Forschungsartikel

Acupotomie reguliert die RIC8A/P38-MAPK-Achse auf Basis des CircRNA-Gerüsts, um die Knorpelreparatur bei Gonarthrose zu fördern

80 Ansichten

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DOI:

10.3791/71422

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18. August 2026

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1Department of Tuina, Shuguang Anhui Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of First Clinical Medical College, Anhui University of Chinese Medicine, 3Department of Orthopedics, The Second Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie untersuchte, ob die Akupotomie die Knorpelreparatur in einem Kaninchenmodell der Kniegelenksarthrose fördert. Fünfzig Kaninchen wurden fünf Gruppen zugewiesen. Die Akupotomie wurde vier Wochen lang wöchentlich verabreicht. Gelenkschwellung, Histopathologie, entzündliche Zytokine sowie Marker der circPDE4B/RIC8A/p38-MAPK-Achse wurden analysiert, um den zugrundeliegenden Wirkmechanismus zu erforschen.

Zusammenfassung

Das Kniegelenk-Osteoarthritis (KOA) ist gekennzeichnet durch fortschreitende Knorpeldegeneration und Entzündung. Diese Studie untersuchte die therapeutischen Wirkungen der Akupotomie in einem Kaninchenmodell von KOA und deren Zusammenhang mit der zirkulären RNA Phosphodiesterase 4B (circPDE4B)/Resistenz gegen Cholinesterase-Hemmer 8A (RIC8A)/p38-Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-Signalachse. Fünfzig Neuseeland-Weiße Kaninchen wurden zufällig fünf Gruppen zugewiesen (n = 10 pro Gruppe): Kontrolle, KOA-Modell, Celecoxib, Akupotomie und Schein-Akupotomie. Die KOA wurde mittels der modifizierten Videman-Methode induziert. Beginnend sechs Wochen nach der Modellierung erhielt die Akupotomie-Gruppe wöchentlich über vier Wochen hinweg eine Behandlung, während Celecoxib täglich über vier Wochen in einer Dosis von 24 mg/kg per Gavage verabreicht wurde. Kniegelenkanschwellung und Knorpelhistopathologie wurden evaluiert. Die Konzentrationen von Interleukin-1β (IL-1β), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) und Interleukin-6 (IL-6) in Knorpelgewebshomogenaten wurden mittels enzymgekoppelter Immunosorbent-Assay (ELISA) gemessen. Gen- und Proteinausprägungen im Zusammenhang mit dem Knorpelstoffwechsel und der circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK-Signalachse wurden mittels quantitativer reverser Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion und Western Blotting analysiert. Im Vergleich zur KOA-Modellgruppe reduzierte die Akupotomie die Kniegelenkanschwellung, verbesserte die histopathologischen Scores, senkte die Spiegel entzündlicher Zytokine, downregulierte Matrix-Metalloproteinase-3 (MMP-3), Matrix-Metalloproteinase-13 (MMP-13), RIC8A und phosphoryliertes p38 MAPK und upregulierte SRY-Box-Transkriptionsfaktor 9 (SOX9), Aggrecan sowie circPDE4B relativ. Ihre Wirkungen waren vergleichbar mit denen von Celecoxib, während die Schein-Akupotomie keine signifikante Verbesserung zeigte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Akupotomie Entzündungen und Knorpeldegeneration beim Kaninchen-KOA lindert und mit einer Modulation der circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK-Signalachse assoziiert ist.

Einleitung

Kniegelenksarthrose (KOA) ist eine weit verbreitete degenerative Gelenkerkrankung, die sich durch fortschreitenden Knorpelabbau, Synovialentzündung, subchondrale Knochensklerose und Osteophytbildung auszeichnet1,2,3. Aufgrund der Alterung der Weltbevölkerung nimmt die Inzidenz der KOA weiterhin zu und macht sie weltweit zu einer der Hauptursachen für Gelenkdysfunktion und chronische Schmerzen bei mittelalten und älteren Erwachsenen4,5,6. Die derzeitigen klinischen Behandlungen konzentrieren sich hauptsächlich auf symptomatische Linderung durch pharmakologische Wirkstoffe wie nichtsteroidale Antirheumatika (NSAR) und intraartikuläre Kortikosteroidinjektionen. Therapien, die den Krankheitsverlauf modifizieren und eine Fortschreitung der Erkrankung stoppen oder die Knorpelreparatur fördern können, sind jedoch weiterhin begrenzt7,8.

Neuere Erkenntnisse haben die wichtigen regulatorischen Rollen von nichtkodierenden RNAs (ncRNAs) bei der Pathogenese und Progression von KOA9,10,11 hervorgehoben. Unter diesen ncRNAs haben zirkuläre RNAs (circRNAs) aufgrund ihrer einzigartigen kovalent geschlossenen Ringstruktur, die ihnen eine höhere Stabilität als linearen RNAs verleiht, sowie aufgrund ihrer vielfältigen biologischen Funktionen zunehmend Aufmerksamkeit erregt12,13. Shen et al. berichteten, dass circPDE4B als molekulares Gerüst wirkt und die Resistenz gegenüber Inhibitoren des RIC8A/p38-MAPK-Signalwegs (p38 mitogen-aktivierter Proteinkinase) reguliert, wodurch der Stoffwechsel der extrazellulären Matrix und entzündliche Reaktionen in Chondrozyten beeinflusst werden14. Der RIC8A/p38-MAPK-Signalweg spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation von Entzündung, Katabolismus, Apoptose und Seneszenz in Chondrozyten, Faktoren, die alle zur Entstehung der Osteoarthritis beitragen15.

Die Akupotomie ist ein minimalinvasiver therapeutischer Ansatz, der die Theorie der traditionellen chinesischen Medizin mit modernen anatomischen Prinzipien verbindet und bei der klinischen Behandlung von Kniegelenk-Osteoarthritis (KOA) vielversprechende Wirksamkeit gezeigt hat16,17. Bei dieser Technik kommt ein spezielles Nadelmessergerät zum Einsatz, um Weichteiladhäsionen zu lösen, die lokale Durchblutung zu verbessern und das biomechanische Gleichgewicht um betroffene Gelenke wiederherzustellen, wodurch Schmerzen gelindert und die Funktion bei Patienten mit KOA verbessert wird18. Trotz dieser berichteten klinischen Vorteile sind die molekularen Mechanismen, die den therapeutischen Wirkungen der Akupotomie zugrunde liegen – insbesondere ihre mögliche Regulation von circRNA-vermittelten Signalwegen, die an der Knorpelreparatur beteiligt sind – weitgehend unerforscht.

Mechanistisch erzeugt die Akupotomie lokale mechanische Reize durch die Freisetzung des periartikulären Weichgewebes. Chondrozyten sind mechanosensitive Zellen, die auf biomechanische Signale reagieren, und es wurde gezeigt, dass circRNAs an den Mechanotransduktionsantworten von Chondrozyten beteiligt sind19,20. Obwohl direkte Belege, die die Akupotomie mit der Regulation gelenkknorpelspezifischer circRNAs verbinden, fehlen, ist es biologisch plausibel, dass durch die Akupotomie erzeugte mechanische Signale mechanosensitive circRNAs wie circPDE4B modulieren könnten. Diese Möglichkeit bildete die Grundlage der vorliegenden Untersuchung.

