Ein Modell der piroxicam-beschleunigten Enterokolitis bei Interleukin-10-Knockout-Mäusen zur Untersuchung entzündungsinduzierter metabolischer Veränderungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll verwendet Piroxicam, um die Entwicklung der Kolitis im Interleukin-(IL-10)-Knockout-Mausmodell zu beschleunigen. Das Protokoll gewährleistet die Synchronisation der Kolitis, was zu rigorosen, reproduzierbaren Ergebnissen unabhängig von Geschlecht, Hintergrundbelastung oder Vivariumsbedingungen führt. Es dient als nützliches Modell zur Untersuchung von Stoffwechselveränderungen während der Darmentzündung.

Zusammenfassung

Entzündliche Darmerkrankung (IBD) ist eine chronisch entzündliche Erkrankung des Verdauungstrakts, die weltweit über 10 Millionen Menschen betrifft. Während umfangreiche Forschung sich auf die immunologischen Mechanismen und Folgen der IBD konzentriert hat, ist weniger darüber bekannt, wie die schleimhautige Entzündung zur metabolischen Dysregulation beiträgt, einschließlich Gewichtsverlust und vermindertem Appetit. Hier beschreiben die Autoren ein Mausmodell der piroxicam-beschleunigten Enterokolitis bei Interleukin-10-Knockout (IL-10-KO)-Mäusen, um eine entzündungsinduzierte metabolische Dysregulation zu untersuchen. IL-10-KO-Mäuse sind dafür bekannt, spontane Enterokolitis zu entwickeln und eine erhöhte Anfälligkeit für durch Infektionen oder Medikamente ausgelöste Enterokolitis zu haben. Allerdings wurden in diesem Modell Vivariumsbedingungen und Hintergrund als Störer bei der Entwicklung von Kolitis berichtet. Piroxicam, ein nichtsteroidales entzündungshemmendes Medikament (NSAID), wurde gezeigt, dass es in Tiermodellen eine Enterokolitis auslöst oder beschleunigt, indem es die schleimhautige Exposition gegenüber luminalen Bakterien erhöht. In diesem Protokoll wurden männliche und weibliche IL-10-KO-Mäuse anstelle einer regulären Futterdiät mit Piroxicam angereichert. Nahrungsaufnahme und Körpergewicht wurden täglich gemessen, um Veränderungen des gesamten Körperstoffwechsels sowie klinische Manifestationen der Enterokolitis wie Durchfall und rektale Blutungen widerzuspiegeln. Das Protokoll ist effizient und reproduzierbar, induziert gleichzeitig Enterokolitis bei mehreren Mäusen und ermöglicht die Beurteilung der metabolischen Dysregulation in einem entzündlichen Darmerkrankungsmodell. Weitere Studien mit diesem Protokoll könnten die Auswirkungen der Enterokolitis auf andere Komponenten der metabolischen Dysregulation untersuchen, wie Energieverbrauch und Körperzusammensetzung, und breitere Zusammenhänge zwischen entzündlichen Darmerkrankungen und Wirtsstoffwechsel aufzeigen.

Einleitung

Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, zusammen bekannt als entzündliche Darmerkrankung (IBD), sind chronische Autoimmunerkrankungen des Magen-Darm-Trakts, die durch eine schleimhautige Entzündung gekennzeichnet sind, mit klinischen Manifestationen wie Bauchschmerzen, Gewichtsverlust, Hämatotezie und Durchfall. IBD betrifft weltweit Millionen von Menschen, mit der höchsten Prävalenz in westlich geprägten Gesellschaften¹. In den USA wird geschätzt, dass über 3 Millionen Menschen betroffen sind. ^2,3, mit einer steigenden Inzidenz und Prävalenz, insbesondere bei Kindern und Jugendlichen ^4,5.

Die genauen Mechanismen, die der IBD-Pathogenese zugrunde liegen, sind noch unvollständig bekannt, aber die Krankheit wird weithin als Folge einer übertriebenen Immunantwort auf die Darmmikrobiota bei genetisch anfälligen Personen angesehen. Zytokine, die die Entzündungsreaktionen modulieren, spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Darmhomöostase und bei der Entwicklung von IBD. Unter diesen ist Interleukin-10 (IL-10) ein gut erforschtes antiinflammatorisches Zytokin, das hilft, die immunologische Homöostase beim Menschen aufrechtzuerhalten, indem es sowohl die angeborenen als auch die adaptiven Arme der Immunantwort ^6,7 reguliert. Bemerkenswert ist, dass Polymorphismen in IL-10 und seinem Rezeptor (IL-10RA/B) bei Säuglingen mit sehr früh einsetzender IBD (VEO-IBD) identifiziert wurden, die klassisch innerhalb der ersten Lebensmonate eine perianale Erkrankung^zeigen. Diese Verbindung wird weiter durch groß angelegte Exom-Sequenzierung erwachsener Patienten mit Morbus Crohn gestützt, die IL-10RA als Krankheitsanfälligkeitslocus im nicht-monogenen IBD⁹ identifizierte. Darüber hinaus wurde bei VEO-IBD-Patienten ein nicht-genetischer Signalweg beschrieben, der IL-10-neutralisierende Antikörper umfasst, was die Bedeutung dieses Weges für die Aufrechterhaltung der schleimhäusigen Immunhomöostase¹⁰ weiter unterstreicht.

