sie die USB-Kabel der Kamera, des Arduino und der Infrarotlampen ab. Schalten Sie den Computer aus. Beenden Sie das auf dem Thermocycler laufende Programm „thermocycler_program.x50prog“.
    2. Stellen Sie die Mückenplatten über Nacht in einen -20 °C-Tiefkühler, um die Mücken zu töten. Waschen Sie die Aluminiumplatte mit entionisiertem Wasser. Benetzen Sie die Acrylplatte mit 70 % Ethanol, spülen Sie sie anschließend mit entionisiertem Wasser ab und lassen Sie sie über Nacht trocknen, bevor weitere Mücken beladen werden.
      HINWEIS: Die Platten sollten nach dem Waschen über Nacht getrocknet werden, um sicherzustellen, dass keine Feuchtigkeit verbleibt. Bei verbleibender Feuchtigkeit entsteht Kondenswasser auf dem Deckel, was die Videoaufzeichnung stören würde.

4. Opto-Membranfütterungs-Assay

  1. Zusammenbau der Bestandteile des Assays (Abbildung 4)
    1. Stellen Sie einen Rahmen unter Verwendung optomechanischer Komponenten und einer Größe von 30,48 cm mal 30,48 cm, schwarz, 0,635 cm dicke Acrylplatte. Erstellen Sie mit einem Laserschneider ein Loch in der Mitte der Acrylplatte mit einem Durchmesser von 11,43 cm. Schneiden Sie Löcher im Abstand von 2,54 cm von jeder Ecke, damit die Acrylplatte auf den Rahmenstützen aufliegen kann, etwa 23,495 cm über der Basis.
    2. In der Mitte einen schwarzen Acrylring mit einem Innendurchmesser von 19,05 cm und einem Außendurchmesser von 20,32 cm anbringen (Abbildung 4A). Schablonen für alle Acrylkomponenten befinden sich im opto-membran Feeder GitHub-Repository (https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0) zusammen mit den Arduino-Programmen. Siehe Abbildung für den Gesamtaufbau (Abbildung 4A), Reiz (Abbildung 4B), Schaltplan (Abbildung 4C) und Standbild aus dem Video (Abbildung 4D).
      ​HINWEIS: Die spezifischen Materialien, die zum Zusammenbau dieser Plattform verwendet werden, sind nicht entscheidend, sodass möglicherweise kostengünstigere Alternativen verfügbar sind.
    3. Befestigen Sie eine Kamera mit einem Infrarot-Longpassfilter unterhalb des mittleren Lochs, sodass sie nach oben in Richtung des Moskito-Behälters zeigt. Stellen Sie die Blende vollständig offen, um eine selektive Fokussierung auf das Maschendach des Behälters zu ermöglichen.Abbildung 4A).
    4. Um die Kanister herzustellen, schneiden Sie ein durchsichtiges Polycarbonatrohr mit einem Durchmesser von 11,43 cm in zylindrische Segmente von 12,7 cm Länge.
      1. Stellen Sie die Böden für die Behälter her, indem Sie Kreise mit einem Durchmesser von 11,43 cm aus 0,3175 cm dickem Acrylglas mittels Laserschneiden ausschneiden. Die Kanten der Kreise werden lasergeätzt, sodass sie in die Röhre eingesetzt werden können. Befestigen Sie sie mit Kunststoff-Kleber an den Röhren.
      2. Erstellen Sie einen eingelassenen Deckel aus schwarzem 0,635 cm und 0,3175 cm Acryl und UV-beständigem schwarzem Netzmaterial. Der innere Ring hat einen Durchmesser von 10,795 cm, während der äußere Ring einen Durchmesser von 12,065 cm aufweist, wobei das schwarze Netz über den kleineren Ring gespannt wird. Das Netz sollte durch laserbeschnittene Löcher mit gewachstem Faden angenäht werden.
        ​HINWEIS: Die Kanister sollten stets auf Papierhandtücher gestellt werden, um Kratzer auf den Acrylböden zu vermeiden, durch die die Aufnahme erfolgt.
    5. Acrylbehälter für die Blutmahlzeitlieferung herstellenAbbildung 4A).
      1. Schneiden Sie einen Ring mit einem Innendurchmesser von 5,08 cm und einem Außendurchmesser von 6,6 cm aus 0,15875 cm dickem klarem Acrylglas aus. Befestigen Sie diesen mit Acrylkleber an einem weiteren klaren Ring mit einem Innendurchmesser von 5,842 cm und einem Außendurchmesser von 6,604 cm.
      2. Platzieren Sie einen Metallgitterzylinder mit einer Höhe von 13,97 cm und einem Durchmesser von 19,05 cm in der Mitte der Plattform innerhalb des schwarzen Acrylringes.
      3. Befestigen Sie innerhalb des Metallgitters eine Spule aus RGB-LED-Leuchten im Abstand von 3,81 cm zur Außenseite des Behälters, die von einem Arduino Uno-Board gesteuert wird, das auf der schwarzen Acrylplattform platziert ist.Abbildung 4C).
      4. Mit einem Leistungsmesser die Lichtintensität im gesamten Inneren des Zylinders messen und die Position der Lichtquellen so einstellen, dass die Versuchsarena zwischen 3,5 und 6 beleuchtet ist µW/mm2Außerhalb des Metallgitters befestigen Sie mit Kabelbindern einen Ring aus 850 nm Infrarot-LEDs am Rahmen, wobei die LEDs nach innen gerichtet sind.
    6. Schließen Sie ein USB-Kabel an das Arduino Uno-Board an und verbinden Sie es mit dem Computer. Schließen Sie ein USB-Kabel von der Kamera zum Computer an. Schalten Sie die Internetverbindung aus.
    7. Platzieren Sie die Opto-Membranstruktur in einem dunklen Inkubator oder einer Umweltkammer bei 26 °C und 80 % relative Luftfeuchtigkeit für die Dauer der Experimente.
  2. Vorbereitung der Mückenbehälter
    1. Vor dem Experiment die Mückenbehälter damit reinigen, dass sie mit 70 %igem Ethanol besprüht und vorsichtig mit einem weichen Schwamm abgewischt werden. Anschließend die Behälter mit entionisiertem Wasser spülen und über Nacht lufttrocknen lassen.
    2. Zwei Tage vor dem Experiment männliche und weibliche Mücken unter Kältenarkose sortieren und jeweils 20 Weibchen in jeden Behälter geben. Zugang zu ATR gemäß Schritt 1.6 gewähren.
    3. Zu diesem Zeitpunkt sollten die Genotypen für den Experimentator verblindet sein. Die Reihenfolge der Versuche sollte zwischen den Tagen rotiert werden, um Unterschiede in den Verhaltensergebnissen aufgrund der experimentellen Zeitplanung zu minimieren.
  3. Versuchsdurchläufe
