Zytometrische Quantifizierung von Gewebefaktor-positiven Blutplättchen im Gesamtblutfluss: Ein harmonisierter multizentrischer Arbeitsablauf

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir einen harmonisierten Arbeitsablauf für die Quantifizierung von Gewebefaktor-positiven Blutplättchen in multizentrischen Studien. Das Protokoll beschreibt standardisierte Verfahren für die Blutentnahme, Ganzblutfixierung, Färbung und Instrumentharmonisierung, sodass die Analyse je nach Laborkapazität entweder lokal oder zentral durchgeführt werden kann.

Zusammenfassung

Tissue Factor (TF)pos-Thrombozyten stellen eine Teilmenge der Thrombozytenpopulation dar. In jüngerer Zeit wurde gezeigt, dass diese Teilgruppe die kardiovaskuläre Sterblichkeit bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit vorhersagt und sie als Biomarker für die thrombotische Risikostratifizierung etabliert. Eine genaue Quantifizierung von TF-Pos-Blutplättchen mittels Durchflusszytometrie erfordert eine strenge Standardisierung der präanalytischen Handhabung, der Färbungsverfahren und der Instrumenteneinstellungen, insbesondere in multizentrischen Studien, bei denen technische Variabilität deren Messung beeinflussen kann. Dieses Protokoll beschreibt einen harmonisierten Arbeitsablauf für die Vollblutzytometriebewertung zirkulierender TF-Pos-Thrombozyten, der darauf ausgelegt ist, die Reproduzierbarkeit über Labore mit unterschiedlichen technischen Infrastrukturen hinweg zu gewährleisten. Das Verfahren umfasst eine standardisierte Blutentnahme und Vollblutfixierung, um den in vivo phänozytenartigen Phänotyp zu erhalten. Je nach lokalen Laborkapazitäten werden zwei verschiedene Methoden zur Probenvorbereitung bereitgestellt: der Versand von festen Proben an das Core Laboratory zur zentralen Färbung, Erfassung und Analyse für Zentren ohne Durchflusszytometrieeinrichtungen oder lokale Färbung und Aufnahme für Zentren mit Durchflusszytometrieinstrumenten und geschultem Personal. Die Bewertung des Prozentsatzes an TF-Pos-Thrombozyten erfolgt durch direkte Markierung mit Anti-TF Star Fluor 488 und Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 Antikörpern, um das Zielprotein bzw. den Thrombozytenpopulationsmarker zu identifizieren. Die Harmonisierung des Durchflusszytometers erfolgt entweder durch eine gemeinsame Erfassungsvorlage für identische Zytometermodelle oder durch perlenbasierte Ausrichtung für verschiedene Plattformen. Der Workflow integriert zudem einen standardisierten Gating-Ansatz und eine zentrale Datenanalyse, um einen zuverlässigen Vergleich der TF-Pos-Thrombolet-Messungen über Standorte hinweg zu ermöglichen. Repräsentative Ergebnisse zeigten, dass dieser Workflow eine reproduzierbare Quantifizierung von TF-Pos-Thromletten über die validierten Multicenter-Erfassungssettings hinweg unterstützt. Dieses Protokoll könnte eine breitere Anwendung der TF-Pos-Thrombozyten-Bewertung in der thrombotischen Risikostratifizierung erleichtern und eine breitere Standardisierung der Thrombotenflusszytometrie in translationaler und klinischer Forschung unterstützen.

Einleitung

Der Tissue Factor (TF) ist der Hauptinitiator der Blutgerinnungskaskade und ein entscheidender Faktor für die Thrombinbildung. Neben seiner klassischen Expression durch subendotheliale Zellen und Leukozyten ist TF auch mit zirkulierenden Thrombozyten 1,2,3,4,5 assoziiert. Während der Thrombopoese übertragen Megakaryozyten TF auf eine Teilmenge der Thrombozyten⁶. Unter physiologischen Bedingungen enthalten etwa 20–30 % der zirkulierenden Thrombozyten TF, die im offenen kanalikulären System gespeichert sind, räumlich getrennt vom Plasmafaktor VII⁷. In diesem kompartimentierten Zustand ist TF funktional vor zirkulierenden Gerinnungsfaktoren abgeschirmt und bleibt inaktiv. Dementsprechend zeigt nur ein kleiner Bruchteil der Thrombozyten nachweisbare Oberflächen-TF, wenn Vollblut gesunder Personen mittels Durchflusszytometrie analysiert wird, was die physiologische Homöostase ^2,8 widerspiegelt. Pathologische Erkrankungen, die durch Thrombozytenaktivierung und thromboentzündliches Ungleichgewicht gekennzeichnet sind, können dieses Gleichgewicht stören und zu einer erhöhten Oberflächenexposition der TF führen. Erhöhte Anteile von TF-positiven (TF^pos) Thrombozyten wurden bei mehreren thrombotischen Erkrankungen berichtet^{: 9,10,11,12,13,14,15}. Bemerkenswert ist, dass bei koronarer Herzkrankheit TF-Pos-Thrombozyten-Spiegel von über 4 % unabhängig die kardiovaskuläre Sterblichkeit nach 5-jähriger Nachbeobachtung vorhersagen und so den Prozentsatz der TF-pos-Thrombozyten als klinisch relevanten Biomarker für thrombotisches^{Risiko 16} feststellen.

Eine genaue und reproduzierbare Quantifizierung von TF-Pos-Thrombozyten ist daher sowohl für translationale als auch klinische Forschungsanwendungen unerlässlich. Ein zuvor veröffentlichter Thrombozytometrie-Workflow zur TF-Pos-Thrombozytometrie-Bewertung hat die Untersuchung dieses Proteins in Ein-Zentrum-Umgebungen verbessert¹⁷ und gibt Ratschläge zur Optimierung ausgewählter präanalytischer oder analytischer Schritte. Dieser Ansatz war jedoch nicht speziell darauf ausgelegt, die zusätzlichen logistischen und analytischen Herausforderungen von Multicenter-Studien zu adressieren, einschließlich Versandverfahren, standardisierter Probenverarbeitung und der Notwendigkeit, die Probenentnahme zwischen verschiedenen Durchflusszytometerplattformen zu harmonisieren. Darüber hinaus müssen auch die unterschiedlichen Infrastrukturen und technischen Kompetenzniveaus der teilnehmenden Zentren berücksichtigt werden.

