Methodenartikel

Genom-Editierung in primären Säugetierzellen mittels Elektroporation von Editor-RNA

130 Ansichten

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DOI:

10.3791/71449

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31. Juli 2026

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1Department of Genetic Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Institute for NanoBioTechnology, Johns Hopkins University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Abgabe von Genomeditoren als RNAs ist ein besonders wirkungsvolles Mittel zur Modifikation der Genome primärer Säugetierzellen und -zelllinien. Ziel dieses Protokolls ist es, Genom-Editoren als mRNA in primäre Säugetierzellen und -zelllinien zu liefern, gefolgt von gezielter Illumina-Sequenzierung und Analyse zur Quantifizierung der Editierergebnisse.

Zusammenfassung

CRISPR-Editoren, darunter Nukleasen, Baseneditoren und Prime-Editoren, können krankheitserregende genetische Varianten effizient korrigieren oder Zielgene stören. Bearbeitungsergebnisse werden häufig in kultivierten Primärzellen, patientenabgeleiteten Zellen oder manipulierten Zelllinien bewertet, um die Auswirkungen genetischer Variation zu untersuchen oder als erster Schritt vor Beginn von Tierversuchen oder klinischer Übersetzung. Die Abgabe von Editoren als mRNA zusammen mit synthetischen Guide-RNAs in Säugetierzellen kann die Editierungseffizienz im Vergleich zu plasmidbasierten Ansätzen verbessern und Probleme wie DNA-Integration oder Off-Target-Editierung bei nachhaltiger Expression verhindern. Dieser Artikel präsentiert einen Workflow zur Vorbereitung von Genom-Editor-mRNA mittels In-vitro-Transkription (IVT), einschließlich ko-transkriptionaler Capping und chemisch modifizierter Nukleotide, Elektroporat-Editor-mRNA und Guide-RNAs in primäre humane Fibroblasten, induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) oder lymphoblastoide Zelllinien (LCLs) sowie zur Quantifizierung der Editierungsergebnisse durch gezielte Amplicon-Sequenzierung auf einer Illumina-Plattform, gefolgt von Analyse mit CRISPResso2. Dieser Workflow ermöglicht quantitative Benchmarking von Leit-RNAs, Elektroporationsparametern und Editor-Varianten und unterstützt nachgelagerte Anwendungen wie Einzelzellklonen, phänotypische Tests, präklinische Tierstudien und therapeutische Entwicklung.

Einleitung

Eine effiziente Genombearbeitung in primären Säugetierzellen unterstützt die Erstellung genetischer Modelle und die präklinische Bewertung von Kandidaten-Therapiestrategien. Jüngste Fortschritte in CRISPR-basierten Technologien, einschließlich Basenbearbeitung und Prime-Editing, ermöglichen präzise Nukleotidmodifikationen ohne Doppelstrang-DNA-Brüche, wodurch die Reinheit der Bearbeitungsergebnisseverbessert wird 1,2. Diese Technologien wurden erfolgreich in der Krankheitsmodellierung und therapeutischen Genom-Editierungsstudien eingesetzt, einschließlich Strategien zur Korrektur von Varianten, die zu Sichelzellanämie3 und Mukoviszidose4 führen.

Eine besonders effiziente Strategie zur Lieferung von Genom-Editierungskomponenten an Säugetierzellen ist die Elektroporation von in vitro transkribierten (IVT) mRNA, die das Editierenzym codiert, kombiniert mit synthetischen Guide-RNAs (gRNAs). Die Abgabe von mRNA ermöglicht eine vorübergehende Expression von Genom-Editoren, minimiert die verlängerte Nukleaseaktivität und verringert die Wahrscheinlichkeit von Off-Target-Editierungen. Fortschritte in der IVT-Technologie haben die Effizienz, Ausbeute und Qualität der mRNA-Syntheseverbessert 4,5,6. Plasmid-DNA-Vorlagen und PCR-abgeleitete DNA-Vorlagen werden jeweils häufig für die In-vitro-Transkription verwendet und bieten jeweils unterschiedliche Vorteile und Einschränkungen. In diesem Protokoll werden PCR-generierte Vorlagen bevorzugt, um Probleme zu vermeiden, die mit der Fortpflanzung langer Poly(A)-Bahnen in Plasmiden verbunden sind, die anfällig für Rekombination und Längenvariabilität sind. Die Verwendung von PCR-Vorlagen, wie in diesem Protokoll beschrieben, erfordert jedoch einen teuren Reverse-Primer, der den 120-Nukleotid-Poly(A)-Schwanz enthält, und PCR kann fehleranfälliger sein als die bakterielle Vermehrung von Plasmiden für Sequenzen, die nicht in den Primern codiert sind. Alternativ können kommerzielle Anbieter wie Elegen und 4basebio hochpräzise DNA-Vorlagen anbieten, was eine zuverlässige, wenn auch teurere Option zur Erstellung von Transkriptionsvorlagen bietet.

