Kopfhatakupunktur in Kombination mit Bewegung induziert die Aktivierung von PI3K/Akt und verbessert die synaptische Plastizität bei spastischen Ratten nach dem Schlaganfall

Zusammenfassung

Diese Studie zielt darauf ab, die Auswirkungen von Kopfhautakupunktur in Kombination mit Übung auf die synaptische Plastizität des motorischen Kortex in einem Rattenmodell der Spastizität der Gliedmaßen nach einem Schlaganfall zu untersuchen und den Zusammenhang zwischen der Aktivität des PI3K/Akt-Signalwegs und den therapeutischen Effekten zu untersuchen.

Zusammenfassung

Wirksame Behandlungen für Post-Stroke-Spastikität (PSS) sind weiterhin begrenzt, und der Mechanismus, durch den Kopfhautakupunktur in Kombination mit Bewegung (SAE) PSS lindert, ist nicht vollständig verstanden. Diese Studie untersuchte die Auswirkungen von SAE bei Ratten mit PSS und untersuchte, ob SAE die synaptische Plastizität über den PI3K/Akt-Weg reguliert. Ein Rattenmodell für die mittlere Gehirnarterienokklusion (MCAO) wurde etabliert, und die Ratten wurden zufällig in fünf Gruppen eingeteilt: Blank, Sham, MCAO, SAE und Baclofen. Alle Interventionen wurden an 7 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt. Neurologische Funktionen, das Volumen des Gehirninfarkts, die Histopathologie, die synaptische Ultrastruktur und die damit verbundene Proteinexpression wurden anschließend bewertet. Im Vergleich zur MCAO-Gruppe verbesserte SAE neurologische Defizite, reduzierte Muskelhypertonie, verringerte das Infarktvolumen, linderte neuronale Schäden, erhöhte die Synapsenzahl und verbesserte die synaptische Morphologie. SAE hat außerdem den glialen Zelllinien-abgeleiteten neurotrophen Faktor (GDNF), phosphorylierte PI3K (p-PI3K), phosphorylierte Akt (p-AKT) und synaptische Proteine, darunter Synaptophysin (SYN), postsynaptische Dichteprotein 95 (PSD-95) und wachstumsassoziiertes Protein 43 (GAP-43) hochreguliert. Die Immunfluoreszenzfärbung deutete zudem auf eine verbesserte Expression von SYN und p-Akt im motorischen Kortex nach der SAE-Behandlung hin. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass SAE mit der Aktivierung der PI3K/Akt-Signalübertragung durch Hochregulation von GDNF korreliert sein könnte, wodurch die synaptische Plastizität verbessert und PSS-Symptome gelindert werden. Diese Studie untersuchte die Auswirkungen von SAE bei Ratten mit PSS und untersuchte den möglichen Zusammenhang zwischen SAE-Intervention, PI3K/Akt-Signalwegaktivität und synaptischer Plastizität.

Einleitung

Der Hirninfarkt bleibt weltweit eine der häufigsten Todes- und Behinderungsursachen. Ischämie und Hypoxie schädigen Neuronen, stören das Erregungs-Hemmungs-Gleichgewicht in den motorischen Schaltkreisen und führen zu motorischer Dysfunktion¹. Spastizität nach einem Schlaganfall äußert sich in erhöhter Muskeltonus und verminderter Gelenkbeweglichkeit, was die täglichen Aktivitäten beeinträchtigt und die Belastung der Pflegekraft erhöht². Obwohl antispastische Mittel wie Baclofen vorübergehend symptomatische Linderung bieten können, kann langfristige Anwendung zu Arzneimitteltoleranz und Nebenwirkungen führen und stellt die neuronale^{Funktion nicht} wieder her. Die konventionelle motorische Rehabilitation ist zudem durch einen langsamen Einbruch des Nutzens und eine verlängerte Behandlungsdauer eingeschränkt. Daher sind dringend sicherere und wirksamere therapeutische Strategien erforderlich, und die zugrunde liegenden Mechanismen erfordern weitere Untersuchungen. Neuroplastizität ist ein zentraler Mechanismus der funktionellen Erholung nach einem Schlaganfall und beinhaltet synaptische Remodellierung, axonale Regeneration und neuronales Überleben⁴. Nach einem ischämischen Schlaganfall sterben die Neuronen im Infarktkern schnell, während lokale Entzündungsreaktionen Gewebeschäden im ischämischen Penumbra verschlimmern; Zusammen treiben diese Prozesse die Hirnverletzung ^5,6 an. Synaptische Plastizität, ein Schlüsselbestandteil der Neuroplastizität, kann mit synapsenbezogenen Proteinen bewertet werden, einschließlich präsynaptischer Marker wie Synaptophysin (SYN) und wachstumsassoziiertem Protein 43 (GAP-43) sowie postsynaptischer Dichteprotein 95 (PSD-95)^7,8,9.