    1. Um die Blutmahlzeit vorzubereiten, stellen Sie 119 mL-Flaschen mit Wasser in ein 45 °C-Heizbad, eines für jeden Versuch. Dieses Volumen und diese Temperatur halten die Blutmahlzeit während des gesamten Experiments nahe der Körpertemperatur.
    2. Bereiten Sie Aliquote von jeweils 5 mL entfibriniertem Schafsblut vor. Lagern Sie bei 4 °C. °C und vor Gebrauch umkehren, um eine Trennung zu verhindern. Die Blutmahlzeit vor jedem Experiment frisch herstellen.
      ACHTUNG: Defibriniertes Schafsblut stets unter Verwendung der richtigen persönlichen Schutzausrüstung (PSA) handhaben, um eine Exposition gegenüber Krankheitserregern zu minimieren. Wiederverwendbare Materialien, die mit Blut in Kontakt gekommen sind, sollten in 10 % Bleiche getaucht und anschließend mit entionisiertem Wasser gespült werden. Da Bleiche schwere Haut- und Augenreizungen verursachen kann, ist während der gesamten Handhabung geeignete PSA zu tragen.
    3. Geben Sie die erste Blutportion in eine 45 °C-Wasserbad für mindestens 20 Minuten vor dem Versuch. Tauen Sie das ATP auf Eis auf. Dehnen Sie ein 5,08 cm mal 5,08 cm² große Parafilm-Quadrat über den Acryldeckel auf der Seite mit dem größeren, flachen Kreis legen, um eine Vertiefung für die Blutmahlzeit zu erzeugen (Abbildung 4A).
    4. Wischen Sie den Computer mit 70 %igem Ethanol ab, um menschliche Gerüche zu entfernen. Schließen Sie den Computer an eine externe Festplatte an. Schließen Sie die Kamera und das Arduino an. Stecken Sie die RGB- und Infrarotlampen in eine Stromquelle.
    5. Öffnen Sie die SpinView-Software und die Arduino-Datei für den entsprechenden Reiz. Erstellen Sie einen Ordner auf der externen Festplatte, um die Versuchsdaten zu speichern. Laden Sie die „blue_only.ioArduino-Datei zur Bereitstellung eines gedimmten blauen 471 nm Lichts von den RGB-LEDs an die Versuchsarena (gefolgt von Abbildung 4B).
    6. Ohne die Mücken einem Überschuss an CO₂ auszusetzen2 aus der Atmung, überprüfen Sie das Kanister für die Versuchsdurchführung und notieren Sie alle Todesfälle vor Beginn des Experiments. Stellen Sie das Kanister in die Mitte und lassen Sie die Tiere bei schwachem blauem Licht 10 bis 20 Minuten akklimatisieren, bevor sie der Reizdarbietung ausgesetzt werden.
      ​HINWEIS: Der Akklimatisierungsschritt und das Experiment werden unter schwachem blauen Licht durchgeführt, da völlige Dunkelheit den Flug der Mücken hemmt.
    7. Videoaufnahme aktivieren
      1. Wählen Sie im SpinView-Programm die Kamera aus. In der Einstellungen Registerkarte, stellen Sie die Belichtung und den Verstärkungsfaktor nach Bedarf ein, um einen hohen Kontrast zwischen den hellfarbenen Insekten und dem dunklen Hintergrund aufrechtzuerhalten (Abbildung 4D).
      2. Klicken Sie auf die rote Aufnahmetaste in der oberen Leiste, um die Videoaufnahmeeinstellungen anzupassen. Legen Sie den Dateipfad fest, indem Sie auf Durchsuchen, navigieren Sie dann zu dem externen Festplattenlaufwerk. Erstellen Sie einen neuen Ordner mit einem aussagekräftigen Namen für jeden Versuch. Verwenden Sie keine Leerzeichen im Ordnernamen.
      3. In dem Speicheroptionen Registerkarte auswählen, auswählen 0 Bilder erfassen, wodurch die Videoaufnahme fortgesetzt wird, bis sie manuell gestoppt wird. Unter Aufnahmemodus, auswählen gepuffert. Legen Sie im Tab „Videos“ die folgenden Felder fest: Videoaufzeichnungsformat: MJPG, Größe für die Videodatei-Aufteilung: 1000 MBund JPEG-Komprimierungsqualität: 65.
    8. Unmittelbar vor der Reizexposition 500 µL pipettieren µL von 20 mM ATP, um eine Endkonzentration von 2 mM ATP, in das vorbereitete 5 mL Blutaliquot. Invertieren Sie das Gefäß mehrmals, um zu mischen.
    9. Geben Sie die ATP-Blut-Lösung in den Blutmahlzeitbehälter. Legen Sie auf die Blutmahlzeit eine umgedrehte 119-mL-Flasche, die mit 45 °C-Wasser, um die Temperatur des Blutes während des gesamten Experiments nahe der menschlichen Körpertemperatur zu halten.
    10. Wählen Sie in der SpinView-Software „Start Recording“ aus. Ohne die Mücken mit Atemluft zu stimulieren, platzieren Sie die Blutmahlzeit auf dem Netzdeckel des Behälters, sodass die Mücken die Parafilm-Membran durch das Netz hindurch durchstechen können.
    11. Hochladen der, die, das Arduino Programm für 1sON_10sOFF.io (Abbildung 4B), oder dem gewünschten Stimulus. Dadurch wird alle 10 Sekunden für 1 Sekunde rotes Licht mit 624 nm ausgegeben, bis der „blue_only.io»-Datei wird manuell hochgeladen. Die Wellenlänge von 624 nm ist ausreichend, um CsChrimson optogenetisch zu aktivieren.
    12. Geben Sie die Blutprobe in das Wasserbad für den folgenden Versuch. Nachdem der Versuch 15 Minuten gelaufen ist, wählen Sie Aufnahme beenden. Laden Sie die „blue_only.io»Datei«, um den Rotlichtreiz zu beenden.
    13. Entfernen Sie den Blutmahlhalter und die Wasserflasche. Entfernen Sie den Behälter und betäuben Sie die Mücken bei 4 °C. Um weitere Versuche durchzuführen, kehren Sie zu Abschnitt 4.3 zurück. Untersuchen Sie die anästhesierten Mücken visuell, um die Anzahl derjenigen zu bestimmen und zu dokumentieren, die sich durch Aufnahme von Blut gesättigt haben, indem Sie auf einen mit Blut gefüllten Abdomen achten.
  4. Reinigen
    1. Schließen Sie alle Programme. Ejecten Sie die externe Festplatte und trennen Sie sie vom Computer. Schalten Sie den Computer aus.
    2. Reinigen Sie die Mückenbehälter, wie zuvor in Schritt 4.2.1 beschrieben. Reinigen Sie die Acryl-Blood-Meal-Halter. Füllen Sie eine halb große Polycarbonatschale zu zwei Dritteln mit Wasser und geben Sie dann 100 mL Bleichmittel hinzu.
    3. Fügen Sie Acryl-Blutmehlhalter und Plastikflaschen der Pfanne hinzu. Bedecken Sie sie mit einem Deckel und lassen Sie sie 10 Minuten einweichen. Spülen Sie die Bleiche ab und entfernen Sie die Parafolie. Bürsten Sie vorsichtig und spülen Sie, um eventuelle Blutreste zu entfernen.