Aufbauend auf früheren Erkenntnissen zur regulatorischen Rolle von circPDE4B in der RIC8A/p38-MAPK-Signalachse wurde in der vorliegenden Studie ein Kaninchenmodell einer durch die modifizierte Videman-Methode induzierten KOA verwendet, um die Hypothese zu überprüfen, dass Akupotomie die Knorpelreparatur durch Modulation des circPDE4B/RIC8A/p38-MAPK-Signalwegs fördert. Akupotomie wurde für diese Studie aus mehreren Gründen gegenüber anderen KOA-Interventionen gewählt. Erstens bietet die Akupotomie im Vergleich zu pharmakologischen Wirkstoffen wie nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAR) und Celecoxib, die hauptsächlich symptomatische Linderung bewirken und mit begrenkten krankheitsmodifizierenden Effekten sowie potenziellen langfristigen Nebenwirkungen assoziiert sind7,8, einen nichtpharmakologischen Ansatz, der sowohl lokale mechanische Faktoren als auch biologische Signalwege anspricht. Zweitens zielt die Akupotomie, im Gegensatz zu intraartikulären Kortikosteroid- oder Hyaluronsäure-Injektionen, die wiederholte intraartikuläre Applikation erfordern und Infektions- sowie Gelenkschäden bergen, auf periartikuläre Weichteile ab und kann nachhaltige biomechanische und biochemische Effekte entfalten21. Drittens haben klinische Belege gezeigt, dass Akupotomie bei der Schmerzreduktion und Verbesserung der Gelenkfunktion bei Patienten mit KOA vergleichbare oder überlegene Ergebnisse im Vergleich zu konventionellen Therapien erzielt, und experimentelle Studien legen nahe, dass Akupotomie entzündliche Reaktionen und den Chondrozytenstoffwechsel moduliert21,22. Die spezifischen molekularen Signalwege, über die Akupotomie ihre knorpelschützenden Wirkungen entfaltet, sind jedoch noch wenig charakterisiert, insbesondere im Hinblick auf durch circRNA vermittelte Signalübertragung. Daher könnte die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Akupotomie und der circPDE4B/RIC8A/p38-MAPK-Achse neue mechanistische Erkenntnisse liefern und die Anwendung von Akupotomie als krankheitsmodifizierende Intervention bei KOA unterstützen16,18. Die primären Endpunkte waren Schwellung des Kniegelenks, histopathologische Knorpeldegeneration (Mankin- und Moran-Scores), Spiegel entzündlicher Zytokine (Interleukin-1β, Tumornekrosefaktor-α und Interleukin-6), Expression knorpelmetabolismusbezogener Marker (Matrix-Metalloproteinase-3, Matrix-Metalloproteinase-13, SRY-Box-Transkriptionsfaktor 9 und Aggrecan) sowie Expression von circPDE4B und RIC8A und Phosphorylierung von p38 MAPK. Akupotomie wurde einmal wöchentlich über einen Zeitraum von 4 Wochen an ausgewählten periartikulären Punkten mittels der Vier-Schritt-Technik (longitudinale Freigabe, transversale Trennung und Inzision von Knoten) durchgeführt. Histopathologische Bewertungen, Messungen entzündlicher Zytokine sowie Analysen der Gen- und Proteinexpression wurden verwendet, um die Wirkungen der Akupotomie zu charakterisieren und ihre potenzielle molekulare Grundlage bei KOA zu erforschen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß den institutionellen Richtlinien für die Haltung und Verwendung von Labor­tieren durchgeführt und von dem Tierversuchsausschuss der Anhui University of Chinese Medicine genehmigt (Genehmigungsnummer: AHUCM-rabbits-2023195). Die in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien, Chemikalien, Software und Geräte sind in der Tabelle der Materialien aufgelistet.

1. Experimentelle Tiere und Gruppierung
Fünfzig gesunde erwachsene männliche Neuseeland-Weiße-Kaninchen (6 Monate alt, 2,0–2,5 kg schwer) wurden von der Zuchtfarm Laifu im Bezirk Pukou in Nanjing bezogen (Genehmigungsnummer für die Tierzucht: SCXK (Su) 2024-0007). Alle Tiere durchliefen eine einwöchige Akklimatisierungsphase mit Fütterung vor Beginn des Experiments. Als einheitliche prozedurale Konvention wurde das rechte Knie zur Schwellungsbeurteilung bestimmt und das linke Knie zur Gewinnung von Knorpelgewebe, und zwar nicht basierend auf einer spezifischen experimentellen Hypothese. Nach der Akklimatisierung wurden die Kaninchen zufällig fünf Gruppen zugewiesen (n = 10 pro Gruppe): eine Kontrollgruppe, die weder einer Modellierung noch einer Behandlung unterzogen wurde; eine KOA-Modellgruppe, bei der KOA nach der modifizierten Videman-Methode induziert wurde; eine Celecoxib-Gruppe, bei der die medikamentöse Behandlung sechs Wochen nach der Modellierung begann; eine Akupotomie-Gruppe, bei der die Akupotomie-Behandlung sechs Wochen nach der Modellierung begann; sowie eine Schein-Akupotomie-Gruppe, bei der eine Nadeleinführung ohne Schneiden oder Lösen sechs Wochen nach der Modellierung begann.

2. Erstellung des KOA-Modells
Alle Kaninchen außer den Tieren der Kontrollgruppe wurden einer modifizierten Videman-Prozedur unterzogen, um KOA zu induzieren. Die Tiere wurden vor der Operation 12 Stunden lang nüchtern gehalten. Die Anästhesie wurde durch intravenöse Gabe von 3 % Natriumpentobarbital in einer Dosis von 30 mg/kg über die Randvene des Ohres eingeleitet. Nach routinemäßiger Vorbereitung des Operationsgebiets, Desinfektion und steriler Abdeckung wurde ein longitudinaler Schnitt entlang der medialen Seite des Kniegelenks angelegt. Die mediale Seitenbandstruktur und das vordere Kreuzband wurden nacheinander durchtrennt, und der mediale Meniskus wurde vollständig entfernt. Anschließend wurde die Wunde schichtweise verschlossen.

Um das Risiko einer postoperativen Infektion zu verringern, wurde Penicillin drei aufeinanderfolgende Tage lang intramuskulär in einer Dosis von 40.000 U/kg/Tag verabreicht. Nach der Operation wurden die Kaninchen in ihre Käfige zurückgebracht und konnten sich uneingeschränkt bewegen, ohne dass das Gelenk immobilisiert wurde.

3. Schein-Akupotomie-Behandlung
Sechs Wochen nach der KOA-Modellierung erhielten die Kaninchen der Schein-Akupotomie-Gruppe dieselben Abtast- und Punktmarkierungsverfahren wie bei der aktiven Akupotomie-Behandlung. Eine sterile Einweg-Akupotomie-Nadel mit den Maßen 0,35 mm × 25 mm wurde an jedem markierten Punkt senkrecht durch die Haut bis in das subkutane Gewebe eingeführt. Es wurden keine Schnitt-, Lockerungs-, Querbewegungs- oder sonstigen mechanischen Freisetzungsmanöver durchgeführt. Die Nadel wurde unmittelbar nach der Einführung ohne Gewebemanipulation wieder entfernt. Die Scheinbehandlung wurde einmal wöchentlich über vier aufeinanderfolgende Wochen verabreicht.

4. Akupotomie-Behandlung
Sechs Wochen nach der KOA-Modellierung wurden die Kaninchen der Akupotomie-Gruppe auf einem Behandlungstisch fixiert. Die periartikulären Gewebe um das betroffene Knie wurden abgetastet, insbesondere um die Patella sowie die mediale und laterale Gelenkspalte, um strangförmige Strukturen oder harte Knoten zu identifizieren. Vier bis sechs Behandlungspunkte wurden entsprechend den Befunden der Palpation ausgewählt und auf der Haut markiert.

Der Behandlungsbereich wurde rasiert und mittels routinemäßiger steriler Verfahren desinfiziert. Eine sterile Einweg-Akupotomie-Nadel mit den Maßen 0,35 mm × 25 mm wurde langsam und senkrecht an jedem markierten Punkt eingeführt, bis die Knochenoberfläche erreicht war. Der Eingriff erfolgte gemäß der vierstufigen Akupotomie-Technik. Zuerst wurde eine longitudinale Freilegung durchgeführt, gefolgt von einer transversalen Trennung. Bei einem harten Knoten wurde dieser so lange incidiert, bis eine deutliche Freigabeempfindung über die Nadelklinge wahrgenommen wurde. Nach Abschluss des Eingriffs wurde die Nadel zurückgezogen, jede Einstichstelle kurz mit steriler Gaze komprimiert und mit einem adhäsiven Pflaster abgedeckt. Die Behandlung wurde einmal wöchentlich über vier aufeinanderfolgende Wochen verabreicht.

5. Medikamentöse Behandlung
Sechs Wochen nach der KOA-Modellierung erhielten die Kaninchen der Celecoxib-Gruppe täglich über vier aufeinanderfolgende Wochen hinweg eine Celecoxib-Suspension in einer Dosis von 24 mg/kg Körpergewicht per orale Gavage. Die Suspension wurde täglich frisch in physiologischer Kochsalzlösung hergestellt. Angaben zu Lieferant und Katalognummer finden sich in der Materialtabelle.

6. Beurteilung der Schwellung des Kniegelenks
Am Ende der Interventionsphase, entsprechend 10 Wochen nach der KOA-Modellierung, wurde die Schwellung des Kniegelenks beurteilt. Ein weicher Seidenfaden wurde um den am stärksten geschwollenen Bereich des rechten Kniegelenks gewickelt, typischerweise auf Höhe des Tibiakondylus. Der Faden wurde entfernt und mit einem Lineal auf den nächsten Millimeter genau gemessen, und die erfasste Länge wurde als Kniefußumfang definiert.