In diesem Zusammenhang liegt der Mehrwert des derzeitigen Protokolls in der Bereitstellung eines detaillierten Arbeitsablaufs, der standardisierte Blutentnahme und Vollblutfixierung, flexible Probenverarbeitungsprotokolle, plattformübergreifende Harmonisierung der Erfassung sowie direkte Färbung und zentralisierte Qualitätskontrolle durch Datenanalyse kombiniert.

Ziel dieser Arbeit ist es daher, einen operativen Rahmen für eine harmonisierte multizentrische Umsetzung der TF-Pos-Thrombozyten-Analyse im Vollblut mittels Durchflusszytometrie bereitzustellen. Dieses integrierte Design reduziert die präanalytische, analytische und interinstrumentale Variabilität und schafft damit die Grundlage für die konsistente Bewertung von TF-Pos-Thrombozyten in multizentrischen Umgebungen.

Protokoll

Alle Blutspender gaben eine schriftliche informierte Einwilligung ab, die vom Ethischen Ausschuss der Institution genehmigt wurde (Nr. 70/24, CE 18.06.24).

Der multizentrische Workflow zur Quantifizierung der Vollblutflusszytometrie von TF-Pos-Thrombozyten ist in Abbildung 1 zusammengefasst. Das unten beschriebene Protokoll führt den Nutzer durch fünf Hauptschritte.

Abbildung 1: Multicenter-Workflow für TF-Pos-Thrombozyten-Analyse. Schematische Darstellung der analytischen Pipeline zur multizentrischen Bewertung zirkulierender^{TF-Pothlättchen} mittels Vollblutflusszytometrie. Nach der Aufnahme und Blutentnahme werden die Proben entsprechend den technischen Ressourcen jeder klinischen Einheit fixiert und verarbeitet. Zentren ohne Durchflusszytometrie-Einrichtungen liefern feste Proben an das Core Laboratory zur Färbung, Entnahme und Analyse. Zentren, die mit Durchflusszytometern ausgestattet sind, können vor Ort Färbungen und Aufnahmen mit standardisierten Aufnahmevorlagen durchführen. Die Instrumentenharmonisierung erfolgt entweder durch gemeinsame Vorlagen (dasselbe Instrumentmodell), Vorlagen, die im Kernlabor erstellt wurden (anderes Modell zur Ausrichtung verfügbar), oder durch Kalibrierung mit fluoreszierenden Perlen, wenn eine direkte Harmonisierung der Vorlagen nicht möglich ist. Die Datenanalyse erfolgt zentral unter Verwendung eines standardisierten Gating-Workflows. Das Diagramm wurde mit ChatGPT (OpenAI) erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

1. Blutentnahme

HINWEIS: Die TF-Pos-Thrompets-Bewertung erfordert maximal 50 μL Vollblut.

1. Entnehmen Sie peripheres venöses Blut aus der antecubitalen Vene mit einer 19-Gauge-Schmetterlingsnadel. Tragen Sie das Tourniquet nur für die Venenpunktion auf und lassen Sie es unmittelbar nach dem Einsetzen der Nadel los, um die Aktivierung der Thrombozyten ex vivo zu minimieren.
2. Entsorge die erste EDTA-Röhre. Dann sammeln Sie das Blut in einen 0,129 M natriumcitrathaltigen Vakuumbehälter, der den Schlauch nach Herstellerangabe füllt, um das korrekte Blut-zu-Antikoagulanten-Verhältnis zu erhalten.
3. Fünfmal vorsichtig umdrehen, um Blut und Antikoagulans gründlich zu mischen.
4. Halten Sie das Rohr bei Zimmertemperatur aufrecht und vermeiden Sie so Rührung, Kühlung oder pneumatischen Transport.
5. Verarbeiten Sie die Probe innerhalb von 3 Stunden nach der Entnahme.

2. Probenvorbereitung

HINWEIS: Alle Antikörper müssen vom Core Laboratory gekauft werden und aus derselben Charge stammen. Wenn während der laufenden Studie ein Batchwechsel notwendig wird, sollte die neue Reagenziencharge durch parallele Tests unter denselben Prüfbedingungen direkt mit der in Gebrauch befindlichen Charge verbunden und nur dann übernommen werden, wenn eine vergleichbare Leistung bestätigt wird. Häufig verwendete Reagenzien (z. B. PBS – phosphatgepufferte Kochsalzlösung – und PFA – Paraformaldehyd) können von jedem teilnehmenden Zentrum gekauft werden; die Produktcodes müssen jedoch mit denen des Core Laboratory übereinstimmen, und die Chargenkonsistenz muss während der gesamten Studie aufrechterhalten werden.

