Expansionsunterstützte Hybridisierungskettenreaktion – smFISH und Immunhistochemie im Gehirn von Drosophila

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen expansionsunterstützten HCR-smFISH- und immunhistochemischen Workflow für quantitative, zelltypspezifische Analyse der RNA- und Proteinexpression im Gehirn von Drosophila , einschließlich Bildgebung mit Lichtblatt- oder Konfokalmikroskopie sowie automatisierter Quantifizierung von Kern- und zytoplasmatischen Transkripten.

Zusammenfassung

Eine quantitative, räumlich aufgelöste Analyse der Genexpression ist unerlässlich, um zelltypspezifische Molekularprofile zu bewerten. Im visuellen System von Drosophila eröffnen umfangreiche genetische Werkzeuge einen Rahmen für die direkte Bewertung sowohl RNA- als auch Proteinniveaus in definierten neuronalen Populationen. Hier präsentieren wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, das expansionsunterstützte HCR-smFISH (Hybridisierungskettenreaktion, Einzelmolekülfluoreszenz, in situ Hybridisierung) mit Immunhistochemie kombiniert, um eine quantitative Analyse zelltypspezifischer Molekularprofile in genetisch definierten neuronalen Typen des visuellen Systems zu ermöglichen. Der Workflow ist für Zellen optimiert, die mit nuklear-lokalisierten oder membrangebundenen Markern markiert sind, was die Messung von Transkript- und Proteinniveaus in denselben Neuronen ermöglicht. Nach der Gewebeexpansion werden die Proben mittels Lichtblattmikroskopie für eine schnelle volumetrische Aufnahme abgebildet, wobei ein alternativer Montage- und Bildgebungsablauf für Standard-Invertiertlaser-Scanning und rotierende Scheibenkonfokalmikroskope demonstriert wird. Darüber hinaus stellen wir einen automatisierten Segmentierungsalgorithmus bereit, der nukleare und zytoplasmatische Transkripte unterscheidet und so Analysen des transkriptionellen Zustands und der subzellulären RNA-Lokalisierung ermöglicht. Praktische Hinweise zu experimentellen Parametern und häufigen Fallstricken auf Signalqualität, Gewebeintegrität und quantitative Leistung werden gegeben. Repräsentative Anwendungen umfassen die Validierung zelltypspezifischer RNA-Interferenz durch die Quantifizierung entsprechender Veränderungen von RNA- und Proteinniveaus. Durch die Ermöglichung integrierter RNA- und Protein-Messungen mit Zelltyp-Spezifität bietet dieser Ansatz eine skalierbare Strategie für hypothesengetriebene molekulare Analysen und in gezielten Kontexten eine praktische Alternative zu einzelzelligen Transkriptom-Assays. Dieses Protokoll bietet einen praktischen Ansatz zur Validierung zelltypspezifischer molekularer Störungen, während der anatomische Kontext des intakten Drosophila-Gehirns erhalten bleibt.

Einleitung

Das visuelle System von Drosophila melanogaster diente als kraftvolles Modell zur Bearbeitung einer Vielzahl von Fragen in der Entwicklungsneurowissenschaft, darunter neuronale Differenzierung ^1,2, Zelltypspezifikation ^3,4 und molekulare Logik der Gehirnverdrahtung ^5,6,7. Dieser Fortschritt wurde durch ein ungewöhnlich umfangreiches experimentelles Toolkit vorangetrieben, darunter große Sammlungen zelltypspezifischer genetischer Treiberlinien ^8,9,10, kürzlich umfassende konnektomische Rekonstruktionen 10,11,12 sowie zunehmend detaillierte Einzelzelltranskriptome ^13,14 und Multiomik¹⁵ Datensätze. Zusammen definieren diese Ressourcen neuronale Typen multimodal und ermöglichen präzise genetische Manipulationen. Dadurch kann das Fachgebiet nun zunehmend prädiktive Hypothesen darüber erzeugen, wie spezifische Gene neuronale Identität, Konnektivität und Funktion regulieren¹⁶.. Während die RNA-Sequenzierung bei Einzelzellen wichtige Einblicke in transkriptionelle Zustände liefert, sagt RNA-Häufigkeit nicht immer die Proteinexpression¹⁷ voraus, und viele Störungsexperimente erfordern letztlich direkte, quantitative Messungen sowohl RNA als auch Protein in denselben Neuronen.

Die Single-Molekül-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (smFISH)^18,19 ermöglicht die quantitative Messung der Transkripthäufigkeit mit zellulärer und subzellulärer Auflösung bei gleichzeitiger Erhaltung des anatomischen Kontexts. Die Kombination von smFISH mit Expansionsmikroskopie 20,21,22 hat den Nutzen für intakte Gehirne weiter erweitert, indem das Gewebe in einem schwellbaren Hydrogel physisch vergrößert wird, wodurch die molekulare Überfüllung reduziert, der optische Zugang verbessert und die effektive räumliche Auflösung erhöht wird. In Kombination mit der Hybridisierungskettenreaktion (HCR)-basierter Signalverstärkung²³ ermöglicht expansionsunterstützte smFISH eine robuste Detektion diskreter Transkripte im dicken neuronalen Gewebe und unterstützt die Ganzhirnbildgebung entweder mittels Lichtblatt- oder Konfokalmikroskopie.

Eine Reihe von in-situ-RNA-Bildgebungsmethoden wurde auf das Gehirn von Drosophila angewandt, was unterschiedliche experimentelle Prioritäten widerspiegelt. Expansionsunterstütztes iteratives HCR-FISH hat die ganz-Gehirn-RNA-Detektion ermöglicht,^{räumlich aufgelöst zu werden}. Parallel dazu wurden Whole-Mount-FISH-Ansätze ohne Expansion für RNA-Messungen in genetisch markierten Neuronen eingesetzt, darunter HCR-basierte Aktivitätskartierungsstrategien, die sich auf unmittelbare frühe Gene²⁵ konzentrieren, sowie segmentierungsbasierte Transkriptzählungs-Workflows mit membrangebundenen, genetisch kodierten Markern²⁶. Kommerzielle probebasierte Methoden wie RNAscope haben zudem den Multiplex-RNA-Nachweis in ganzen Gehirnen ermöglicht, oft in Kombination mit Immunhistochemie zur Identifizierung von Zielzellpopulationen²⁷. Zusammen zeigen diese Ansätze, dass eine räumlich aufgelöste RNA-Analyse im Fliegenhirn technisch machbar ist. Hypothesengetriebene Störungsexperimente stellen jedoch einen spezifischeren Anforderungskatalog, der von keinem einzelnen bestehenden Workflow vollständig abgedeckt wird. Viele Methoden priorisieren entweder multiplexartige Entdeckungs-Transkriptkartierung, Aktivitätszustandsprofilierung oder RNA-Quantifizierung allein, wobei die Immunfärbung typischerweise als Zellidentifikator dient und nicht als abgestimmte Anzeige des gestörten Proteins oder ohne genetische Zelltypzuweisung²⁸ angewendet wird. Darüber hinaus würden routinemäßige Anwendungen von der Kompatibilität mit mehreren Bildverarbeitungsplattformen und automatisierten, skalierbaren Analysepipelines profitieren.

Hier präsentieren wir einen integrierten, schrittweisen Workflow für das visuelle System von Drosophila , der expansionsunterstütztes HCR-smFISH mit der vor der Expansion durchgeführten Immunhistochemie kombiniert und so eine paarweise Messung von RNA- und Proteinniveaus in denselben Neuronen innerhalb derselben biologischen Probe ermöglicht. Aufbauend auf dem zuvor entwickelten FlySeg-Framework²⁹ bieten wir eine automatisierte Quantifizierungspipeline für die nukleare Segmentierung und Transkriptzählung, die nukleare und zytoplasmatische Puncta unterscheidet und sowohl Totalexpressionsmessungen als auch transkriptionszustandssensitive Analysen unterstützt. Das Protokoll wird sowohl an einem Lichtblattmikroskop als auch an zwei konfokalen Systemen mit alternativen Montage- und Bildverarbeitungsprozessen demonstriert. Abschließend veranschaulichen wir den Nutzen der integrierten RNA–Protein-Anzeige mit einem repräsentativen Störungsvalidierungsexperiment (d. h. RNAi-vermittelter Knockdown eines definierten Ziels), das praktische Hinweise zu Parametern und Fallstricken gibt, die die Signalqualität, die Gewebeintegrität und die quantitative Leistung beeinflussen.