Das relative Quellverhältnis wurde mit der folgenden Gleichung berechnet:

Formel für das relative Schwellungsverhältnis, Vergleich des Kniefellumfangs in einer experimentellen Kaninchenstudie.

7. Probenentnahme
Am Ende der Interventionsphase wurden die Kaninchen durch intravenöse Gabe von 3 % Natriumpentobarbital in einer Dosis von 30 mg/kg über die Randvene des Ohres anästhesiert. Das linke Kniegelenk wurde mit einer Skalpellklinge Nr. 23 eröffnet, um die Gelenkflächen des Tibiakondyls und der Femurkondylen freizulegen. Gelenkknorpelgewebe wurde aus diesen Bereichen entnommen.

Jede Knorpelprobe wurde in zwei Teile geteilt. Ein Teil wurde in 4 % Paraformaldehyd zur histopathologischen Untersuchung fixiert. Der zweite Teil wurde in kryogene Röhrchen gegeben, schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei −80 °C gelagert, bis molekularbiologische Analysen durchgeführt wurden. Unmittelbar nach Abschluss aller Gewebeentnahmeverfahren wurden die Kaninchen durch eine Luftembolie mittels schneller intravenöser Injektion von Luft über die Randohrvene euthanasiert.

Die histologische Färbung sowie die Mankin- und Moran-Bewertung wurden mit Knorpelproben von jeweils allen 10 Kaninchen pro Gruppe (n = 10) durchgeführt. Repräsentative Bilder der Hämatoxylin- und Eosin- sowie der Safranin-O–Fast-Grün-Färbung wurden von jeweils drei zufällig ausgewählten Kaninchen pro Gruppe ausgewählt. Die Immunhistochemie und die Western-Blot-Analyse wurden mit Proben von jeweils drei zufällig ausgewählten Kaninchen pro Gruppe (n = 3) durchgeführt. Die quantitative reversetranskriptionsbedingte Polymerase-Kettenreaktion und der enzymgekoppelte Immunosorbens-Assay wurden mit Proben von jeweils sechs zufällig ausgewählten Kaninchen pro Gruppe (n = 6) durchgeführt. Alle Teilauswahlen erfolgten zufällig, ohne vorherige Kenntnis der Gruppenzuordnungen.

8. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung
Das in 4 % Paraformaldehyd fixierte Knorpelgewebe wurde zur Entkalkung 4–6 Wochen lang in einer 10%igen Ethylendiamintetraessigsäure-(EDTA-)Lösung mit einem pH-Wert von 7,4 inkubiert. Die Entkalkungslösung wurde alle 3 Tage erneuert. Nach Bestätigung der vollständigen Entkalkung durch Nadeleinstich wurde das Gewebe über eine abgestufte Ethanolreihe (70 %, 80 %, 90 %, 95 % und 100 %) dehydriert, in Xylol geklärt und in Paraffin eingebettet. Das eingebettete Gewebe wurde mit einem Mikrotom in 5 µm dicke Schnitte zerlegt, die anschließend auf Objektträger aufgebracht wurden.

Für die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung wurden die Schnitte 60 min bei 60 °C erhitzt, dreimal für jeweils 5 min in Xylol entparaffiniert und nacheinander in 100 %, 95 %, 80 % und 70 % Ethanol sowie anschließend in destilliertem Wasser rehydriert. Die Schnitte wurden 5 min mit Hämatoxylin gefärbt, 10 min unter fließendem Leitungswasser gespült, 2–3 s in 1 % Salzsäure, hergestellt in 70 % Ethanol, differenziert und erneut mit destilliertem Wasser gespült. Anschließend wurden die Schnitte 2 min mit Eosin gefärbt, mit destilliertem Wasser gespült, durch 70 %, 80 %, 90 %, 95 % und 100 % Ethanol dehydriert, in Xylol geklärt und mit neutralem Harz eingedeckt. Die Knorpelmorphologie wurde untersucht, und repräsentative Bilder wurden mit einem Lichtmikroskop aufgenommen.

9. Safranin-O-Fast-Green-Färbung
Paraffin-eingebettete Knorpelschnitte wurden wie in Abschnitt 8 beschrieben deparaffinisiert und rehydriert. Die Schnitte wurden 5 min mit Weigert-Eisenhämatoxylinfärbung angefärbt und mit destilliertem Wasser gespült. Anschließend wurden die Schnitte 3 min mit einer 0,05 %igen Fast-Green-Lösung gefärbt, kurz 10–15 s in 1 %iger Essigsäure gespült und danach 5 min mit einer 0,1 %igen Safranin-O-Lösung gefärbt.

Nach der Färbung wurden die Schnitte schnell in 95 % und 100 % Ethanol dehydriert, in Xylol geklärt und mit neutralem Harz eingebettet. Die gefärbten Schnitte wurden mit einem Lichtmikroskop untersucht. Die Safranin-O-Färbungsintensität, die den Proteoglykangehalt widerspiegelt, wurde semiquantitativ mithilfe einer Bildanalyse-Software analysiert.

10. Histologische Bewertung
Zwei Pathologen, die hinsichtlich der experimentellen Gruppenzugehörigkeit verblindet waren, bewerteten die gefärbten Schnitte unabhängig voneinander anhand der Mankin- und Moran-Bewertungssysteme, um das Ausmaß der Knorpeldegeneration zu beurteilen. Vor der Bewertung erhielten alle Schnitte zufällige Identifikationscodes. Die Behandlungszuordnungen wurden den Pathologen erst mitgeteilt, nachdem die gesamte Bewertung abgeschlossen war23.

11. Enzymgekoppelter Immunosorbens-Assay
Gefrorenes Knorpelgewebe wurde gewogen, mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung bei pH 7,4 versetzt und gründlich auf Eis homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 3.000 × g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert, und der Überstand wurde zur Analyse gesammelt. Die Konzentrationen von Interleukin-1β (IL-1β), Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) und Interleukin-6 (IL-6) im Gewebeüberstand wurden mithilfe spezifischer enzymgekoppelter Immunosorbens-Assay-Kits für Kaninchen gemäß den Herstelleranweisungen bestimmt.

12. Quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion
Gesamtes RNA wurde aus Knorpelgewebe mittels einer auf Phenol-Chloroform basierenden Methode extrahiert. Kurz gesagt, wurde das Gewebe in einem RNA-Extraktionsreagenz lysiert, und Chloroform wurde hinzugefügt, um die wässrige und die organische Phase zu trennen. Die wässrige Phase wurde gesammelt, und die RNA wurde mit Isopropanol präzipitiert, mit 75%igem Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in mit Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser gelöst. Die RNA-Konzentration und -reinheit wurden mithilfe eines Spektrophotometers gemessen.

Vor der reversen Transkription wurde genomische Rest-DNA mit einem Reagenz zur Eliminierung genomischer DNA entfernt. Die komplementäre DNA wurde anschließend mit einem Reverse-Transkriptionskit gemäß den Herstelleranweisungen synthetisiert. Die quantitative Polymerase-Kettenreaktion wurde mittels einer SYBR-Green-basierten Detektionsmethode auf einem Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionssystem durchgeführt. Die Zyklenbedingungen waren wie folgt: eine initiale Denaturierung bei 95 °C für 1 min, gefolgt von 40 Zyklen mit Denaturierung bei 95 °C für 20 s und Annealing sowie Extension bei 60 °C für 1 min. Eine Schmelzkurvenanalyse wurde durchgeführt, um die Spezifität der Amplifikation zu überprüfen.

Die Expressionslevel von Matrix-Metalloprotease-3 (MMP-3), Matrix-Metalloprotease-13 (MMP-13), SRY-Box-Transkriptionsfaktor 9 (SOX9), Aggrecan, RIC8A und circPDE4B wurden gemessen. β-Aktin wurde als internes Referenzgen verwendet. Die relative Expression wurde nach der 2-ΔΔCt-Methode berechnet. Die Primersequenzen sind in Tabelle 1.

13. Western-Blot-Analyse
Knorpelgewebe wurde in Radioimmunpräzipitationspuffer, ergänzt mit Phenylmethylsulfonylfluorid, lysiert. Der Lysat wurde bei 12.000 × g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert, und das Überstand wurde als Gesamtproteinfraction gesammelt. Die Proteinmenge wurde mittels einer Bicinchoninsäure-Analyse bestimmt.