Ein sorgfältiges Design der Guide-RNA ist ein weiterer entscheidender Bestandteil erfolgreicher Genom-Editierungsexperimente. Mehrere rechnergestützte Werkzeuge wurden entwickelt, um Forschenden bei der Identifizierung optimaler gRNA-Sequenzen auf Basis vorhergesagter On-Target-Effizienz und minimaler Off-Target-Aktivität zu helfen. Weit verbreitete Plattformen umfassen CHOPCHOP und CRISPOR, die die Identifikation von Guide-Sequenzen ermöglichen, die mit den Protospacer-angrenzenden Motiven (PAM)-Anforderungen von Cas-Enzymen kompatibel sind, und Bewertungsmetriken bereitstellen, um Kandidaten-Guides mit hoher vorhergesagter Aktivität und Spezifität 7,8 zu priorisieren. Die grundlegenden Prinzipien und Best Practices für das Design von Leit-RNAs wurden ausführlich in der CRISPR-Literatur9,10,11,12,13 beschrieben.

Elektroporation wird häufig eingesetzt, um Genom-Editierungsreagenzien an Säugetierzellen zu liefern, da sie eine hohe Abgabeeffizienz bei Zelltypen erreichen kann, die typischerweise resistent gegen lipidbasierte Transfektionsmethoden sind. Die Elektroporation permeabilisiert vorübergehend die Zellmembran, sodass exogene Nukleinsäuren wie mRNA und gRNAs in das Zytoplasma eindringen können. Optimierte Elektroporationsprotokolle wurden für mehrere Säugetierzelltypen entwickelt, darunter Primärzellen, Fibroblasten, lymphoblastoide Zelllinien und induzierte pluripotente Stammzellen14. Kommerzielle Elektroporationsplattformen wie die Lonza 4D- und Amaxa-Systeme bieten zelltypspezifische Programme und Reagenzien, die darauf ausgelegt sind, die Liefereffizienz zu verbessern und gleichzeitig die Zellviabilität zu erhalten. Hochdurchsatz-Elektroporationssysteme wie die Amaxa 96-Well-Shuttle-Plattform ermöglichen zudem skalierbare Genom-Editierungsexperimente unter verschiedenen experimentellen Bedingungen. Das Neon-Elektroporationssystem wird ebenfalls häufig verwendet, steht aber nicht im Mittelpunkt dieses Protokolls.

Nach der Abgabe der Genom-Editierungskomponenten werden die Editierungsergebnisse typischerweise mittels gezielter Next-Generation-Sequenzierung (NGS) der genomischen Region rund um die Editierstelle bewertet. Sequenzierungsbibliotheken werden durch PCR-Amplifikation des Ziellocus generiert, gefolgt von Indexierung und Hochdurchsatzsequenzierung. Die resultierenden Sequenzierungslesungen werden mit spezialisierten bioinformatischen Pipelines analysiert, die für Genom-Editierungsexperimente entwickelt wurden. In diesem Protokoll werden die Editierergebnisse mithilfe von CRISPResso2 quantifiziert, einer weit verbreiteten Computerplattform, die eine detaillierte Analyse von Genom-Editierungsergebnissen aus Sequenzierungsdatenermöglicht. CRISPResso2 richtet die Sequenzierungslesungen an eine Referenzsequenz an und quantifiziert Bearbeitungsergebnisse, einschließlich der Gesamteffizienz der Bearbeitung, Insertion-Deletion-(Indel-)Häufigkeiten, präzisen Nukleotidsubstitutionen und Bearbeitungsverteilungen im Zielbereich. Die Software bietet außerdem grafische Visualisierungen und statistische Zusammenfassungen, die den Vergleich experimenteller Bedingungen und die Optimierung der Bearbeitungsparameter erleichtern.