Dieses Protokoll baut im Allgemeinen auf dem bereits beschriebenen²⁴ EASI-FISH-Rahmen für die Nachweisung von Ganzhirn-RNA in Drosophila auf und behält seine Kernprinzipien RNA-Verankerung, Hydrogel-Expansion und HCR-basierte Signalverstärkung bei. Das vorliegende Protokoll erweitert und verfeinert diesen Ansatz, indem es die Immunhistochemie vor der Expansion integriert, um abgestimmte RNA- und Proteinmessungen in denselben Neuronen zu ermöglichen, mehrere Verarbeitungs- und Handhabungsschritte im gesamten Workflow überarbeitet, um Robustheit und Reproduzierbarkeit zu verbessern, praktische Montage- und Bildgebungsstrategien sowohl für Lightsheet- als auch konventionelle invertierte konfokale Mikroskope bereitstellt und automatisierte Soma-Segmentierung und Transkriptquantifizierung integriert mit expliziter Trennung von Kern- und zytoplasmatischen RNA-Pools.

Dieser Arbeitsablauf eignet sich am besten für gezielte Experimente, bei denen das Ziel ist, definierte RNA- und Proteinwerte in genetisch identifizierten Neuronen zu quantifizieren und dabei den anatomischen Kontext zu bewahren. Sie ist besonders nützlich zur Validierung molekularer Störungen, wenn das Ziel darin besteht, die Hoch- oder Abregulierung eines definierten Gens oder einer kleinen Gruppe von Kandidatengenen zu messen, die Expression über Genotypen oder Entwicklungsstadien hinweg zu vergleichen oder den transkriptionellen Zustand anhand der nuklearen versus zytoplasmatischen Transkriptlokalisierung zu bewerten. Sie ist weniger geeignet für unvoreingenommene Transkriptentdeckung oder High-Plex-Whole-Brain-Expressionskartierung, wo Einzelzellsequenzierung, räumliche Transkriptomik oder iterative multiplexierte FISH-Ansätze geeigneter sein könnten.

Protokoll

Ethikerklärung

Dieses Protokoll verwendet Drosophila melanogaster. Es wurden keine Wirbeltiere oder menschliche Probanden verwendet. Daher war keine Genehmigung des institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -nutzung erforderlich.

HINWEIS: Verwende die RNase-Clean-Technik durchgehend. Tragen Sie Handschuhe, wischen Sie Oberflächen und Werkzeuge mit einer RNase-Dekontaminationslösung ab und bereiten Sie alle Lösungen mit RNase-freiem Wasser vor.

Abbildung 1. Schritt-für-Schritt-Ablauf des Probenvorbereitungsprotokolls (A) Schematische Zeitleiste des Protokolls, die den ungefähren Tagesablauf und die Inkubationsschritte über Nacht angibt. (B–J) Schematische Übersicht der wichtigsten Probenvorbereitungsschritte, von der Hirndissektion und -fixierung über Immunhistochemie, RNA/Protein-Vernetzung, Hydrogel-Einbettung, Verdauung, Sondenhybridisierung und HCR-Signalverstärkung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

1. Hirndissektion, Fixierung und Immunhistochemie (Tag 1–3)

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer Terasaki-ähnlichen Multiwell-Platte aus, sofern nicht anders angegeben. Verwenden Sie 10 μL pro Brunnen für Inkubationen und Wascharbeiten. Halten Sie die Luftfeuchtigkeit, indem Sie ein feuchtes Labortuch in eine Ecke der Platte legen.

VORSICHT: Paraformaldehyd und glyoxale Fixierungsmittel sind toxisch/reizend. Führe sie in einer Abzugshaube und trage geeignete PSA.

1. Zerlege Gehirne in eiskaltem S2-Insektenmedium. Übertrage Gehirne in Brunnen, bis zu 10 Gehirne pro Brunnen (Abbildung 1B–C).
   HINWEIS: Für die hier gezeigten repräsentativen Experimente wurden 72 h-alte Puppengehirne verwendet.
2. Ersetze S2-Medium durch 10 μL Fixativ pro Bohrloch, tausche einmal aus.
3. Addax säurefreies Glyoxal mit 5 % (W/V) Saccharose über Nacht bei 4 °C fixieren (Abbildung 1C).
4. Waschen Sie Gehirne 3 × in 10 μL PBST (0,5 % Triton X-100 in PBS) jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur.
   VORSICHT: Triton X-100 ist ein Reizstoff; Vermeiden Sie Haut- und Blickkontakt.
5. Inkubieren Sie Gehirne in einer 10-μL-Primärantikörperlösung (im PBST, bei den in der Materialtabelle aufgeführten Verdünnungen) 24 Stunden bei 4 °C (Abbildung 1D).
6. Wasche Gehirne 3× für 10 Minuten in 10 μL PBST bei 4 °C. Für jede Waschung wird die Lösung einmal zur Hälfte der Inkubation ersetzt (zwei Austausche pro Wasch).
7. Inkubieren Sie Gehirne in 10 μL Sekundärantikörperlösung (in PBST, bei den in der Materialtabelle aufgeführten Verdünnungen) für 24 Stunden bei 4 °C (Abbildung 1D).
   HINWEIS: Schützen Sie Proben vor Licht.
8. Wasche Gehirne 3× für 10 Minuten in 10 μL PBST bei 4 °C. Für jede Waschung wird die Lösung einmal zur Hälfte der Inkubation ersetzt (zwei Austausche pro Wasch).
   HINWEIS: Verwenden Sie primäre und sekundäre Antikörperkonzentrationen, die 2–3-mal höher sind als die Standard-Ganz-Mount-Immunhistochemie-Konzentrationen
   PAUSENPUNKT: Gehirne in 10 μL 1× PBS bei 4 °C bis zu 96 Stunden lagern.

2. Kovalente Verankerung von RNA und Proteinen (Tag 4) (Abbildung 1E)

VORSICHT: RNA-verankernde Alkylatoren und AcX sind gefährlich (toxisch/reizend; einige gelten als krebserregende Verdacht). Bereite Lösungen in einer chemischen Abzugshaube mit geeigneter PSA vor und handhabe sie. Sammeln Sie alle Abfälle als gefährliche chemische Abfälle.

1. Inkubieren Sie Gehirne in 10 μL eines 20 mM MOPS-Puffers (pH 7,7) für 20 Minuten bei 37 °C.
2. Bereiten Sie eine Verankerungslösung vor, indem Sie 49,5 % (v/v) 20 mM MOPS, 49,5 % (v/v) Melphalan-Lager (2,5 mg·^mL-1 in DMSO) und 1% (v/v) AcX-Lager (10 mg·^mL-1 in DMSO) mischen. Dies ergibt Endkonzentrationen von 1,24 mg^·mL-1 Melphalan und 0,10 mg·^mL-1 AcX.
3. Ersetzen Sie MOPS durch 7–8 μL Verankerungslösung pro Bohrloch, tauschen Sie die Lösung einmal aus und inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C im Dunkeln.
   HINWEIS: Verwenden Sie 7–8 μL, um Überlauf und Querwell-Mischung zu minimieren und gleichzeitig die volle Sample-Abdeckung zu erhalten.

3. Gelation (Einbettung des Gehirns in ein Hydrogel) und Proteinase-K-Verdauung (Tag 5)

VORSICHT: Acrylmonomere, APS und TEMED sind reizend und giftig. Behandle sie mit PSA; Bereite flüchtige/exotherme Komponenten in einer Abzugshaube vor.