Gleiche Mengen an Protein (30 µg pro Lane) wurden mittels 10%iger Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt und auf Polyvinylidenfluorid-Membranen übertragen, die zuvor in Methanol präaktiviert worden waren. Die Übertragung erfolgte bei 300 mA und 4 °C. Die Übertragungszeiten betrugen: Aggrecan (250 kDa) 90 min; MMP-3 (60 kDa), RIC8A (59 kDa), SOX9 (56 kDa) und MMP-13 (52 kDa) jeweils 50 min; sowie p38 MAPK (41 kDa) und GAPDH (36 kDa) jeweils 40 min. Die Membranen wurden mit 5%iger fettfreier Trockenmilch in Tris-gepufferter Salzlösung mit Tween 20 für 2 h bei Raumtemperatur blockiert. Anschließend wurden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen MMP-3 (1:2.000), MMP-13 (1:1.000), SOX9 (1:1.000), Aggrecan (1:1.000), RIC8A (1:1.500), phosphoryliertes p38 MAPK (1:1.000) und gesamtes p38 MAPK (1:2.000) inkubiert. GAPDH (1:2.000) diente als Ladekontrolle. Nach dreimaligem Waschen mit Tris-gepufferter Salzlösung mit Tween 20 (jeweils 10 min) wurden die Membranen 1,2 h bei Raumtemperatur mit mit Peroxidase konjugierten sekundären Antikörpern (1:20.000) inkubiert. Nach drei weiteren Waschschritten wurden die Proteinbanden mittels eines verbesserten chemilumineszenten Substrats sichtbar gemacht und mit einem Gel-Dokumentationssystem aufgezeichnet. Die Bandenintensitäten wurden mit der ImageJ-Software quantifiziert und auf GAPDH normalisiert.

14. Immunhistochemie
Paraffin-eingebettete Knorpelschnitte wurden entparaffiniert und durch eine abgestufte Ethanolreihe rehydriert (drei Wechsel von Xylol, jeweils 5 min; gefolgt von 100 %, 95 % und 80 % Ethanol, jeweils 3 min). Die Antigen-Retrieval-Behandlung erfolgte durch Erhitzen der Schnitte in EDTA-Puffer (pH 9,0) in einem Schnellkochtopf. Der Puffer wurde zum Sieden gebracht, und nach dem Aufbau von Druck wurde die Retrievierung 2 min lang fortgesetzt, gefolgt von einer Abkühlung auf Raumtemperatur. Die endogene Peroxidase-Aktivität wurde mit 3 % Wasserstoffperoxid 10 min bei Raumtemperatur blockiert. Nach dem Waschen wurde unspezifische Bindung mit Ziegen-Serum 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln blockiert.

Die Schnitte wurden 60 Minuten bei 37 °C mit primären Antikörpern gegen phosphoryliertes p38 MAPK (1:800) und phosphorylierten nukleären Faktor kappa B (NF-κB) (1:300) inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung, die Tween 20 enthielt, wurden die Schnitte 30 Minuten bei 37 °C mit den entsprechenden mit Peroxidase konjugierten sekundären Antikörpern inkubiert. Nach drei weiteren Waschschritten erfolgte die Farbentwicklung mit Diaminobenzidin (mikroskopisch kontrolliert), gefolgt von einer Kontrastfärbung mit Hämatoxilin (2 min), Differenzierung in 1%iger Salzsäure in 70%igem Ethanol und Blaufärbung in Lithiumcarbonatlösung (30 s). Anschließend wurden die Schnitte dehydriert, geklärt, eingebettet und mit einem Lichtmikroskop untersucht. Die Färbung wurde mittels ImageJ-Software ausgewertet, und die integrierte optische Dichte zur semiquantitativen Analyse berechnet.

15. Statistische Analyse
Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angegeben. Der Vergleich zwischen mehreren Gruppen erfolgte mittels einfaktorieller Varianzanalyse, gefolgt von Tukey’s post-hoc-Test. Ein Wert von P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Die Akupotomie lindert histologische Veränderungen im Gelenkknorpel
Wie in Abbildung 1A,B gezeigt, waren der Knieweiteumfang und das relative Schwellungsverhältnis in der KOA-Modellgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht. Beide Parameter waren nach Behandlung mit Akupotomie oder Celecoxib signifikant vermindert, während eine Schein-Akupotomie im Vergleich zur KOA-Modellgruppe keine signifikante Verbesserung bewirkte.

Wie in den Abbildungen 1C und 1D gezeigt, war der Mankin-Score in der KOA-Modellgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant höher und sank nach Behandlung mit Akupotomie oder Celecoxib signifikant ab. In der Schein-Akupotomie-Gruppe wurde keine signifikante Abnahme beobachtet. Der Moran-Score zeigte das entgegengesetzte Muster.

Die Hämatoxylin- und Eosin- sowie Safranin-O–Fast-Grün-Färbung zeigten im Vergleich zur Kontrollgruppe eine Verdünnung und Diskontinuität der Gelenkknorpeloberfläche mit lokalisierten Erosionen in der KOA-Modellgruppe (Abbildung 1E,F). Akupotomie und Celecoxib besserten diese pathologischen Veränderungen, wie durch klarere Knorpelkonturen und reduzierte strukturelle Schäden angezeigt. Im Gegensatz dazu wiesen die Schein-Akupotomie-Gruppe pathologische Merkmale auf, die denen der KOA-Modellgruppe ähnelten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Akupotomie Wirkungen hervorrief, die denen von Celecoxib vergleichbar waren, hinsichtlich der Verringerung von Gelenkschwellungen und Knorpeldegeneration sowie der Verbesserung der histologischen Scores im KOA-Modell.

Die Akupotomie senkt die Spiegel entzündungsfördernder Zytokine
Wie Abbildung 2A–C zeigt, waren die Konzentrationen von Interleukin-1β (IL-1β), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) und Interleukin-6 (IL-6) in Homogenaten von Knorpelgewebe in der KOA-Modellgruppe signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Die Behandlung mit Akupotomie oder Celecoxib senkte die Spiegel aller drei entzündungsfördernden Zytokine signifikant. Im Gegensatz dazu zeigte die Placebo-Akupotomie-Gruppe im Vergleich zur KOA-Modellgruppe keine signifikante Reduktion.

Die Akupotomie moduliert den RIC8A/p38-MAPK-Signalweg auf Proteinebene
Die immunhistochemische Analyse zeigte, dass die Expression des phosphorylierten p38-MAPK (p38 mitogenaktivierten Proteinkinase; p-p38 MAPK) und des phosphorylierten nukleären Faktors kappa B (NF-κB) in der Akupotomie- und in der Celecoxib-Gruppe signifikant niedriger war als in der KOA-Modellgruppe (Abbildung 3A). Zwischen der Schein-Akupotomie- und der KOA-Modellgruppe wurde kein signifikanter Unterschied beobachtet.

Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass die Proteinspiegel von Matrix-Metalloproteinase-3 (MMP-3), Matrix-Metalloproteinase-13 (MMP-13), Resistenz gegen Cholinesterase-Hemmer 8A (RIC8A) und p-p38 MAPK in der KOA-Modellgruppe signifikant höher waren als in der Kontrollgruppe, während die Spiegel der knorpelsyntheserelationierten Proteine SRY-Box-Transkriptionsfaktor 9 (SOX9) und Aggrecan signifikant niedriger waren. Im Vergleich zur KOA-Modellgruppe zeigten die Akupotomie- und Celecoxib-Gruppen eine verminderte Expression von MMP-3, MMP-13, RIC8A und p-p38 MAPK sowie eine erhöhte Expression von SOX9 und Aggrecan. Die Schein-Akupotomie-Gruppe wies Proteinausdrucksmuster auf, die denen der KOA-Modellgruppe ähnelten, ohne signifikante Veränderungen der gemessenen Proteine (Abbildung 3B–I). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Wirkungen von Akupotomie und Celecoxib bei KOA mit einer Modulation des RIC8A/p38 MAPK-Signalwegs assoziiert waren.

Die Akupotomie moduliert den RIC8A/p38 MAPK-Signalweg auf Transkriptebene
Wie in Abbildung 4A–G dargestellt, waren die Expressionsniveaus von MMP-3, MMP-13 und RIC8A in der KOA-Modellgruppe signifikant höher als in der Kontrollgruppe, während die Expression von SOX9 und Aggrecan signifikant niedriger war. Im Vergleich zur KOA-Modellgruppe verringerten Akupotomie und Celecoxib die Expression von MMP-3, MMP-13 und RIC8A und erhöhten die Expression von SOX9 und Aggrecan. Die Schein-Akupotomie-Gruppe zeigte keine signifikanten Unterschiede zur KOA-Modellgruppe hinsichtlich der gemessenen Transkriptniveaus.