Neurotrophe Faktoren bilden eine molekulare Grundlage für synaptische Plastizität. Der von der Glialzelllinie abgeleitete neurotrophe Faktor (GDNF) ist besonders wichtig, da er das neuronale Überleben und die Reparatur fördert, Entzündungen unterdrückt und die synaptische^{Mikroumgebung verbessert}. Durch die Bindung an den Ret-Rezeptor kann GDNF die PI3K/Akt-Signalübertragung¹¹ aktivieren. Die PI3K/Akt-Kaskade ist ein wichtiger überlebensfördernder Weg im Nervensystem, und ihre Aktivierung hemmt die Apoptose, während sie die Proteinsynthese unterstützt, die für die synaptische Remodellierung^{erforderlich ist 12,13}. Kopfhautakupunktur kombiniert mit Bewegung (SAE) ist eine integrative Rehabilitationsstrategie, die Kopfhautakupunkturstimulation mit aktivem motorischem Training verbindet. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, gleichzeitig die zentrale neuronale Aktivität zu modulieren und die aufgabenbezogene motorische Erholung zu fördern, wodurch die Muskelhypertonie reduziert und die funktionellen Ergebnisse nach dem Schlaganfall verbessert werden. SAE wird in China weit verbreitet zur Behandlung von Spastizität nach Schlaganfall (PSS) eingesetzt. Die Begründung für diesen kombinierten Ansatz ist, dass die Kopfhautakupunktur die kortikale Erregbarkeit und die zerebrale Perfusion modulieren kann, während die Trainingstherapie aktivitätsabhängiges motorisches Training bietet, das die funktionelle Erholung und die synaptische Remodellierung fördert. Im Vergleich zur reinen Bewegungstherapie haben frühere klinische Erkenntnisse gezeigt, dass Kopfhautakupunktur an den Kopfhautpunkten in Kombination mit Bewegungstherapie die Spastizität der Gliedmaßen weiter reduziert und die motorische Funktion sowie die täglichen Aktivitäten bei Patienten mit Post-Schlaganfall-Gliedmaßenspasmen¹⁴ verbessert.

Eine aktuelle systematische Übersichts- und Metaanalyse deutete außerdem darauf hin, dass bewegungsartige Kopfhautakupunktur oder verwandte parallele Kopfhautakupunktur-Übungsinterventionen größere Verbesserungen in Spastizität, motorischer Funktion, Gleichgewicht und täglichen Aktivitäten bieten als Einzelkomponenten- oder sequentielle Interventionen, was den potenziellen Vorteil gleichzeitiger Neuromodulation und motorisches Training unterstützt¹⁵. Präklinische Studien haben gezeigt, dass SAE oder verwandte Bewegungs-Skalp-Akupunkturprotokolle den zerebralen Blutfluss verbessern und die Spastikität durch die 5-HT₂A-Rezeptor-vermittelte spinale KCC2-Reaktivierung^16,17 abschwächen können. Eine aktuelle Studie legt außerdem nahe, dass Akupunktur die Neuroplastizität über das PI3K/Akt-Signalsystem¹⁸ fördert. Daher könnte SAE besonders für experimentelle und klinische Kontexte geeignet sein, in denen die Modulation der post-stroke-neuronalen Plastizität, motorische Erholung und Spastizitätsreduktion zentrale therapeutische Ziele sind. Die potenzielle Assoziation zwischen SAE, GDNF/PI3K/Akt-Signalisierung und synaptischer Plastizität bei der Linderung von PSS ist jedoch weiterhin wenig verstanden. Die vorliegende Studie etablierte ein Rattenmodell von PSS, um die Auswirkungen von SAE auf neurologische Defizite und Muskelspastizität zu bewerten und Veränderungen in der GDNF-Expression, der PI3K/Akt-Signalwegaktivität sowie synaptischer plastizitätsbezogener Proteine nach der Intervention zu charakterisieren. Diese Studie könnte experimentelle Belege liefern, um festzustellen, ob SAE eine geeignete Rehabilitationsstrategie für PSS ist, und um den möglichen Wirkmechanismus zu klären.

Protokoll

Alle Verfahren wurden vom Tierethikkomitee der Changchun University of Chinese Medicine (Genehmigungsnr. 20251038) genehmigt und gemäß den Richtlinien Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE 2.0) sowie dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt. Alle in dieser Studie verwendeten Materialien sind in der Materialtabelle dargestellt.