1. Befestigen Sie eine 0,5 mm dicke Silikondichtung an einem ungeladenen Glasmikroskop-Objektträger (Abbildung 1F, unten links) und drücken Sie fest, um vollständigen Kontakt und Abdichtung sicherzustellen.
2. Geben Sie 200 μL Poly-L-Lysinlösung in die Kammer und verteilen Sie sie gleichmäßig, um die Oberfläche zu beschichten, inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie die Lösung mit einer Pipette.
3. Lassen Sie das Poly-L-Lysin vollständig verdampfen, bis die Oberfläche sichtbar trocken ist.
   HINWEIS: Die Verdampfung von Poly-L-Lysin ist langsam. Für zuverlässige Ergebnisse bereiten Sie die Kammern im Voraus vor und lassen Sie sie über Nacht in einer staubfreien Umgebung trocknen. Alternativ werden am Tag der Nutzung ≥ 1 Stunde in einem 37 °C Inkubator getrockent.
4. Waschen Sie Gehirne 2× in 10 μL 1× PBS für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur.
5. Stellen Sie eine Gel-Monomerlösung vor und fügen Sie Polymerisationsreagenzien unmittelbar vor der Verwendung hinzu, indem Sie eine Monomerlösung mit 4HT, TEMED und APS (frisch machen) im Verhältnis 47:1:1:1 mischen. Die endgültige Gelierungslösung enthält 1 M Natriumacrylat, 14 % Acrylamid, 0,1 % Bis-Acrylamid, 1× PBS, 0,01 % 4HT, 0,2 % TEMED und 0,2 % APS.
6. Vortex kurz und die endgültige Gelationslösung auf Eis lassen. Verwenden Sie die Lösung sofort.
7. Inkubiere Gehirne in 10 μL kalter Gelationslösung für 15 Minuten auf Eis.
8. Während der Vorausgleichsbewegung schneidet man mit einer neuen Rasierklinge auf jeder Seite der Silikondichtung einen schmalen Kanal, damit Luft beim Befüllen entweichen kann (Abbildung 1F, oben links)
9. Mit einer Pipettenspitze werden die Gehirne in die vorbereitete Gelationskammer übertragen, wobei jedes Gehirn jederzeit in einer Gelationslösung untertaucht bleibt.
   VORSICHT: Nach dem Verankern und Gleichgewicht werden Gehirne sehr klebrig und haften leicht an Plastikoberflächen. Um Probenverlust zu vermeiden, verwenden Sie Pipettenspitzen mit breiter Bohrung oder schneiden Sie das Ende einer Standardspitze ab, um die Öffnung zu verbreitern.
10. Entfernen Sie die Schutzfolie vom Oberflächensilikon-Dichtungskleber und legen Sie vorsichtig einen sauberen 1,5H-Glasdeckel über die Kammer, um eingeschlossene Luftblasen zu vermeiden.
11. Langsam pipettieren Sie 200 μL frisch hergestellte Gelationslösung durch einen der Seitenkanäle in die Kammer, bis die Kammer vollständig gefüllt ist.
12. Stellen Sie die versiegelte Kammer in einen dunklen Behälter und inkubieren Sie bei 37 °C für 2 Stunden.
    HINWEIS: Setze wasserbefeuchtete Labortücher) in den Behälter. Stellen Sie sicher, dass der Schlitten nicht direkt mit flüssigem Wasser in Kontakt kommt.
13. Bereiten Sie einen Verdauungspuffer vor, bestehend aus 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM NaCl, 1 mM EDTA und 0,5 % (v/v) Triton X-100 in RNase-freiem Wasser.
14. Unmittelbar vor der Anwendung wird Proteinase K bei 1:100 aus einem 20 mg·^mL-1-Bestand zu einer Endkonzentration von 0,2 mg·^mL-1 hinzugefügt.
    VORSICHT: Proteinase K ist ein Reizstoff und sollte mit Handschuhen behandelt werden; Vermeiden Sie Einatmen und Hautkontakt.
15. Lassen Sie den Schlitten 5 Minuten bei Zimmertemperatur abkühlen, bevor Sie den Deckel entfernen. Schneiden Sie das Gel mit einem Skalpell in eine rechteckige Form mit einfachen, geraden Schnitten. Minimieren Sie das überschüssige Gelvolumen rund um jedes Gehirn (Abbildung 1F, oben rechts).
16. Geben Sie jedes getrimmte Gel in einen einzelnen Schacht einer 24-Loch-Platte mit einer 1000 μL Verdauungslösung. Stellen Sie sicher, dass die Gele vollständig untergetaucht sind.
17. Versiegeln Sie die Platte mit Parafilm und bebrüten Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Orbitalshaker mit 0,11 g (Abbildung 1G).

4. DNase-Verdauung und HCR-smFISH-Probe-Hybridisierung (Tag 6)

1. Aspirieren Sie die Verdauungslösung vorsichtig mit einer Pipette am Rand des Brunnens, um Kontakt oder Verformung des Gels zu vermeiden.
2. Waschgel 3× mit 500 μL 1× PBS jeweils 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Orbitalshaker von 0,11 g.
   PAUSENPUNKT: Lagern Sie Gels bis zu 7 Tage in 500 μL 1× PBS bei 4 °C auf, bevor Sie fortfahren.
3. Bereiten Sie 500 μL DNase-Arbeitslösung pro Gel vor, indem Sie DNase-I-Bestand aus dem QIAGEN-RNase-freien DNase-Set 1:10 im RDD-Puffer verdünnen. Die endgültige Arbeitslösung enthält etwa 0,27 Kunitz-Einheiten·^μL-1.
4. Inkubieren Sie Gele in 500 μL DNase-Arbeitslösung für 2 Stunden bei 37 °C mit sanftem Schaukeln (Abbildung 1H).
5. Waschgels 4× mit 500 μL RNase-freien 1× PBS jeweils 15 Minuten bei Zimmertemperatur.
6. Gleichgewichtsgel in einem 500 μL vorgewärmten Probe-Hybridisierungspuffer für 30 Minuten bei 37 °C
7. Verdünnter HCR smFISH-Sondenbestand (1 μM; Molekulare Instrumente) 1:300 im Probe-Hybridisierungspuffer auf eine Endkonzentration von ~3,3 nM. Mischung durch Vortexing
8. Ersetzen Sie den Gleichgewichtspuffer durch 500 μL Sondenmischung pro Gel und inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C auf einem Orbitalshaker bei 0,11g (Abbildung I).
   VORSICHT: Sondenhybridisierungspuffer enthalten Formamid, das giftig ist. Verwenden Sie Handschuhe und vermeiden Sie das Einatmen.

5. Hybridisierungskettenreaktion (Tag 7) (Abbildung 1J)

1. Waschgel 3× mit 500 μL vorgewärmtem Sonden-Waschpuffer für jeweils 30 Minuten bei 37 °C auf einem Orbitalshaker bei 0,11 g.
   VORSICHT: Sonden-Waschpuffer enthalten Formamid, das giftig ist. Verwenden Sie Handschuhe und vermeiden Sie das Einatmen.
2. Waschgels 3× mit 500 μL 1× PBS jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Orbitalshaker mit 0,11 g.
3. Gels über Nacht bei Raumtemperatur in 1 ml 1× PBS auf einem Orbitalshaker bei 0,11 g lassen.
   HINWEIS: Eine ausgedehnte Nächt-Spülung verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis, indem sie die Off-Target-Sondenbindung und Hintergrundpunkte reduziert. Für die Bearbeitung am selben Tag gehen Sie direkt zur HCR-Amplifikation.
   PAUSENPUNKT: Nach den Waschen nach der Hybridisierung werden die Gels in 1 ml 1× PBS bei Raumtemperatur oder 4 °C bis zu 96 Stunden vor der HCR-Verstärkung gelagert.
4. Ersetze PBS pro Bohrloch durch einen 500-μL-Verstärkungspuffer (zuvor auf Raumtemperatur ausgeglichen) und inkubiere 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Orbitalshaker bei 0,11 g.
5. Für jedes Sondenset verdünnen Sie die Haarnadeln h1 und h2 (3 μM Stock; Molekulare Instrumente) im Verstärkungspuffer 1:100 (30 nM Endkonzentration). Bereiten Sie pro Bohrloch 350 μL verdünntes Haarnadel-Gemisch vor.
6. Wärmeverdünnte Haarnadellösungen in PCR-Röhren bei 95 °C für 90 Sekunden in einem Wärmezyklus oder Wärmeblock. Verwenden Sie 100 μL Gesamtvolumen pro Röhre, um eine gleichmäßige Heizungs- und Temperaturausgleichung zu gewährleisten.
   HINWEIS: HCR-Richtlinien empfehlen üblicherweise die Snap-Heating Haarnadel H1 und H2 getrennt und sie erst nach dem Abkühlen zu kombinieren. Alternativ kann man H1 und H2 vor dem Snap-Heating kombinieren, wenn eine vereinfachte Handhabung erforderlich ist.
7. Lassen Sie Haarnadeln im Dunkeln 10 Minuten ohne Störung auf Zimmertemperatur abkühlen.
8. Entferne den Amplifikationspuffer und gib pro Muld eine 350 μL Haarnadelmischung hinzu.
9. Inkubieren Sie Gele 2 Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln auf einem Orbitalshaker bei 0,11 g.
10. Waschgel 3× mit 500 μL 5× SSCT jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Orbitalshaker bei 0,11 g.
11. Haarnadellösungen nach der Verstärkung gewinnen, sie vor Licht schützen und bei -20 °C zur Wiederverwendung lagern.
12. Gels auf 500 μL 1× PBS übertragen und 3 × bei Zimmertemperatur 30 Minuten waschen.
13. Gels in 500 μL 1× PBS bei 4 °C aufbewahren, geschützt vor Licht.
    PAUSENPUNKT: Verstärkte Gele können bis zu 2 Wochen vor der Bildgebung mit minimalem Signalverlust gelagert werden.

