Funktionelle Charakterisierung einzelner prä- und postsynaptischer Partner im zentralen Nervensystem der Drosophila-Larve mittels CaMPARI

Summary

Dieses Protokoll bewertet die funktionelle synaptische Aktivität zwischen definierten neuronalen Partnern in vivo im zentralen Nervensystem der Drosophila melanogaster-Larven mit genetisch codierten Werkzeugen. CsChrimson-vermittelte optogenetische Stimulation präsynaptischer cIVda-Sensorneuronen induziert eine calciumabhängige Photokonversion von CaMPARI in postsynaptischen Basin-4-Interneuronen.

Abstract

Connectome-Studien haben das Verständnis der synaptischen Konnektivität in den Nervensystemen verschiedener Arten erheblich erweitert. Während die Charakterisierung synaptischer Partner mittels Elektronenmikroskopie (EM) detaillierte anatomische Informationen liefert, erfordern funktionale Aspekte neuronaler Netzwerke komplementäre Ansätze. Neuere Studien an Drosophila haben nicht nur das vollständige Konnektom der Larve sowie des männlichen und weiblichen erwachsenen Zentralnervensystems aufgedeckt, sondern auch die zellulären Komponenten neuronaler Netzwerke, die spezifische Verhaltensweisen regulieren, wie das larvenartige Nozizeptive Netzwerk. Im dritten Larvenstadium stellen die Klasse-IV-dendritischen Arborisierungsneuronen (cIVda) multidendritische Sensorneuronen (Nozizeptoren) die meisten synaptischen Kontakte mit Basin-4-Interneuronen her. Um die funktionelle Relevanz dieser anatomischen Verbindungen zu bewerten, wurde der genetisch kodierte Kalziumindikator CaMPARI (Calcium Modulated Photoactivatable Ratiometric Integrator) in lebenden, nicht dissektionierten Larven des dritten Stadiums als aktivitätsabhängiger Reporter eingesetzt, um die synaptische Konnektivität zwischen cIVda-Neuronen und Basin-4-Interneuronen zu bewerten. CaMPARI ist ein ratiometrischer fluoreszierender Indikator, dessen Emissionsspektrum sich als Reaktion auf erhöhte intrazelluläre Kalziumwerte verändert. Unter Ausgangsbedingungen leuchtet CaMPARI grün; Bei hohen Kalziumkonzentrationen und bei Kontakt mit Photokonversionslicht (~400 nm) wechselt es irreversibel in rote Fluoreszenz. Da der Kalziumzufluss in postsynaptische Neuronen ein Markenzeichen der synaptischen Aktivierung ist, liefert die CaMPARI-Photokonversion eine Anzeige der funktionellen synaptischen Signalübertragung. Eine Schritt-für-Schritt-Methode wird vorgestellt, um Larven des dritten Stadiums auf einem Objektträger zu immobilisieren, um die optogenetische Aktivierung von cIVda-Nozizeptoren mittels des rotverschobenen Channelrhodopsin CsChrimson zu aktivieren, kombiniert mit gleichzeitiger CaMPARI-Photokonversion in Basin-4-Neuronen. Die calciumabhängige Photokonversion in Basin-4-Neuronen liefert trotz innerer Bewegungen und Veränderungen in der Fokalebene funktionelle Hinweise auf synaptische Konnektivität zwischen diesen Zellen. Dies dient als Beweis für die Anwendung von CaMPARI in Kombination mit präsynaptischer optogenetischer Stimulation bei intakten, nicht dissektionierten Drosophila-Larven .

Introduction

Die Identifizierung präziser synaptischer Partner im zentralen Nervensystem (ZNS) ermöglicht die Nachverfolgung der Bildung und Verfeinerung synaptischer Verbindungen während der Entwicklung des Nervensystems. Dementsprechend konzentrierten sich die Bemühungen auf den Einsatz der volumetrischen Elektronenmikroskopie (EM), um nicht nur vollständige Konnektive in leistungsstarken genetischen Modellorganismen wie Caenorhabditis elegans ^1,2 und Drosophila melanogaster ^3,4,5 zu rekonstruieren, sondern auch EM-Volumina im Millimetermaßstab komplexer Säugetierhirnen, einschließlich des primären visuellen Kortex⁶ der Maus und des menschlichen temporalen Kortex⁷. Diese Studien bieten einzigartige Einblicke in die organisatorischen Prinzipien, die der synaptischen Konnektivität auf anatomischer Ebene zugrunde liegen. Die funktionelle Charakterisierung synaptischer Partner liefert jedoch ergänzende Einblicke in die neuronale Konnektivität und ist erforderlich, um anatomische Befunde zu validieren.