Aufbauend auf Studien am Menschen, die IL-10 für IBD in Verbindung bringen, wurden Interleukin-10-Knockout (IL-10-KO)-Mäuse als Modell entwickelt, um die Rolle von IL-10 bei IBD zu untersuchen. IL-10-KO-Mäuse sind dafür bekannt, spontane Enterokolitis mit einer übertriebenen CD4+-Th1-Reaktion auf Reize zu entwickeln, typischerweise beginnend im Alter von 8–12 Wochen im^{Alter von 11} Jahren. Die Entwicklung einer spontanen Enterokolitis bei IL-10-KO-Mäusen kann jedoch ohne einen beschleunigten Erreger 12,13,14 unvorhersehbar sein, abhängig vom genetischen Stamm, der Zusammensetzung der Mikrobiota und den Wohnbedingungen ^15,16. Der Einsatz eines zuverlässigen Protokolls zur Induzierung von Kolitis ist entscheidend, damit das IL-10-KO-Modell praktisch nützlich ist. Frühere Studien verwendeten nichtsteroidale entzündungshemmende Medikamente (NSAR) wie Piroxicam, um Enterokolitis bei IL-10-KO-Mäusen^17,18 zu induzieren. Diese Studien konzentrierten sich jedoch hauptsächlich auf immunologische Veränderungen, mit relativ wenig Fokus auf die Auswirkungen der Enterokolitis auf den Stoffwechsel oder auf die Rolle des Geschlechts bei der Kolitis-Schwere¹⁹. Die Autoren beschreiben hier die Verwendung einer mit Piroxicam angereicherten Diät zur Induzierung einer Enterokolitis bei IL-10-KO-Mäusen und charakterisieren metabolische Dysregulation sowie mukosale entzündliche Reaktionen in diesem Modell sowohl mit männlichen als auch weiblichen Mäusen. Dieses Protokoll misst das Körpergewicht und die Nahrungsaufnahme, um die Stoffwechselveränderungen des gesamten Körpers sowie klinische Manifestationen von Kolitis und histologische sowie transkriptomische Veränderungen widerzuspiegeln, die eine schleimhautentzündung widerspiegeln. Dieses effiziente und reproduzierbare Modell bietet ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen IBD und Wirtsstoffwechsel.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß dem vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am University of Texas Southwestern Medical Center genehmigten Protokoll gemäß dem "Leitfaden für die Pflege und Nutzung von Labortieren" [Genehmigungsnummer: 2017-102011] durchgeführt. Die Euthanasie erfolgte gemäß institutionellen Leitlinien. Für die durchgeführten Eingriffe war keine Anästhesie erforderlich. Spezifische Details für Materialien sind in der Materialtabelle beschrieben.

1. Etablierung des piroxicam-beschleunigten Enterokolitis-Modells bei IL-10-KO-Mäusen

1. Pflege von IL-10-KO-Mäusen in einer speziellen pathogenfreien (SPF) Einrichtung in einem 12-Stunden-Lichtzyklus mit ad libitum-Zugang zu Futter und Wasser.
2. Individuel werden 7–8 Wochen alte, geschlechtsgleiche Mäuse in Mikroisolatorkäfigen untergebracht. Lassen Sie Mäuse sich mindestens eine Woche vor Beginn des Experiments an Einzelunterkünfte und tägliche Handhabung gewöhnen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Körpergewicht bei Männchen >20 g oder bei Weibchen >17 g beträgt und dass Mäuse frei von Kampfverletzungen sind.
3. Teilen Sie Mäuse einer Versuchsgruppe und einer Kontrollgruppe zu. Für die Versuchsgruppe ersetzen Sie das Standardchow durch mit Piroxicam verstärktes Chow. Für die Kontrollgruppe sollten Sie frisches Standardessen bereitstellen. Gib 50 g Futter zu jedem Käfigbehälter.
   HINWEIS: Weisen Sie jeder Gruppe mindestens fünf Mäuse pro Geschlecht zu. Das mit Piroxicam angereicherte Chow (200 ppm) wurde von Teklad mit Piroxicam zubereitet, das von den Forschern bereitgestellt wurde, um eine maßgeschneiderte Futter für Labortiere herzustellen. Um die Variabilität von Charge zu Charge zu minimieren, wird empfohlen, dass alle Tiere eines Experiments Futter aus derselben Produktionscharge erhalten. Wenn möglich, sollte dieselbe Charge auch in verschiedenen Experimenten verwendet werden, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern.

2. Überwachung des Körpergewichts und des Ernährungsverhaltens

1. Mit einer analytischen Waage wird das Körpergewicht jeder Maus erfasst. Wiegen Sie jede Maus einzeln zur gleichen Zeit, täglich für 7 aufeinanderfolgende Tage. Berichte das tägliche Körpergewicht als Prozentsatz des Grundgewichts am Tag 0 (auf 100 % gesetzt).
   HINWEIS: Ein Gewichtsverlust von mehr als 20 % deutet auf übermäßigen Stress und ein Risiko eines unmittelbaren Todes hin. Mäuse sollten eingeschläfert werden, wenn diese Schwelle erreicht wird.
2. Mit einer analytischen Waage wird das Anfangsgewicht des mit Piroxicam verstärkten Chows und das Standardfutter in jedem Käfig erfasst.
3. Dann misst man die verbleibende Mahlzeit in jedem Käfigbehälter zur gleichen Zeit, täglich für 7 aufeinanderfolgende Tage.
4. Berechnen Sie den täglichen Essenskonsum, indem Sie das tägliche Essensgewicht vom restlichen Essen des Vortages abziehen.
   HINWEIS: Überprüfen Sie regelmäßig die Menge an Futter und füllen Sie nach, wenn sie unter 10 g liegt. Die Schmackhaftigkeit von Piroxicam-Chow beeinflusst nicht die Aufnahme und sollte der von Standardessen sehr ähneln.