1. Repariere die Probe.
   HINWEIS: Vor Beginn der Blutaufnahme bereiten Sie 1 % PFA vor, indem Sie 4 % PFA mit PBS bei Raumtemperatur verdünnen.
   VORSICHT: PFA ist giftig und sollte mit einer chemischen Kapuze behandelt werden, während geeignete persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel, Handschuhe und Augenschutz) getragen wird. Vermeiden Sie Einatmen und Kontakt mit Haut oder Augen. ABFALLENTSORGUNG: Sammeln Sie alle PFA-haltigen Lösungen, festen Proben und kontaminierten Verbrauchsmaterialien gemäß institutionellen und lokalen Vorschriften in ordnungsgemäß beschriftete, geschlossene Behälter für gefährliche Abfälle.
   1. Wenden Sie den Vakuumbehälter vorsichtig fünfmal um, um Blut und Antikoagulans zu mischen.
   2. Transferiere 50 μL Blut in ein 2-mL-Röhrchen mit 950 μL 1% PFA.
   3. Die Probe vorsichtig verrühren und 1 Stunde und 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.
   4. Fügen Sie 500 μL PBS hinzu.
   5. Zentrifugiere bei 1500 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
   6. Entfernen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Pellet in 1 ml PBS wieder.
      HINWEIS: Technischer Kontrollpunkt: Nach der Zentrifugation sollten Sie sicherstellen, dass das Pellet sichtbar ist, bevor Sie das Überlagerungsmittel entfernen. Entferne vorsichtig das Überdachungsmittel, ohne das Pellet zu stören. Nach der Resuspension wird versichert, dass die Probe homogen und frei von sichtbaren Klumpen oder Aggregaten ist.
   7. Senden Sie die feste Probe in temperaturkontrollierter Verpackung, die innerhalb von 24 Stunden nach der Fixierung bei 2–8 °C gehalten wird, zum Core Laboratory. Nicht einfrieren. Dokumentensammlungszeit, Fixierungszeit und Versandzeit.
2. Probenkennzeichnung für die Durchflusszytometrie-Analyse.
   HINWEIS: Anti-TF Star Fluor 488 (Klon HTF1; Anti-CD142) richtet sich gegen den Tissue Factor, während Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 das Thrombozytenintegrin alphaIIb erkennt. Vor Beginn des Färbeverfahrens zentrifugieren Sie Antikörper bei 17.000 x g für 5 Minuten bei +4 °C, um etwaige¹⁸ Aggregate zu entfernen. Verdünnen Sie den Anti-TF Star Fluor 488 Antikörper (1:100) mit PBS. Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 benötigt keine Zwischenverdünnung und sollte in der vom Hersteller empfohlenen Menge verwendet werden.
   1. Bereite vier 2-ml-Polypropylenröhren vor.
   2. Geben Sie in jedem Röhrchen 80 μL feste Probe ab.
   3. Fügen Sie jeder Tube das korrekte Volumen PBS und Anti-TF Star Fluor 488 Antikörper hinzu, wie in Tabelle 1  (Tag 1) angegeben.
   4. Mische die Proben vorsichtig.
   5. Inkubiere O/N bei 4 °C im Dunkeln.
   6. Am folgenden Tag (Tag 2) geben Sie Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 in die Röhrchen 3 und 4 wie in Tabelle 1 angegeben.
   7. Mische die Proben vorsichtig.
   8. Inkubiere 15 Minuten bei Zimmertemperatur im Dunkeln.
   9. Verdünnen Sie jede Röhre mit 300 μL PBS.
   10. Lagere gefärbte Proben im Dunkeln bis zur Aufnahme der Durchflusszytometrie.
       HINWEIS: Proben können bis zu drei Tage bei 4 °C^gelagert werden. Längere Speicherkapazitäten führen zu fortschreitendem Signalabfall und sollten vermieden werden.

		Tag 1		Tag 2
Nein.	Röhren-ID	1X PBS (μL)	Anti-TF Stern Fluor 488 (μL)	Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 (μL)
1	Unbefleckt	20	0	0
2	TF	12.5	7.5	0
3	CD41	15	0	5
4	TF/CD41	7.5	7.5	5

Tabelle 1: Färbungsprotokoll für die Bewertung von TF pos-thrombozyten.

3. Standardisierung der Erwerbung des Durchflusszytometers

1. Erstellung einer Erwerbsvorlage (durch das Core Laboratory).
   1. Vorlage für Durchflusszytometer A eingerichtet.
      1. Öffne die Software A v2.6.
      2. Erstellen Sie ein FSC-A/SSC-A-Punktdiagramm [Alle Ereignisse] im logitaritmischen Maßstab, um Zellpopulationen zu visualisieren (Abbildung 2A).
      3. Erstellen Sie ein CD41 PerCP-Cy5.5-A/SSC-A Punktdiagramm [Alle Ereignisse] in logitaritchem Maßstab, um Blutplättchen innerhalb eines [Thromlets]-Tores zu identifizieren (Abbildung 2B).
      4. Erstellen Sie einen PerCP-Cy5.5-A/Star Fluor 488-A Pseudocolor-Plot [Alle Ereignisse], um auf Überlauf/Kompensation zu prüfen (Abbildung 2C).
      5. Erstellen Sie ein FSC-A/FSC-H-Punktdiagramm im [Platelets]-Gate und definieren Sie eine Region zur Identifikation der Singlets ([Singlets]; Abbildung 2D).
      6. Erstellen Sie ein CD41 PerCP-Cy5.5-A/TF Star Fluor 488-A Dot-Plot im [Singlets]-Gate, um TF-Pos-Thromlets zu identifizieren (Abbildung 2E).
      7. Stelle die Schwelle auf 1000 auf SSC-H.
      8. Stelle die Durchflussrate auf "Langsam".
      9. Stellen Sie die B525-Verstärkung auf 315 ein, um eine optimale Unterscheidung zwischen positiven und negativen Ereignissen sicherzustellen; Anpassen Sie bei Bedarf je nach verwendetem Instrument.
      10. Stellen Sie den B690-Gewinn nach der täglichen Qualitätskontrolle ein. Die Aufnahme ist nur akzeptabel, wenn die CD41-Posplättchenpopulation vollständig vom negativen Hintergrund entfernt ist und während der Aufnahme innerhalb des vordefinierten Referenzgattes in der Vorlage verbleibt.
      11. Exportiere die Vorlage mit der "Experiment export-Vorlage".
      12. Herunterladen: Die Aufnahmevorlage für die TF-Pos-Thrombozyten-Analyse auf dem Flow Cytometer A steht als Ergänzungsdatei 1 und ergänzende Abbildung 1 zum Download bereit.
          HINWEIS: Ein Diagramm zur Überprüfung von Überlauf/Kompensation (Abbildung 2C), das für diese multiparametrische Analyse nicht erforderlich ist, ist enthalten. Dennoch sollte geprüft werden, ob eine Kombination von Fluorochromen, die von den in diesem Protokoll vorgeschlagenen abweicht, verwendet wird.
   2. Erstellen Sie eine Vorlage für Flow Cytometer B.
      1. Erstellen Sie eine Protokolldatei, die das gesamte Erfassungs-Setup gemäß 3.1.1 enthält.
      2. Exportiere die Vorlage mit der Funktion "Export Protocol" in Software B v1.6 und generiere eine Protokolldatei.
      3. Auf dem empfangenden Instrument importieren Sie die Protokolldatei über die Funktion "Protokoll importieren" innerhalb der Software.
   3. Vorlagenerstellung für Flow Cytometer C.
      1. Erstellen Sie eine Workspace-Datei, die das gesamte Acquisition-Setup wie in 3.1.1 beschrieben enthält. und exportiert es.
      2. Importiere auf dem empfangenden Instrument die Arbeitsbereichsdatei mit der Funktion "Kopieren" der Software C v3.1.
2. Harmonisierung von Flusszytometern mit Kalibrierungsperlen.
   HINWEIS: Verwenden Sie 6-Peak-Rainbow-Kalibrierungsperlen.
   1. Zielwert-Definition.
      HINWEIS: Verwenden Sie folgende Formel, um die mediane Fluoreszenzintensität (MdFI) des ersten Peaks im B525-Fluoreszenzkanal zu definieren:
      MdFI_CU =
      wobei CU: Clinical Unit Instruments und RI: Reference Instrument.
   2. Probenvorbereitung.
      1. Vortex das Perlenfläschchen.
      2. Gib 5 Tropfen Perlen in ein Probenglas.
      3. Fügen Sie 1 ml PBS hinzu.
      4. Vortex für 5-10 Sekunden.
   3. Perlenbesitz.
      1. Erstellen Sie ein FSC-A/SSC-A-Punktdiagramm im Logmaßstab, das [Alle Ereignisse] darstellt, und definieren Sie einen Bereich namens [Beads] (Abbildung 3A).
      2. Erstellen Sie ein FSC-A/FSC-H-Punktdiagramm im [Beads]-Gate und definieren Sie einen Bereich zur Identifikation der Singlets [Singlet] (Abbildung 3B).
      3. Erstellen Sie ein Histogrammdiagramm für den Star Fluor 488 Fluor-Fluor-Fluor-Kanal (B525).
      4. Zeigen Sie nur [Singlet]  auf dem Histogramm an.
      5. Zeichne ein Gatter über die gesamte Breite des ersten Gipfels (Bereich B in Abbildung 3C).
      6. Im Statistik-Ribbon werden X Median (X-Med) Werte angezeigt.
      7. Entfernen Sie alle bestehenden Entschädigungen.
      8. Stelle die Durchflussrate auf "Langsam".
      9. Starte die Erwerbung im "Lauf"-Modus.
      10. Aus der "Erfassungseinstellung" modifizieren Sie die B525-Spannung/-Verstärkung, um das X-Med-Ziel entsprechend dem Zielwert zu erreichen.
      11. Erfassen Sie eine Datendatei mit 10.000 Ereignissen erst im [Singlet]-Gate, nachdem dieses Akzeptanzkriterium erreicht ist. Nehmen Sie keine Studienproben, bevor der Zielbereich erreicht ist.