Gemeinsam bieten die Integration von hochwertiger IVT-mRNA-Produktion, optimierte Lieferung durch Elektroporation und hochauflösende Sequenzierungsanalyse einen robusten Arbeitsablauf zur Bewertung von Genom-Editierungsstrategien in kultivierten Zellen (Abbildung 1). Dieser Ansatz ermöglicht eine iterative Optimierung der Editierungseffizienz, Spezifität und experimenteller Parameter, bevor Genom-Editierungsstrategien auf In-vivo-Studien und potenzielle therapeutische Anwendungen vorangetrieben werden.

Protokoll

Ethik-Erklärung:
Alle Verfahren mit menschlich abgeleiteten Zelllinien wurden gemäß institutionellen Richtlinien und genehmigten Protokollen durchgeführt.

1. Erstellen Sie lineare DNA-Vorlagen mittels PCR

Vorsicht: Führen Sie alle RNA-Schritte mit RNase-freien Verbrauchsmaterialien und Arbeitsflächen durch. Berücksichtigen Sie bei der Auswahl des geeigneten Editors für die beabsichtigte genomische Modifikation die aufgeführten mRNA-Editoren und deren verschiedene Varianten (Tabelle 1).

  1. Setze die PCR-Reaktion auf Plasmid-DNA zusammen, die aus Bakterien extrahiert wurde, mit einem Miniprep- oder Midiprep-Kit. Verwenden Sie 20 ng Plasmid-DNA pro 50 μL PCR-Reaktion mit dem Enzym NEBNext Ultra II Q5 Master Mix, um das PCR wie in Tabelle 2 beschrieben zusammenzustellen.
    1. Verwenden Sie einen Vorwärtsprimer, der den inaktiven T7-Promotor auf dem Plasmid korrigiert und so eine zirkuläre Transkription verhindert.
    2. Verwenden Sie einen Reverse-Primer, der einen 120-nt-Poly(A)₁₂₀-Schwanz einführt, um effiziente Transkription und mRNA-Stabilität zu unterstützen.
    3. Verwenden Sie N1-Methyl-Pseudouridin anstelle von Uracil und integrieren Sie CleanCap AG, um die mRNA-Translation zu verbessern und die angeborene Immunaktivierungzu reduzieren 1,2,3,4 (Abbildung 1).
      HINWEIS: Weitere Nukleotidanaloga und Capping-Reagenzien sind verfügbar, aber diese zeigen durchgehend eine hohe Aktivität in genom-editierenden mRNAs. Die Nanopartikel-basierte Verabreichung ist eine geeignete Alternative, wird aber in diesem Protokoll nicht behandelt.
  2. Verstärken Sie die Editor-Codierungssequenz durch PCR für 30 Zyklen mit Primern, die einen funktionalen T7-Promotor stromaufwärts der Codierregion und eine Poly(A)-Sequenz stromabwärts (Tabelle 2 und Tabelle 3) einführen.
    HINWEIS: Die Nukleotidsequenz der IVT-Vorlage ist in Tabelle 4 unterstrichen.
  3. Verifizieren und reinigen Sie das PCR-Produkt
    1. Führe 5 μL des PCR-Produkts auf einem 1%igen Agarosegel in TE-Puffer bei 180 V für 30 Minuten durch. Bestätigen Sie das Vorhandensein eines einzelnen Bands bei etwa 4000–6500 bp (je nach transkribiertem Editor), bevor Sie mit der PCR-Produktreinigung fortfahren.
    2. Reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem PCR-Reinigungskit (Materialtabelle).
      HINWEIS: Wenn mehrere Bänder oder schlechte PCR-Produktqualität festgestellt werden, optimieren Sie die Thermocycling-Bedingungen (Tabelle 5 – Fehlerbehebungstabelle).
    3. Quantifizieren Sie die gereinigte DNA mit einem fluorometrischen DNA-Assay. Für die Qubit-dsDNA-Analyse bereitet man die Puffer-Farbstoff-Mastermischung vor, indem man 796 μL der hochempfindlichen Qubit-Arbeitslösung mit 4 μL Farbstoff kombiniert, beides im Kit bereitgestellt.
    4. In separaten Röhren mischen Sie 198 μL des Pufferfarbe-Masters mit 2 μL des niedrigen Konzentrationsstandards S1, hochkonzentrierter Standard S2 und der Probe. Fügen Sie jeden Standard und jede Probe wie im Qubit-Fluorometerinstrument gefordert ein, um die Bestandskonzentration zu messen.
      HINWEIS: Wenn die Proben über dem Analysebereich liegen, müssen möglicherweise Verdünnungen vorbereitet werden.