Experimentelle Verfahren
Versuchstiere und Gruppierung
Achtzig spezifische pathogenfreie (SPF) erwachsene männliche Sprague–Dawley-Ratten (220–250 g) wurden von der Hongda Animal Breeding Farm (Bezirk Kuancheng, Changchun, China) gekauft. Die Tiere wurden im Versuchstierzentrum der Changchun University of Chinese Medicine unter kontrollierten Bedingungen von 22–25 °C, 50–60 % relativer Luftfeuchtigkeit und einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus untergebracht, mit freiem Zugang zu Futter und Wasser. Nach einer Woche der Akklimatisierung wurden die Ratten zufällig einer leeren Gruppe (n = 12), einer Sham-Gruppe (n = 12) und einer Modell-Reserve-Gruppe (n = 56) zugeteilt. Die Blankgruppe wurde als normale, unbehandelte Kontrollgruppe einbezogen, um Ausgangswerte für Verhaltensleistung, histopathologische Merkmale und molekulare Markerexpression bei gesunden Ratten bereitzustellen. Die Sham-Gruppe unterzog sich der gleichen Anästhesie und der operativen Exposition wie die MCAO-Gruppe, mit dem Unterschied, dass keine arterielle Okklusion durchgeführt wurde; Daher diente diese Gruppe als Kontrollgruppe für die möglichen Auswirkungen von Anästhesie und chirurgischer Manipulation. Die Aufnahme sowohl der Blank- als auch der Sham-Gruppe ermöglichte es, die Auswirkungen ischämischer Verletzungen von denen des chirurgischen Eingriffs selbst zu unterscheiden.

Die Modellreservegruppe wurde einer MCAO-Modellierung unterzogen. Die ersten drei Tage nach der Operation wurden als Modell-Induktionsperiode definiert. In diesem Zeitraum starben 8 von 56 Ratten, was einer Sterblichkeitsrate von 14,29 % entspricht, und 12 Ratten wurden ausgeschlossen, da die Modellierung erfolglos war. Die übrigen 36 Ratten mit erfolgreicher Modellbildung wurden zufällig mit einer Zufallszahlentabelle den MCAO-, SAE- und Baclofen-Gruppen zugeteilt, wobei jede Gruppe 12 Ratten umfasste. Die Gruppeninterventionen waren wie folgt: (I) Leere Gruppe: nur routinemäßige Fütterung, ohne Intervention. (II) Sham-Gruppe: chirurgische Exposition der Arterie Halsschlagader gemeinsam, der inneren und externen Halsschlagader sowie des Vagusnervs, ohne Ligation oder Filamenteinführung. (III) MCAO-Gruppe: MCAO wurde unter intraperitonealer Anästhesie mit 3 % Natriumpentobarbital etabliert, ohne weitere Behandlung. (IV) SAE-Gruppe: Nach erfolgreicher MCAO-Modellierung und Validierung erhielten die Ratten eine Kopfhautakupunktur in Kombination mit Bewegung. Eine Isofluran-Inhalationsanästhesie mit 1,5–2,0 % wurde nur während der kurzen Nadeleinführungsphase verwendet. Das Laufbandtraining begann erst nach vollständiger Bewusstseinsgewinnung und Wiedererholung der spontanen Gehfähigkeit. Akupunktur wurde bei GV20 und bilateral EX-HN1 durchgeführt. Die Nadeln wurden bis zu einer Tiefe von 1 mm eingeführt und während der Laufband-Trainingsphase beibehalten. Die standardisierte 30-minütige Nadelfesthalte-/Trainingsphase wurde als Laufbandtrainingsphase definiert und bestand aus 6 m/min für 10 Minuten, gefolgt von 12 m/min für 20 Minuten bei 0° Steigung. Die Intervention wurde einmal täglich an 7 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt. (V) Baclofen-Gruppe: Nach erfolgreicher MCAO-Modellierung und Validierung erhielten Ratten Baclofen durch intragastrische Gavage mit 0,4 mg/kg einmal täglich für 7 aufeinanderfolgende Tage.

Etablierung des MCAO-Modells
Das Ratten-MCAO-Modell wurde mit einer modifizierten intraluminalen Filamentmethode¹⁹ entwickelt. Nach 12 Stunden Fasten und Wassermangel wurden die Ratten durch eine intraperitoneale Injektion von 3 % Natriumpentobarbital betäubt und in die Rückenposition gebracht. Nach der Hautdesinfektion wurde ein Mittellinien-Halswirbelschnitt angefertigt, um die rechte Arteria common carotis (CCA) sowie angrenzende Nerven und Muskeln freizulegen. Die äußere Halsschlagader (ECA) wurde identifiziert und ligiert, und die interne Halsschlagader (ICA) isoliert. Ligaturen wurden an der proximalen ICA und CCA angebracht, und die distale CCA wurde vorübergehend geklemmt. Anschließend wurde im CCA proximal zur Klemme eine kleine Arteriotomie durchgeführt. Ein 0,26 mm dicker Nylonfaden wurde eingesetzt und 18–20 mm durch die ICA geführt, um den Ursprung der mittleren Großhirnarterie zu verschließen. ICA und CCA wurden anschließend ligiert und der Schnitt genäht. Nach der Operation wurden die Ratten während der Genesung warm gehalten und erhielten eine intraperitoneale Injektion von Penicillin (40.000 U), um eine Infektion zu verhindern. In der Sham-Gruppe wurde nur eine vaskuläre Exposition durchgeführt, ohne Filamentinsertion; Wundverschluss und postoperative Versorgung waren identisch mit denen der MCAO-Gruppe. Die erfolgreiche Modellentwicklung wurde definiert als ein Zea-Longa-Wert ≥ 2 3 Tage nach der^{Operation 19} und ein modifizierter Ashworth-Skala (MAS) Muskeltonuswert ≥ Grad 1²⁰.