Die Akupotomie erhöhte ebenfalls die relative Expression von circPDE4B, was darauf hindeutet, dass ihre therapeutischen Wirkungen mit einer Modulation der circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK-Signalachse sowie mit einer Verringerung entzündlicher und kataboler Signalwege verbunden waren.

VERFÜGBARKEIT VON DATEN :
Die Rohdaten, die die Ergebnisse dieser Studie unterstützen, einschließlich ELISA-, H&E-Färbungs-, Immunhistochemie-, RT‑qPCR-, Safranin O–Fast Green-Färbungs- und Western Blot-Daten, sind im Figshare-Repository unter https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33090935 öffentlich zugänglich.

Vergleich der Behandlung von Kniegelenksarthrose; Balkendiagramme, histologische Bilder; Analyse der Behandlungseffekte.
Abbildung 1. Acupotomie verringert Schwellungen des Knies und degenerative Veränderungen des Gelenkknorpels bei Kaninchen mit Kniegelenksarthrose. (A) Knieumfang. (B) Relativer Schwellungsquotient des Knies. (C) Mankin-Histologiescore. (D) Moran-Histologiescore. (E) Repräsentative mit Hämatoxylin und Eosin gefärbte Schnitte des Gelenkknorpels aus den Gruppen Kontrolle, KOA-Modell, Celecoxib, Acupotomie und Schein-Acupotomie. (F) Repräsentative Safranin-O–Fast-Green-gefärbte Schnitte aus den fünf experimentellen Gruppen. Die histologische Bewertung (Mankin und Moran) erfolgte an Proben aller 10 Kaninchen pro Gruppe (n = 10), während repräsentative Bilder für die H&E- und Safranin-O–Fast-Green-Färbung von jeweils 3 zufällig ausgewählten Kaninchen pro Gruppe stammen. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Statistische Vergleiche wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse gefolgt von Tukeys post-hoc-Test durchgeführt. Horizontale Balken zeigen die jeweils verglichenen Gruppen an. P < 0,05, P < 0,01 und P < 0,001. Maßstabsbalken: 100 µm. Abkürzungen: KOA = Kniegelenksarthrose; SEM = Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Balkendiagramm-Vergleich der IL-1β-, IL-6- und TNF-α-Spiegel in den KOA-Behandlungsgruppen und Kontrollgruppen.
Abbildung 2. Acupotomie senkt die Spiegel entzündungsfördernder Zytokine bei Kaninchen mit Kniegelenksarthrose. (A) Konzentration von Interleukin-1β. (B) Konzentration von Interleukin-6. (C) Konzentration von Tumor-Nekrose-Faktor-α. Die Zytokinkonzentrationen wurden mittels enzymgekoppelter Immunadsorptionstest (ELISA) in Proben von jeweils sechs Kaninchen pro Gruppe (n = 6) gemessen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Statistische Vergleiche erfolgten mittels einfaktorieller Varianzanalyse, gefolgt von Tukeys post-hoc-Test. Horizontale Balken zeigen die jeweils verglichenen Gruppen an. P < 0,05, P < 0,01 und P < 0,001. Abkürzungen: IL-1β = Interleukin-1β; IL-6 = Interleukin-6; KOA = Kniegelenksarthrose; SEM = Standardfehler des Mittelwerts; TNF-α = Tumor-Nekrose-Faktor-α. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Histologiebilder, Proteinexpressionsanalyse, Balkendiagramme; Behandlungsergebnisse bei Kniegelenk-Osteoarthritis.
Abbildung 3. Acupotomie moduliert entzündungs- und knorpelmetabolismusbezogene Proteine bei Kaninchen mit Kniegelenk-Osteoarthritis. (A) Repräsentative immunhistochemische Bilder, die die Expression von phosphoryliertem nukleärem Faktor kappa B und phosphoryliertem p38-MAP-Kinase (p38 mitogen-aktivierter Proteinkinase) im Gelenkknorpel der Kontroll-, KOA-Modell-, Celecoxib-, Acupotomie- und Schein-Acupotomie-Gruppen zeigen. Maßstabsbalken: 100 µm. (B) Repräsentative Westernblots, die die Expression von SOX9, RIC8A, MMP-13, phosphoryliertem p38 MAPK, gesamt p38 MAPK, MMP-3, Aggrecan und GAPDH zeigen. (C) Densitometrische Quantifizierung von Aggrecan, normiert auf GAPDH. (D) Quantifizierung von MMP-13, normiert auf GAPDH. (E) Quantifizierung von MMP-3, normiert auf GAPDH. (F) Quantifizierung von gesamt p38 MAPK, normiert auf GAPDH. (G) Quantifizierung von phosphoryliertem p38 MAPK, normiert auf GAPDH. (H) Quantifizierung von SOX9, normiert auf GAPDH. (I) Quantifizierung von RIC8A, normiert auf GAPDH. Westernblot-Analysen wurden mit Proben von jeweils drei Kaninchen pro Gruppe durchgeführt (n = 3). Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Statistische Vergleiche erfolgten mittels einfaktorieller Varianzanalyse, gefolgt von Tukeys post-hoc-Test. Horizontale Balken zeigen die miteinander verglichenen Gruppen an. P < 0,05, P < 0,01 und P < 0,001. Abkürzungen: GAPDH = Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase; KOA = Kniegelenk-Osteoarthritis; MAPK = mitogen-aktivierte Proteinkinase; MMP-3 = Matrix-Metalloprotease-3; MMP-13 = Matrix-Metalloprotease-13; NF-κB = nuklearer Faktor kappa B; p-NF-κB = phosphorylierter nuklearer Faktor kappa B; p-p38 MAPK = phosphorylierter p38 MAPK; RIC8A = Resistenz gegen Cholinesterasehemmer 8A; SEM = Standardfehler des Mittelwerts; SOX9 = SRY-Box-Transkriptionsfaktor 9. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Balkendiagramme der Proteinexpressionen (Aggrecan, MMPs, p38 MAPK, SOX9) im Vergleich zu β-Actin, Wirkung der Medikamentenbehandlung.
Abbildung 4. Acupotomie moduliert Transkripte, die mit dem Knorpelstoffwechsel assoziiert sind, sowie die Expression von circPDE4B bei Kaninchen mit Kniegelenksarthrose. (A) Relative Aggrecan-Expression. (B) Relative MMP-3-Expression. (C) Relative MMP-13-Expression. (D) Relative p38-MAPK-Expression. (E) Relative SOX9-Expression. (F) Relative circPDE4B-Expression. (G) Relative RIC8A-Expression. Die Expression wurde mittels quantitativer reverser Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion gemessen und auf das Referenzgen normalisiert. Die Analysen wurden mit Proben von jeweils sechs Kaninchen pro Gruppe durchgeführt (n = 6). Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Statistische Vergleiche erfolgten mittels einfaktorieller Varianzanalyse, gefolgt von Tukeys post-hoc-Test. Horizontale Balken zeigen die jeweils verglichenen Gruppen an. P < 0,05, P < 0,01 und P < 0,001. Abkürzungen: circPDE4B = zirkuläre RNA der Phosphodiesterase 4B; KOA = Kniegelenksarthrose; MAPK = mitogenaktivierter Proteinkinase; MMP-3 = Matrix-Metalloprotease-3; MMP-13 = Matrix-Metalloprotease-13; RIC8A = Resistenz gegen Cholinesterasehemmer 8A; SEM = Standardfehler des Mittelwerts; SOX9 = SRY-Box-Transkriptionsfaktor 9. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

GenAmplifikonsgrößeForward-PrimerReverse-Primer
(bp)(5'→3')(5'→3')
β-actin113CAGCCCTCCTTCATCGGTATGACATGACGTTGTTGGCGTA
MMP-3108TGTGAGTTGAAGTGGCTCATCCTGTTTGAACACCCGTAAC
MMP-13119GGCTCCTAGGCAAGTACAATGTGTACGCCCATCAGGATAA
SOX985GGAGGAAGTCGGTGAAGAATGCCTTGAAGATGGCGTTG
Aggrecan70TTGATGAGTGCCTTTCAAGCCATGTGAAAGAGTCGATGGC
RIC8A100ATAAACTTTCCAGAGAGGAGTTGCTCGATGACAGAGTACTGGTTG
p38 MAPK103TGTTCAAGGTCTCCCACAAGTGCAGCTCCCTTATGATCTG
CircPDE4B174GTCATTTTGCCGAACTCCCCATTATCATCTGCCGTCACTG

Tabelle 1: Primersequenzen, die für die quantitative reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion verwendet wurden. Die Tabelle enthält die Zielgene, erwarteten Amplifikonsgrößen sowie die Vorwärts- und Rückwärts-Primersequenzen in 5′-3′-Richtung. Abkürzungen: bp = Basenpaare; circPDE4B = zirkuläre RNA Phosphodiesterase 4B; MAPK = mitogenaktivierter Proteinkinase; MMP-3 = Matrix-Metalloprotease-3; MMP-13 = Matrix-Metalloprotease-13; RIC8A = Resistenz gegen Hemmstoffe der Cholinesterase 8A; SOX9 = SRY-Box-Transkriptionsfaktor 9.