Drosophila bietet zahlreiche Vorteile für die Untersuchung der neuronalen Konnektivität, darunter die Verfügbarkeit vollständiger Konnektive für das^{Larvensystem 3} sowie das weibliche⁴ und^{männliche 5} erwachsene Zentralnervensystem sowie gut charakterisierte neuronale Schaltkreise, die vorhersehbares Verhalten regulieren ^8,9,10. Das larvale nozizeptive Netzwerk stellt einen solchen gut geeigneten Schaltkreis zur Untersuchung der präzisen synaptischen Konnektivität¹¹ dar. Die EM-Rekonstruktion dieses Netzwerks hat detaillierte synaptische Partnerschaften aufgedeckt, die für die Verarbeitung nozizeptiver Reize erforderlich sind, was zum charakteristischen Fluchtverhalten führt, das als nocifensives Rolling^12,13 bekannt ist.

Innerhalb dieses Netzwerks fungieren die dendritischen Arborisationsneuronen der Klasse IV (cIVda) ¹⁴ als primäre sensorische Nozizeptoren, die für die Schmerzerkennung^{verantwortlich sind.} Ihre Zellkörper und Dendriten befinden sich peripher in der Körperwand, während ihre Axone in das ventrale Nervenkreuz der Larve (VNC)¹⁵ projizieren. Innerhalb des ZNS arborisieren cIVda-Neuronen ihre axonalen Endpunkte in einem stereotypen Muster und bilden den Großteil ihrer synaptischen Kontakte mit den Basin-4-Interneuronen ^11,12,13,17. Diese definierte synaptische Beziehung etabliert cIVda-Neuronen und Basin-4-Interneuronen als ideales Paar für die funktionelle Beurteilung der synaptischen Konnektivität in vivo. Die Entwicklung von Methoden zur Analyse funktioneller Verbindungen zwischen individuell identifizierten synaptischen Partnern wird die Untersuchung der Mechanismen für die Entwicklung und Verfeinerung der synaptischen Entwicklung und Verfeinerung erleichtern, insbesondere in genetisch handhabbaren Systemen mit stereotypen neuronalen Schaltkreisen.

CaMPARI (Calcium Modulated Photoactivatable Ratiometric Integrator)¹⁸ ist ein genetisch codierter ratiometrischer fluoreszierender Indikator, dessen Emissionsspektrum sich als Reaktion auf erhöhte intrazelluläre Kalziumspiegel verschiebt. Unter Ausgangsbedingungen leuchtet CaMPARI grün; Bei hohen Calciumkonzentrationen und bei der Begegnung mit Photokonversionslicht (~400 Nanometer (nm)) wandelt es sich irreversibel in rote Fluoreszenz¹⁸ um. Da der Kalziumzufluss in postsynaptische Neuronen ein Markenzeichen der synaptischen Aktivierung ist, liefert die CaMPARI-Photokonversion eine Anzeige der funktionellen synaptischen Signalübertragung^19,20.