5. Verhaltensanalyse

  1. Bereiten Sie die Videos zur Analyse vor, indem Sie sie mit ffmpeg (Version 8.0.1) in .mp4-Dateien komprimieren. Falls die Videodateien geteilt sind, fügen Sie sie mit einer beliebigen Videobearbeitungssoftware zu einem einzigen Video zusammen. Öffnen Sie die Trainingsvideos in SLEAP (Version 1.4.1) im Graustufenmodus.
    ​HINWEIS: Bei geeigneten Videoaufnahmeeinstellungen sollte alles im Bildrahmen liegen, und sich bewegende Mücken sollten nicht unscharf sein. Es können auch andere Softwarelösungen zur Verfolgung von Körperteilen verwendet werden. Die in dieser Arbeit verwendete SLEAP-Version ist 1.4.1. Weitere aktuelle Protokolle finden Sie in der SLEAP-Dokumentation.
  2. Erstellen Sie ein Skelett, das die relevanten Körperteile der Tiere entsprechend den zu bewertenden Verhaltensweisen kennzeichnet (Abbildung 2D, Abbildung 3D und Abbildung 4E).
  3. Wählen Sie mithilfe der Option „Zufallsbild“ unter dem Reiter Vorgeschlagenes Bild zufällig 10 Bilder aus und kennzeichnen Sie jede einzelne Mücke als Instanz. Falls bestimmte Körperteile verdeckt sind (z. B. die Proboscisspitze während des Probierens in das Netz eingeführt ist), kennzeichnen Sie die ungefähre Position des Körperteils. Trainieren Sie ein Modell mit den markierten Bildern unter Verwendung folgender Einstellungen:
    1. Für ein Top-Down-Mehrfachtiermodell (verwendet für den Opto-Thermocycler und die Blutdecke): Legen Sie im Reiter Trainingspipeline die Maximale Anzahl Instanzen auf 14 fest. Im Reiter „Centroid Model Configuration“ setzen Sie die Ausschnittsgröße auf Automatisch, Plateau Min. Delta auf 1e-04, Plateau Geduld auf 10, Stride auf 8 und den Ankerpunkt auf Thorax.
    2. Für ein Bottom-Up-Mehrfachtiermodell (verwendet für den Opto-Membranfütterer): Legen Sie im Reiter Trainingspipeline die Maximale Anzahl Instanzen auf Kein Maximum fest. Im Reiter „Bottom-Up Model Configuration“ setzen Sie die Ausschnittsgröße auf Automatisch, Plateau Min. Delta auf 1e-04, Plateau Geduld auf 10 und Stride auf 16.
  4. Erzeugen Sie Vorhersagen für eine festgelegte Anzahl von Bildern mit folgenden Einstellungen: Im Reiter „Inference Pipeline“ setzen Sie für den Opto-Thermocycler und die Blutdecke Maximale Anzahl Instanzen auf 14, Tracker auf Einfach, Maximale Anzahl Spuren auf 14 und Einzelspurunterbrechungen verbinden auf Wahr.
  5. Für den Opto-Membranfütterer setzen Sie Kein Maximum für Maximale Anzahl Instanzen und Maximale Anzahl Spuren, Tracker auf Einfach und Einzelspurunterbrechungen verbinden auf Wahr. Korrigieren Sie die vorhergesagten Bilder und trainieren Sie erneut. Wiederholen Sie die Zyklen aus Vorhersage, Markierung und Training anhand des Trainingsdatensatzes.
    HINWEIS: Die Validierung erfolgte durch zufällige Stichprobenkontrollen markierter Bilder und Identifizierung systematischer Fehler (z. B. falsche Mückenerkennungen, doppelte Vorhersagen, falsche Orientierung oder falsche Zuordnung von Körperteilen), wobei der Fokus auf Bildern mit solchen Randfällen lag. Abhängig von der Fehlerhäufigkeit können bis zu 150 markierte Bilder erforderlich sein. SLEAP bietet zusätzlich GUI-basierte Evaluierungsmetriken zur weiteren Modellvalidierung. Sobald die visuelle Inspektion ausreichende Genauigkeit und Präzision bestätigt, wenden Sie das Modell auf experimentelle Videos an und exportieren Sie die Ergebnisse als .csv- oder .h5-Datei zur Verhaltensanalyse. Anschließend können Verhaltensklassifizierer unter Verwendung der Pose-Estimation-Ergebnisse wie zuvor beschrieben8 trainiert werden. Die Verhaltensweisen sind wie folgt definiert: Gehen, translatorische Körperbewegung mit Beinbewegung; Fliegen, schnelle translatorische Bewegung mit ausgebreiteten Flügeln; Putzen, wiederholte Beinbewegungen über Körperteile (Antennen, Proboscis, Flügel oder Beine); und Probieren, Einführen der Proboscis durch das Netz am Boden des Behälters. Die Verhaltensklassifizierer sollten im Vergleich zu manuellen Annotationen eine Genauigkeit von >90 % erreichen.
  6. Führen Sie die statistische Analyse durch Auswahl nichtparametrischer Tests durch, da die Daten in der Regel nicht normalverteilt sind. Führen Sie geeignete post-hoc-Tests mit Korrektur für multiple Vergleiche durch. Bei Sättigungsdaten handelt es sich bei den experimentellen Wiederholungen um Gruppen von Mücken, während bei Verhaltensdaten die Wiederholungen einzelne Mücken sind.

Ergebnisse

Zur Beobachtung des Wirtssuch- und Blutmahlverhaltens von Mücken wurden drei Verhaltensassays verwendet, wie in Abbildung 1A gezeigt. Die Mücken wurden unter einem Hell-Dunkel-Zyklus mit blauem Licht (14:10 LD; Abbildung 1B) aufgezogen, um zirkadiane Rhythmen zu synchronisieren und Experimente während der Wachphasen durchführen zu können. Zwei Tage vor den Experimenten wurden die Mücken in völlige Dunkelheit verbracht und mit dem Opsin-Cofaktor ATR versorgt. Wenn die Mücken asynchron sind oder nicht mit ATR gefüttert wurden, zeigen sie eine geringe Aktivität in den Verhaltensassays. Die für jeden Assay verwendeten Genotypen waren Gr3>CsChrimson sowie zwei genetische Kontrollen: die Treiberlinie Gr3-QF2 und die Effektorlinie QUAS-CsChrimson.