Diskussion

Diese Studie bewertete die therapeutischen Wirkungen der Akupotomie in einem Kaninchenmodell der Kniegelenksarthrose (KOA) und identifizierte eine Assoziation zwischen der Expression von circPDE4B und der RIC8A/p38-Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK)-Signalübertragungsachse. Die Akupotomie verbesserte Gelenkschwellungen und histopathologische Veränderungen und veränderte entzündungs- sowie knorpelmetabolismusbezogene Marker auf Transkript- und Proteinebene.

Die Abnahme von Interleukin-1β, Tumor-Nekrose-Faktor-α und Interleukin-6 nach der Akupotomie-Behandlung stimmt mit zuvor berichteten immunmodulatorischen Wirkungen der Akupotomie überein21. Diese Zytokine tragen durch die Förderung matrixabbauender Enzyme und die Hemmung der Synthese der extrazellulären Matrix zum Knorpelabbau bei22,24,25. Die gleichzeitige Verringerung von Matrix-Metalloproteinase-3 (MMP-3) und Matrix-Metalloproteinase-13 (MMP-13) auf Transkript- und Proteinebene legt zudem nahe, dass die Akupotomie katabole Aktivitäten, die mit KOA assoziiert sind, unterdrückt.

Ein bemerkenswerter Befund war die Assoziation zwischen akupotomiebedingten Veränderungen der circPDE4B-Expression und der Modulation des RIC8A/p38 MAPK-Signalwegs. Eine abnormale Aktivierung dieses Signalwegs ist mit Entzündungen, oxidativem Stress und dem Abbau der extrazellulären Matrix verbunden. Die Reduktionen der RIC8A-Expression und der p38 MAPK-Phosphorylierung nach der Akupotomie legen nahe, dass die Behandlung zur Wiederherstellung des Signalgleichgewichts innerhalb dieses Signalwegs beitragen könnte. Die koordinierten Veränderungen der relativen Marker für circPDE4B sowie des RIC8A/p38 MAPK-Signalwegs stimmen mit der Hypothese überein, dass circPDE4B möglicherweise als molekulares Gerüst fungiert, wie zuvor vorgeschlagen26,27. Die vorliegenden Ergebnisse sind jedoch korrelativ und belegen nicht, dass circPDE4B die therapeutischen Wirkungen der Akupotomie vermittelt. Funktionsverlust- und Funktionsgewinn-Studien sind erforderlich, um Kausalität zu bestimmen.

Die mögliche Assoziation zwischen Akupotomie und der Regulation von circRNA ist ein wichtiger Aspekt dieser Studie. Mechanische Stimulierung hat sich als Einflussfaktor auf die Expression von circRNA in mehreren Geweben erwiesen28,29,30,31. Direkte Belege, die eine Verbindung zwischen der durch Akupotomie induzierten mechanischen Stimulierung und der Regulation gelenkknorpelspezifischer circRNAs herstellen, sind jedoch begrenzt. Die beobachtete Veränderung der relativen circPDE4B-Expression nach der Behandlung könnte entweder auf eine direkte Reaktion auf mechanische Stimulierung oder auf eine indirekte Reaktion auf verminderte Entzündung zurückzuführen sein. Künftige Studien, die kontrollierte mechanische Stimulierung mit zellspezifischer Manipulation von circPDE4B in Chondrozyten kombinieren, könnten helfen, zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu unterscheiden.

Akupotomie und Celecoxib zeigten trotz unterschiedlicher Wirkmechanismen ähnliche Trends bei zahlreichen gemessenen Endpunkten. Für diese Übereinstimmung gibt es mehrere mögliche Erklärungen. Erstens könnten beide Behandlungen auf gemeinsamen nachgeschalteten Signalwegen wirken, einschließlich der RIC8A/p38-MAPK-Achse und der Signalübertragung durch den nukleären Faktor kappa B. Zweitens könnten die beobachteten Ähnlichkeiten gemeinsame Merkmale des Knorpelschutzes widerspiegeln, anstatt wirkwegspezifische Effekte darzustellen. Drittens könnten die ausgewählten Marker gemeinsame Endpunkte von Entzündung und Knorpelstoffwechsel darstellen und daher nicht ausreichen, um zwischen unterschiedlichen upstream-Mechanismen zu unterscheiden. Eine vergleichbare Wirksamkeit impliziert nicht identische Wirkmechanismen, deutet jedoch darauf hin, dass beide Interventionen auf gemeinsame Bestandteile des pathologischen Netzwerks der Osteoarthritis einwirken26,32,33. Unvoreingenommene Ansätze wie transkriptomische oder proteomische Profilierungen könnten helfen, behandlungsspezifische molekulare Signaturen zu definieren.

Die vergleichbaren Wirkungen von Akupotomie und Celecoxib könnten ebenfalls klinische Relevanz haben. Die Akupotomie könnte eine nichtpharmakologische Behandlungsoption darstellen, die periartikuläre mechanische Faktoren anspricht und gleichzeitig einige Nebenwirkungen vermeidet, die mit langfristiger Medikamenteneinnahme assoziiert sind. Diese Interpretation sollte jedoch mit Vorsicht betrachtet werden, da das Kaninchenmodell die Komplexität der menschlichen Kniegelenk-Osteoarthritis (KOA) nicht vollständig abbildet. Weitere translations- und klinische Studien sind erforderlich, bevor diese präklinischen Ergebnisse eine breitere klinische Anwendung unterstützen können.

Mehrere Einschränkungen sollten anerkannt werden. Erstens wurde die Assoziation zwischen circPDE4B und der RIC8A/p38-MAPK-Achse nicht mittels Funktionsverlust- oder Funktionsgewinn-Experimenten überprüft. Zweitens beschränken das Kaninchenmodell und die vierwöchige Behandlungsdauer die Schlussfolgerungen hinsichtlich menschlicher Erkrankungen und Langzeitergebnisse. Drittens verwendeten die molekularen Assays relativ kleine Tierstichproben, was die Detektion subtiler Unterschiede zwischen den Gruppen möglicherweise eingeschränkt hat. Viertens könnte das gewählte Markerpanel nicht in der Lage sein, behandlungsspezifische upstream-Mechanismen voneinander zu unterscheiden. Schließlich erfordern die ähnlichen Reaktionen auf Akupotomie und Celecoxib weitere Untersuchungen, um festzustellen, ob die beiden Interventionen über konvergierende oder unabhängige Signalwege wirken.