Zusätzlich zu CaMPARI kann die neuronale Aktivität mit reversiblen Sensoren wie genetisch codierten Kalziumindikatoren (GECIs) wie GCaMP oder RCAMP²¹ sowie genetisch kodierten Spannungsindikatoren (GEVIs)²² wie Arclight²³, Ace2N-mNeon²⁴ oder VARNAM²⁵ visualisiert werden. Obwohl diese schnellen, reversiblen Sensoren gut geeignet sind, vorübergehende Aktivitäten in Echtzeit zu überwachen, sind sie während der In-vivo-Bildgebung anfällig für Bewegungsartefakte. Im Gegensatz dazu ermöglichen die integrativen und irreversiblen Photokonversionseigenschaften von CaMPARI die Erfassung von Aktivität über ein definiertes Zeitfenster, sodass die neuronale Aktivierung auch dann erkannt werden kann, wenn sich die Fokalebenen während der Bildgebung²⁰ verschieben. Zusätzlich kann die CaMPARI-Photokonvertierung durch Anpassung der Intensität des violetten Lichts abgestimmt werden, was die Detektion reduzierter synaptischer Stärke oder Subthreshold-Eingänge²⁶ ermöglicht. Diese Eigenschaften haben eine Aktivitätskartierung bei frei bewegenden Tieren ohne Kopffixierung oder -bindung ermöglicht, einschließlich Studien in Mausekortex²⁷, Zebrafischhirn²⁸, C. elegans²⁹ und adulten Drosophila²⁰.

Ein Protokoll wird beschrieben, um funktionelle synaptische Partner mittels CaMPARI-Photokonversion in Kombination mit präsynaptischer optogenetischer Stimulation mittels konfokaler Mikroskopie in intakten, nicht dissektionierten Drosophila-Larven zu visualisieren. Bei diesem Ansatz wird CaMPARI verwendet, um postsynaptische Kalziumzufuhr in Basin-4-Interneuronen nach optogenetischer Aktivierung von cIVda-Neuronen in lebenden Larven des dritten Stadiums nachzuweisen. cIVda-Neuronen exprimieren den rotlichtaktivierten Kanal CsChrimson^30,31, während Basin-4-Interneuronen CaMPARI exprimieren. Die Exposition gegenüber rotem Licht aktiviert selektiv Nozizeptoren, die einen nozizeptiven Reiz auf zeitlich kontrollierte Weise nachahmen^16,30. Diese Strategie ermöglicht die Bewertung, ob die präsynaptische Aktivierung die calciumabhängige CaMPARI-Photokonversion in postsynaptischen Neuronen induziert und so funktionelle Hinweise auf synaptische Konnektivität liefert.

Mehrere technische Vorteile unterstützen die Verwendung von CaMPARI in Kombination mit CsChrimson zur Analyse der cIVda–Basin-4-Konnektivität. Erstens bilden cIVda-Dendriten eine vollständige, nicht überlappende Kachelung der Larvenkörperwand³², die die optogenetische Aktivierung intakter sensorischer Neuronen ohne störende Effekte durch dissektionsinduzierte Schäden^ermöglicht. Zweitens, obwohl die Larven auf einem Objektträger physisch bewegungsunfähig sind, verändern innere Bewegungen während der Bildaufnahme häufig die Position des ZNS und die Fokalebene; Die CaMPARI-Photokonversion ist weniger empfindlich gegenüber solchen Bewegungsartefakten und liefert eine stabile, zeitintegrierte Anzeige der neuronalen Aktivität. Drittens ermöglichen die integrativen und abstimmbaren Eigenschaften von CaMPARI die Detektion synaptischer Aktivität auch bei reduzierter synaptischer Stärke oder Kontaktzahl, etwa in frühen Entwicklungsstadien, was zukünftige Studien zur Synapsenbildung und -verfeinerung unterstützt.

Protocol

Alle experimentellen Verfahren mit Drosophila melanogaster wurden gemäß institutionellen Richtlinien durchgeführt. Der Genotyp w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4 (erhalten durch die Rekombination von RRID:BDSC_54899¹² und RRID:BDSC_32079¹⁶) wurde verwendet, um die optogenetische und CaMPARI-Expression zu steuern (unter Verwendung der Linie w^-, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/Cyo durch die Rekombination von RRID:BDSC_81085 mit Markern des zweiten Chromosomen) bei prä- bzw. postsynaptischen Partnern gewonnen. Die in diesem Protokoll verwendeten Forschungswerkzeuge sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Larven