3. Überwachung der Krankheitsaktivität

1. An den Tagen 0 und 7 werden die Kotpellets einzelner Mäuse visuell untersucht und das Vorhandensein von Blut im Stuhl festgestellt.
2. Wenn kein Blut sichtbar ist, führen Sie einen Test auf okkultes Blut im Stuhl durch, indem Sie eine Kugel auf die Testkarte auftragen und dann das mitgelieferte Entwicklerreagenz hinzufügen. Punktzahlen gemäß Tabelle 1.
3. An den Tagen 0 und 7 sollten frisch entleerte Kotpellets visuell untersucht werden, um die Konsistenz des Stuhls zu prüfen. Verwenden Sie eine flache Pinzette, um die Konsistenz zu verbessern. Punktzahlen gemäß Tabelle 1.
4. An den Tagen 0 und 7 bestimmen Sie den Ausmaß des rektalen Prolaps, indem Sie den perianalen Bereich untersuchen. Punktzahlen gemäß Tabelle 1.
5. Missen Sie das Körpergewicht wie oben beschrieben. Punktzahlen gemäß Tabelle 1.
   HINWEIS: Die Bewertung des Disease Activity Index (DAI) sollte vom selben Forscher während des gesamten Experiments blind durchgeführt werden, um Konsistenz sicherzustellen, Beobachterverzerrungen zu minimieren und die Zuverlässigkeit der Bewertung zu verbessern.

4. Entnahme von Darmgewebe

1. Euthanasie Mäuse durch CO-2-Erstickung und zervikale Verrenkung, wie anderswo berichtet²⁰.
2. Legen Sie die Maus in Rückenlage und sprühen Sie 70 % Ethanol auf den ventralen Bauch.
3. Heben Sie die Haut mit der Pinzette an und schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere entlang der Mittellinie. Legen Sie die Bauchhöhle frei und lokalisieren Sie den Dickdarm.
4. Legen Sie den Dickdarm und das Fäderum mit stumpfer Dissektion frei. Entfernen Sie den Colon-en-bloc, einschließlich des Felskörpers und der Analmanschette.
5. Legen Sie den Dickdarm auf eine ebene Fläche und entfernen Sie jegliches Bindegewebe.
6. Messen und notieren Sie die Dickdarmlänge.
7. Nach der Messung der Dickdarmlänge entfernen Sie das Blinddarm durch Schneiden an der Kekokolonialverbindung.
8. Bereiten Sie eine 10-ml-Spritze vor, gefüllt mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und einer angebrachten 22-Gauge-Kugelspitze wiederverwendbaren Stahl-Gavage-Nadel. Führe die Nadel in den Dickdarm ein und spüle den Darminhalt aus.
9. Geben Sie den gespülten Dickdarm in eine Petrischüssel mit PBS und spülen Sie den Restinhalt ab. Sobald sie freigegeben ist, verwenden Sie sie für nachgelagerte Assays.

5. Histologieanalyse

1. Lege den Dickdarm flach auf einen Glasrutschen. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe am distalen Ende um sich herum zu wickeln, um eine "Schweizer Rolle" zu formen. Dabei bleibt das distale/anale Ende in der inneren Rolle, während die näheren Regionen zur äußeren Rolle hinausgehen.
2. Mit einer 27-Gauge-Nadel steckt man den gerollten Dickdarm fest, um die Rolle zu halten, und legt sie in eine Einbettungs-Gewebekassette.
3. Zur Reparatur von Geweben tauchen Sie Gewebekassetten für 16 Stunden bei 4 °C in eine 10%ige Formalinlösung ein.
   VORSICHT: 10 % Formalin sind schädlich, wenn es mit der Haut in Kontakt kommt, und kann schwere Hautverbrennungen und Augenschäden verursachen. Führen Sie vorsichtig mit Schutzhandschuhen und medizinischen Schutzbrillen. Restformalin sollte ordnungsgemäß gemäß institutionellen Richtlinien entsorgt werden.
4. Nach der Formalinfixierung werden Gewebe für die Paraffineinbettung verarbeitet und für die Montage auf Glasobjekten geschnitten.
   HINWEIS: Die Proben sollten an ein histologisches Labor mit der notwendigen Ausrüstung für die Verarbeitung von Gewebekassetten in Paraffin, Scrollschnitt, Objektträgerbefestigung sowie Hämatoxylin- und Eosinfärbung eingereicht werden.
5. Färbungsgewebe-Folien mit Hämatoxylin und Eosin (HE) gemäß den festgelegten Protokollen²¹.
6. Mit dem in Tabelle 2 beschriebenen histologischen Bewertungssystem werden in jedem Abschnitt folgende histologische Merkmale bewertet: Gewebeschäden durch Enterokolitis, lamina-propria-inflammatorische Zellinfiltration und Prozentsatz der betroffenen Fläche. Kombinieren Sie die Punktzahlen in jedem Abschnitt, um eine Gesamtpunktzahl zu erhalten (Tabelle 2).
   Gesamtpunktzahl = Merkmale × Beteiligung (Gewebeschädigung) + Merkmale × Beteiligung (Lamina Propria entzündliche Zellinfiltration) (1)
7. Repräsentative histopathologische Bilder von Gewebeschäden und Zellinfiltration finden sich in der Veröffentlichung von Erben et al.²².
   HINWEIS: Die histologische Bewertung sollte blind durchgeführt werden, vorzugsweise von einem ausgebildeten Pathologen, um die Konsistenz und Zuverlässigkeit der Beurteilung zu gewährleisten.