6. Vorbereitung, Montage und Bildgebung erweiterter Proben (Tag 8) (Abbildung 2)

1. Inkubieren Sie Gele in 1× PBS mit DAPI (1:1000) über Nacht bei 4 °C auf einem Orbitalshaker bei 0,11 g.
2. Verwenden Sie kurze UV-Beleuchtung, um das Gehirn im Gel zu visualisieren. Richte die Probe aus und schneide überschüssiges Gel bei Bedarf ab.
   VORSICHT: UV-Beleuchtung wird während der Probenpositionierung und -montage verwendet. Tragen Sie geeigneten Augenschutz.
3. Aufnahmeproben in 1× PBS ergänzt durch DAPI (1:1000) unter Verwendung der passenden Konfiguration für die ausgewählte Bildgebungsplattform (siehe Tabelle 1).
4. Lassen Sie die Proben mindestens eine Stunde vor der Entnahme im Gleichgewicht ausgleichen.
5. Verwenden Sie Wasserimmersionsobjektive mit ausreichender Arbeitsdistanz, um durch das expandierte Gel zu bilden.
6. Bildproben mit Lichtblattmikroskopie, laserscannender konfokaler Mikroskopie oder rotierender Scheibenkonfokalmikroskopie. Die repräsentativen, plattformspezifischen Montage- und Erwerbsparameter, die in dieser Studie verwendet werden, sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
   HINWEIS: Nach der Bildgebung können Sonden und HCR-Haarnadeln durch die oben beschriebene DNase-Verdauung entfernt werden. Gele können dann weiteren Runden der Probe-Hybridisierung und HCR-Amplifikation unterzogen werden.

Plattform	Beispielvisualisierung, Montage und Lokalisierung	Objektiv / Detektor	Repräsentative Erwerbsumgebungen
Zeiss Lightsheet 7	Verwenden Sie kurze UV-Beleuchtung, um die Gehirnposition im Gel zu visualisieren. Reduzieren Sie überschüssiges Gel und richten Sie jedes Gehirn auf das Erkennungsziel aus. Geben Sie 5–6 Gels auf eine 1 × cm lange, poly-L-lysin-beschichtete Deckschicht mit nach außen gerichteten Gels (Abbildung 2A). Befestigen Sie den Deckzettel mit einem kleinen Tropfen UV-aushärtendes Klebemittel am LS7-Probenhalter; Schalten Sie die UV-Lampe aus, bevor Sie Kleber auftragen. In der LS7-Kammer montieren und Hirnregionen mithilfe von Live-View in ZEN Black lokalisieren.	20×/1,0 NA Wassertaucherkennungsobjektiv; 2,5× optischer Zoom (50× Gesamtvergrößerung).	Z-Step, 0,4 μm bei 2,5× Zoom und 2× Expansion. Pivot-Scanning aktiviert. Belichtung: 50 ms für alle Kanäle. Laser: 405 nm bei 5 %, 488 nm bei 2 %, 561 nm bei 8 %. Strahlung: 420–470 nm, 505–545 nm, 570–620 nm.
			(Abbildung 2C, links)
Nikon Ti2-E AXR NSPARC Laser-scannende Konfokal	Verwenden Sie kurze UV-Beleuchtung, um das Gehirn im Gel zu visualisieren. Richten Sie ein einzelnes Gel so, dass das Gehirn nach unten zum umgekehrten Ziel zeigt. Übertragen auf eine Bildschüssel mit Glasboden, gefüllt mit 1× PBS + DAPI (Abbildung 2B). Lokalisieren Sie das Gehirn mit einem Ziel von 4×, identifizieren Sie ROIs mit einem Ziel von 20 × und registrieren Sie X-Y-Positionen in NIS-Elementen. Fügen Sie ein Immersionsmedium hinzu, überprüfen Sie die registrierten ROIs erneut und bringen Sie sie in den Fokus.	40× Langstrecken-Wasserimmersionsobjektiv (Nikon CFI APO LWD 40× WI, 1,15 NA Lambda S, 0,61 mm Arbeitsentfernung); NSPARC-Detektor im Superauflösungsmodus.	Galvanometer-Scan, 2048 × 2048 Pixel, 1,6 μs/Pixel, 8,0× Zoom. Laser: 488 nm bei 2 %, 640 nm bei 20 %. Emission: 502–546 nm und 666–732 nm.
			(Abbildung 2C, Mitte)
Evident Scientific IXplore IX85 / Yokogawa CSU-W1 rotierende Scheibe konfokal	Muster wie bei der invertierten konfokalen Bildgebung montiert: Richte das Gel so aus, dass das Gehirn zum Objektiv zeigt, und lege es in eine Glasboden-Bildgebungsschüssel mit 1× PBS + DAPI (Abbildung 2B). Identifizieren Sie Interessengebiete, wie sie für die Laserscanning-Konfokalmikroskopie mit der CellSens-Software beschrieben sind.	60× Langstrecken-Wasserimmersionsobjektiv (Olympus LUMFLN60XW LWD, 1,10 NA, 1,5 mm Arbeitsabstand); Hamamatsu ORCA-Fusion BT GenIII Kamera (2304 × 2304 Pixel; 6,5 × 6,5 μm Pixelgröße).	488 nm Anregung bei 75 % Leistung, 200 ms Belichtung; 640 nm Anregung bei 100 % Leistung, 800 ms Belichtung. Emission: 500–550 nm und 665–705 nm.
			(Abbildung 2C, rechts)

Tabelle 1: Repräsentative Einbau-, Probenlokalisierung und Bildgebungsparameter über Mikroskopieplattformen hinweg. Zusammenfassung der Probenmontagestrategien, Lokalisierungsansätze, Ziele und Erfassungsparameter, die über Lichtblatt- und konfokale Mikroskopieplattformen verwendet werden.

7. Quantitative Analyse der RNA- und Proteinexpression

HINWEIS: Wählen Sie den Analyse-Workflow basierend auf dem experimentellen Ziel. Ein Vergleich dieser Ansätze findet sich in Ergänzungstabelle 1.