Interventionsmethoden
Kopfhautakupunktur kombiniert mit Bewegungsintervention
Frühere Studien zeigen, dass bei MCAO-Ratten die neurologischen Defizite am dritten Tag ihren Höhepunkt erreichen und innerhalb von 10 Tagen nach der Operation erhöht bleiben, während der periphere Muskelwiderstand von Tag 6 bis Tag⁹²¹ progressiv zunimmt. Daher wurde die Behandlung am postoperativen Tag 3 eingeleitet und wurde einmal täglich über 7 aufeinanderfolgende Tage fortgesetzt, um die Auswirkungen der spontanen Genesung zu minimieren. Vor der Modellierung durchliefen die Ratten, die der SAE-Gruppe zugeteilt waren, drei Tage adaptives Laufbandtraining mit 5 m/min für 10 Minuten^{pro Tag 22} Minuten. Dieses adaptive Training wurde genutzt, um Ratten mit dem Laufbandlaufen vertraut zu machen und die Wahrscheinlichkeit von Kämpfen, Fallen, Laufweigerung oder Stopp während der formellen Interventionsphase zu verringern. Während des adaptiven Trainings und der formalen Intervention wurden abnormale laufbandbezogene Ereignisse als anhaltendes Kämpfen, Sturz aus der Laufbahn, Weigerung, länger als 1 Minute zu laufen, oder längeres als 1 Minute Stopp während des Laufbandtrainings definiert. Diese Ereignisse wurden in experimentellen Protokollen festgehalten, als sie beobachtet wurden. Kurzes Zögern oder vorübergehendes Stoppen führte nicht zu einem Ausschluss, wenn das Laufbandlaufen nach sanfter Aufforderung wieder aufgenommen werden konnte. Daten wurden nur dann ausgeschlossen, wenn ein Tier aufgrund wiederholter Stürze, anhaltender Laufweigerung oder starker Belastung die zugewiesene tägliche Laufbandsitzung nicht absolvieren konnte. Nach erfolgreicher Modellvalidierung am dritten Tag wurde die SAE-Intervention einmal täglich für 7 aufeinanderfolgende Tage durchgeführt.

Für jede Behandlungssitzung wurden die Ratten mit 1,5–2,0 % Isofluran betäubt. Die Anästhesie wurde unmittelbar nach dem Einsetzen der Nadel eingestellt. In der experimentellen Praxis erlangten Ratten typischerweise innerhalb von etwa 1–2 Minuten nach dem Isofluranentzug wieder das volle Bewusstsein. Das Laufbandtraining begann nicht, während die Ratten betäubt waren. Die Akupunkturen wurden von erfahrenen Tierakupunkteuren gemäß der Nomenklatur und Lokalisierung gewöhnlicher Akupunkturpunkte bei Versuchstieren, die 2020 von der China Association of Acupuncture-Moxibustion herausgegeben wurde, lokalisiert. GV20 war definiert als der Mittelpunkt der Linie, die die vorderen und hinteren Fontanellen auf der Schädelmittellinie verbindet. Die beidseitigen EX-HN1-Punkte befanden sich 2 mm lateral zu GV20. Einwegnadeln mit den Maßen 0,25 mm × 13 mm wurden vertikal bis zu einer Tiefe von 1 mm eingesetzt und während der standardisierten 30-minütigen Laufbandtrainingsphase beibehalten. Nadeln wurden mit atmungsaktivem medizinischem Klebeband befestigt, um eine Verschiebung zu verhindern, und die Schädelpenetration wurde durch Palpation ausgeschlossen, um eine prozedurale Konsistenz zu gewährleisten. Nadelposition und Klebeband wurden vor dem Laufbandtraining, während kurzer Pausen bei abnormalem Laufverhalten und unmittelbar nach Abschluss des Trainings überprüft. Außerdem wurde die Nadelposition während des Laufbandtrainings alle 5 Minuten visuell überprüft, unabhängig vom Tierverhalten. Nadelverschiebung wurde definiert als sichtbare Lockerung, eine Änderung des Nadelwinkels, teilweisen Rückzug oder vollständiges Lösen während des Laufbandlaufens. Wenn es zu leichter Lockerung ohne Verlust der Nadelposition kam, wurde das Band sanft verstärkt, während das Laufband kurzzeitig pausiert wurde. Wenn eine Nadel teilweise herausgezogen oder vollständig verrutscht wurde, wurde sie während dieser Sitzung nicht wieder eingesetzt; Die Ratte absolvierte das verbleibende Laufbandtraining ohne zusätzliche Nadelmanipulation, und das Ereignis wurde im experimentellen Logbuch dokumentiert. Tiere wurden nicht allein wegen eines einzelnen Nadelverschiebungsereignisses ausgeschlossen, es sei denn, das Ereignis ging mit einer Unfähigkeit zum Abschluss des Laufbandtrainings oder Anzeichen starker Belastung einher.