6. Immunfluoreszente Färbung von formalinfixiertem, paraffin-eingebettetem Gewebe

1. Legen Sie die Folien in ein Slide-Gitter und in einen 55 °C Slide-Trockner für 1 Stunde, um Paraffin zu schmelzen.
2. Platziere die Objektträger in ein Beichtgestell und tauche das Gestell nacheinander für 3 Minuten in Färbeglaser mit Xylen. Wiederhole diesen Schritt dreimal.
3. Tauchen Sie das Beichtgestell für 3 Minuten in Färbegläser mit 100 % Ethanol. Wiederhole diesen Schritt dreimal.
4. Tauchen Sie das Beichtgestell für 3 Minuten in das Farbglas mit 95 % Ethanol ein.
5. Tauchen Sie das Färbergitter für 3 Minuten in das Färbeglas mit 80 % Ethanol.
6. Tauchen Sie das Färbergestell für 5 Minuten in Färbungsgläser mit deionisiertem (DI) Wasser.
   HINWEIS: Alle vorherigen Schritte müssen aufgrund der Xylengampe in einer belüfteten Haube durchgeführt werden. Führen Sie vorsichtig mit Schutzhandschuhen und medizinischen Schutzbrillen. Residuales Xylol sollte gemäß institutionellen Richtlinien ordnungsgemäß entsorgt werden.
7. Die Objektträger auf ein Objektträgergestell übertragen und in ein Färbeglas mit 1× Citrat-Entnahmelösung untertauchen.
8. Stellen Sie das Färbeglas in die Halterung der Färbeschüssel.
9. Stelle die Halterung der Fleckschale in den Schnellkochtopf.
10. Kochen Sie 15 Minuten in einem Schnellkochtopf.
11. Holen Sie die Objektträger aus dem Schnellkochtopf und lassen Sie sie auf Zimmertemperatur abkühlen.
12. Inkubieren Sie die Objektträger mit einem 300-μL-Blockpuffer (3,5 % Ziegenserum, verdünnt in PBS) für 1 Stunde in einer befeuchteten Kammer. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig vom Blockpuffer bedeckt ist.
13. Belichten Sie die Objektträger 300 μL primärer Antikörper, die in einem Blockpuffer verdünnt wurden, für 16 Stunden bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig vom primären Antikörper bedeckt ist. Folgender primärer Antikörper wurde verwendet: Anti-S100A8/S100A9 (1:500).
    HINWEIS: Antikörperverdünnungen sind reagenzienspezifisch und sollten den Empfehlungen des Lieferanten folgen.
14. Spülen Sie die Objektträger, indem Sie sie dreimal für 5 Minuten in PBS in ein Färbeglas tauchen.
15. Belichte Objektträger 300 μL eines verdünnten fluoreszierenden Sekundärantikörpers im Blockpuffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig vom sekundären Antikörper bedeckt ist. Folgender fluoreszierender sekundärer Antikörper wurde verwendet: Ziegen-Anti-Rabbit Alexa Fluor 555 (1:150 Verdünnung).
    HINWEIS: Ab diesem Punkt sollten Objektträger vor Licht geschützt werden, um Photobleaching von Fluorophoren zu verhindern. Verdünnungen der sekundären Antikörper sind reagenzienspezifisch und sollten den Empfehlungen des Lieferanten folgen.
16. Spülen Sie die Objektträger, indem Sie sie dreimal für 5 Minuten in PBS in ein Färbeglas tauchen.
17. Setzen Sie Objektträger einer nuklearen Färbung aus, indem Sie sie für 20 Minuten in einer 1:5000 in PBS verdünnten Hoechst-Lösung in einem Färbeglas untertauchen.
18. Spülen Sie die Objektträger, indem Sie sie dreimal für 5 Minuten in PBS in ein Färbeglas tauchen.
19. Wischen Sie vorsichtig jegliches PBS von den Objektträgern mit einem nicht abrasiven Gewebe ab. Füge 50 μL Antifade-Montagemedium und einen Deckdecker hinzu.

7. RNA-Extraktion

1. Den gesamten Dickdarm oder ein Fragment in flüssigem Stickstoff einfrieren und dann bei -80 °C lagern. Alternativ sollte man in 1,5 mL RNALater-Konservierungslösung eintauchen und gemäß den Anweisungen des Herstellers lagern.
2. Taue den zuvor gefrorenen Dickdarm auf und lege ihn auf eine ebene Oberfläche. Zerstören und homogenisieren Sie das Gewebe mit einem handgehaltenen Homogenisierer.
3. Isoliere RNA mit dem Kit und folge den Anweisungen des Herstellers.
4. Missen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer. A₂₆₀/A₂₈₀ Verhältnisse > 1,8 und A₂₆₀/A₂₃₀ Verhältnisse von 2,0–2,2 deuten auf akzeptable RNA-Reinheit hin.
5. Fahren Sie mit der Reverse-Transkription fort, gefolgt von qPCR mit SYBR-grünem interkalierendem Farbstoff.
6. Analysieren Sie die Ergebnisse mit der Quantifizierungsplattform oder einem ähnlichen Instrument.