1. Populationsskalierte Transkriptquantifizierung mit FlySeg.
   HINWEIS: Die Analyse basiert auf der aktualisierten Version der FlySeg^29-Pipeline. Ein schematischer Überblick über den Analyse-Workflow ist in Abbildung 3A–B dargestellt.
   1. Installieren Sie FlySeg, ein Python-basiertes Paket, indem Sie eine Conda-Umgebung erstellen, indem Sie Folgendes verwenden:
      conda env create -f environment.yml
   2. Aktivieren Sie die Umgebung vor der Analyse mit:
      Conda Activate Flyseg
   3. Beginnen Sie die Analyse mit:
      Python main.py --file <input_file>
      Verwenden Sie unterstützte Eingabeformate, einschließlich CZI- oder NPY-Dateien.
   4. Passe die Analyse bei Bedarf mit optionalen Argumenten an, darunter:
      Anzahl der Kanäle (--Kanäle)
      Kernkanal (--nuclei_ch oder --nuclei_wavelength)
      Zytoplasmakanal (--cytoplasm_ch oder --cytoplasm_wavelength)
      Nachweisparameter der Kerne (--nuclei_sigma_range, --nuclei_threshold)
      Kerndilatationsfaktor (--nuclei_dilation)
      FISH-Nachweisschwellenwerte (--fish_threshold_range)
      Ausgabeverzeichnis (--output_dir)
      Visualisierung über Napari (--visualisieren)
   5. Zeigen Sie alle verfügbaren Optionen an:
      Python main.py – Hilfe
   6. Inspizieren Sie Bildmetadaten mit:
      Python main.py --metadata_only.
      Voxelgröße, Anzahl der Kanäle und Kanalidentität bestätigen.
   7. Führen Sie die Analyse mit Parametern aus, die entsprechend für den Datensatz angepasst sind. Typischerweise wird die Gesamtanzahl der Kanäle, der Kernkanal, der Zytoplasmakanal (sofern vorhanden) und der Nukleardilationsfaktor angegeben.
      HINWEIS: Setzen Sie den --nuclei_dilation Wert für die gewünschte Kern-/zytoplasmatische Grenze ein. Siehe Abbildung 3C–D als Beispiel.
   8. Überwachen Sie das Verarbeitungsprotokoll. Alle Ausgaben werden in einem Ordner gespeichert, der nach der Eingabedatei benannt ist.
   9. Identifizieren Sie die primären Ergebnisse für die nachgelagerte Analyse, darunter:
      1. -Nuclei-df.csv
         die pro-nukleus Merkmalsmessungen und zugehörige Puncta-Zählungen für jeden FISH-Kanal enthält und quantitative Daten für die statistische Analyse liefert.
      2. -Nuclei-equivalent-diameter-area-scatter.png
         Das ist ein Streudiagramm, das verwendet wird, um Segmentierungsausreißer basierend auf der Kerngröße und -intensität zu identifizieren; schließen als Ausreißer markierte Kerne aus der weiteren Analyse aus.
   10. Verwenden Sie zusätzliche Zwischenausgaben (z. B. Segmentierungsmasken, Puncta-Erkennungstabellen und zusammengeführte FISH-Zusammenfassungsdateien) für fortgeschrittene Nachbearbeitung, falls erforderlich.
2. Transkriptzählung in individuell identifizierbaren Zellen mit Imaris
   1. Mit dem Surfaces-Tool segmentieren Sie das interessierende Neuron basierend auf einem zytoplasmatischen oder Membranmarkerkanal.
   2. Stellen Sie die Parameter für Oberflächenglättung und Intensitätsschwellenwerte an, um sicherzustellen, dass die resultierende Oberfläche das Soma genau umschließt, während benachbarte Strukturen ausgeschlossen werden.
   3. Mit dem Spots-Erkennungstool identifizieren Sie die Transkriptpunkte im FISH-Kanal. Stellen Sie den geschätzten Fleckdurchmesser und die Intensitätsschwelle basierend auf der Puncta-Größe und der Signalintensität ein (z. B. 0,25 μM für 2x Gewebeausdehnung).
   4. Beschränken Sie die Punkterkennung auf die zuvor erzeugte Oberfläche, um sicherzustellen, dass nur Puncta innerhalb des Neurons gezählt werden.
   5. Extrahieren Sie die Gesamtzahl der erkannten Flecken innerhalb der Neuronenoberfläche mithilfe des Statistik-Panels.
   6. Exportiere Spotzählungen und zugehörige Messungen für die nachgelagerte Analyse.
3. ROI-basierte Fluoreszenzquantifizierung mit FIJI/ImageJ
   1. Open Image stackt in FIJI und erzeugt Maximumintensitätsprojektionen mit Image > Stacks > Z Project > Maximum Intensity Projection. Verwenden Sie identische Projektionseinstellungen für alle Proben innerhalb eines Experiments.
   2. Identifizieren Sie die interessierende neuronale Struktur mithilfe eines anatomischen Markerkanals (z. B. membran- oder zytoplasmatischer GFP). Mit dem Freihand- oder Polygonauswahlwerkzeug können Sie manuell den ROI markieren, der der Struktur entspricht (z. B. Giant Fiber Dendrite).
   3. Wechsle zum Proteinkanal und messe die Fluoreszenzintensität innerhalb des definierten ROI mit Analyze > Measure. Zeichnen Sie folgende Parameter auf: Mittlere Fluoreszenzintensität; Integrierte Dichte; ROI-Bereich.
   4. Messen Sie die Fluoreszenzintensität in einem nahegelegenen Hintergrund-ROI ähnlicher Größe, das kein spezifisches Signal enthält und außerhalb der markierten neuronalen Struktur liegt. Verwenden Sie dieselbe Hintergrund-ROI-Strategie für alle Proben im Experiment und ziehen Sie den Hintergrundwert von der ROI-Messung ab.
   5. Verwenden Sie hintergrundkorrigierte integrierte Dichte- oder mittlere Intensitätswerte für den quantitativen Vergleich zwischen Genotypen oder experimentellen Bedingungen. Stellen Sie sicher, dass für alle zu vergleichenden Proben identische Bildeinstellungen verwendet werden.

Ergebnisse

Um den expansionsunterstützten HCR-smFISH- und immunhistochemischen Workflow in einem biologisch relevanten Kontext zu validieren, konzentrierten wir uns auf den drohenden Fluchtkreislauf des visuellen Systems von Drosophila. Dieser Schaltkreis besteht aus genetisch definierten LC4-visuellen Projektionsneuronen^30,31, die drohende Reize erkennen, sowie einem gut charakterisierten Giant Fiber (GF) absteigenden Neuronen, die schnelle Abflüge^{antreiben 32,33}, was ein anatomisch stereotypisiertes System für zelltypspezifische molekulare Messungen in intakten Gehirnen bietet.

Das Drosophila-Gap-Junction-Protein Shaking-B (ShakB)³⁴ wurde an der elektrischen Übertragung innerhalb mehrerer Komponenten der GF-Schaltung beteiligt, einschließlich axonaler Ausgangssynapsen³⁵ und auditiven Eingängen³⁵. Obwohl direkte Hinweise auf elektrische Kopplung an den GF-Dendriten während der drohenden Detektion begrenzt sind, zeigen neuere Forschungen, dass LC4-Neuronen hohe Werte von Shak B³⁶ exprimieren. Diese Beobachtungen motivierten den Einsatz von ShakB-Knockdown- und Markierungsstrategien als Testfall, um zu bewerten, ob das Protokoll gezielte molekulare Störungen sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene in genetisch definierten neuronalen Typen quantitativ bewerten kann.

Zunächst bewerteten wir die Effizienz des ShakB-Knockdowns im GF und LC4 mit HCR-smFISH in Kombination mit ShakB-Antikörperfärbung. Der GF, ein einzelnes Neuron pro Hemihirn, wurde mit einem Membranmarker markiert (Abbildung 4A). LC4, eine Population von etwa 60 Neuronen pro Hemihirn, wurden mit einem Kernmarker markiert, um eine populationsebene Quantifizierung zu ermöglichen (Abbildung 4B). Im Kontrollgehirn wurden ShakB-Transkripte sowohl im GF- als auch im LC4-Neuron klar nachgewiesen. Die Expression von shakB-RNAi führte zu einer signifikanten Reduktion der shakB-mRNA-Puncta in gezielten Neuronen beider Zelltypen (Abbildung 4C–D). Im Einklang mit der zytoplasmatischen Stelle der RNA-Interferenz war die Transkriptdepletion am ausgeprägtesten im zytoplasmatischen Kompartiment. Die Trennung von nukleären und zytoplasmatischen Puncta mittels der FlySeg-basierten Quantifizierung zeigte eine selektive Reduktion der zytoplasmatischen ShakB-Transkripte in der LC4-Population, während Nuklearpuncta signifikant weniger betroffen waren (Abbildung 4D, 69 % vs. 22 % Reduktion).

Wir fanden eine ShakB-Antikörperfärbung, die auf Bereiche lokalisiert ist, in denen GF-Dendriten mit den Axonen der riesigen kommissuralen Interneuronen (GCI) überlappen, welche die beiden Riesenfasern verbinden und kontralaterale visuelle Reaktionen^{ermöglichen 37} (Abbildung 4E). Diese Beobachtungen stimmen mit früheren Studien³⁵ überein, die eine ShakB-abhängige elektrische Kopplung zwischen GF und GCI demonstrieren. ShakB-Antikörperfärbungen wurden auch in Regionen beobachtet, in denen LC4-Axone GF-Dendriten berühren, obwohl die Lokalisierung in diesem Bereich weniger klar aufgelöst wurde. Unabhängig von der genauen subzellulären Lokalisierung war das ShakB-Antikörpersignal, das mit der GF-dendritischen Region assoziiert ist, nach RNAi-Expression deutlich reduziert (Abbildung 4F).