Schlussfolgerung
Die Akupotomie verringerte Gelenkschwellungen, die Spiegel entzündlicher Zytokine, Knorpeldegeneration und die Expression kataboler Marker in einem Kaninchenmodell der KOA. Diese Wirkungen standen in Zusammenhang mit Veränderungen der relativen circPDE4B-Expression und der Modulation der RIC8A/p38-MAPK-Signalübertragungsachse. Da die vorliegenden Ergebnisse korrelativ sind, sind weitere mechanistische Studien erforderlich, um zu klären, ob circPDE4B die therapeutischen Effekte der Akupotomie direkt vermittelt.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die die in diesem Artikel beschriebene Arbeit beeinflusst haben könnten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Nationale Naturwissenschaftliche Stiftung Chinas (Förderkennzeichen Nr. 81774436), das Projekt zur Transformation klinischer medizinischer Forschung der Provinz Anhui (Förderkennzeichen Nr. 202427b10020136), das wissenschaftliche Forschungsprojekt des Bildungsministeriums der Provinz Anhui (Förderkennzeichen Nr. 2023AH050824), das Gesundheitsforschungsprogramm von Anhui (Förderkennzeichen Nr. AHWJ2023A30123) sowie das Projekt zur Vererbung und Innovation der Traditionellen Chinesischen Medizin durch die Anhui-Vereinigung für Traditionelle Chinesische Medizin (Förderkennzeichen Nr. 2024ZYYXH153).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3 % WasserstoffperoxidFuzhou Maixin BiotechSP kit-A3Hemmt die endogene Peroxidase-Aktivität während der Immunhistochemie.
4 % ParaformaldehydBiosharpBL539AFixiert Knorpelgewebe vor der Entkalkung und histologischen Aufarbeitung.
EssigsäureMerckA6283Wird zur Herstellung von 1 % Salzsäure in 70 % verwendet
PflasterZhejiang RenkangRK-8802Wird nach der Akupotomie verwendet.
Aggrecan-AntikörperProteintech13880-1-APPrimärantikörper zur Detektion von Aggrecan in Knorpel-Proteinextrakten.
Wasserfreies EthanolSinopharm Chemical Reagent10009228Wird zur Gewebe-Dehydrierung und Schnitt-Rehydrierung während der histologischen Aufarbeitung verwendet.
BCA-Protein-Assay-KitThermo Fisher ScientificA55860Wird zur Bestimmung der Proteinkonzentration verwendet.
CelecoxibBiochempartnerBCP02156Referenzpharmakologische Behandlung, verabreicht per orale Gavage.
ZentrifugeAnhui Jiawen InstrumentsJW-3021HRWird zur Klärung von Gewebelysaten und Homogenaten durch zentrifugale Trennung verwendet.
ChloroformNanjing Reagent67-66-3Wird zur Phasentrennung während der Gesamt-RNA-Extraktion verwendet.
Zitratpuffer, pH 6,0ZSGB-BIOZLI-9065Wird zur hitzeinduzierten Antigen-Retrieval vor der Immunhistochemie verwendet.
KryoröhrchenNEST Biotechnology607001Wird zur Lagerung von gefrorenen Proben verwendet
DAB-SubstratFuzhou Maixin BiotechKit-5230Chromogenes Substrat zur Visualisierung von HRP-markierten immunhistochemischen Signalen.
DEPC-behandeltes WasserGeneray BiotechD1007RNAse-freies Wasser, verwendet zur RNA-Auflösung und molekularbiologischen Verfahren.
Einmal-Akupotomie-Nadel, 0,35 mm × 25 mmMa'anshan Bond Medical EquipmentGB3525RSterile Nadelmesser für Akupotomie- und Schein-Akupotomie-Verfahren.
EDTAbiosharpBL617AWird zur Herstellung der Entkalkungslösung für knorpelhaltiges Gewebe verwendet.
Verstärktes chemilumineszentes SubstratThermo 340958340958Wird zur Visualisierung von Western-Blot-Banden verwendet.
Eosin-LösungZhuhai BesoBA4022Gegenfärbung in der Hämatoxylin-Eosin-Färbung.
Fast Green-LösungSolarbioG1371Gegenfärbung in der Safranin-O–Fast-Green-Färbung.
GAPDH-AntikörperZsbioTA-08Wird als Ladekontrolle im Western Blot verwendet, jedoch derzeit nicht aufgeführt.
Gel-Imaging-SystemShanghai Peiqing TechnologyJS-1070PAufnahme von chemilumineszenten Western-Blot-Bildern.
GlasobjektträgerCITOTEST‌188105Wird zum Aufbringen von Schnitten verwendet
Ziegen-Anti-Maus-IgG, HRP-konjugiertZSGB-BIOZB-2305HRP-konjugierter Sekundärantikörper für Maus-Primärantikörper.
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, HRP-konjugiertZSGB-BIOZB-2301HRP-konjugierter Sekundärantikörper für Kaninchen-Primärantikörper.
ZiegenserumZSGB-BIOZLI-9056Blockiert unspezifische Antikörperbindung während der Immunhistochemie.
GraphPad Prism, Version 10GraphPad SoftwareNicht zutreffendWird für die statistische Analyse und die Erstellung von Grafiken verwendet.
Hämatoxylin-LösungZhuhai BesoBA4041Kernfärbung für die Hämatoxylin-Eosin-Färbung und immunhistochemische Gegenfärbung.
HomogenisatorWitegSGCR-5-553-722Homogenisiert Knorpelgewebe für ELISA- und molekulare Assays.
SalzsäureMerck7607Wird zur Herstellung von 1 % Salzsäure in 70 % verwendet
Image Lab-SoftwareBio-RadNicht zutreffendWird für die dichtometrische Analyse von Western-Blot-Banden verwendet.
Image-Pro Plus, Version 6.0Media CyberneticsNicht zutreffendWird für die semiquantitative Analyse der Safranin-O-Färbungsintensität verwendet.
IsopropanolSinopharm Chemical ReagentSCR40007960Wird zur RNA-Präzipitation während der Gesamt-RNA-Extraktion verwendet.
LichtmikroskopOlympusCX41Wird zur Untersuchung und Bildaufnahme gefärbter Knorpelschnitte verwendet.
Medizinischer Markierstiftedding497985Wird zur Markierung von Behandlungspunkten verwendet
MethanolShanghai Suyi20180427Wird zur Aktivierung der PVDF-Membran verwendet
MikrotomLeicaRM2016Schneidet paraffin-eingebettetes Gewebe in 5 µm dicke Schnitte.
MMP-13-AntikörperBiossbs-0575RPrimärantikörper zur Detektion von Matrix-Metalloproteinase-13.
MMP-3-AntikörperBiossbs-43017RPrimärantikörper zur Detektion von Matrix-Metalloproteinase-3.
Neutrales HarzWuxi JiangyuanZLI-9516Einbettmedium zur dauerhaften Präparation gefärbter Gewebeschnitte.
Neuseeland-Weiße Kaninchen (männlich, 6 Monate alt, 2,0–2,5 kg)Zuchtstation Laifu, Bezirk Pukou, NanjingSCXK (Su) 2024-0007Experimentelle Tiere zur Modellierung und Behandlungsbeurteilung von Kniegelenksarthrose.
Skalpellklinge Nr. 23CaissonSCX08-100PCWird während der Probenentnahme verwendet.
MagermilchpulverGene9999SWird als Blockierreagenz verwendet.
p38-MAPK-AntikörperBiossbs-0637RPrimärantikörper zur Detektion von gesamt p38-MAPK.
ParaffinThermo8330Wird zur Gewebeeinbettung verwendet
PBSZSGB-BIOZLI-9062Wird zur Gewebshomogenisierung, Waschen und Reagenzherstellung verwendet.
PenicillinJilin Huamu Animal Health ProductsNicht zutreffendWird postoperativ mit 40.000 U/kg/Tag verabreicht
NatriumpentobarbitalBeijing Chemical Reagents61222Wird zur Anästhesie mit 3 %, 30 mg/kg verwendet.
phosphatgepufferte KochsalzlösungbeyotimeST448Wird zur Gewebshomogenisierung und zum Waschen während der Immunhistochemie verwendet.
Physiologische KochsalzlösungservicevioG4702Wird zur Herstellung der Celecoxib-Suspension verwendet
PMSFBeyotimeST506Proteaseinhibitor, der dem Lysepuffer während der Proteinextraktion zugesetzt wird.
p-NF-κB-AntikörperSantasc-136548Primärantikörper zur Detektion von p-NF-κB in der immunhistochemischen Analyse.
p-p38-MAPK-AntikörperBiossbs-5476RPrimärantikörper zur Detektion von phosphoryliertem p38-MAPK.
PrimeScript RT-Reagenzien-Kit mit gDNA-EraserTaKaRaRR047AWird zur Entfernung genomischer DNA und zur reversen Transkription von RNA in cDNA verwendet.
PVDF-MembranMilliporeIPVH00010Membran zur Proteinübertragung während des Western Blots.
Kaninchen-IL-1β-ELISA-KitJiyinmeiJYM0011RbQuantifiziert Kaninchen-Interleukin-1β in der analysierten Probe.
Kaninchen-IL-6-ELISA-KitJiyinmeiJYM0006RbQuantifiziert Kaninchen-Interleukin-6 in der analysierten Probe.
Kaninchen-TNF-α-ELISA-KitJiyinmeiJYM0003RbQuantifiziert Kaninchen-Tumor-Nekrose-Faktor-α in der analysierten Probe.
Echtzeit-PCR-SystemThermo Fisher ScientificPIKOREAL 96Führt fluoreszenzbasierte quantitative PCR-Amplifikation durch.
RIC8A-AntikörperBiossbs-11355RPrimärantikörper zur Detektion von RIC8A.
RIPA-LysepufferBeyotimeP0013BExtrahiert Gesamtprotein aus Knorpelgewebe.
Safranin-O-LösungSolarbioG1371Färbt Knorpelproteoglykane in der Safranin-O–Fast-Green-Histologie.
SDS-PAGE-Reagenzien oder vorgefertigte GeleSolarbioS8010Enthalten Angaben zur Gelkonzentration oder zum Produkt.
SOX9-AntikörperBiossbs-4177RPrimärantikörper zur Detektion von SOX9.
SpektrophotometerNanjing Wuyi TechnologyOD1000+Misst RNA-Konzentration und -Reinheit.
Sterile GazeZhendeV505463Wird zur Kompression nach dem Nadelziehen verwendet.
SYBR Green Master MixNovoproteinE096-01BFluoreszierendes Reagenz für die quantitative PCR.
Tris-gepufferte KochsalzlösungSolarbioT8060Wird zur Herstellung des Wasch- und Blockierpuffers für den Western Blot verwendet.
TRIzol-ReagenzLife Technologies15596018Phenol–Guanidinium-Reagenz zur Gesamt-RNA-Extraktion.
Tween 20SolarbioT8220Nichtionisches Detergens, das den Waschlösungen aus Tris-gepufferter Kochsalzlösung und phosphatgepufferter Kochsalzlösung zugesetzt wird.
Weigert-Eisenhämatoxylin-LösungMerck1.15973Wird in der Safranin-O–Fast-Green-Färbung verwendet.
XylolSinopharm Chemical Reagent10023428Wird zur Entparaffinierung und Gewebedurchsichtigung verwendet.