Ergebnisse

Männliche und weibliche IL-10-KO-Mäuse entwickeln nach kurzer Exposition mit einer mit Piroxicam angereicherten Ernährung eine Enterokolitis (Abbildung 1A–E). Am zweiten Tag zeigten Piroxicam-exponierte Mäuse statistisch signifikant einen größeren Gewichtsverlust als ihre gleichgeschlechtlichen, regelmäßig gefütterten Kontrollpersonen, und vergleichbare Gewichtsverluste wurden über alle Geschlechter hinweg beobachtet (Abbildung 1B). Die scheinbare tägliche Nahrungsaufnahme blieb während der Piroxicam-Exposition und der Entwicklung von Enterokoliten unverändert und ähnelte der Aufnahme des Standardessens, was darauf hindeutet, dass der Gewichtsverlust in diesem Modell nicht primär durch eine reduzierte Aufnahme, sondern vielmehr durch andere Faktoren verursacht wird, die den Stoffwechselverbrauch fördern (Abbildung 1C).

Um das Fortschreiten der Darmentzündung weiter zu untersuchen, wurde die Krankheitsaktivität anhand eines kombinierten Werts von Gewichtsverlust, Blut im Stuhl, Stuhlkonsistenz und Ausmaß des rektalen Prolaps bewertet. Der modifizierte Krankheitsaktivitätsindex (DAI) wurde zu Beginn und Tag 7 bewertet; Die Ergebnisse des 7. Tages sind in Abbildung 1D dargestellt. Darüber hinaus war die Entwicklung der Enterokolitis, die bei Piroxicam-exponierten Mäusen beobachtet wurde, mit einem starken Trend zu erhöhter Sterblichkeit assoziiert, obwohl dieser Unterschied statistisch nicht signifikant war (p = 0,12; Abbildung 1E). In diesem Modell ist die frühe Sterblichkeit sekundär daran, dass Mäuse humane Endpunkte erreichen (Gewichtsverlust > 20 %) und betrifft bevorzugt Männchen (Abbildung 1E). Wenn die Sterblichkeit ein gefragter experimenteller Endpunkt ist, kann eine größere Anzahl von Versuchstieren als hier verwendet werden. In dieser Studie nutzten die Autoren die minimale Anzahl von Tieren, die notwendig sind, um statistische Stärke durch den Abschluss der Studie zu erzielen, wobei die erwartete Sterblichkeit berücksichtigt wurde.

Die Verkürzung des Darms ist ein Merkmal, das mit der Schwere der Kolitis bei Mausmodellen in Verbindung steht. Bei der Ernte hatten sowohl männliche als auch weibliche IL-10-KO-Mäuse, die mit einer Piroxicam-Diät gefüttert wurden, kürzere Darmen als die regulären Mäuse (Abbildungen 2A–B). Bei histologischer Untersuchung zeigten die Dickdarmer der mit Piroxicam gefütterten Gruppe epitheliale Schäden und erhöhte Immunzellinfiltration, Veränderungen im Zusammenhang mit Kolitis (Abbildung 2C). Diese Ergebnisse führten zu einem höheren histologischen Wert (Abbildung 2D). Zusätzlich wurden transkriptionelle Werte pro-inflammatorischer Zytokine, die an humanen IBD- und Mausmodellen der Kolitis beteiligt sind, untersucht²³. In Übereinstimmung mit früheren Berichten zeigten Kolons von mit Piroxicam gefütterten IL-10-KO-Mäusen eine signifikante Hochregulierung proinflammatorischer Zytokine auf Transkriptebene (Abbildung 3A–D). Bemerkenswert ist, dass diese transkriptionelle Veränderung bei IL-10-KO-Mäusen, die regelmäßig Futter erhielten, oder bei WT-Mäusen, die mit Piroxicam angereichert wurden, nicht beobachtet wurde, was darauf hindeutet, dass die transkriptionelle Signatur durch eine Kombination aus IL-10-Mangel und Piroxicam verursacht wurde und nicht durch einen der einzelnen Faktoren. Schließlich bestätigten die Autoren, dass die im Dickdarm beobachtete transkriptionelle Signatur von mit Piroxicam behandelten Mäusen mit einer erhöhten Calprotectin-Färbung in der Darmschleimhaut assoziiert war (Abbildung 3E)^24,25.