Die antikörperbasierte Detektion erlaubt jedoch keine eindeutige Zuordnung des ShakB-Proteins zu präsynaptischen LC4-Endpunkten im Gegensatz zu postsynaptischen GF-Dendriten an Kontaktstellen. Darüber hinaus begrenzt die weit verbreitete Expression von ShakB im gesamten visuellen System^34,36 die zelltypspezifische Quantifizierung in LC4-Neuronen mittels Anti-ShakB-Immunfärbung. Um diese Einschränkungen zu überwinden und die zelltypspezifische ShakB-Lokalisierung direkt zu bewerten, verwendeten wir ein endogent markiertes ShakB-Allel, das wir zuvor^36,38 erzeugt hatten. Dies ermöglichte eine selektive Visualisierung des ShakB-Proteins speziell innerhalb von LC4-Neuronen. SmGdP-10×V5-markierte ShakB wurde sowohl in Dendriten (entsprechend den Eingaberegionen von vorstromaufen visuellen Neuronen) als auch in Axonterminalen, die mit den GF-Dendriten in Kontakt treten, angereichert (Abbildung 4G). Die Expression von ShakB-RNAi führte zu einem nahezu vollständigen Verschwinden des V5-Signals sowohl in dendritischen als auch in axonalen Kompartimenten (Abbildung 4H). Diese Ergebnisse zeigen, dass das Protokoll eine zelltypspezifische und subzelluläre Auflösung der endogenen Proteinlokalisierung innerhalb dicht innervierter Neuropil ermöglicht.

Als zusätzliche qualitative Kontrollgruppe testeten wir nicht-expandierte FISH in Kombination mit Immunhistochemie in identifizierten neuronalen Populationen (ergänzende Abbildung 1). FISH-Signal von grd überlappte sich mit LC22-Somata, was mit der vorhergesagten Expression aus den ScRNA-seq-Daten des optischen Lappens übereinstimmt (Ergänzende Abbildung 1A–C)¹³. In Tm3-Neuronen, die tdTomato exprimieren, überlappte sich tdTomato mRNA mit dem tdTomato-Protein, während VGlut1 mRNA nicht mit Tm3 Somata überlappte, was mit der cholinergen Identität der Tm3-Neuronen übereinstimmt (Ergänzende Abbildung 1)¹³. Diese Beispiele zeigen, dass nicht-expandierte FISH + IHC für die qualitative Präsenz-/Abwesenheitsbewertung ausreicht, während eine Erweiterung für eine zuverlässige Einzelpunkt-Quantifizierung erforderlich ist.

Die erfolgreiche Umsetzung dieses Protokolls zeigt sich in klarer zelltypspezifischer Markierung, diskreter smFISH-Puncta mit niedrigem Hintergrund, zuverlässiger Segmentierung einzelner Kerne oder manuell definierter Zellvolumina sowie einer konsistenten Reduktion des Ziel-RNA- oder Proteinsignals nach der Störung. Negative oder niedrige Signalergebnisse sollten ebenfalls interpretierbar sein: Zum Beispiel erzeugte shakB-RNAi ein reduziertes ShakB-mRNA - und ShakB-Proteinsignal, während nicht-expandierte FISH trotz klarer tdTomato-mRNA-Detektion ein Fehlen des VGlut1-Signals in Tm3-Somaten zeigte. Suboptimale Ergebnisse umfassen schwache Antikörper- oder smFISH-Signale, hohe Hintergrundpuncta, unvollständige Segmentierung, Puncta-Fehlzuweisung oder Probendrift während der Bildgebung, die alle die nachgelagerte Quantifizierung beeinflussen können.

Abbildung 2. Montage und Bildgebung erweiterter Proben mit Lichtblatt- und Konfokalmikroskopieplattformen. (A) Visualisierung und Abschneiden von expandierten Hydrogelen (1–2), die allen Bildgebungsplattformen gemeinsam sind, gefolgt von der Montage für Lichtblattmikroskopie (3–4; Zeiss Lightsheet 7). (B) Fotografie einer erweiterten Probe, die auf einem invertierten laserabtastenden konfokalen Mikroskop (Nikon Ti2-E AXR) montiert ist. (C) Repräsentative einzelne optische Schnitte (einzelne Z-Ebenen) einer erweiterten Probe des Drosophila-visuellen Systems (LC4-Neuronen, markiert mit einem fluoreszierenden Kernmarker), untersucht auf ShakB-mRNA (siehe Abbildung 4), aufgenommen über drei Bildgebungsplattformen. Skalenbalken, 10 μm (Gewebe nach der Expansion). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3. Quantitative Analyse von smFISH-puncta mit FlySeg. (A) Schematische Übersicht des FlySeg-Analyse-Workflows für automatisierte Segmentierung und Puncta-Quantifizierung innerhalb identifizierter Zellen. (B) Dreidimensionale Voronoi-Tessellation, die die Kernsegmentierungslogik von FlySeg veranschaulicht. Das Bildvolumen ist in räumliche Bereiche unterteilt (jeweils in einer eigenen Farbe dargestellt), wobei jede Partition maximal einen Kern enthalten darf, um eine Einzelzellzuweisung zu gewährleisten. Innerhalb jeder Voronoi-Domäne wird der Kern mithilfe eines funktionalen Optimierungsverfahrens segmentiert, das die optimale Kernoberfläche anhand sowohl der nuklearen als auch der umgebenden zytoplasmatischen Intensitätswerte bestimmt. (C) Demonstration der --nuclei_dilation Möglichkeit zur Unterscheidung von nuklearen und zytoplasmatischen Transkripten: Ein einzelner optischer Schnitt, der einen GFP-markierten Kern zeigt, umgeben von smFISH-puncta, mit diffusem DAPI-Signal, das das zytoplasmatische Kompartiment nach der DNase-Behandlung umreißt. Die Linien zeigen die Dilatationsfaktoren von 0 und 0,5 an, was den Kern- bzw. zytoplasmatischen Volumina entspricht. (D) Maximalintensitätsprojektion von (C), was zeigt, dass Puncta sowohl das nukleare als auch das zytoplasmatische Kompartiment lokalisiert. Skalenbalken, 10 μm (Gewebe nach der Expansion). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4. Validierung des quantitativen Workflows mittels RNAi-vermittelter molekularer Störung (A) Lichtblattprojektionen (10 μm Dicke, decken nicht das gesamte Zellvolumen ab) des Giant Fiber (GF)-Soma, die mit einem Membranmarker markiert und unter Kontroll- (oben) und ShakB-RNAi-Bedingungen auf ShakB-mRNA untersucht werden. Gestrichelte grüne Umrisse zeigen Soma-Ränder an, um die Erschöpfung des zytoplasmatischen, aber nicht des nuklearen mRNA-Pools hervorzuheben. n, Gehirne (eine Seite pro Tier). (B) dasselbe wie (A) für LC4-Neuronen, die mit einem Kernmarker markiert sind. (C) Quantifizierung von shakB FISH puncta in GF-Neuronen (kombinierte nukleare und zytoplasmatische Pools) unter Kontroll- und shakB-RNAi-Bedingungen. Punkte stellen einzelne Neuronen dar (ein Neuron pro Gehirn, eine Seite pro Tier). (D) Dasselbe wie (C) für LC4-Neuronen. Punkte stellen einzelne Gehirne dar (eine Seite pro Tier; Puncta-Zahl pro Zelle gemittelt pro Gehirn). (E) Konfokale Projektionen der GF-Dendriten, die mit einem Membranmarker markiert und für ShakB unter Kontrollbedingungen (oben) und ShakB RNAi (unten) gefärbt sind. (F) Quantifizierung der ShakB-Proteinspiegel in den GF-Dendriten, gemessen als mittlere Fluoreszenzintensität unter Kontrolle und GF>shakB-RNAi-Bedingungen. n, Gehirne (eine Seite pro Tier). (G) Konfokale Projektionen von LC4-Neuronen, die mit einem Membranmarker markiert sind und unter Kontroll- (oben) und ShakB-RNAi-Bedingungen (unten) mit SMGDP-10xV5-markierten ShakB exprimieren. Gestrichelte grüne Umrisse zeigen Bereiche von LC4-Dendriten und Axonterminalen, auf denen die ShakB-V5-Dichte gemessen wurde (H) Quantifizierung der ShakB-smGdP-V5-Proteinwerte in den LC4-Dendriten und Axonterminalen gemessen als mittlere Fluoreszenzintensität unter Kontrolle und LC4 > ShakB-RNAi-Bedingungen. n, Gehirne (eine Seite pro Tier). Fehlerbalken zeigen den Mittelwert ± SEM an. Alle statistischen Vergleiche wurden mit zweiseitigen Welch-T-Tests durchgeführt. Skalenbalken, 10 μm in allen Bildern (Gewebe nach der Expansion). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Dieses Protokoll kombiniert expansionsunterstütztes HCR-smFISH, Pre-Expansion-Immunhistochemie und segmentierungsbasierte Transkriptquantifizierung, um abgestimmte RNA- und Proteinmessungen in denselben genetisch definierten Neuronen zu ermöglichen. Durch die Integration dieser Komponenten in einen einzigen Arbeitsablauf sollte diese Methode eine quantitative, zelltypspezifische molekulare Analyse im intakten Gehirn von Drosophila ermöglichen.