Ergänzende Akte 1: Erwerbsvorlage für TF-Pos-Thrombozyten-Analyse auf dem Flow Cytometer A zum Download verfügbar. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Screenshot der Erfassungsvorlage für die TF-Pos-Thrombozytenanalyse auf dem Flusszytometer A. (A) Das FSC-A vs. SSC-A Punktdiagramm bietet eine visuelle Darstellung der Gesamtverteilung der Ereignisse. (B) Thrombozyten werden in einem CD41- vs. SSC-A-Diagramm identifiziert und als [Thrombozyten] abgetrennt. (C) Ein PerCP-Cy5.5 vs. Star Fluor 488-Plot wird einbezogen, um potenzielle Überlagerungen zu bewerten. (D) Doublets werden innerhalb des [Platelets]-Gates mit einem FSC-A vs. FSC-H-Plot ausgeschlossen, wodurch die [Singlets]-Population definiert wird. (E) TF-Pos-Thrombozyten werden innerhalb des [Singlets]-Gates basierend auf PerCP-Cy5.5 und Star Fluor 488 Fluorfluoreszenz identifiziert. (F-H) Die Erfassungseinstellungen, einschließlich Probenflussrate (Langsam), primärer Schwellenwert (SSC) und Detektorverstärkungen (B525 und B690), wie sie in der Vorlage implementiert sind, werden dargestellt. Vollständige Details zur Erwerbungseinrichtung und zum Workflow finden Sie in Abschnitt 3.1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung 2: Erwerbsvorlage und Gating-Strategie zur Identifikation von TF-Pos-Thromlets. (A) FSC-A/SSC-A Punktdiagramm (logaritmische Skala), das alle erkannten Ereignisse zeigt. (B) CD41-A/SSC-A Punktdiagramm zur Bestimmung der Thrombozytenpopulation. (C) PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 Pseudofarb-Diagramm, verwendet zur Bewertung von spektralem Überlauf und Kompensationsanforderungen. (D) FSC-A/FSC-H-Plot im [Platelets]-Gatter, das verwendet wird, um Doublets auszuschließen und Singlets zu definieren. (E) PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 Punktdiagramm in [Singlets], verwendet zur Identifizierung von TF-Pos-Thromlets. Die in Klammern angezeigten Statistikfelder werden automatisch mit stichprobenspezifischen Werten gefüllt, wenn die Vorlage während der Stichprobenerfassung angewendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Perlenbasiertes Kalibrierungsverfahren für Instrumente. (A) FSC-A/SSC-A Diagramm zur Identifizierung von Perlenereignissen. (B) FSC-A/FSC-H-Diagramme innerhalb von Perlenereignissen, die zum Ausschließen von Aggregaten und zur Definition von Singlets verwendet werden. (C) Histogramm der Fluorfluor-488-Fluoreszenz, das Perlenspitzen mit Gating auf den ersten Perlenspitzen zur Bestimmung der medianen Fluoreszenzintensität zeigt. Die visualisierten Statistiken sind als repräsentativ zu betrachten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

4. Aufnahme von Durchflusszytometrieproben für TF-Pos-Thrombozyten-Analyse

1. Erwerben Sie eine FCM-Vorlage.
   1. Importiere die Erwerbsvorlage mit der Funktion "Vorlage importieren" innerhalb von Software A.
   2. Erhalte die in Schritt 2 vorbereiteten Proben.
   3. Überprüfen Sie vor der Datenaufzeichnung, dass die Thrombozyten- und Singlet-Gatter mit der Geometrie des Referenzdiagramms übereinstimmen. Passe die Tore bei Bedarf an.
   4. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung nach 5–10 Sekunden stabilem Durchfluss. Zeichnen Sie eine Datendatei mit 20.000 Ereignissen innerhalb des [Singlets] -Gates  auf (siehe Abbildung 2D). Speichere unbezahlte .fcs-Dateien und leite sie an das Core Laboratory weiter.
2. Übernahme ohne FCM-Vorlage.
   1. Erstellen Sie ein Erwerbs-Arbeitsblatt wie in Abschnitt 3.1 beschrieben, einschließlich der beschriebenen fünf Diagramme und der Gate-Hierarchie: Alle Ereignisse > Thrombozyten > Singuletten > TF/CD41-Quadranten.
   2. Stelle die Schwelle auf 1000 auf SSC-H.
   3. Stelle die Durchflussrate auf "Langsam".
   4. Setze B525 Spannung/Verstärkung wie in 3.2.3 definiert.
   5. Erwerben Sie die in Schritt 2 vorbereitete Probe. Beginnen Sie mit der Aufnahme nach 5–10 Sekunden stabiler Strömung; erhalte 20.000 Events innerhalb des [Singlets]-Tors. Speichern Sie unbezahlte .fcs-Dateien und leiten Sie sie an das Core Laboratory weiter.
      HINWEIS: Der Erwerb ist nur akzeptiert, wenn das tägliche QC-Instrument verabschiedet wird. Wenn das Ziel von 20.000 CD41^pos– Thrombozyten nicht erreicht werden kann, sollten mindestens 10.000 CD41 pos-Thrombozytenereignisse erreicht werden.