Der Opto-Thermocycler-Assay (Abschnitt 2) ermöglicht die Beurteilung der Aktivierung und Stechverhaltens von Mücken über längere Zeiträume hinweg in Reaktion auf Wärme- und Lichtreize. Die Wärmezufuhr imitiert die Annäherung der Mücke an einen warmblütigen Wirt, während die 5-sekündige Lichtzufuhr einer langen Ausatmung von Atemluft entspricht.33Die Verwendung eines Thermocyclers ermöglicht eine schnelle Oberflächenheizung und -kühlung, die über ein Thermoelement und einen Mikrocontroller mit der optogenetischen Aktivierung synchronisiert ist.Abbildung 2A, B). Die drei Mücken-Genotypen wurden in Acrylplatten mit isolierten Vertiefungen mit maschigen Böden platziert, in denen sie Lauf-, Flug- und Stichverhalten zeigen (Abbildung 2C). Die Position der Körperteile der Mücke wurde mithilfe von Pose-Tracking-Algorithmen wie SLEAP erfasst.34  und DeepLabCUT35 (Abbildung 2D, E). Algorithmen zur Verhaltensklassifizierung können ausgehend von der Pose-Tracking (z. B. SimBA36, A-SOiD37) oder von Videos (z. B. FERAL) verwendet werden38) Eingabe. Abbildung 2E zeigt die SLEAP-Kennzeichnungen während Flug, Laufens und Probierens, wesentliche Verhaltensweisen zur Wirtssuche und Nahrungsaufnahme. Diese Verhaltensweisen können anhand der Geschwindigkeit des Thorax sowie der Distanz zwischen der Basis und der Spitze des Rüssels klassifiziert werden. Hier ist die Ausgabe der Verhaltensverfolgung mithilfe von APT und JAABA dargestellt39Mücken wurden entweder einer Erhöhung der Temperatur, einem Lichtreiz oder beiden Reizen (Temperatur und Licht) gleichzeitig ausgesetzt, gefolgt von einer Pause von 20 Minuten, bevor der nächste Reiz appliziert wurde.8. (Abbildung 2F). Bei Hitzeeinwirkung zeigen alle drei Genotypen eine kurze Phase des Probierens (Abbildung 2G). Wichtig ist, dass bei einer 5-Sekunden-Lichtstimulation die Gr3>CsChrimson Mücken geraten in Erregung oder „Aktivierung“ und zeigen ein erhöhtes Lauf- und Flugverhalten, das bis zu 10–15 Minuten anhält. Außerdem zeigen die Mücken Probierverhalten, definiert als wiederholtes Einführen des Saugrüssels in den maschigen Boden der Platten. Die Daten wurden als individuelles Mückenverhalten dargestellt (Abbildung 2G) und Anteil aller Mücken, die im Zeitverlauf jedes Verhalten zeigen (Abbildung 2H). Der Opto-Thermocycler ermöglicht wiederholte, präzise optogenetische und thermische Stimulationen an mehreren Individuen und ist damit ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung der Erregungszustände und zur Analyse des Verhaltens.

Der Blutdeckel-Assay (Abschnitt 3) baut auf dem Opto-Thermocycler-Assay auf, bietet jedoch eine schmackhafte künstliche Minimalblutmahlzeit, sodass die Fütterung von Mücken quantifiziert werden kann (Abbildung 3A). Ein 5-Sekunden-Impuls roten Lichts (~627 nm) wurde zur optogenetischen Aktivierung der CO2-sensorischen Neuronen angewendet, und die dünne Schicht der künstlichen Blutmahlzeit wurde von 25 °C auf ~35 °C erhitzt (gemessen an der Oberfläche mittels Thermoelement; Abbildung 3B). Die drei Genotypen erhielten jeweils eine künstliche Blutmahlzeit auf einer Aluminium-Fütterungsplatte (Abbildung 3C). Gr3-QF2-, QUAS-CsChrimson- und Gr3>CsChrimson-Mücken (n = 10 Versuche pro genetischer Gruppe, jeweils 14 Mücken) erhielten eine künstliche Blutmahlzeit auf einer Aluminium-Fütterungsplatte (Abbildung 3C). Um die Füllung der Mücken im Verlauf des Experiments zu messen, wurde SLEAP verwendet, um Punkte am Körper der Mücke zu verfolgen. Dies erfolgte durch Erstellung eines Skeletts mit 5 Knotenpunkten am Abdomen der Mücke (Abbildung 3D). Am Ende jedes Versuchs wurde die Anzahl der gesättigten Mücken manuell gezählt. Die Kontrolllinien Gr3-QF2 und QUAS-CsChrimson zeigten eine ähnliche durchschnittliche Füllungsrate (Abbildung 3E, p = 0.401). Im Gegensatz dazu zeigte die Gr3>CsChrimson-Linie signifikant höhere Fütterungsraten mit einer durchschnittlichen Füllungsrate von 53 % (Abbildung 3E, p = 0,00078 gegenüber Gr3-QF2 und p = 0,00097 gegenüber QUAS-CsChrimson). Die Daten wurden als Violinplots und Boxplots (Median, Interquartilsabstand und Spannweite) dargestellt und mittels Kruskal-Wallis-Test sowie Dunn-Test mit Holm-Korrektur bei einer Signifikanzschwelle von p < 0,05 analysiert. Die individuelle Füllung der Tiere über die Zeit wurde als Veränderung der von den 5 Knotenpunkten eingeschlossenen Bauchfläche bestimmt (Abbildung 3F). Diese Ergebnisse zeigen, dass der Blutdeckel-Assay verwendet werden kann, um die Auswirkungen der optogenetischen Aktivierung CO2-reaktiver neuronaler Populationen auf das Füllungsverhalten von Mücken bei einer künstlichen Blutmahlzeit zu untersuchen.

Der Opto-Membranfütterungs-Assay (Abschnitt 4), bei dem Mücken Zugang zu einer warmen Blutmahlzeit in einer zylindrischen Versuchsanordnung erhalten, ermöglicht die Untersuchung der Anziehung von Mücken an eine Blutquelle sowie deren Sättigung. Um zu bestimmen, ob die optogenetische Aktivierung von CO2-sensorischen Neuronen ausreicht, um eine Anziehung an die Blutquelle und Fütterung damit hervorzurufen, wurden Gr3>CsChrimson-Mücken und Kontrollmücken (n = 10 für jeden Genotyp, wobei n die Anzahl der durchgeführten Versuche angibt, mit jeweils 20 Mücken pro Behälter pro Versuch) in dem Opto-Membranfütterungsgerät Zugang zu einer warmen Blutmahlzeit erhalten, während sie über einen Zeitraum von 15 Minuten einer wiederholten, 1-sekündigen Pulsung mit hellem rotem Licht alle 10 Sekunden ausgesetzt waren (Abbildung 4B). Um die Anziehung an den Membranfütterer zu messen, wurde ein SLEAP-Modell mit drei Punkten verwendet, um Kopf, Thorax und Abdomen der gelandeten Mücken zu verfolgen und jene innerhalb des interessierenden Bereichs zu zählen (Abbildung 4D, Abbildung 4E). Gr3>CsChrimson-Mücken zeigten im Verlauf der Zeit eine erhöhte Anziehung zum Bereich der Blutmahlzeit im Vergleich zur Gr3-QF2-Kontrolle (Abbildung 4F, p = 0,027). Die Gr3>CsChrimson-Mücken zeigten jedoch keine statistisch signifikant höhere Anziehung als die QUAS-CsChrimson-Kontrolle (Abbildung 4F, p = 0,310). Die Signifikanzgruppen wurden mittels Kruskal-Wallis-Test bestimmt, gefolgt vom Dunn-Test mit Holm-Korrektur. Die Signifikanzschwelle wurde bei p < 0,05 festgelegt. Die Daten wurden als durchschnittlicher Prozentsatz der Mücken, die zur Blutmahlzeit angelockt wurden, dargestellt, wobei der schattierte Bereich den Standardfehler zeigt. Die Kontroll-Genotypen Gr3-QF2 und QUAS-CsChrimson zeigten eine ähnliche Sättigung mit 26 % bzw. 29 %, manuell bewertet wie beschrieben (Abbildung 4G, p = 0,351). Im Gegensatz dazu zeigten Gr3>CsChrimson-Mücken eine signifikant höhere Sättigungsrate als beide Kontrollen, im Durchschnitt 61 % (Abbildung 4G, p < 0,001 gegenüber Gr3-QF2 und p = 0,002 gegenüber QUAS-CsChrimson). Die Daten wurden als Violinplots und Boxplots (Median, Interquartilsabstand und Spannweite) dargestellt und mittels Kruskal-Wallis-Test sowie Dunn-Test mit Holm-Korrektur bei einer Signifikanzschwelle von p < 0,05 analysiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Opto-Membranfütterungs-Assay eine geeignete Methode darstellt, um die Auswirkungen der optogenetischen Aktivierung von CO2-Neuronen auf die Anziehung und Sättigung von Mücken an einer Blutmahlzeit zu untersuchen.