Mehrere hier eingeführte praktische Modifikationen stellen entscheidende Schritte zur Kombination der Immunhistochemie mit expansionsunterstütztem HCR-smFISH im Gehirn von Drosophila ²⁴ dar. Zunächst sollte die Immunhistochemie vor Gewebeexpansion und smFISH durchgeführt werden. Da das Protokoll einen Proteinase-K-Verdauungsschritt beinhaltet, kann die Durchführung der Immunhistochemie nach der Expansion die Integrität der Epitope verringern. Wichtig ist, dass die Pre-Expansion-Antikörperinkubation (24 Stunden primär + 24 h sekundär) die RNA-Signalintensität nicht merklich reduziert, wenn die RNase-Clean-Technik und kovalente RNA-Verankerung verwendet werden. Zweitens sollten primäre und sekundäre Antikörperkonzentrationen erhöht werden, typischerweise um 2–3 × im Vergleich zu Standard-Whole-Mount-IHC, um den Signalverlust im Zusammenhang mit der Verdauung und Gewebeexpansion der Proteinase-K-Flüssigkeit auszugleichen. Drittens sind Fixationsbedingungen wichtig, um sowohl das Protein- als auch das RNA-Signal zu erhalten. Die säurefreie glyoxale Fixierung verbessert die Erhaltung der punktaten-synaptischen Proteinlokalisierung, erhält die strukturelle Integrität neuronaler Prozesse und beeinträchtigt die quantitative Detektion von mRNA-Puncta nicht. Wir beobachteten außerdem, dass die gleichzeitige Verankerung von RNA und Protein sowohl mit der nachgelagerten HCR-smFISH- als auch mit der Immunfluoreszenzdetektion kompatibel ist. Zusammen verbessern diese Anpassungen die Kompatibilität zwischen Immunhistochemie und expansionsunterstützter Transkripterkennung.

Die Erweiterung fügt einen einzelnen Übernachtungsschritt hinzu und ist technisch nicht komplex, aber ihre Anwendung hängt vom experimentellen Ziel ab. Wie in ergänzender Abbildung 1 gezeigt, reicht nicht-expandiertes FISH in Kombination mit Immunhistochemie aus, um zu beurteilen, ob ein Gen in einem bestimmten Zelltyp exprimiert wird, während eine Expansion erforderlich ist, wenn einzelne smFISH-Puncta zuverlässig aufgelöst, dem einzelnen Somata zugeordnet und quantitativ analysiert werden müssen, aufgrund der erheblichen Zunahme der effektiven räumlichen Auflösung. Ebenso sind Terasaki-ähnliche Mehrbrunnenplatten nicht zwingend erforderlich, reduzieren jedoch den Reagenzverbrauch, ermöglichen die parallele Verarbeitung mehrerer Bedingungen und helfen, die Probenidentität über kleine Chargen hinweg zu erhalten; Standard-Mikrozentrifugenröhren können auch verwendet werden, wenn das Reagenzvolumen weniger begrenzt ist. Obwohl die Lichtblattmikroskopie eine schnelle volumetrische Bildgebung von erweitertem Gewebe ermöglicht, zeigen wir, dass standardmäßige invertierte Laserscanning- und rotierende Scheibenkonfokalsysteme für eine vollständige Bildgebung der ausgewählten neuronalen Populationen im erweiterten Drosophila-Gehirn ausreichen. Eine häufige Einschränkung der konfokalen Mikroskopie ist die kurze Arbeitsdistanz. Da das Fliegenhirn jedoch klein ist und die Proben in PBS etwa 2 × erweitert werden, bieten Wassertauchobjektive auf langen Arbeitsdistanzen eine ausreichende Eindringtiefe. Für quantitative Vergleiche sollten die Aufnahmeeinstellungen über Proben hinweg identisch bleiben, gesättigte Pixel vermieden und die Voxelgröße ausreichen, um einzelne smFISH-Puncta aufzulösen. Dies erweitert die Zugänglichkeit des Protokolls für Labore ohne dedizierte Lightsheet-Instrumentierung.

Die aktualisierte FlySeg-Implementierung baut auf dem zuvor veröffentlichten FlySeg-Framework auf und führt zwei Hauptergänzungen für dieses Protokoll ein. Erstens ermöglicht ein konfigurierbarer Kerndilatationsparameter die klassifizierung von smFISH-puncta als nuklear oder zytoplasmatisch basierend auf ihrer räumlichen Beziehung zu segmentierten Kernen. Die zytoplasmatische DAPI-Färbung nach der Behandlung mit DNase ist für diesen Schritt wichtig, da sie ein diffuses Signal liefert, das den Zellkörper umreißt, und eine zuverlässige nukleare Segmentierung unterstützt, wodurch die Trennung von nukleären und zytoplasmatischen Transkriptpools unterstützt wird. Zweitens identifiziert die automatisierte Ausreißererkennung schlecht segmentierte Kerne, die von der nachgelagerten Quantifizierung ausgeschlossen werden können. Über die Bewertung der molekularen Effekte des zelltypspezifischen Gen-Knockdowns hinaus kann die Trennung von Kern- und zytoplasmatischen Transkripten informativ sein, wenn die Transkriptlokalisierung die laufende transkriptionelle Aktivität widerspiegelt. Im Gehirn der Säugetiere erscheinen aktivitätsinduzierte unmittelbare frühe Gentranskripte zuerst im Zellkern und akkumulieren anschließend im Zytoplasma, während mRNAs verarbeitet^{und exportiert} werden, ein Prinzip, das in der CatFISH-40-Analyse neuronaler Aktivierungszeiten verwendet wird. Ob vergleichbare transkriptionelle Dynamiken im Gehirn von Drosophila auftreten, ist derzeit unbekannt, aber dies kann prinzipiell mit dem aktuellen Arbeitsablauf untersucht werden. In anderen Puls-Chase-Experimenten kann die Unterscheidung von Kern von zytoplasmatischer Puncta daher zeitliche Informationen über die Gesamtzahl der Transkriptzahlen hinaus liefern. Gleichzeitig ist der Arbeitsablauf nicht auf die nukleare Segmentierung beschränkt und kann an Whole-Soma (d. h. membrandefinierte) Zellsegmentierung angepasst werden. Der aktuelle quantitative Workflow ist für neuronale Somata optimiert; obwohl Neuropil-Regionen abgebildet werden können, würde die quantitative Zuordnung von mRNA-Puncta zu einzelnen Axonen oder Dendriten zusätzliche kompartmentspezifische Segmentierungsstrategien erfordern. FlySeg ist am nützlichsten für automatisierte, hochdurchsatzfähige Quantifizierung in dichten neuronalen Populationen, bei denen Populationsstatistiken erforderlich sind. Für individuell identifizierbare Neuronen oder manuell definierte Kompartimente könnten andere Werkzeuge wie Imaris oder FIJI/ImageJ geeigneter sein. Eine Zusammenfassung dieser Quantifizierungsstrategien, einschließlich ihrer Hauptanwendungen, Vorteile und Einschränkungen, findet sich in Ergänzungstabelle 1.