5. Datenanalyse

HINWEIS: Der unten beschriebene Analyse-Workflow soll die Aktivitäten des Kernlabors unterstützen, das für zentralisierte Datenverarbeitung und Qualitätskontrolle verantwortlich ist.

1. Öffne ein neues Analyse-Arbeitsblatt und lade die .fcs-Dateien.
2. Für jede Probe erstellen Sie eine Analysevorlage, wie in Abbildung 2 gezeigt. Für nicht-identische Plattformen verwenden Sie eine entsprechende plattformspezifische Vorlage mit derselben Gate-Struktur und denselben statistischen Ausgaben.
3. Überprüfen Sie, dass das Gating die Thrombozytenpopulation gemäß den vordefinierten Streueigenschaften und der Singlet-Diskriminierungsstrategie korrekt identifiziert (Abbildung 4A, B, D).
4. Überprüfen Sie auf Überlauf/Kompensation mittels eines Pseudocolor-Diagramms [Alle Ereignisse] (Abbildung 4C).
   HINWEIS: Der Fluorochrom-Star Fluor 488 hat eine spektrale Emission bei 520 nm, verglichen mit PerCP-Cy5.5, das eine spektrale Emission bei 676 nm aufweist, was das Fehlen von Überlappungen und die Notwendigkeit fehlender Kompensation erklärt.
5. Wenden Sie folgende Gatoring-Sequenz im Star Fluor 488-Punktdiagramm an (Abbildung 5):
   1. Ungefärbt: Quadranten mit der ungefärbten Kontrolle definieren, sodass Hintergrund-TF-Pos-Events bei 0,01 % der Thrombozytenereignisse bleiben oder darunter bleiben, wobei die Autofluoreszenz der Thrombozyten ausgeschlossen wird (Abbildung 5A).
   2. TF: Verwenden Sie die in der ungefärbten Probe definierten Quadrantenkoordinaten, um das^{TF-Pos-Signal} in einzeln gefärbten Proben zu identifizieren (Abbildung 5B).
   3. CD41: Quadranten mit der einzeln gefärbten CD41-Probe definieren, um die Hintergrundfluoreszenz der Thrombozyten auszuschließen (Abbildung 5C).
   4. TF/CD41: Verwenden Sie dieselben Quadrantenkoordinaten, um das^{TF-Pos-Signal} in TF/CD41-gefärbten Proben zu identifizieren (Abbildung 5D).
      HINWEIS: Der endgültige TF-Pos-Thrombozyten-Prozentsatz wird aus den von der Analysesoftware generierten Statistiken gewonnen und als Prozentsatz der CD41-Pos-Ereignisse angegeben, die im TF-Pos-Quadranten der geschlossenen Thrombozytenpopulation liegen.
6. Führen Sie zentrale Qualitätskontrolle bei Dateinamensidentifikation, Reagenzchargen, Fixierungs- bis Aufnahmeintervall, Versandtemperatur, Ereignisanzahl und Ausreißer-Fluoreszenzverteilungen durch. Akten, die dokumentierte Abweichungen bei lokaler Handhabung, Versand, Fixationszeitpunkt oder Erwerbseinstellungen zeigen, sollten markiert, zentral überprüft und entweder ausgeschlossen oder wiederholt werden, gemäß dem studienspezifischen Abweichungsmanagementplan.

Abbildung 4: Sequentielle Gating Strategie für die TF-Pos-Thrombozyten-Analyse. Der repräsentative Analyse-Workflow veranschaulicht die Identifikation von Thrombozytenpopulationen nach dem Laden von .fcs-Dateien. (A-B) Punktdiagramme bestätigen die korrekte Eingrenzung der Thrombozytenpopulationen. (C) PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 Pseudocolor-Plot zur Bewertung des spektralen Überlaufs. (D) FSC-A/FSC-H-Diagramm innerhalb des Thromlet-Gates, das verwendet wird, um Doublets auszuschließen und Singlets zu definieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Vorlage für Datenanalyse. Repräsentative Punktdiagramme von (A) ungefärbter Kontroll, die zur Definition der Basis-Autofluoreszenz und Quadrantenpositionierung verwendet werden. (B) TF Einzelfarbungsprobe; (C) CD41 einzeln gefärbte Probe, die zur Definition der Quadrantenpositionierung verwendet wird. (D) TF/CD41 doppelt gefärbte Probe für TF pos-thrombozytenbasierte Analyse. Die Zahlen geben den Prozentsatz der TF-Pos-Thrombozyten in einer repräsentativen Stichprobe an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergebnisse

Dieser Workflow wurde speziell entwickelt, um Zentren mit heterogenen technischen Infrastrukturen die Teilnahme an Multicenter-Studien zu ermöglichen, die eine Quantifizierung von TF-Pos-Thromletten erfordern. Abbildung 1 illustriert das organisatorische Workflow-Diagramm, das zur Unterstützung von multizentrischen Studien entwickelt wurde, die darauf abzielen, zirkulierende TF-Pos-Thrombozytometrie mittels Vollblutflusszytometrie zu messen. Je nach den technischen Ressourcen der teilnehmenden Zentren werden unterschiedliche Verfahren zur Probenvorbereitung implementiert. Konkret (i) wenn einer klinischen Einheit keine Durchflusszytometrie-Einrichtung oder geschultes Personal fehlt, werden Vollblutproben unmittelbar nach der Entnahme fixiert und anschließend zur zentralen Färbung, Entnahme und Analyse ins Kernlabor geliefert. (ii) Alternativ können Zentren mit Durchflusszytometrie-Einrichtungen lokal Färbung und Aufnahme durchführen. In diesen Fällen folgt die Datenerfassung einem harmonisierten Arbeitsablauf, der vom Core Laboratory definiert wird. Wenn das Instrumentenmodell mit dem im Kernlabor verwendeten übereinstimmt, erfolgt die Erwerbung mit einer standardisierten Vorlage des Kernlabors. Wenn verschiedene Instrumentenmodelle verwendet werden, kann die Harmonisierung entweder durch Vorlagentransfer – wenn Instrumente im Core Laboratory zur Ausrichtung verfügbar sind – oder durch perlenbasierte Kalibrierungsverfahren vor der Probenentnahme erreicht werden. Proben können anschließend gemäß dem standardisierten Arbeitsablauf entnommen und analysiert werden.

Die folgenden repräsentativen Ergebnisse sollen die Machbarkeit des Workflows und wichtige Harmonisierungsschritte veranschaulichen, anstatt eine formale Multicenter-Assay-Validierung zu ermöglichen. Um eine zuverlässige TF-Detektion sicherzustellen, wurde die Färbungsstrategie zunächst auf spektrale Kompatibilität und Signalstabilität getestet. Blutplättchen wurden mit Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 identifiziert, während der TF-Nachweis auf einem anti-TF monoklonalen Antikörper basierte, der mit Star Fluor 488 konjugiert war. Einzelne gefärbte Kontrollen wurden verwendet, um das Fehlen eines Fluoreszenzüberlaufs zwischen den Detektionskanälen zu überprüfen. Wie in Abbildung 6A dargestellt, erzeugten CD41 PerCP-Cy5.5-Einzelfärbungsproben kein nachweisbares Signal im Star Fluor 488-Kanal. Der Prozentsatz der TF-Pos-Thrombozyten, die in doppelt gefärbten Proben gemessen wurden, war konsistent vergleichbar mit dem in TF-Einzel-gefärbten Proben (Abbildung 6B).

Abbildung 6: Validierung der Färbungsspezifität. (A) Einzelne gefärbte Anti-CD41 PerCP-Cy5.5-Probe, analysiert in einem PerCP-Cy-Cy5.5/Star Fluor 488-Punkt-Diagramm zur Überprüfung der Signalspezifität. (B) Die Prozentsätze der TF-Pos-Thrombozyten, die in TF Single-Colored versus TF/CD41 Double-Colored-Proben gemessen wurden, werden als individuelle gepaarte Messungen (Punkte) und als Mittelwert ± SD (n = 18 unabhängige Probanden angegeben). Die Daten wurden mit dem Wilcoxon-Matched-Pairs-Signed-Rank-Test analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.Die analytische Sensitivität des vorgeschlagenen Tests wurde an Proben von n=200 gesunden Probanden bewertet. Mit biologisch leeren Proben betrug die berechnete Grenze der Leerzahl (LoB) 0,39 %, die Nachweisgrenze (LoD) 0,77 % und die Quantifizierungsgrenze (LoQ) 1,12 %, definiert als das niedrigste Niveau, das mit einem CV ≤ 20 % assoziiert ist. Die Interoperator-Reproduzierbarkeit der Gating-Strategie wurde an 40 unabhängigen Proben bewertet, die von 6 Operatoren mit der vordefinierten Analysevorlage analysiert wurden, was einen ICC von 0,985 ergab (95%-KI: 0,978–0,990).

Die Stabilität der TF-Detektion nach Ganzblutfixierung wurde anschließend durch längs gefärbte fixierte Proben bewertet. Im Vergleich zu Basisproben, die am Tag der Fixierung gefärbt wurden (D0), blieben die Pos-Thrombozyten-Spiegel der TF bis zu vier Tage nach der Fixierung stabil und zeigten nur einen nicht signifikanten Rückgang von etwa 22 % bei D3-D4 (77,8 ± 7,2 % – relativer Prozentsatz bei TF^{pos-Thrombozyten}) im Vergleich zum D0-Niveau. Wenn die Färbung bei D5-D6 durchgeführt wurde, sank die TF-Pos-Thrombozyten-Erkennung signifikant auf 53,8 % ± 20,7 % (relativer Prozentsatz bei TF-Po-Thrombozyten; S< 0,0001; Abbildung 7). Diese Ergebnisse zeigen, dass feste Proben innerhalb von vier Tagen nach der Fixierung zuverlässig analysiert werden können, mit nur geringem Signalverlust.

Abbildung 7: Zeitverlaufanalyse nach Probenfixierung. Quantifizierung der TF-pos-Thrombozyten, gemessen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Fixierung, angegeben auf der X-Achse wie folgt: D0 = Tag der Blutentnahme; D1 = Tag 1; D2 = Tag 2; D3-4 = Tag 3 oder 4; D5-6 = Tag 5 oder 6. Die Daten werden als mittlerer Prozentsatz ± SD im Vergleich zu D0 angegeben (n = 7–10 gesunde Probanden, bewertet über die angegebenen Zeitpunkte nach der Fixierung). Die Daten wurden mit Anova analysiert, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Die Leistung des harmonisierten Akquisitions-Workflows wurde anschließend über verschiedene Flowzytometrieplattformen hinweg bewertet. Die vorlagenbasierte Harmonisierung wurde zunächst mit FACSLyrischen und MACSQuant-Instrumenten als Referenzzytometern bewertet. Zusätzliche Instrumente derselben Modelle, die an externen Einrichtungen stationiert waren, wurden als Testplattformen verwendet. Vollblutproben mit Ruheplättchen wurden sowohl auf Referenz- als auch auf Testinstrumenten mit der standardisierten Aufnahmevorlage entnommen. Wie in Abbildung 8A,B dargestellt, wurden vergleichbare TF-Pos-Thrombozyten-Prozentsätze über Referenz- und Testzytometer ermittelt, was die Reproduzierbarkeit des Shared-Template-Ansatzes bestätigt.