Diagramm zum Mückenverhalten; Methoden: Opto-Thermocycler, Blutdecke; Reize: Wärme, CO2.
Abbildung 1: Verhaltensassays und Zucht zur Optogenetik bei Mücken. (A) Schematische Darstellung der Wirtssuchverhalten von Mücken mit den Merkmalen der dargestellten Verhaltensassays. Die durch jeden Verhaltensassay gemessenen Schritte der Wirtssuche sind durch graue Balken gekennzeichnet. (B) Zeitplan der Zucht von Mücken für Optogenetik-Experimente. Abbildung 1 wurde von den Autoren für diese Veröffentlichung mit Adobe Illustrator erstellt; für die Nutzung ist keine Lizenz erforderlich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Mückenverhalten, Infrarot-Thermocycler, LED-Rotlichtaufbau, Graphanalyse, Stimulusantwort.
Abbildung 2: Der Opto-Thermocycler quantifiziert Aktivierungs- und Suchverhalten während der optogenetischen Aktivierung. (A) Schematische Darstellung des Opto-Thermocycler-Assays, bestehend aus einer Platte mit Mücken auf dem Block eines PCR-Thermocyclers mit darüber angeordneten LEDs und einer Kamera. (B) Schaltplan des Mikrocontrollers, der die Temperatur des Thermocyclers erfasst und die LEDs steuert. Der Schaltplan wurde mit Fritzing unter der Lizenz CC-BY-SA 3.0 erstellt (https://github.com/fritzing/fritzing-app/blob/develop/README.md). Diese Lizenz erlaubt auch die vollständige Wiederverwendung des Bildes, sofern die angemessene Anerkennung erfolgt. (C) Standbild aus dem Assay, das die Acrylplatte zeigt, die bis zu 14 Mücken aufnehmen kann. Das Thermoelement befindet sich im rechten unteren Brunnen. (D) Das Mückenskelett, das im SLEAP-Modell zur Pose-Schätzung verwendet wird. Die markierten Körperteile umfassen: die Spitze und Basis des Rüssels, die zur Detektion des Probierverhaltens dienen (rot dargestellt); die Vorderbeine, jeweils an der Verbindungsstelle mit dem Thorax, dort wo sich Femur und Tibia treffen, sowie dort, wo Tibia und Tarsus verbunden sind (blau dargestellt); und die Abdomenspitze (gelb dargestellt). Ein top-down Multi-Tier-Modell wurde verwendet. Pose-Estimator und Verhaltensklassifizierer wurden eingesetzt, um die Aktivierung und das Probierverhalten der Mücken zu quantifizieren. (E) Beispiele für das Verhalten von Mücken beim Laufen, Fliegen und Probieren, mit überlagerten SLEAP-Vorhersagen. Laufen und Fliegen werden als Verhaltensmetriken für die Aktivierung verwendet. (F) Ausgabe der Stimulusapplikation. Gelbe wellenförmige Linien zeigen Wärmereize auf Körpertemperaturniveau an, rote LEDs zeigen Rotlichtreize an. (G) Ethogramme des Lauf-, Flug- und Probierverhaltens von Gr3-QF2-, QUAS-CsChrimson- und Gr3>CsChrimson-Mücken (n = 22–23 einzelne Mücken pro Genotyp) nach der Stimulusapplikation. (H) Langanhaltendes Verhalten nach optogenetischer Aktivierung bei Gr3>CsChrimson-Mücken (n = 68–70 einzelne Mücken). Die Abbildungsteile A–E wurden von den Autoren für diese Publikation mit Adobe Illustrator erstellt; für die Nutzung ist keine Urheberrechtslizenz erforderlich. Die Daten in (F–H) sind aus Sorrells et al., 2022, mit CC BY 4.0-Lizenz8 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Aufbau des Mückenfütterungsexperiments, Diagramme zur Datenanalyse, Schema der künstlichen Blutmahlzeit, Temperaturdiagramm.
Abbildung 3: Der Blutdeckel-Assay quantifiziert die Füllung in Abhängigkeit von optogenetischer Aktivierung. (A) Schematische Darstellung des Blutdeckel-Assays. Die Mücke befindet sich in einem Acrylgehäuse, in dem künstliches Blut unter einem Maschendrahtgitter angeboten wird. (B) Aufzeichnung der Temperatur- und Rotlicht-Stimuli aus dem Assay. (C) Schematische Darstellung der Aluminium-Blutdeckel-Fütterungsplatte. (D) Das für die Pose-Erkennung verwendete SLEAP-Skelett enthielt zusätzlich zu den in Abbildung 2D beschriebenen Punkten vier Punkte an den Seiten des Abdomens, wo dieser mit dem Thorax verbunden ist, sowie an den Rändern des dicksten Teils des Abdomens. Die Füllung wurde als Fläche innerhalb der fünf Punkte entlang des Bauchumrisses anhand von Vorhersagen eines top-down Multi-Tier-Modells gemessen. (E) Violin-Plot, der den mittleren prozentualen Füllungsgrad der künstlichen Blutmahlzeit pro Genotyp darstellt (n = 10 Versuche mit jeweils 14 Mücken pro Genotyp). Die Signifikanz wurde mittels Kruskal-Wallis-Test bestimmt, gefolgt von einem Dunn-Test mit Holm-Korrektur. Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen eine Signifikanz von p < 0,05 zwischen den Gruppen, wobei Gruppen mit demselben Buchstaben sich nicht signifikant voneinander unterscheiden. (F) Füllung über die Zeit bei einem Gr3>CsChrimson-Tier, gemessen als Bauchfläche. Die rote Trendlinie zeigt ein 30-sekündiges gleitendes Fenster über acht Minuten des Versuchs, wobei x = 0 den Zeitpunkt markiert, zu dem die Füllung beginnt. Alle Schemata in Abbildung 3 wurden von den Autoren für diese Publikation mit Adobe Illustrator erstellt; für deren Nutzung war keine Urheberrechtslizenz erforderlich. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Aufbau der Mücken-Optogenetik; RGB-Lichtsteuerung; Arduino; Blutmahlzeit; Graph der Anflugquote; Ergebnisse.
Abbildung 4: Der Opto-Membranfütterungs-Assay misst Anflugverhalten und Blutmahlzeitaufnahme. (A) Schematische Darstellung des Opto-Membranfütterungsgeräts mit einzelnen Komponenten. (B) Zeitplan der Experimentdurchläufe. Die blaue Linie steht für schwaches blaues Licht während der gesamten Akklimatisierungs- und Versuchsphase. Ein Ausschnitt des experimentellen Stimulus ist dargestellt, der 1-Sekunden-Pulse roten Lichts zeigt, die im Abstand von 10 s auftreten. (C) Diagramm der Verkabelung des Opto-Membranfütterungsgeräts. Das Schaltbild wurde von den Autoren mit Fritzing unter CC-BY-Lizenz erstellt. (D) Beispielbild aus dem Video des Opto-Membranfütterungsversuchs. Mücken im roten Kreis werden gezählt, um die prozentuale Anflugquote zu bestimmen. (E) Beispiele für eine ungefüllte und eine vollgesogene Mücke, wobei Kopf, Thorax und Abdomen durch das SLEAP-Verfolgungsmodell für den Opto-Membranfütterungsversuch gekennzeichnet sind. Ein Bottom-up-Modell für mehrere Tiere in SLEAP wurde verwendet, um den Anflug in den interessierenden Bereich, in dem die Blutmahlzeit platziert ist, zu quantifizieren. (F) Liniendiagramm, das die durchschnittliche prozentuale Besetzung des Blutmahlzeitenbereichs (als Verhaltensparameter für das Landen) über die Zeit je Genotyp darstellt (n = 10 Durchläufe mit jeweils 20 Mücken pro Genotyp). Der Mittelwert wurde alle 30 s erfasst. Die schattierten Bereiche zeigen den Standardfehler an. Die statistische Signifikanz wurde mittels Kruskal-Wallis-Test bestimmt, gefolgt vom Dunn-Test mit Holm-Korrektur. Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen signifikant verschiedene Gruppen; die Signifikanzschwelle wurde bei p < 0,05 festgelegt. (G) Violin-Plot, der die durchschnittliche prozentuale Füllung nach einer Blutmahlzeit je Genotyp darstellt. In (F, G) wurde die Signifikanz mittels Kruskal-Wallis-Test, gefolgt vom Dunn-Test mit Holm-Korrektur, ermittelt. Genotypen mit demselben Buchstaben weisen keine signifikanten Unterschiede auf. Die Signifikanzschwelle liegt bei p < 0,05. Abbildung 4 wurde mit Adobe Illustrator erstellt, die zugrundeliegenden Daten wurden von den Autoren für diese Publikation erhoben, und für die Nutzung war keine Urheberrechtslizenz erforderlich. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