1. Einrichtung genetischer Kreuzungen zwischen jungfräulichen Weibchen UAS-CsChrimson, LexAop-CaMPARI; CyO/sp (RRID:BDSC_81085) und Männchen stammen aus einer Fliegenlinie mit zwei binären Systemen, zum Beispiel, wobei das präsynaptische Neuron von Interesse die GAL4-Expression antreibt und das postsynaptische Neuron von Interesse LexA^33,34 antreibt.
2. Setze genetische Kreuzungen in Kunststoffphiolen mit Standard-Mais-Agar-Medium 35,36,37,38, ergänzt mit 0,5 mM All-Trans-Retinal (ATR) für CsChrimson-Aktivierung ^30,33. Bereite parallele Fläschchen ohne ATR als Nicht-ATR-Steuerung vor.
   HINWEIS: Schmelzen Sie das Agarmedium aus Maismehl ohne zu kochen. Lass sie abkühlen, ohne zu fest zu werden. Bereiten Sie eine 40 mM ATR-Schaftlösung vor (Pulver-ATR, gemäß Herstelleranweisung in 95 % Ethanol verdünnt), verdünnen Sie dann auf 0,5 mM im Medium und mischen Sie gründlich.
3. Decken Sie die Fläschchen komplett mit Alufolie ab, um Lichteinwirkung zu vermeiden.
   HINWEIS: Aufziehbedingungen in ständiger Dunkelheit aufrechtzuerhalten, da ATR lichtempfindlich ist, und um unbeabsichtigte neuronale Aktivierung zu verhindern. Obwohl CsChrimson am empfindlichsten auf rotes Licht reagiert (590–680 nm), kann es auch von anderen sichtbaren Wellenlängen aktiviert werden:^31,39.
4. Phiolen bei 25 °C bebrüten und Larven bis zum dritten Stadium aufziehen.

2. Larvenbewegung

1. Sammeln Sie mit einem Pinsel eine dritte Larve im Larvenstadium. Waschen Sie die Larven in einer Drei-Loch-Mikropunktplatte mit 0,1 m PBS, um die Nahrung zu entfernen.
   HINWEIS: Entfernen Sie nicht überschüssiges PBS; Es hilft, die Flüssigkeitszufuhr zu erhalten.
2. Legen Sie an jede Ecke eines sauberen Überdecks eine kleine Menge Modellierton (18 × 18 mm) auf. Platzieren Sie die Larve in einem Tropfen PBS auf den Deckzettel und lassen Sie sie sich mit der Bauchseite nach unten orientieren.
   HINWEIS: Für die Bildgebung des ventralen Nervenstrangs (VNC) wird die Larve auf ihrer dorsalen Seite so montiert, dass die ventrale Oberfläche mit dem Deckmantel in Kontakt kommt. Diese Ausrichtung ermöglicht es den Basin-4-Interneuronen im VNC, das Ziel durch den Deckmantel zu zeigen.
3. Legen Sie einen sauberen Objektträger über den Deckmantel mit der Larve.
4. Sichern Sie den Deckmantel, indem Sie zusätzlich Modellierton an den Ecken auftragen. Üben Sie ausreichenden Druck aus, um die Larve zu immobilisieren, ohne eine Ruptur oder den Deckrutsch der Larve zu vermeiden.

3. Stimulation, Fotokonversion und Bildgebungs-Workflow

1. Erziele einen Baseline-Z-Stack postsynaptischer Neuronen, die CaMPARI exprimieren, indem sie gleichzeitig grüne (488 nm, 0,8 % Laserleistung) und rote (~561 nm, 0,8 % Laserleistung) Kanäle verwenden. Verwenden Sie einen Z-Schritt von 1 μm, 256 × Auflösung von 256 Pixeln, Linienmittelung von 2, bidirektionales Scannen und eine Scangeschwindigkeit von 9 an einem Konfokalmikroskop mit einem 40×/1,2-Objektiv. Führen Sie alle Bildgebungen in einer dunklen Umgebung durch. Behalten Sie während des gesamten Experiments identische Z-Stack-Parameter bei.
   HINWEIS: Erwarten Sie leuchtend grüne Zellkörper an stereotypen Positionen im larvalen VNC und keine nachweisbare rote Fluoreszenz am Ausgangspunkt.
2. Stimulieren Sie die Larve kontinuierlich 30 Sekunden lang mit gleichzeitigem Photokonversionslicht (405 nm, 0,5 % Laserleistung) und optogenetischem Stimulationslicht (594 nm, 0,8 % Laserleistung).
3. Erfassen Sie einen Z-Stack nach der Stimulation mit denselben Parametern wie in Schritt 3.1 unter sowohl roten (~561 nm) als auch grünen (488 nm) Kanälen. Erwarten Sie VNC-Zellkörper an ähnlichen Positionen wie im Ausgangsbereich. Erkennen Sie rote CaMPARI-Fluoreszenz in Neuronen, die während der Stimulation in ATR-gefütterten Larven aktiviert werden, mit minimaler Photokonversion bei Kontrollgruppen ohne ATR.
   HINWEIS: Arbeitsablauf und Parameter sind in Abbildung 1 zusammengefasst.