Abbildung 1: Piroxicam-beschleunigte Enterokolitis bei IL-10-KO-Mäusen. (A) Schematischer Überblick über das experimentelle Protokoll. (B) Körpergewicht, (C) Nahrungsaufnahme, (D) Krankheitsaktivitätsindex am 7. Tag (DAI), (E) Überlebenskurve bei 8 Wochen alten männlichen und 8 Wochen alten weiblichen IL-10-KO-Mäusen, die eine mit Piroxicam angereicherte Diät oder eine reguläre Ernährung erhalten. Männliche Kontrolle: n = 5, männliche Piroxicam: n = 5, weibliche Kontrolle: n = 6, weibliche Piroxicam: n = 6 Zoll (B), (C) und (D). Männliche Kontrolle: n = 6, männliche Piroxicam: n = 10, weibliche Kontrolle: n = 6, weibliche Piroxicam: n = 7 Zoll (E). * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 durch paarweise Vergleich von männlichen (oberen Sternchen) und weiblichen (unteren Sternchen) Mäusen in (B). Statistische Analysen wurden mit einem zweiseitigen, ungepaarten t-Test in (B), (C) und (D) sowie einem logaritimischen Rangtest in (E) durchgeführt. Mittelwerte und Fehlerbalken, die den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) darstellen, werden dargestellt. In Balkendiagrammen werden einzelne Maße durch Jitterdiagramme dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Darmverkürzung und histologische Beurteilung. (A) Repräsentative Darmproben von 8 Wochen alten männlichen und weiblichen Interleukin-10-Knockout (IL-10-KO) Mäusen, die eine Piroxicam-Diät (oben) oder eine reguläre Diät (unten) für 7 Tage erhalten. Skalenleiste = 1 cm. (B) Dickdarmlänge am Tag 7 (männliche Kontrolle: n = 5, männliche Piroxicam: n = 5, weibliche Kontrolle: n = 6, weibliche Piroxicam: n = 6). (C) Repräsentative Bilder von HE-gefärbtem Dickdarm. Skalenleiste = 100 μm. (D) Histologie-Wert am 7. Tag. Zweischwänziger, ungepaarter T-Test in (B) und (D). Mittelwerte und Fehlerbalken, die SEM repräsentieren, werden dargestellt. In Balkendiagrammen werden einzelne Maße durch Jitterdiagramme dargestellt. Nicht signifikant (NS), * p ≤ 0,05, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001 im paarweisen Vergleich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Entzündliche Veränderungen bei piroxicam-beschleunigter Enterokolitis. Quantitative RT-PCR-Ergebnisse von (A) Tnf, (B) Il6, (C) Il1b und (D) Ifng im Darmgewebe von 8 Wochen alten Wildtyp- (WT) und Interleukin-10-Knockout (IL-10-KO) männlichen Mäusen zum Zeitpunkt der Ernte. Für die Paneele A–D, wt Piroxicam n = 7, KO piroxicam n = 6, KO Control n = 3. (E) Repräsentative Calprotectin-Immunfluoreszenzfärbung des Darmgewebes von 8 Wochen alten IL-10-KO-Mäusen zum Zeitpunkt der Ernte. Statistische Analysen wurden mit einem zweiseitigen, ungepaarten T-Test durchgeführt. Mittelwerte und Fehlerbalken, die den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) darstellen, werden dargestellt. In Balkendiagrammen werden einzelne Maße durch Jitterdiagramme dargestellt. Skalenleiste in (E) = 200 μm. Nicht signifikant (NS), * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 im paarweisen Vergleich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Domäne	Partitur
Gewicht	0 – Unverändert
	1 – Verlust von 1–5 %
	2 – Verlust von 6–10 %
	3 – Verlust von 11–20 %
	4 – ; Verlust von mehr als 20 %
Stuhlkonsistenz	0 – Normal ;
	1 – Weich, aber geformt
	2 – Locker Stuhl (nicht wässrig)
	4 – Durchfall (flüssiger Stuhl)
Blutung	0 – Keine
	2 – Hämatokulte positive Stuhlgänge
	3 – Sichtbares Blut auf dem Stuhl
	4 – Starke Blutungen pro Rektum
Rektalprolaps	0 – Abwesend
	1 – Gegenwart
Gesamtpunktzahl	Gesamtpunktzahl: Summe von (Domain-Werte) für jede Domäne

Tabelle 1: Krankheitsaktivitätsscore (DAI). Ein Bewertungssystem zur Bestimmung der Krankheitsaktivität anhand von Gewichtsverlust, Stuhlkonsistenz, Blut im Stuhl und rektalem Prolaps. Angepasst aus Sifuentes-Dominguez et al.²⁶.

Gewebeschäden					Lamina-propria-Entzündungszellinfiltration
Merkmale		Beteiligung			Merkmale		Beteiligung
0	Keine	1	1–25 % der Oberfläche		0	Selten	1	1–25 % der Oberfläche
1	Selten;	2	26–50 % der Oberfläche		1	Erhöht, einige Neutrophile	2	26–50 % der Oberfläche
2	Schleimhauterosisionen und Geschwüre	3	51–75 % der Oberfläche		2	Submukosale Präsenz von entzündlichen Zellclustern	3	51–75 % der Oberfläche
3	Umfangreiche Schäden tief in der Darmwand	4	76–100 % der Oberfläche		3	Transmurale Zellinfiltrationen	4	76–100 % der Oberfläche

Tabelle 2: Histologisches Wertungssystem. Bewertungssystem zur Bestimmung histologischer Veränderungen und Schäden. Angepasst aus Sifuentes-Dominguez et al.²⁶.

Diskussion

Entzündliche Darmerkrankungen sind eine komplexe polygene Störung, bei der präklinische Modelle als unschätzbare Werkzeuge dienen, um Signalwege zu analysieren, die zur IBD-Pathogenese beitragen, und neuartige diagnostische und therapeutische Strategien zu entwickeln. Derzeit basieren viele präklinische IBD-Modelle auf chemische Exposition, wie Dextransulfatnatrium (DSS), Oxazolon und Trinitrobenzol-Sulfonsäure (TNBS), da sie einfach zu bedienen sind. Genetische Modelle, die spontane Kolitis entwickeln, sind ebenfalls verfügbar. Unter diesen ist das IL-10-KO-Modell besonders wertvoll, da genetische Variationen im IL-10-Weg bekannterweise Darmentzündungen beim Menschen verursachen und IL-10-KO-Mäuse spontane chronische Enterocolite entwickeln, die menschlichen Krankheiten ähnelt. Eine wesentliche Einschränkung dieses Modells ist jedoch seine Unfähigkeit, phänotypische Variabilität zu berücksichtigen. Obwohl sich eine Enterokolitis spontan entwickelt, kann ihr Ausbruch je nach Hintergrund und Vivariumsbedingungen^variieren.