Die standardisierte 30-minütige Nadel-Retention und Trainingsphase begann, als die Ratte nach vollständiger Genesung von der Isofluran-Anästhesie mit dem Laufbandlaufen begann und endete unmittelbar nach Abschluss des Laufbandtrainings, als die Nadeln entfernt wurden. Das kurze Erholungsintervall nach dem Absetzen des Isoflurans wurde nicht in den standardisierten 30-minütigen Trainingszeitraum einbezogen. Da die Nadeln vor der Erholung eingeführt wurden, war die tatsächliche Verweildauer etwa 1–2 Minuten länger als die 30-minütige Laufbandtrainingsphase. Diese Definition wurde auf alle Ratten der SAE-Gruppe einheitlich angewendet. Eine Ratte galt als ausreichend genesen, um mit dem Laufbandtraining zu beginnen, wenn folgende Kriterien erfüllt waren: vollständige Wiedererholung des Bewusstseins, Fähigkeit zum eigenständigen Stehen, Fähigkeit, ruhig auf einer ebenen Unterlage zu gehen, und normale Reaktion auf sanfte äußere Stimulation. Diese Kriterien wurden vor der Platzierung auf dem Laufband überprüft.

Während der Nadelfesthaltung führten die Ratten Laufbandübungen bei 0° Neigung aus: 6 m/min für 10 Minuten, gefolgt von 12 m/min für 20 Minuten. Während der Studie wurde zu keinem Zeitpunkt Elektroschock eingesetzt. Wenn eine Ratte während des formalen Trainings aufhörte zu laufen oder sich weigerte, länger als eine Minute zu laufen, wurde sanfte, nicht-aversive auditive Stimulation, wie leichtes Klopfen auf die Laufbandwand, eingesetzt, um die Bewegung zu fördern. Der Einsatz solcher Impulse sowie jegliches Kämpfen, Fallen, Stoppen, Rennverweigern oder Nadelverschiebung wurden im experimentellen Logbuch dokumentiert, als es beobachtet wurde. Diese Ereignisse wurden deskriptiv überwacht und im experimentellen Logbuch dokumentiert, wenn sie beobachtet wurden. Die Trainingsintensität wurde umfassend angepasst, basierend auf zuvor berichteten Protokollen, die Kopfhautakupunktur mit Laufbandtraining^{kombinieren 16,23}. Die SAE-Intervention wurde einmal täglich über 7 aufeinanderfolgende Tage durchgeführt (Abbildung 1A).

Baclofen-Intervention
Nach erfolgreicher Modellvalidierung erhielten Ratten der Baclofen-Gruppe eine Baclofen-Lösung mittels intragastrischer Gavage in einer Dosis von 0,4 mg/kg. Das Medikament wurde einmal täglich um 9:00 Uhr an 7 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht.

Ergebnis-Mittelwert
Allgemeine Beobachtung
Der allgemeine Zustand wurde in allen Gruppen täglich überwacht, einschließlich Körpergewicht, geistigem Zustand, Nahrungs- und Wasseraufnahme sowie spontaner Aktivität.

Neurologische Funktion und Muskeltonusbewertung
Neurologische Defizite und Spastizität der Gliedmaßen wurden an den Tagen 1, 3, 5 und 7 nach Modellvalidierung mit dem Zea Longa-Score, dem modifizierten neurologischen Schweregrad (mNSS) und der modifizierten Ashworth-Skala bewertet. Alle Verhaltensbewertungen zu allen Zeitpunkten wurden unabhängig voneinander von zwei Forschern durchgeführt, die während des gesamten Beobachtungszeitraums für die Gruppenzuweisung blind waren. Detaillierte Bewertungskriterien sind dargestellt (Tabellen 1–3).

Bestimmung des zerebralen Infarktvolumens
Das Zerebralinfarktvolumen wurde mittels einer 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung bewertet. Nach 7 Tagen der Intervention wurden drei Ratten aus jeder Gruppe zufällig ausgewählt und durch eine intraperitoneale Überdosis von Natriumpentobarbital eingeschläfert, gefolgt von einer schnellen Enthauptung für die gesamte Gehirnsammlung. Die Gehirne wurden zunächst bei −20 °C eingefroren und anschließend in 2 mm dicke koronale Abschnitte geschnitten. Die Abschnitte wurden in einer 2%igen TTC-Lösung bei 37 °C für 30 Minuten im Dunkeln inkubiert und dann über Nacht in 4% Paraformaldehyd bei 4 °C fixiert. Am folgenden Tag wurden alle Abschnitte mit einer Digitalkamera fotografiert. Normales Hirngewebe war dunkelrot gefärbt, während infarktiertes Gewebe blass weiß erschien. Infarktflächen wurden mit ImageJ quantifiziert, und das Infarktvolumen wurde als Prozentsatz mit folgender Formel angegeben:

Infarktvolumen (%) = Infarktfläche / gesamter Hirnschnittbereich X 100%.   (1)