Abbildung 8: Instrumentübergreifende Reproduzierbarkeit unter Verwendung gemeinsamer Akquisitionsvorlagen. Prozentsätze der^{TF-pos-Thrombozyten}, gemessen in Vollblut von n=6 gesunden Proben, die auf Referenz- und Testbasis erfasst wurden FACSLyrische (A) oder MACSQuant (B) Instrumente mittels einer gemeinsamen Aufnahmevorlage, die über die Instrumente angewendet wird. Die Daten werden als individuelle Bestimmungen (Punkte) und Mittelwert ± SD ausgedrückt. Die Daten wurden mit einem gepaarten t-Test analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Schließlich wurde die perlenbasierte Harmonisierung so bewertet, dass Instrumente unterschiedlicher Konfigurationen ausgerichtet wurden. Zytometer A wurde als Referenzinstrument verwendet, und eine FACSymphonie als Testinstrument. Die Ausrichtung erfolgte mit 6-Peak-Rainbow-Kalibrierungskugeln, indem die FACSymphony-Detektorspannung von 488 nm angepasst wurde, bis die Fluoreszenzintensität der Perlen im vordefinierten Zielbereich lag. Histogrammprofile, die die Verteilung der Perlenspitzen vor und nach der Ausrichtung veranschaulichen, sind in Abbildung 9A dargestellt. Vollblutproben wurden dann vor und nach der Kalibrierung auf dem Testinstrument entnommen. Vor der Harmonisierung unterschieden sich die TF-Pos-Thrombozyten-Prozentsätze zwischen den beiden Plattformen. Nach der perlenbasierten Ausrichtung entsprachen die Werte genau denen des Referenzzytometers (Abbildung 9B), was eine erfolgreiche plattformübergreifende Harmonisierung und reproduzierbare TF-Quantifikation zeigte.

Abbildung 9: Harmonisierung von perlenbasierten Instrumenten. (A) Repräsentatives Fluoreszenzhistogramm von 6-Peak-Rainbow-Kalibrierungsperlen, die vor (roten Spitzen) und nach der (grünen Spitzen) Instrumentenausrichtung aufgenommen wurden. (B) Prozentsätze der TF-Pos-Thrombozyten, gemessen in Ruheproben, die aus n=6 gesunden Probanden hergestellt wurden, die auf dem Testinstrument vor (Vor) und nach der (Nach-)Harmonisierung aufgenommen wurden. Messungen, die auf dem Referenzinstrument erzielt wurden, werden zum Vergleich angezeigt. Die Daten wurden mit einem gepaarten t-Test analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Dieses Protokoll bietet einen Schritt-für-Schritt-Workflow für die Quantifizierung der Ganzblutblutzytometrie von TF-Pos-Thrombozyten, speziell für eine multizentrische Implementierung konzipiert. Sein größter methodischer Vorteil gegenüber herkömmlichen Arbeitsabläufen auf Basis der Thrombozytometrieanalyse besteht darin, dass sie den gesamten analytischen Prozess standardisiert – von der Blutentnahme und Ganzblutfixierung bis hin zur Probenbeschriftung, der Instrumentenharmonisierung vor der Probenentnahme sowie der zentralen Analyse und Qualitätskontrolle der Daten. Dies ermöglicht es Zentren ohne Probenverarbeitung, an Multicenter-Studien teilzunehmen, sofern sie Blutproben liefern können. Der aktuelle Arbeitsablauf behandelt die praktischen Quellen der Variabilität zwischen den Zentren, die am relevantesten sind, da nur ein kleiner Anteil der Blutplättchen unter physiologischen Bedingungen nachweisbare oberflächenassoziierte TF aufweist ^7,8. Diese Quellen umfassen Unterschiede in der lokalen Probenhandhabung, Zugang zu Durchflusszytometrieanlagen, Instrumentenkonfiguration und operatorabhängige Datenanalyse.

Um diese Probleme zu überwinden, wird Vollblut kurz nach der Entnahme fixiert, wodurch der in vivo phänozytische Phänotyp stabilisiert wird und sofortige Markierung und Probenentnahme notwendig sind. Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass dieser Ansatz mit fester Stichprobe eine verzögerte zentralisierte Verarbeitung innerhalb des validierten Postfixationsintervalls ermöglicht. Dies erweitert die Möglichkeit der Studienbeteiligung auf Zentren ohne Flowzytometrieeinrichtungen vor Ort, während ein konsistenter voranalytischer Workflow aufrechterhalten bleibt. Ein weiterer Vorteil des Protokolls ist die Verwendung einer vereinfachten direkten Färbemethode mit einem einfachen zweifarbigen Panel, was die Komplexität des Verfahrens verringert.

Im Panel verwendeten wir den gut charakterisierten anti-TF monoklonalen Antikörperklon HTF1, der die katalytische Stelle von TF erkennt und mit der Faktor-VII-Bindung konkurriert, was es zu einem der zuverlässigsten Reagenzien für TF-Nachweis macht, ebenfalls in Thrombozyten 14,16,17. Der Antikörper wurde mit Star Fluor 488 konjugiert, einem hellen, fotostabilen Fluorochrom, spektral ähnlich wie FITC, aber mit verbesserter Signalstabilität. Wichtig ist, dass die Anregung bei 488 nm die Probenerkennung mit der blauen Laserkonfiguration ermöglicht, die auf nahezu allen herkömmlichen Durchflusszytometern, einschließlich Einstiegsinstrumenten, verfügbar ist. Diese Kombination aus Epitopspezifität und einfacher Fluorochromerkennung verbessert die analytische Sensitivität und Skalierbarkeit über mehrere Standorte hinweg. In diesem Test wurden Positivitätsschwellenwerte mit ungefärbten und FMO-Kontrollgruppen definiert, als bessere Option im Vergleich zur Isotyp-Kontrolle für die Schwellenplatzierung in Niederfrequenzpopulationen¹⁸.

Der Einsatz verschiedener Durchflusszytometer könnte eine Quelle der Variabilität in multizentrischen Durchflusszytometriestudien^darstellen 19,20,21. Wir haben zuvor Ratschläge zur voranalytischen Handhabung, zur Färbungseinrichtung und zur lokalen Instrumentenoptimierung^{gegeben 17}. Diese Maßnahmen gewährleisten jedoch keine einheitlichen Fluoreszenzsignale über verschiedene Plattformen hinweg. Der aktuelle Arbeitsablauf adressiert dieses Problem, indem er zentrale Analyse mit der Harmonisierung der prospektiven Akquisition kombiniert. Gemeinsame Akquisitionsvorlagen können verwendet werden, wenn identische Zytometer verfügbar sind, während perlenbasierte Ausrichtung angewendet werden kann, wenn verschiedene Plattformen einbezogen werden müssen. Diese duale Strategie bietet einen praktischen Vorteil gegenüber multizentrischen analytischen Modellen, die ausschließlich auf zentralisierte Analyse nach heterogener lokaler Erfassung beruhen, indem sie die Variabilität der Datenanalyse ab von Anfang an reduziert und eine reproduzierbare Gate-Anwendung über Standorte hinweg unterstützt.