Referenzen

  1. Mobasheri A, Batt M. An update on the pathophysiology of osteoarthritis. Ann Phys Rehabil Med. 2016;59(5):333-339.
  2. Forestier R, et al. Prevalence of generalized osteoarthritis in a population with knee osteoarthritis. Joint Bone Spine. 2011;78(3):275-278.
  3. Motta F, Barone E, Sica A, Selmi C. Inflammaging and osteoarthritis. Clin Rev Allergy Immunol. 2023;64(2):222-238.
  4. Ghouri A, Conaghan PG. Prospects for therapies in osteoarthritis. Calcif Tissue Int. 2021;109(3):339-350.
  5. Roseti L, et al. Articular cartilage regeneration in osteoarthritis. Cells. 2019;8(11):1305. https://doi.org/10.3390/cells8111305
  6. Fujii Y, et al. Cartilage homeostasis and osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2022;23(12):6330. https://doi.org/10.3390/ijms23126330
  7. Kreutzinger V, et al. Limited effects of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) on imaging outcomes in osteoarthritis: observational data from the osteoarthritis initiative (OAI). BMC Musculoskelet Disord. 2025;26. https://doi.org/10.1186/s12891-025-08245-0
  8. Migliore A, et al. Low dose NSAIDs and sysadoas in the management of knee osteoarthritis. Aging Clin Exp Res. 2025;37(1):121. https://doi.org/10.1007/s40520-025-03015-6
  9. Fu M, et al. Expression profile of long noncoding RNAs in cartilage from knee osteoarthritis patients. Osteoarthritis Cartilage. 2015;23(3):423-432.
  10. Jiang SD, et al. Long noncoding RNAs in osteoarthritis. Joint Bone Spine. 2017;84(5):553-556.
  11. Xing D, et al. Identification of long noncoding RNA associated with osteoarthritis in humans. Orthop Surg. 2014;6(4):288-293.
  12. Wu W, Zou J, Yang Y. Studies on the role of circRNAs in osteoarthritis. BioMed Res Int. 2021;2021:6672322. https://doi.org/10.1155/2021/6672322
  13. Liu X, et al. Identification and comprehensive analysis of circRNA–miRNA–mRNA regulatory networks in osteoarthritis. Front Immunol. 2022;13:1018820. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1018820
  14. Shen S, et al. circPDE4B prevents articular cartilage degeneration and promotes repair by acting as a scaffold for RIC8A and MID1. Ann Rheum Dis. 2021;80(9):1209-1219.
  15. Cao M, et al. A peroxiredoxin-P38 MAPK scaffold increases MAPK activity by MAP3K-independent mechanisms. Mol Cell. 2023;83(17):3140-3154.
  16. Lu M, et al. Promotion and mechanism of acupotomy on chondrocyte autophagy in knee osteoarthritis rabbits. Chin J Integr Med. 2024;30(9):809-817.
  17. Chen C, et al. Clinical effects of ultrasound-guided acupotomy in knee osteoarthritis treatment. J Vis Exp. 2024;(208):e66587. https://doi.org/10.3791/66587
  18. Wang Y, et al. Effect of acupotomy modulation of NLRP3/Caspase-1/GSDMD pathway on chondrocyte pyroptosis in knee osteoarthritis. J Pain Res. 2025;18:4935-4945.
  19. Zhang J, et al. Whole transcriptome mapping identifies an immune- and metabolism-related non-coding RNA landscape remodeled by mechanical stress in IL-1β-induced rat OA-like chondrocytes. Front Genet. 2022;13:843187. https://doi.org/10.3389/fgene.2022.843187
  20. Liu Q, et al. Emerging roles of circRNA related to the mechanical stress in human cartilage degradation of osteoarthritis. Mol Ther Nucleic Acids. 2017;7:223-230.
  21. Guo Y, et al. Acupotomy improves synovial hypoxia, synovitis and angiogenesis in KOA rabbits. J Pain Res. 2023;16:749-760.
  22. Ma Y, et al. Acupotomy ameliorates KOA related chondrocyte premature senescence through YAP/FOXD1 pathway. J Pain Res. 2025;18:2011-2023.
  23. Wang Z,et al. Electroacupuncture ameliorates cartilage damage in a rat model of knee osteoarthritis and regulates expression of miRNAs and the TLR4/NF-κB pathway, Acupuncture in Medicine. 2025, 43(2025), 164-173.
  24. Feng S, Cong H, Ji L. Salvianolic acid A exhibits anti-inflammatory and antiarthritic effects via inhibiting NF-κB and p38/MAPK pathways. Drug Des Devel Ther. 2020;14:1771-1778.
  25. Abdallah AM, et al. Pyrazole derivatives ameliorate synovial inflammation in collagen-induced arthritis mice model via targeting p38 MAPK and COX-2. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(1):819-832.
  26. Alaaeldin E, et al. Topical nano-vesicular spanlastics of celecoxib: enhanced anti-inflammatory effect and down-regulation of TNF-α, NF-кB and COX-2 in complete Freund's adjuvant-induced arthritis model in rats. Int J Nanomedicine. 2021;16:133-145.
  27. Pamudurti NR, et al. Translation of CircRNAs. Mol Cell. 2017;66(1):9-21.
  28. Wang Z, et al. Electroacupuncture ameliorates cartilage damage in a rat model of knee osteoarthritis and regulates expression of miRNAs and the TLR4/NF-κB pathway. Acupunct Med. 2025;43(3):164-173.
  29. Shen J, et al. Circular RNA sequencing reveals the molecular mechanism of the effects of acupuncture and moxibustion on endometrial receptivity in patients undergoing infertility treatment. Mol Med Rep. 2019;20(2):1623-1633. https://doi.org/10.3892/mmr.2019.10386
  30. Wang Y, et al. Electroacupuncture alleviates perioperative hypothalamus-pituitary-adrenal axis dysfunction via circRNA-miRNA-mRNA networks. Front Mol Neurosci. 2023;16:1152861. https://doi.org/10.3389/fnmol.2023.1152861
  31. Xiao X, et al. Transcription profiling of a revealed the potential molecular mechanism of Governor Vessel electroacupuncture for spinal cord injury in rats. Neurospine. 2022;19(3):757-769.
  32. Xu C, Gu K, Yasen Y, Hou Y. Efficacy and safety of celecoxib therapy in osteoarthritis: a meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2016;95(20):e3585. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000003585
  33. 33. Jiang D, et al. Efficacy of intra-articular injection of celecoxib in a rabbit model of osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2010;11(10):4106-4113.

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Immunology and InfectionAcupotomyKnee OsteoarthritisCircular RNAcircPDE4BRIC8A p38 MAPK signaling pathway

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