Histopathologische Untersuchung des Hirngewebes
Hämatoxylin–Eosin (HE) Färbung
Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen wurden verwendet, um histopathologische Veränderungen im periinfarkten Kortex zu bewerten. Nach 7 Tagen der Intervention wurden die Ratten durch eine intraperitoneale Überdosis von Natriumpentobarbital eingeschläfert. Anschließend wurde eine schnelle transkardiale Perfusion mit 0,01 m phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durchgeführt, um das Blut zu entfernen, gefolgt von 250 ml kaltem 4%-Paraformaldehyd (4 °C) zur Fixierung. Ganze Gehirne wurden entnommen, und peri-infarktes kortikales Gewebe isoliert und in 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C für 24 Stunden fixiert. Das Gewebe war paraffin-eingebettet und koronal bei 5 μm durchschnitten. Die Abschnitte wurden auf Objektträgern montiert, 30 Minuten bei 60 °C gebacken und in Xylol I–III (jeweils 10 Minuten) deparaffinisiert. Anschließend wurde eine HE-Färbung durchgeführt, gefolgt von Dehydrierung und Säuberung. Abschließend wurden Abschnitte mit neutralem Balsam gedeckt, und die Bilder wurden mit einem Nikon-Lichtmikroskop aufgenommen.

Nissl-Flecken
Die Nissl-Färbung wurde verwendet, um das neuronale Überleben und die Nissl-Körperdichte im periinfarkten Bereich zu beurteilen. Nach 7 Tagen der Intervention wurden die Ratten eingeschläfert und transkardial mit 0,01 M PBS (37 °C) perfundiert, gefolgt von 250 ml 4 % Paraformaldehyd (4 °C). Ganze Gehirne wurden entfernt, und periinfarktes sowie kontralaterale kortikale Gewebe wurden seziert und über Nacht in 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C fixiert. Nach der Paraffineinbettung wurden 5 μm-Abschnitte vorbereitet. Die Schnitte wurden 10 Minuten lang in Xylol deparaffinisiert, durch eine Reihe von graduierten Ethanollösungen (95 %, 90 %, 80 %, 70 % und 50 %; 5 Minuten pro Konzentration) rehydriert und bei Raumtemperatur 30 Minuten mit Nissl-Arbeitslösung gefärbt. Nach einer kurzen Spülung mit destilliertem Wasser wurden die Abschnitte durch gegraduertes Ethanol dehydriert, 2 Minuten lang in Xylol freigegeben und schließlich mit Deckfolien befestigt. Die Bilder wurden unter einem Lichtmikroskop aufgenommen und analysiert.

Western-Blot-Analyse der Protein-Exprssion
Western-Blotting wurde durchgeführt, um Proteine zu untersuchen, die an der PI3K/Akt-Signalübertragung und synaptischen Plastizität beteiligt sind. Nach 7 Tagen der Intervention wurden die Ratten mit einer Überdosis Natriumpentobarbital eingeschläfert, und periinfarktes motorisches Cortex-Gewebe wurde entnommen. Die Gewebe wurden vollständig homogenisiert in einem Radioimmunpräzipitations-Assay (RIPA)-Lysispuffer auf Eis und bei 1610 × g bei 4 °C für 30 Minuten zentrifugiert, um das gesamte Protein zu extrahieren. Die Proteinkonzentration wurde mit einem kommerziellen Bicinchoninsäure-(BCA)-Protein-Assay-Kit quantifiziert. Gleiche Mengen an Protein (50 μg pro Spur) wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt und elektrisch auf Polyvinylidenfluorid-(PVDF)-Membranen übertragen. Die Membranen wurden mit einer 5%igen Rinderserum-Albuminlösung (BSA) für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert, um unspezifische Bindungen zu eliminieren, und dann über Nacht mit primären Antikörpern bei 4 °C inkubiert. Nach drei Waschrunden mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung und Tween-20 (TBST)-Puffer wurden die Membranen mit sekundärem Antikörper (Verdünnungsverhältnis 1:1000) für 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Proteinbänder wurden mit verstärkter Chechemielumineszenz (ECL) visualisiert, und die Bandintensität wurde mit ImageJ quantifiziert. Die relative Proteinexpression wurde als Verhältnis des Zielproteins zur internen Kontrolle berechnet. Die primären Antikörper waren wie folgt: GAPDH (1:1000), PI3K (1:1000), phospho-PI3K (1:1000), Akt (1:1000), phospho-Akt (1:1000), GAP-43 (1:1000), SYN (1:1000), PSD-95 (1:1000) und GDNF (1:1000).