Häufige Fehlerbehebungspunkte sind schwaches Antikörpersignal, hoher smFISH-Hintergrund, Gelschäden oder Probenverluste, Probendrift während der Bildgebung und schlechte Segmentierung. Das schwache Antikörpersignal kann oft verbessert werden, indem die Antikörperkonzentration weiter erhöht oder die primären und/oder sekundären Antikörperinkubationen von 24 auf 48 Stunden verlängert werden. Der hohe smFISH-Hintergrund kann oft durch Verlängerung der Post-Hybridisierungs-Washes und das Vermeiden von gesättigten Erfassungseinstellungen reduziert werden. Gelschäden und Probenverlust werden durch die Verwendung von Breitbohr-Spitzen, das Trimmen von Gelen mit geraden Schnitten und das Schneiden von Lüftungskanälen minimiert, um Blasen während der Kammerfüllung zu verhindern. Die Probendrift während der Bildgebung wird durch das Ausgleich der montierten Gels für mindestens eine Stunde vor der Aufnahme reduziert; Wenn Drift anhält, kann das Gleichgewicht auf 2 Stunden oder länger verlängert werden. Schlechte Segmentierung kann durch schwache zytoplasmatische DAPI-Färbung oder unvollständige Probengleichgewichtsbildung entstehen, was das Zellgrenzsignal reduzieren oder X-Y-Z-Verschiebungen während der Aufnahme verursachen kann; diese sollten vor der Anpassung der FlySeg-Parameter überprüft werden. In diesem Protokoll werden die Gele in 1× PBS aufrechterhalten, was zu einer isotropen Expansion von etwa 2× führt. Wenn eine höhere räumliche Auflösung erforderlich ist, kann eine größere Ausdehnung in verdünntem PBS oder deionisiertem Wasser erreicht werden. Umgekehrt, wenn das Ziel nur darin besteht, das Vorhandensein oder Fehlen von Expression in einem definierten Zelltyp zu beurteilen, kann nicht-expandiertes FISH in Kombination mit Immunhistochemie ausreichen, wie in ergänzender Abbildung 1 gezeigt. Das Protokoll bleibt mit iterativen FISH-Workflows kompatibel. Sonden und HCR-Haarnadeln können durch eine DNase-Behandlung entfernt werden, was zusätzliche Runden der Hybridisierung und Amplifikation im selben Exemplar ermöglicht. Zukünftige technische Erweiterungen könnten HCR-smFISH, automatisierte Registrierung über Bildrunden, verbesserte Ganzzell- oder Neuritsegmentierung sowie standardisierte Analysepipelines zum Vergleich von RNA- und Proteinsignalen über Experimente hinweg umfassen. Die weitere Entwicklung kompartimentspezifischer Segmentierungsstrategien könnte die quantitative Analyse über neuronale Somaten hinaus auf Axone und Dendriten ausweiten. Zusammen machen die kombinierte RNA-Protein-Auslesung, die kompartimentaufgelöste Transkriptquantifizierung und die Kompatibilität mit Standardbildgebungsplattformen diesen Arbeitsablauf geeignet für gezielte molekulare Validierungsexperimente in genetisch definierten Neuronen des intakten Drosophila-Gehirns .

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10N Natriumhydroxidlösung	Fisher Scientific	Kat# SS255-1
1N Natriumhydroxidlösung	Fisher Scientific	Katze# SS266-1
20-facher Kochsalz-Natriumcitrat-Puffer	Invitrogen	Katze# AM9763
4-Hydroxy-TEMPO	Sigma-Aldrich	Katze# 176141
5M Natriumchloridlösung	Sigma-Aldrich	Kat# S5150
Acrylamid	Sigma-Aldrich	Katze# A9099
Acrylsäure	Sigma-Aldrich	Kat# 147230
Acryloyl-X, SE	Invitrogen	Kat# A20770
Adobe Illustrator	Adobe	N/A
Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Huhn (1:200)	Jackson ImmunoResearch Labs	Cat# 103-545-155, RRID:AB_2337390
Alexa Fluor 568 Ziegen-Anti-Maus IgG1 (1:200)	Invitrogen	Katze# A-21124, RRID:AB_2535766
Alexa Fluor 568 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG1 (1:200)	Invitrogen	Katze# A-11011, RRID:AB_143157
Ammoniumpersulfat	Sigma-Aldrich	Katze# A3678
Wasserfreies DMSO	Sigma-Aldrich	Kat# 900645-4X2ML
Bondischer UV-Aushärtungsklebstoff	Bondic	Bondic-Starterkit
cellSens Bildgebungssoftware v4.4.1	Offensichtliche Wissenschaft	N/A
Polyklonales Anti-GFP (1:400)	Abcam	Katze# ab13970, RRID:AB_300798
Conda (Umweltmanager)	Anaconda, Inc	N/A
Corning & Trade; Frosted Microscope Slides	Corning	Kat# 2948-75X25
Individuell entworfener LS7-Samplehalter	Janelia Tech	ID 2021-021
DAPI	Sigma-Aldrich	Kat# D9542
Einweg-Edelstahl-Skalpell	MedPride	MPR-47101
Ethylendiamintetraessigsäure	Sigma-Aldrich	Cat# EDS-100G
Fiji (ImageJ) Bildanalyse-Software v2.14.0	ImageJ Konsortium	N/A
FlySeg (benutzerdefinierte Pipeline)	https://github.com/avaccari/DrosophilaFISH	N/A
GAF-Fixationslösung	Addax Biosciences	Katze# VI25
GenClone® 24 Zellkulturplatten, unbehandelt	Genesee Scientific	Cat# 25-102
GMR-86D05-Gal4 (LC4)	Bloomington Stock Center	#41315
Ziegenserum Spenderherde	Sigma-Aldrich	Kat# G6767
HCR™ RNA-FISH(v3.0) Verstärkerpuffer	Molekulare Instrumente	N/A
HCR™ RNA-FISH(v3.0) Verstärker: AF546, JF669	Molekulare Instrumente	N/A
HCR™ RNA-FISH(v3.0) Probe-Hybridisierungspuffer	Molekulare Instrumente	N/A
HCR™ RNA-FISH(v3.0) Sonden-Waschpuffer	Molekulare Instrumente	N/A
HCR™ RNA-FISH(v3.0) ShakB-Sonde	Molekulare Instrumente	N/A
Imaris 10.1	Oxford Instruments	N/A
IXPlore IX85 SpinSR Spinning Disk Konfokalmikroskop	Offensichtliche Wissenschaft	N/A
LS7 Light Sheet Microscope	Carl Zeiss	N/A
Melphalan	Cayman Chemical	Kat# 16665
MOPS Buffer	Fisher Scientific	Kat# BP308-100
Maus monoklonaler Anti-V5 (SV5-Pk1) (1:100)	Abcam	Katze# ab27671, RRID:AB_471093
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin	Sigma-Aldrich	Katze# T7024
N,N'-Methylenbisacrylamid	Sigma-Aldrich	Kat# M7279
Napari	Open-Source-Community	N/A
NIS-Elements Advanced Research Bildbildgebungssoftware	Nikon Corporation	N/A
Nukleasefreies Wasser	Qiagen	Katze# 129114
Nunk und Handel; MiniTrays mit Nunclon™ Delta-Oberfläche	Invitrogen	Katze# 163118
PBS (10x), pH 7,4 nbspoon;	Gibco	Katze# 70011044
Photo-Flo Waschmittel	Elektronenmikroskopiewissenschaften	Kat# 74257
Poly-L-Lysin-Lösung	Ted Pella	Kat# 18026
Präzisionsabdeckungsgläser, #1,5H Dicke	Thorlabs	Katze# CG15CH2
Press-zu-Siegel & Handel; Silikon-Isolator mit Klebstoff, ein Schacht, 20 mm Durchmesser, 0,5 mm tief	Invitrogen	Kat# P24740
Proteinase K	Neuengland  Biolabore	Cat# P8107S
Rabbit Anti-ShakB (1:400)	Geschenk von Geord Ammer	N/A
RNase AWAY & TRADE; Oberflächendekontaminant	Invitrogen	Kat# 7002
RNase-Free DNase Set	Qiagen	Kat# 79256
Schneider' s Drosophila Medium	Gibco	Katze# 21720001
shakB-KDRT-stop-KDRT-smGdP-V5;	Frighetto et al., 2025	PMID: 41278920
Natriumazid	Sigma-Aldrich	Kat# S8032
Stemi 508 Stereomikroskop	Carl Zeiss	N/A
SYTO™ 41 Blaue fluoreszierende Nukleinsäurefärbung	Invitrogen	Kat# S11352
Ti2E AXR NSPARC Laser-Scanning-Konfokalmikroskop	Nikon Corporation	N/A
Tris Base	Fisher Scientific	Kat# BP152-500
Triton & Trade; X-100	Sigma-Aldrich	Katze# T8787
UAS-GFP-2A-KDR;	Sanfilippo et al. 2024	PMID: 38262414
UAS-his2A-GFP;	Dombrovski et al., 2025	PMID: 40468081
UAS-mCherry RNAi	Bloomington Stock Center	#35785
UAS-myr::GFP;	Bloomington Stock Center	#32198
UAS-shakB RNAI	Ammer et al., 2022	PMID: 35385694
UltraPure™ 1M Tris-HCI, pH 8,0 & NBSP;	Invitrogen	Katze# 15568025
VT042336-Gal4 (Riesenfaser)	Dombrovski et al., 2025	PMID: 40468081
Zen Black 3.1	Carl Zeiss	N/A