Die Verallgemeinerbarkeit des Workflows sollte nicht überschätzt werden. Das Protokoll wurde unter Verwendung von festgelegten Vollblutfixierungsbedingungen, der Anti-TF-Star Fluor 488 und Anti-CD41 PerCP-Cy5.5-Reagenzkombination, Harmonisierungsverfahren und einer begrenzten Auswahl an Durchflusszytometer-Konfigurationen validiert. Wenn andere Anti-TF-Klone, Fluorochrom-Kombinationen, Fixationszeiten oder Fixationskonzentrationen oder Durchflusszytometer mit wesentlich unterschiedlicher Optik verwendet werden, sollte die analytische Leistung des Arbeitsablaufs überprüft werden. Insgesamt sollten alle Protokollfehler nach den vorgeschlagenen vordefinierten Abweichungsregeln verwaltet werden. Je nach Schwere der Abweichung können die Daten gemäß dem studienspezifischen Abweichungsplan markiert, wiederholt oder ausgeschlossen werden. Innerhalb dieser Grenzen sollte das vorliegende Protokoll als operatives Rahmenwerk für die multizentrische Implementierung der TF-Pos-Platelet-Analyse betrachtet werden. Formale analytische Validierung, einschließlich umfassender interlaboratorischer Leistungsbewertung, Versandvalidierung und Wiederholbarkeit von Tests, wird derzeit in einer internationalen Standardisierungsstudie der International Society of Thrombosis and Hemostasis behandelt. Die klinische Relevanz einer genauen Quantifizierung von TF-Pos-Thrombozyten wird durch Belege unterstrichen, die ihren prognostischen Wert bei koronarer Herzkrankheit belegen, bei der die Werte von TF-Pos-Thrombozyten über 4 % unabhängig die langfristige kardiovaskuläre Sterblichkeit nach fünf Jahren Nachbeobachtung¹⁶ vorhersagen. Eine zuverlässige multizentrische Messung ist daher unerlässlich, um TF-Pos-Thrombozyten als Biomarker zu validieren und deren Anwendung auf prospektive klinische Studien und reale Register auszuweiten. Die zukünftige Implementierung automatisierter Normalisierungsalgorithmen und Autogating-Strategien könnte den Operator-Bias weiter verringern und dezentrale Analyse unterstützen, während die standortübergreifende Vergleichbarkeit^{erhalten bleibt 22,23}.

Zusammenfassend bietet dieser harmonisierte Arbeitsablauf einen praktischen und reproduzierbaren Ansatz zur Quantifizierung von TF-Pos-Thrombozyten mittels Vollblutflusszytometrie in multizentrischen Umgebungen. Durch die Kombination standardisierter voranalytischer Verfahren, vereinfachter Probenverarbeitung und Instrumentenharmonisierungsstrategien ermöglicht das Protokoll einen zuverlässigen Siteübergreifenden Vergleich von TF-Pos-Thromlets-Messungen. Über die Unterstützung der Bewertung von TF-Pos-Thrombozyten als Biomarker für thrombotisches Risiko hinaus könnten die hier beschriebenen Prinzipien zu umfassenderen Bemühungen beitragen, die Thrombotenflusszytometrie für translationale und klinische Forschungsanwendungen zu standardisieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1X PBS w/o Calcium und Magnesium	Gibco	10010-015	Für Antikörper und Probenverdünnung
Anti-CD41 PerCP-Cy5.5  (Klon HIP8)	BD	333148	Anti-human CD41a monoklonaler Antikörper, der als Marker für die Thrombozytenpopulation verwendet wird; sollte vom Core-Labor bereitgestellt werden
Anti-TF Star Fluor 488  (Klon HTF1)	Cyanagen	CR304	Anti-human Tissue Factor (CD142) monoklonaler Antikörper; sollte vom Core-Labor bereitgestellt werden
BD FACSLyric Durchflusszytometer	BD	nicht im Katalog	Im Text, Durchflusszytometer B
BD FACSuite Software v1.6	BD	nicht im Katalog	Im Text, Software B
Butterfly-Nadel G19	PIKDARE	02044019030010	Zum Blutabnehmen
CytExpert Software	Beckman Coulter	nicht im Katalog	Im Text, Software A
CytoFLEX S Durchflusszytometer	Beckman Coulter	nicht im Katalog	Im Text, Durchflusszytometer A
MACSQuant Durchflusszytometer	Miltenyi Biotec	nicht im Katalog	Im Text, Durchflusszytometer C
MACSQuantify Software v3.1	Miltenyi Biotec	nicht im Katalog	Im Text, Software C
Eppendorf-Röhrchen 2 mL	Eppendorf	120094	Zur Fixierung von Vollblut
Paraformaldehyd	Antibioticos – Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	Zur Fixierung von Proben
Pipettenspitzen 10 µL	Gilson	F161630	Zum Übertragen von Blutproben
Pipettenspitzen 1000 µL	Gilson	F161670	Zum Übertragen von Blutproben
Pipettenspitzen 200 µL	Gilson	F161930	Zum Übertragen von Blutproben
Polystyrol Rundboden-Röhrchen 5 mL	Corning	352052	Erforderlich für die Durchflusszytometer-Akquisition
Rainbow-Kalibrierungsperlen (6 Peaks)	Spherotech (BD)	556286	Zur Harmonisierung des Durchflusszytometers
Vakuumbehälter EDTA	BD	368857	Zum Sammeln der ersten 3 ml Blut
Vakuumbehälter Mehrfach-Probenahme-Luer-Adapter	BD	367300	Zum Blutabnehmen
Vakuumbehälter Einweg-Halter	BD	364815	Zum Blutabnehmen
Vakuumbehälter mit 0,129 M Natriumcitrat	BD	363079	Zum Sammeln von Blut