Durch die Kombination der chemischen Exposition mit einem genetischen Modell liefert das hier beschriebene Protokoll ein zuverlässiges und reproduzierbares Mausmodell experimenteller Kolitis. Die Enterocolitis wird bei IL-10-KO-Mäusen durch Piroxicam beschleunigt, wobei die Krankheit innerhalb von 7 Tagen nach Exposition mit einer mit Piroxicam angereicherten Ernährung beginnt. Dieses Protokoll ermöglicht die Synchronisation der Kolitisentwicklung. Das Modell wiederholt Merkmale, die in anderen häufig verwendeten Mausmodellen der Kolitis beobachtet wurden, darunter Gewichtsverlust, Blut im Stuhl, Durchfall, Verkürzung des Darms, histologische Schäden und transkriptionelle Veränderungen. Darüber hinaus ist dieses Modell im weit verbreiteten C57Bl/6J-Stamm reproduzierbar, was die Untersuchung zusätzlicher mit IBD assoziierter Gendefekte erleichtert, da es relativ leicht möglich ist, Mäuse mit zusätzlichen Mutationen in diesem Stamm zu erzeugen.

Das hier beschriebene Modell bietet ein nützliches Werkzeug, um metabolische Veränderungen während der Darmentzündung zu untersuchen. In diesem Modell fressen Mäuse, die Piroxicam ausgesetzt sind und eine beschleunigte Enterokolitis entwickeln, weiterhin normal, ohne eine signifikante Verringerung der täglichen Aufnahme. Dies deutet darauf hin, dass der Gewichtsverlust in diesem Modell nicht auf eine beeinträchtigte Ernährung zurückzuführen ist, sondern auf zusätzliche Faktoren. Weitere Studien sind erforderlich, um festzustellen, ob diese Ergebnisse auf einen erhöhten Kalorienverbrauch durch Entzündungen, übermäßigen Kalorienverlust durch Durchfall oder eine beeinträchtigte Thermogenese zurückzuführen sind. Darüber hinaus zeigen männliche und weibliche Mäuse ähnliche Muster der Krankheitsschwere, ein Befund, der frühere Beobachtungen an den IL-10-KO- und DSS-Modellen 28,29,30 kontrastiert.

Es gibt mehrere wichtige Schritte zur Fehlerbehebung, um die Reproduzierbarkeit dieses Modells sicherzustellen. Erstens sollten Mäuse eine Woche vor der Exposition mit Piroxicam an tägliche Handhabung und Beobachtungen gewöhnt werden. Das verhindert stressbedingten Gewichtsverlust. Zweitens sollten Käfige nicht mehr als drei Mäuse enthalten, und nur Mäuse, die harmonisch untergebracht sind, sollten in das Experiment einbezogen werden. Mäuse mit Kampfverhalten oder Kampfverletzungen sind anfälliger für die Entwicklung von Kolitis und können vor der Ernte^sterben. Drittens: Wenn die Nahrungsaufnahme während des gesamten Experiments überwacht werden soll, sollten die Mäuse einzeln untergebracht werden, um eine genaue Messung des Futterverbrauchs zu ermöglichen. Außerdem sollten nur große, intakte Futterpellets in die Futterbehälter gelegt werden, um zu verhindern, dass sie in die Einstreu zerbröckeln und die Messungen beeinträchtigen können. Die hier beschriebenen Methoden zur Quantifizierung der Nahrungsaufnahme entsprechen den veröffentlichten Richtlinien zum Nagetierkonsum³³. Schließlich sollten Käfigwechsel während des Experiments vermieden werden, da plötzliche Umweltveränderungen die Nahrungsaufnahme für 1–2 Tage reduzieren können, insbesondere bei jungen Mäusen.

Dieses Protokoll hat mehrere Einschränkungen. Erstens beschränkt sich die Bewertung der Stoffwechselveränderungen auf das Körpergewicht und die Nahrungsaufnahme, während andere Messungen des systemischen Stoffwechsels, wie das Atemaustauschverhältnis (RER), der Energieverbrauch und die körperliche Aktivität, nicht bewertet wurden. Außerdem wurden die zugrunde liegenden Gewichtsverlustmechanismen nicht untersucht; Daher bleiben die relativen Beiträge von reduzierter Nahrungsaufnahme, verändertem Energieverbrauch, Malabsorption und anderen mit Darmentzündungen verbundenen Faktoren unklar. Zweitens wurde nur Darmgewebe entnommen und analysiert, während andere an der Stoffwechselregulation beteiligte Organe, darunter Fettgewebe, Leber und Skelettmuskel, nicht untersucht wurden. Drittens wurde dieses Protokoll mit C57BL/6 IL-10-KO-Mäusen entwickelt, die eine andere Anfälligkeit für Kolitis im Vergleich zu anderen genetischen Hintergründen aufweisen können. Trotz dieser Einschränkungen kann das Protokoll leicht angepasst werden, um zusätzliche metabolische Phänotypisierung und Analyse von extraintestinalen Geweben zu integrieren, was die Untersuchung der Mechanismen hinter dem Gewichtsverlust sowie der Beziehung zwischen Darmentzündung und systemischen Stoffwechselveränderungen³⁴ oder die Untersuchung neuartiger entzündungshemmender Nanomaterialien³⁵ ermöglicht. Darüber hinaus sollte der Ansatz auch auf andere IL-10-KO-Mausstämme anwendbar sein, obwohl zusätzliche Validierungsstudien angebracht sind.