Abbildung 1: Arbeitsablauf für Stimulation, Photokonversion (PC) und Bildgebung. Drei sequentielle Bildgebungsphasen wurden verwendet, um die Kalziumaktivität in Basin-4-Neuronen zu bewerten. Während der Basisphase wurden Z-Stacks mit 488 nm und 561 nm Lasern aufgenommen, um die grüne und rote CaMPARI-Fluoreszenz vor der Stimulation zu erfassen. Während der Stimulationsphase wurden cIVda-Neuronen optogenetisch über CsChrimson (594 nm) aktiviert, während gleichzeitig 405 nm Beleuchtung aktives CaMPARI von grün zu rot photokonvertiert wurde; Während dieses 30-Sekunden-Zeitraums wurde keine Bildgebung durchgeführt. Während der Poststimulationsphase wurden Z-Stacks mit denselben Lasereinstellungen wie am Ausgangspunkt wiederhergestellt, um fotokonvertierte rote Signale in den Basin-4-Zellkörpern zu erkennen. Alle z-Stacks wurden bei 256 × 256 Pixeln mit 1 μm Z-Schritten, Linienmittelung von 2 und bidirektionalem Scannen unter dunklen Bedingungen mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 40×/1,2 NA-Objektiv erfasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

4. Bildgebende Analyse

1. Öffnen Sie Z-Stack-Bilder in Fiji (RRID:SCR_002285) mit aktiviertem Bio-Format. Setze Stack-Anzeige auf Hyperstack, Farbmodus auf Composite und aktiviere Autoscale. Scrolle durch Z-Ebenen und wähle die Ebene mit optimalem Fokus aus. Duplizieren Sie die ausgewählte Ebene (Bild → Duplizieren; Kanäle: 1–2; ausgewählte Z-Ebene).
2. Splitte rote und grüne Kanäle (Bild → Farbe → geteilte Kanäle).
   HINWEIS: Helligkeit und Kontrast mit Image anpassen → → Helligkeit/Kontrast → Auto für beide Kanäle anpassen.
3. Hintergrund von beiden Kanälen abziehen (Prozess → Hintergrund abziehen) mit einem rollenden Kugelradius von 50 px.
4. Stellen Sie Messungen (Analyze → Set Measurements) so ein, dass Flächen, mittlerer Grauwert, integrierte Dichte (IntDen), Standardabweichung sowie Min- und Max-Grauwerte enthalten sind.
5. Zeichne Interessenbereiche (ROIs) um jede Zelle im grünen Kanal mit dem Freihand-Werkzeug. Fügen Sie ROIs dem ROI-Manager hinzu und messen Sie. Wende dieselben ROIs auf den roten Kanal an und messe sie.
6. Halten Sie alle Messungen in einer Tabelle fest, einschließlich Larven- und Zellkennungen.
   HINWEIS: Führen Sie Messungen sowohl für Bilder vor als auch nach der Stimulation durch.
7. Berechnen Sie die Rot-zu-Grün-Fluoreszenzverhältnisse mit integrierten Dichtewerten, um (R/G)_Post und (R/G)_Pre für jede Zelle zu erhalten. Durchschnittliche Zellniveauwerte pro Larve.
   HINWEIS: Die integrierte Dichte (Fläche × Mittelwert) ermöglicht einen Vergleich zwischen Zellen unterschiedlicher Größe.
8. Berechnen Sie Δ(R/G) als (R/G)_post − (R/G)_pre anhand von Larvenmitteln. Positive Δ(R/G)-Werte werden als erhöhte postsynaptische Kalziumaktivität während der Photokonversion interpretiert.
   HINWEIS: Negative Δ(R/G)-Werte können durch Rauschen oder Hintergrundasymmetrie entstehen. Setze negative Werte auf 0. In diesem Datensatz zeigte eine Larve einen negativen Wert (−0,008), der auf 0 gesetzt wurde.