Synaptische Ultrastrukturbeobachtung
Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurde verwendet, um die Anzahl der Synapsen und die strukturelle Integrität zu beurteilen. Nach 7 Tagen der Intervention wurden die Ratten betäubt und transkardial mit einem gemischten Fixativ mit 4 % Paraformaldehyd und 2,5 % Glutaraldehyd perfundiert. Periinfarkt-kortikale Gewebeblöcke (1 mm × 1 mm × 1 mm) wurden gesammelt und 2,5 % Glutaraldehyd für 2 Stunden fixiert, gefolgt von einer Nachfixierung mit 1 % Osmiumtetroxid für 1 Stunde. Die Proben wurden anschließend mit graduierter Ethanoldehydratisierung, Epoxidharz-Einbettung, ultradünner Schnittung (50 nm Dicke) und Doppelfärbung mit Uranylacetat und Bleicitrat verarbeitet. Die synaptische Ultrastruktur wurde mit einem Transmissionselektronenmikroskop untersucht. Bilder wurden mit 8.000 × für die strukturelle Bewertung aufgenommen, und die Synapsen wurden mit 5.000 × gezählt. Drei zufällige Neuropilfelder pro Gruppe wurden analysiert, um die mittlere Synapsenzahl zu berechnen, und die Daten wurden mittels Einweg-ANOVA verglichen.

Immunfluoreszenz-Doppel-Markierungstest
Eine Immunfluoreszenz-Doppel-Markierungsfärbung wurde durchgeführt, um die Expression und Verteilung von SYN und p-Akt im periinfarkten Kortex zu bewerten. Nach 7 Tagen der Intervention wurden die Ratten durch eine intraperitoneale Überdosis von Natriumpentobarbital eingeschläfert, und das peri-infarktische kortikale Gewebe wurde schnell seziert. Die Proben wurden 24 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert, in eine optimale Schneidtemperaturverbindung (OCT) eingebettet und in 10 μm dicke Abschnitte geschnitten. Die Abschnitte wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet und dreimal mit TBST-Puffer gewaschen, um die Reste von OCT-Substanz zu entfernen. Die Schnitte wurden mit 0,3 % Triton X-100 für 20 Minuten bei Zimmertemperatur permeabilisiert, mit PBS abgespült und mit 5 % BSA-Lösung für 1 Stunde bei Zimmertemperatur blockiert. Bei dunklen Bedingungen wurden Abschnitte über Nacht bei 4 °C mit Kaninchen-Anti-SYN (Verdünnung 1:200) und Kaninchen-anti-p-Akt (Verdünnung 1:200) Primärantikörpern inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Schnitte dreimal mit PBS gewaschen und im Dunkeln mit einem sekundären Antikörper (Verdünnung 1:400) bei Zimmertemperatur 50 Minuten lang inkubiert. Nach sechs weiteren Waschgängen mit TBST-Puffer wurden die Zellkerne mit einer 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) Arbeitslösung für 5 Minuten bei Raumtemperatur gekontert. Die Bilder wurden unter identischen Belichtungs- und Hintergrundeinstellungen mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen. Repräsentative Bilder wurden verwendet, um SYN- und p-Akt-Expressionsmuster im motorischen Kortex über verschiedene Gruppen hinweg zu bewerten.

Statistische Analyse
Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism 10.1.2 und IBM SPSS Statistics 25 durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Verhaltensdaten, die zu mehreren Zeitpunkten erhoben wurden, darunter der Zea-Longa-Score, der modifizierte Neurologische Schwerewert und die modifizierte Ashworth-Skala, wurden mit einer zweiseitigen wiederholten ANOVA analysiert, bei der die Gruppe als Zwischen-Proben-Faktor und die Zeit der Faktor innerhalb der Probanden war. Wenn signifikante Haupteffekte oder Wechselwirkungen festgestellt wurden, wurde Sidaks Mehrfachvergleichstest für die Post-hoc-Analyse verwendet. Weitere Daten wurden mittels Einweg-ANOVA analysiert, gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest für Post-hoc-Vergleiche. Ein zweiseitiger p. < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. In Balkendiagrammen wird die statistische Signififikanz durch Sternchen angegeben, wie sie in den entsprechenden Abbildungslegenden definiert sind.

Ergebnisse

SAE verbessert die neurologische Funktion und reduziert die Muskelspastizität bei PSS-Ratten
Die therapeutischen Effekte von SAE auf Verhaltensstörungen bei Ratten mit post-schlaganfall-Spastizität wurden an den Tagen 1, 3, 5 und 7 nach Modellvalidierung mit dem Zea Longa-Score, dem modifizierten neurologischen Schweregrad und der modifizierten Ashworth-Skala bewertet. Der Zea Longa-Score und mNSS wurden zur Bewertung neurologischer Defizite verwendet, während der MAS...