Zusammenfassend berichten die Autoren über ein effizientes und reproduzierbares Protokoll, das gleichzeitig Enterokolitis bei mehreren IL-10-KO-Mäusen induziert und eine Bewertung des Fressverhaltens ermöglicht. Weitere Studien sind erforderlich, um die Auswirkungen der Enterokolitis auf den Energieverbrauch und die Körperzusammensetzung in diesem Modell zu untersuchen und so breitere Zusammenhänge zwischen IBD und Wirtsstoffwechsel aufzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10% buffered formalin	StatLab	28600-1	1 Galllon
27 G needles	BD	305109
Anti-S100A8 + S100A9 antibody	Abcam	AB288715
Balance	Fisher scientific	S94792D	Fisher Science Education Portable Balances, 300 g
Citrate buffer	Sigma Aldrich	C9999-1000mL
DI water	Fisher scientific	STLSL301
Dissecting forceps	Fisher scientific	22-327379
Ethanol, 100% 200 proof	Fisher scientific	NC1675398	Pharmco Products ETHYL ALCOHOL 200 PROOF
Ethanol, 190 proof, 95%	Fisher scientific	AC615110010
Ethanol, 80%	Fisher scientific	T08204K7
EZ-Quick Slide Staining Dish	IHC world	IW-2511	Staining jar
EZ-Quick Slide Staining Rack	IHC world	IW-2512	Slide rack
Feeding needle	Fisher scientific	NC9924986	22 gauge, 25 mm
Fine scissors	Fisher scientific	14060-11
Flat forceps	Fisher scientific	21-125-109
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 555	Thermo Fisher	AB_2535849
Handheld homogenizer	Fisher scientific	15-340-167
HemoCue	Danlee Medical Products, Inc.	BCK 64151A	Hemoccult Dev/ Single Slide Test Cards - CLIA Waived
Hoechst 33342	Invitrogen	62249
IL-10 KO Mice	The Jason Laboratory	Strain #: 002251	IL10-KO mice, genotype: B6.129P2-IL-10tm1Cgn/J
IVC mouse caging	Allentown	Mouse 500
Liquid nitrogen	Airgas	NI UHP300
Microscope cover glass	Fisher scientific	12541033
Nanodrop	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Normal Goat serum	Vector labs	S-1000-20
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
Petri dishes	Fisher scientific	FB0875713
Piroxicam	Sigma Aldrich	P0847	supply to inotiv for preparation of custom animal diet
Piroxicam-fortified chow	Inotiv	Custom	200 ppm
Primer: Mouse GAPDH forward	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGTCGGTGTGAACGGATTTG 3' forward
Primer: Mouse GAPDH reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA 3' reverse
Primer: Mouse IFN-G forward	Sigma Aldrich	N/A	5' ACTGGCAAAAGGATGGTGAC 3' forward
Primer: Mouse IFN-G reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGAGCTCATTGAATGCTTGG 3' reverse
Primer: Mouse IL-10 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' CTTGCACTACCAAAGCCACA 3' (common)
Primer: Mouse IL-10 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTATTGTCTTCCCGGCTGT 3' (Wild type reverse)
Primer: Mouse IL-10 reverse (2)	Sigma Aldrich	N/A	5' CCACACGCGTCACCTTAATA 3' (Mutant reverse)
Primer: Mouse IL-1B forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCTGAAAGCTCTCCACCTCA 3' forward
Primer: Mouse IL-1B reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGCCACAGGTATTTTGTCG 3' reverse
Primer: Mouse IL-6 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTCTCTGGGAAATCGTGGA 3' forward
Primer: Mouse IL-6 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TTTCTGCAAGTGCATCATCG 3' reverse
Primer: Mouse TNF forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCAGGTTCTGTCCCTTTCAC 3' forward
Primer: Mouse TNF reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGTGCCTCTTCTGCCAGTTC 3' reverse
QuantStudio 7 Pro	Thermo Fisher	A43183
RNAlater solution	Invitrogen	AM7020	RNA Stabilization Solution, 100 mL
Rneasy mini kit	Qiagen	74104
SHURDry SD-II Slide Dryer	General data	SD-ll-120
Simport Scientific EasyDip Slide Staining Rack	Fisher scientific	22-038-494	Staining rack
SlowFade Gold antifade reagent	Invitrogen	S36936
Staining dish support	BioSB	BSB7086
Staintray IHC slide staining system	IHC world	M918-1	Humidified chamber for IHC
SuperScript VILO	Invitrogen	11755050
SYBR Green Master mix	Applied Biosystems	A46109
Tintoretriever pressure cooker	BioSB	BSB7008
Tissue cassettes	Fisher scientific	50-197-8152	Research Products International Corp Tissue Processing Cassette, Pink, 500 per Case
Xylene	Pharmco	399000000	1 Gallon