In dieser Arbeit werden detaillierte Protokolle zur Untersuchung der Wirksamkeit neuronaler Zelltypen bei der Steuerung von Schritten der Wirtsanlockung und des Blutsaugens beschrieben. Das Saugverhalten besteht aus einer Abfolge von Verhaltensschritten, beginnend mit der langreichweitigen Wahrnehmung, über die kurzreichweitige Anziehung, das Durchdringen der Haut bis hin zur Blutmahlzeit. Grundsätzlich könnten neuronale Zelltypen spezifische Aktionen oder Schritte steuern, das Verhalten in Richtung bestimmter Abfolgen beeinflussen, die Dauer des gesamten Verhaltens verlängern oder zahlreiche andere Funktionen übernehmen. Daher sind die hier vorgestellten mehrfachen Tests notwendig, um die neuronale Funktion in diesem Prozess aufzuschlüsseln.

Mehrere häufige Fehler können zu einer schlechten Reaktion der Mücken in diesen Assays führen. Geringe Aktivität und Fressverhalten können vermieden werden, indem die Experimente während der Aktivitätsphase der Mücken durchgeführt werden, also in der Nähe der Übergangszeiten zwischen Licht- und Dunkelzyklus in ihren Inkubationskammern. Geringe Fütterungsraten im Blutdeckel- und Opto-Membranfütterungssystem können auf eine minderwertige künstliche Blutmahlzeit oder eine falsche Temperatur zurückzuführen sein. Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien (NaHCO3, ATP, defibriniertes Schafsblut) nicht abgelaufen sind und ordnungsgemäß gelagert wurden. Es wird empfohlen, alle Lösungen am Tag des Experiments frisch herzustellen, um maximale Frische zu gewährleisten. Achten Sie darauf, dass die Blutdeckelplatte direkt die Oberfläche des PCR-Thermocycler-Blocks berührt. An den Platten des Opto-Thermocyclers und des Blutdeckels kann sich Kondenswasser ansammeln, wenn noch Restfeuchtigkeit vorhanden ist. Vor den Experimenten sollten die Platten auf Papiertücher gelegt werden, um Feuchtigkeit aufzunehmen. Wenn die optogenetische Reaktion schwach ausfällt, stellen Sie sicher, dass die Mücken mindestens eine Woche alt sind und ausreichend Zeit haben, ATR aufzunehmen, da es ein notwendiger chemischer Cofaktor für die CsChrimson-Kanäle ist.

Es wurden optogenetische Werkzeuge entwickelt, die gegenüber Wellenlängen von Blau (~450 nm) bis Rot (~650 nm) empfindlich sind und damit den sichtbaren Spektralbereich abdecken. Rotes Licht ist bei Insekten besonders nützlich, da diese typischerweise eine geringe Empfindlichkeit und/oder verhaltensbezogene Reaktionen auf diese Wellenlängen aufweisen40. Interessanterweise zeigen Mücken während des Flugs eine Anziehung zu visuellen Reizen mit langen Wellenlängen, wie sie in menschlichen Hauttönen vorkommen41. Daher könnte die Verwendung von rotem Licht eine Einschränkung darstellen, die die Interpretation der optogenetischen Aktivierung in Assays zur Wirtsanlockung von Mücken erschwert. Genetische Kontroll Mücken zeigten jedoch minimale Reaktionen auf breitflächig angewandtes rotes Licht, selbst bei hohen Intensitäten (Abbildungen 2–4). Es wird empfohlen, genetische Kontrollen ohne entweder den Treiber- oder den Effektor-Konstrukt sowie Kontrollen ohne Lichtanwendung einzusetzen, um sicherzustellen, dass verhaltensbezogene Effekte korrekt interpretiert werden. Eine Kontrolle ohne den Rhodopsin-Cofaktor ATR wird häufig in optogenetischen Experimenten an anderen Arten verwendet; jedoch enthält das Fischfutter, mit dem die Mückenlarven gefüttert werden, Vitamin A, den Vorläufer von ATR, weshalb diese Kontrolle in diesem System weniger wirksam ist.