Diskussion

Frühere klinische Studien haben gezeigt, dass Kopfhautakupunktur in Kombination mit Bewegung spastische Symptome bei Patienten mit Spastizität nach einem Schlaganfall lindern und gleichzeitig die motorische Funktion und Aktivitäten im Alltag verbessern kann (ADL)^14,24. Diese Erkenntnisse stützen ihren klinischen Wert. Die vorliegende Studie bestätigte zudem den therapeutischen Nutzen von SAE in einem Rattenmodell unter Verwendung...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid-Färbelösung	Beyotime	C0651	TTC-Färbung
3MM Filterpapier	Whatman, UK	3030861	Western Blot Transfer
AKT-Antikörper	Affinity	AF0836	Primärantikörper
Aceton	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10000418	Infiltration von Elektronenmikroskopie-Proben
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	Version 29.5 (64-Bit), https://www.adobe.com/products/illustrator.html	64-Bit-Version, verwendet für Grafikbearbeitung und wissenschaftliche Figurenvorbereitung
Wasserfreies Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	100092683	Deparaffinierung von Paraffinschnitten
Anti-Fade-Montagemedium	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1020	Deckglasaufbringung
BCA-Protein-Assay-Kit	MDL	MD913053	Proteinkonzentrationsbestimmung
Bläuungslösung	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2104	Hämatoxylin-Färbung
Chemilumineszenz-Bildgebungssystem	CLINX, China	ChemiScope6100	System Erkennung von Zielprotein
Konzentriertes normales Ziegen-Serum	Boster Biological Technology	AR1009	Serum-Blockierung
DAPI	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1030	Kernfärbung
Diamantmesser	Daitome	Ultra 45°	Ultradünne Proben schneiden
Differenzierungslösung	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2104	HE-Färbung
Trockenschrank	Tianjin Labory Instruments Equipment Co., Ltd.	GFL-230	Gefixte Gewebeschnitte backen
EDTA (pH 9,0) Antigen-Retrieval-Lösung	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1052	Antigen-Retrieval
Elektronenmikroskopisches Fixiermittel	ASPEN	AS1063	Fixierung von Elektronenmikroskopie-Proben
Elektrophorese-Stromversorgung	Longfang	LF-2000	Elektrophoresespannung bereitstellen
Embed 812 Einbettmedium	SPI	90529-77-4	Infiltration von Elektronenmikroskopie-Proben
EndNote X9	Clarivate Analytics (US) LLC	Version X9, https://endnote.com/	Verwendet für Referenzverwaltung und akademische Zitationsformatierung
Gefriertisch	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JB-L5	Einfrieren von Gewebeblöcken
GAP-43-Antikörper	Affinity	Df7766	Primärantikörper
GAPDH-Antikörper	Affinity	AF7021	Primärantikörper
GDNF-Antikörper	Biosynthesis	Bs-1024r	Primärantikörper
Eisessig	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2138	Nissl-Färbung
Gläser und Deckgläser	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10212432C	Montieren von Gewebeschnitten
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	Version 10.1.2 (324) für Windows 64-Bit, https://www.graphpad.com/	64-Bit-Version, verwendet für statistische Analyse und wissenschaftliche Darstellung
Schleifmaschine	Beijing Herde	N.9548	Gewebeproben mahlen
HE-Färbelösung	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2103	HE-Färbung
HRP-konjugierter Sekundärantikörper gegen Maus	Servicebio	C030205	Sekundärantikörper
HRP-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper	SeraCare	5220-0336	Sekundärantikörper
Wasserstoffperoxid (H2O2)	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C5101	Zubereitung von TSA-Reagenzien
IBM SPSS Statistics	IBM Corp.	Version 25, 64-Bit, https://www.ibm.com/products/spss-statistics	64-Bit-Version, verwendet für statistische Datenanalyse und Verarbeitung
Bildgebungssystem	Nikon, Japan	Nikon DS-U3	Mikroskopische Bilder erfassen
Metallbad	COYOTE	H203-H	Konstanttemperatur-Inkubation
Mikrowelle	Galanz Microwave Electrical Appliance Co., Ltd.	P70D20TL-P4	Antigen-Retrieval
NC-Membran (0,22 μm)	GVS, USA	ISEQ00010	Protein-Blot-Transfer
Neutraler Balsam	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10004160	Dehydrierung und Deckglasaufbringung
PBS-Puffer	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C0003	Entfärbung und Waschen
PI3K-Antikörper	Affinity	AF6241	Primärantikörper
PSD-95-Antikörper	Affinity	Af5283	Primärantikörper
Pathologischer Mikrotom	Leica Instruments (Shanghai) Co., Ltd.	RM2016	Paraffinschnitte schneiden
Phospho-AKT-Antikörper	Affinity	Af0832	Primärantikörper
Phospho-PI3K-Antikörper	Affinity	Af3241	Primärantikörper
Pipette	Dragonlab	KE0003087/KA0056573	Quantitative Flüssigkeitsübertragung
Protease-Inhibitor-Cocktail	Beyotime	P1005	Protease-Hemmung
RIPA-Lyse-Puffer (Medium)	Beyotime	P0013C	Gewebe-Lyse
Kühlzentrifuge	SEILOGEX, China	CF1524R	Niedertourige Probentrennung
SDS-PAGE-Elektrophoresesystem	Beyotime	MiniProGel™ Gel-Casting, Elektrophorese und Western Blot Transfer System	Proteinelektrophoretische Trennung
SDS-PAGE-Fertiggel-Kit	MDL	MD911919	SDS-PAGE-Elektrophorese
SYN (Synapsin)-Antikörper	Biosynthesis	bs-3501R	Primärantikörper
Schüttler	Qilinbeier	TS-8	Probenoszillationswaschung
Gewebe-Entwässerungsapparat	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JJ-12J	Paraffingewebe entwässern
Gewebe-Einbettungsmaschine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.