Results

Nach diesem Protokoll wurde die funktionelle Konnektivität zwischen cIVda-Neuronen und Basin-4-Interneuronen bei lebenden, nicht dissektionierten D. melanogaster-Larven im dritten Stadium mit CaMPARI untersucht (Abbildung 2). Vor jeglicher Stimulation mit Photokonversionslicht (PC)-Licht oder optogenetischer Aktivierung zeigten Basin-4-Interneuronen eine grüne Fluoreszenz aufgrund zytosolischer CaMPARI-Expression (Abbildung 2A). Unter Ausgangsbedingunge...

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht eine qualitative und quantitative Bewertung der synaptischen Konnektivität zwischen definierten synaptischen Partnern in intakten D. melanogaster-Larven . Dieser Ansatz nutzt die Kombination aus optogenetischer Stimulation von cIVda-sensorischen Neuronen mit der CaMPARI-basierten Visualisierung aktivierter postsynaptischer Basin-4-Interneuronen, um die synaptische Aktivität im zentralen Nervensystem (ZNS) undissektionierter Larven zu üb...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 M Phosphat-Puffer-Lösung (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK	Chemikalie, die in der Lösung zur Hydratation und Montage von Larven verwendet wird
All-trans-Retinal (ATR)	Sigma Aldrich	R2500-500mg	Chemikalie, die dem Futter hinzugefügt wird, um optogenetische Werkzeuge zu aktivieren
Konfokalmikroskop	ZEISS	LSM900 Confocal	Konfokalmikroskop, Objektivlinse (40×/1,2 NA), Licht-/Laserquelle (405, 488, 561 nm)
Deckgläser (18x18mm)	VWR	48366-205	Wird verwendet, um Tiere für die Bildgebung zu montieren
Ethanol (95%)	Sigma Aldrich	E7023	Wird als Lösungsmittel für Pulver ATR verwendet
Fiji (ImageJ)	Open Source	RRID:SCR_002285	Wird für die Bildgebungsanalyse verwendet
Prism version 10.4.1	GraphPad Software Inc.	RRID:SCR_002798	Wird für statistische Analysen verwendet
Mikroskop-Objektträger	VWR	48300-041	Wird verwendet, um Tiere für die Bildgebung zu montieren
Modelliermasse	Flinn scientific	FB0600	Wird verwendet, um das Deckglas mit der Larve dazwischen auf dem Mikroskop-Objektträger zu halten
Pinsel	Genesee scientific	59-204	Wird verwendet, um Larven zwischen verschiedenen Orten zu übertragen
Standard-Maisgrieß-Agar-Medium	Genesee scientific	66-123	Futter kann auch mit ähnlichen Standardrezepten und Zutaten zubereitet werden
Standard Drosophila Kunststoffröhrchen (25mm x 95mm Drosophila schmale Röhrchen)	Genesee scientific	32-109	Große Röhrchen oder Flaschen können ebenfalls verwendet werden
Drei-Loch-Mikro-Spot-Platte	Electron Microscopy Sciences	71561-01	Platte, die verwendet wird, um einzelne Larven zu trennen und zu reinigen
Drosophila-Stamm (Genotyp: w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4)	Bloomington Drosophila Stock Center	RRID:BDSC_54899 & RRID:BDSC_32079	Erhalten durch Rekombination von RRID:BDSC_54899 und RRID:BDSC_32079
Drosophila-Stamm (Genotyp: w, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/CyO)	Bloomington Drosophila Stock Center	RRID:BDSC_81085	Erhalten durch Rekombination von RRID:BDSC_81085 mit Markern des zweiten Chromosoms