Die hier vorgestellten optogenetischen Stimuli beschränken sich auf kontinuierliche Reize mit einstellbarer Lichtintensität. Optogenetische Stimuli, die natürliche neuronale Aktivitätsmuster genau nachahmen, führen am ehesten zum gewünschten Verhalten. Wenn neuronale Aufzeichnungen verfügbar sind, kann der Stimulus daher so gestaltet werden, dass er die beobachtete Intensität und zeitliche Dynamik widerspiegelt. Wenn dies nicht bekannt ist, kann die Funktion von Neuronen mithilfe unterschiedlicher Stimuli und Verhaltenskontexte untersucht werden, wobei jedoch zu beachten ist, dass die Ergebnisse möglicherweise nicht der Funktion der Neuronen im natürlichen Verhalten entsprechen. Dennoch kann die Aktivierung von Neuronen außerhalb des natürlichen Bereichs genutzt werden, um Schaltkreise oder Verhaltenseigenschaften auf einzigartige Weise zu untersuchen, ähnlich wie die Elektrophysiologie zur Erforschung zellulärer Eigenschaften eingesetzt wird. Bisher wurden optogenetische Werkzeuge bei der Mücke nur in sensorischen Neuronen eingesetzt, eine Anwendung, die gegenüber der Darbietung natürlicher Reize einige Vorteile bietet. Traditionelle Methoden zur Messung der Wirtssuche bei Mücken basieren auf der Applikation von echtem CO2-Gas. Die Verwendung von echtem CO2 erfordert eine Luftströmung, die gefiltert und befeuchtet wurde, was komplexe experimentelle Aufbauten notwendig macht, um das Gas präzise in kurzen Zeitintervallen zuzuführen und wieder zu entfernen9,10,42,43. Sowohl Luftströmung als auch Luftfeuchtigkeit sind Signale für die Anlockung und Navigation der Mücke, weshalb die optogenetische Stimulation als Methode attraktiv ist, um die Wirkung olfaktorischer Reize unabhängig von diesen anderen Reizen zu untersuchen. Optogenetische Werkzeuge wurden zudem bereits früher verwendet, um den Einfluss des Geschlechts und des physiologischen Zustands auf das Verhalten zu erforschen8, und haben dabei wertvolle Einblicke in diese wichtigen Fragestellungen der Mückenbiologie ermöglicht.

Abgesehen von der Optogenetik verwenden diese Protokolle Standardtests, die bereits zur Beurteilung des Mückenverhaltens eingesetzt wurden und mit gewissen Einschränkungen verbunden sind. Zur Vereinfachung der Reinigung verwendet die Blutdecke eine künstliche Mahlzeit, die nur die Geschmacksstoffe enthält, die Mücken zum vollständigen Blutmahl benötigen. Diese Einschränkung ließe sich durch die Verwendung von Blut (wie beim Opto-Membranfütterer) oder biomimetischen Materialien, die Aspekte des Wirtsgewebes nachbilden, überwinden. Die Wärmezufuhr im Opto-Thermocycler und in der Blutdecke erfolgt bei laufenden oder stehenden Mücken, nicht bei fliegenden Mücken, und ist durch die Aufheizgeschwindigkeit des PCR-Thermocyclers begrenzt. Daher können diese Tests Einstich- und Fressverhalten erfassen, jedoch keine Anlockung. Eine weitere Einschränkung laborbasierter Tests besteht darin, dass zur Untersuchung der Verhaltenswirkung spezifischer Reize andere Reize, die Mücken normalerweise nutzen, ausgeschlossen werden. Immer komplexere Labortests und halbfreie Versuchsanordnungen könnten entwickelt werden, um zusätzliche Aspekte der natürlichen Umgebungen zu untersuchen, in denen Mücken ihre Wirte anfliegen und sich von ihnen ernähren.

Eine weitere Einschränkung der Optogenetik bei Mücken besteht darin, dass bisher nur wenige Treiberlinien außerhalb der sensorischen Neuronen erstellt wurden. Daher wird ihr volles Potenzial erst dann ausgeschöpft sein, wenn sie mit Treibern kombiniert wird, die in Interneuronen exprimiert werden und die nicht direkt durch andere Methoden stimulierbar sind. Neu entstehende Ressourcen wie der Aedes aegypti Mosquito Cell Atlas eröffnen die Tür für Fortschritte in der Mückenneurogenetik44. Zukünftige Arbeiten werden erforderlich sein, um solche Treiber zur Untersuchung mückischer neuronaler Schaltkreise zu entwickeln. Ebenso werden zusätzliche optogenetische Werkzeuge zur Hemmung benötigt, um festzustellen, ob ein bestimmter Neuronentyp für ein spezifisches Verhalten notwendig ist. Obwohl die in dieser Arbeit vorgestellten Assays darauf ausgelegt sind, Wirtsanlockung und Blutmahlzeiten zu messen, könnten diese Ansätze auf weitere Schritte der Wirtssuche sowie auf Verhaltensweisen wie Paarung, Eiablage und Nektaraufnahme ausgedehnt werden. Optogenetische Studien werden neue Einblicke darin liefern, wie das Verhalten von Mücken auf Ebene der neuronalen Schaltkreise gesteuert wird, und könnten zu neuen Ansätzen führen, um die Ausbreitung von mückenübertragenen Krankheiten zu verhindern.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Kim Lezon-Geyda, Fernanda Medeiros Contini und Yaoyu Jiao für ihre Kommentare zum Manuskript. Diese Forschung wurde durch die NIH-Zuwendung DP2AI177891 finanziert. Wir danken dem Neurotechnology Core, finanziert durch das Yale Kavli Institute for Neuroscience, für technische Beratung. T.S. ist ein HHMI Freeman Hrabowski-Stipendiat.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1⁄8 Zoll schwarzes AcrylMcMaster-Carr8650K32Opto-Membranfütterer-Struktur
1⁄8-Zoll-klare AcrylglasMcMaster-Carr8536K134Opto-Membranfütterungsbehälter
¼ Zoll Schwarz AcrylMcMaster-Carr8560K259Opto-Membranfütterer-Struktur
NetzteilJameco ReliaPro2197581Opto-Membranfütterer-Struktur
AcrylkleberUnited States Plastic Corp 97562Opto-Membranfütterungsbehälter, Blutdeckelkäfig
Adenosin-5′-Triphosphat-Natriumsalz-HydratSigma AldrichA6419-1GKünstliche Blutmahlzeit
All-Trans-RetinolSpectrum ChemicalR3041-1GMOptogenetische Haltung
Aluminium-TestplatteThorlabsMB12Opto-Membranfütterer-Struktur
Aluminiumblech 0,03125 inMcMaster-Carr89015K11Blutdeckel-Fütterungsplatte
Aluminiumblech 0,0625 inMcMaster-Carr89015K37Blutdeckel-Fütterungsplatte
Animal Part Tracker (APT)Branson-Labor am HHMI Janelia FarmN/VVersion 3.0, Opto-Thermocycler reproduzierte Daten (Abbildung 2), heruntergeladen am 9. Juli 2020
Arduino IDEArduinoN/VVersion 1.8.12, verwendet zur Stimulussteuerung für Opto-Thermocycler, Blutdecke, && Opto-Membranfütterer
Arduino Uno Rev3 Mikrocontroller-BoardArduinoA000066 Programmierung des Opto-Membran-Futters
Schwarzer Fiberglas-FensterbildschirmDurchbruch Premium-Produkte IHLRS3684BLBlutdeckungs-Käfig
Schwarzes KlebebandThorlabsT137-2.0Opto-Thermocycler
Schwarze Kabelbinder Kabelbinder und mehrct242Opto-Membranfütterer-Struktur
VerdunkelungstuchShop einrichten6520SFOpto-Thermocycler und Blutdecke
Blaue LED-Leuchten21LEDUSARB5730BLWPZucht von Mücken
FlascheSKS-Flasche &und Verpackung0604-07Opto-Membran-Blutwärmer
Pellets für BodenfischeAPI5352983Larven füttern
KameraSimuliumU3-13S2M-CS, FLIVideoaufnahme für Assays
Klick-ZählerULineH-7350Larven ausdünnen
ComputerAsus X1407QDurchführung von Assays
Konzentriertes Bleichmittel (8,25 % Natriumhypochlorit)VWR89501-620Opto-Membranfördersystemreinigung
CoolTermRoger Meiers FreewareN/VVersion 2.0.1, verwendet für die Aufzeichnung über die serielle Schnittstelle für Opto-Thermocycler, Blutwarmer & Opto-Membranfütterer
Entfibrilliertes Schafsblut Hämostaselaboratorien DSB100Blutmahlzeit für opto-membranbasierten Fütterungsapparat
Kuppelförmige Sechskantschraube 4-40McMaster-Carr92949A105Blutübertragungs-Fütterungsplatte
EpoxidharzLoctite1363118Opto-Thermocycler-Acrylplatte, Opto-Membran-Zuführungsstruktur
EthanolDecon Labs2716Desinfektion
Externe FestplatteLaCieLAC9000298Video-Speicherung
ffmpegFFmpegN/VVersion 8.0.1, Vorverarbeitung von Videos
Vier-Zoll-BaumwolldochtRichmond Dental201226Erwachsene Mücken füttern
GitHubGitHub, Inc.N/VRepositorys für Code, Bauteildateien und SLEAP-Modelle für den Opto-Thermocycler (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0), Blood Blanket (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/bloodblanket/releases/tag/v1.0.0) und den Opto-Membran-Feeder (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0)
Gr3>CsChrimsonN/VN/VFür diese Studie erstellt, beschrieben in Schritt 1.2
Gr3-QF2-MückenN/VN/VGenetisches Reagenz, DOI: 10.1016/j.cell.2013.12.044
Brutschrank mit undurchsichtiger TürCaron7340-25Zucht von Mücken
Infrarot-LED-LichtAdafruit387Opto-Thermocycler und Blutdecke
Infrarot-LED-StreifenWellenform-Beleuchtung7031.85Opto-Thermocycler, Blutdecke und Opto-Membranstruktur
Infrarot-PassfilterEdmund Optics65-796Videoaufnahme für Assays 
InsektengehegeBugdormDP1000Adultmücken-Gehege
Janelia Automatic Animal Behavior Annotator (JAABA)Branson Labor am HHMI Janelia FarmN/VOpto-Thermocycler reproduzierte Daten (Abbildung 2); Version 0,5,0
Große SuppentasseWebstaurantStore50016SOUPPLAZucht von Mücken
LED-KühlkörperLuxeon StarN25-15BOpto-Thermocycler und Blutdecke
LED-LinseLuxeon Star10209Opto-Thermocycler und Blutdecke
LED-LinsenhalterLuxeon Star10235Opto-Thermocycler und Blutdecke
LED-LinsenbandLuxeon StarLT-01Opto-Thermocycler und Blutdecke
LED-LichtLuxeon StarSP-01-D9Rotes Lichtreiz für Opto-Thermocycler und Blutdecke
LED-ThermobandLuxeon StarLXT-S-12Opto-Thermocycler und Blutdecke
Optische AufbaurahmenThorlabsXE25L12, XE25L24, XE25L09, XE25T4, RA90, TRA6, TR12Opto-Thermocycler und Blutdeckel-Struktur
Optischer Posten ThorlabsTR12Opto-Membranfütterer-Struktur
PapiertücherPacific Blue27385Reinigung des Kanisters
ParafilmAmcorPM-996Blutdeckmembran, optische Membranmahlzeitbehälter
PCR-ThermocyclerEppendorf2231001196Opto-Thermocycler und Blutdecke
PlastikportionsschaleAuswahl999P2CErwachsene Mücken füttern
Plastikportionsschalen-DeckelAuswahl999PL2Erwachsene Mücken füttern
PolycarbonatwanneCambro21410CWCHCLAufzucht von Larven 
Halb große PolycarbonatschaleCambro24CW135 Opto-membranreinigung von Mahlungen
Polycarbonat-SchalenhalbdachCambro20CWCH135 Opto-membranreinigung von Mahlzeiten
Polycarbonat-Deckel für PfanneCambro10CWCH135Aufzucht von Larven
Polycarbonat-RöhrchenMcMaster-Carr8585K56Opto-Membranfutterbehälter 
LeistungsmesserKohärent1299161Alle Assays
QUAS-CsChrimson-MückenN/VN/VGenetisches Reagenz, DOI: 10.7554/eLife.76663
RGB-LeuchtenDigikey 289-1189-NDOpto-membranfütterungs-Stimulusapplikation
Rechtwinkliges KlemmstückThorlabsRA90Opto-Membranfütterer-Struktur
Scotch Magic Tape3M104Opto-Thermocycler und Acryldeckel für Blutdecke
Silikon-Dichtung, 0,5 mmMcMaster-Carr1460N22Blutüberzug-Fütterungsplatte
SLEAPTalmo LabN/VVersion 1.4.1a2, Positionsverfolgung von Mücken in jedem der Assays
Natriumbicarbonat, 1 M Pufferlösung, pH 8,0Thermo ScientificJ62495.APKünstliche Blutmahlzeit
NatriumchloridlösungSigma-AldrichS5150-1L 100 3532552Künstliche Blutmahlzeit
SpinViewTeledyne Vision SolutionsN/VVersion 1.27.0.48, Videoaufnahmesoftware für alle drei Assays
SprühflascheUlineS-11686Desinfektion
SaccharoseSigma AldrichS0389-500GErwachsene Mücken füttern
Thermoelement (Typ T)Harold G Schaevitz Industries LLCCPTC-120-X-NOpto-Thermocycler und Blutdecke
ThermoelementverstärkerAdafruitMAX31856Opto-Thermocycler und Blutdecke
TimerEnduraLightRAC-MTLichtzyklussteuerung für die Zucht von Mücken
Transferpipette Thermo ScientificSAM-225Larven ausdünnen
MüllbeutelUlineS-23040Insektenbeförderung
UV-beständiges NetzMcMaster-Carr 87655K13Opto-Membranfutterbehälter
WasserSigma AldrichW4502-1LKünstliche Blutmahlzeit für Blutdecke
WachsfadenMcMaster-Carr6356K91Opto-Membran-Behälterdeckel
DrahtgeflechtMcMaster-Carr9322T65Opto-Membranfütterer-Struktur

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