2. Transkribiere die mRNA

  1. Bereite die IVT-Reaktion auf Eis mit T7-RNA-Polymerase, NTPs, einem Kappen-Analogon für das ko-transkriptionelle Capping und N1-Methyl-Pseudouridin-Triphosphat als Uridin-Substitut vor, um die angeborene Immunaktivierung1˒5˒6 zu reduzieren.
  2. Bereiten Sie die IVT-Reaktionsmischung gemäß Tabelle 4 vor. Verwenden Sie die in Tabelle 4 bereitgestellte annotierte Template-Sequenz. Setze jede Transkriptionsreaktion in einem Endvolumen von 40 μL zusammen.
  3. Bereiten Sie 5–10 Reaktionsröhrchen vor, um genügend mRNA für mehrere Experimente zu erzeugen. Jede 40-μL-Reaktion erzeugt etwa 100 μg mRNA. Mit 1 μg mRNA für die prime editierende Elektroporation und 3 μg mRNA für die baseneditierende Elektroporation reicht dies für ~33–100 Elektroporationen.
  4. Transkribiere die RNA
    1. Mischen Sie die IVT-Reaktion gründlich durch Pipetten. Die Reaktion bei 37 °C für 2 Stunden inkubieren.
  5. RNA reinigen
    1. In ein 1,5-ml-Rohr übertragen und 7,5 M Lithiumchlorid (LiCl) Lösung zur IVT-Reaktion in einem Volumen von der Hälfte des gesamten Reaktionsvolumens hinzufügen, um eine endgültige LiCl-Konzentration von 2,5 m zu erreichen. Für eine 40 μL IVT-Reaktion fügen Sie 20 μL 7,5 M LiCl hinzu. Sorgfältig durch sanftes Pipettern mischen.
    2. Inkubieren Sie die Reaktion bei -20 °C für 30 Minuten. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 × g bei 4 °C für 15 Minuten.
    3. Entfernen Sie das Überlagermittel mit einer Pipette und entsorgen Sie es. Wasche das Pellet mit 1 ml 70 % Ethanol bei 4 °C. Das Stören des Pellets ist nicht notwendig. Zentrifugiere bei 16.000 × g bei 4 °C für 5 Minuten.
    4. Entfernen Sie Ethanol vollständig und lassen Sie das Pellet 1–2 Minuten an der Luft in einem RNase-freien Biosicherheitsschrank trocknen. Pellet nicht zu trocknen, sonst kann es schwierig sein, ihn wieder aufzuhängen.
  6. RNA neu suspendieren und quantifizieren
    1. Die RNA wird in nukleasefreiem Wasser wieder suspendiert. Zunächst wird jede Reaktion in 50 μL nukleasefreiem Wasser wieder suspendiert und nach der Messung der RNA-Konzentration weiter verdünnt. Quantifizieren Sie die RNA mit einem fluorometrischen RNA-Test wie dem Nanodrop.
      Pausenpunkt: Nach RNA-Quantifizierung und Aliquotierung werden die mRNA-Aliquoten bei -80 °C bis zur Elektroporation gelagert. Wiederholte Frost-Tau-Zyklen vermeiden; Tauen Sie jeden Aliquot nur einmal vor der Verwendung auf.
    2. Bestätigen Sie, dass die gereinigte mRNA-Ausbeute etwa 100–400 μg pro 40 μL IVT-Reaktion beträgt. Verdünnen Sie die mRNA auf 2 μg·μL-1 mit nukleasefreiem Wasser, bevor Sie aliquotieren. Lagern Sie die Aliquots bei −80 °C.
      HINWEIS: Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen. Bereite Einweg-Aliquots vor und entsorge ungenutztes, aufgetautes Material. Bereite 12,5 μL Aliquots in PCR-Streifen für 8–20 Elektroporationen pro Aliquot vor.
  7. Bewertung der RNA-Integrität
    1. RNA-Größe und -Integrität durch Agarosegel-Elektrophorese oder automatisierte Elektrophorese bewerten (Abbildung 2)
    2. Bereiten Sie ein 0,8%iges Agarose-Gel mit 10.000-fach verdünntem SYBR-Gold vor. Verwenden Sie eine einzelsträngige RNA-Leiter, wie zum Beispiel den NEB ssRNA-Marker.
    3. Denaturieren Sie die mRNA mit 2x RNA Gel Loading Dye und erhitze die Proben auf 65 °C für 10 Minuten, bevor die Proben auf das Gel geladen werden.
    4. Bestätigen Sie, dass die mRNA als vorherrschendes Band bei etwa 4000–6500 nt erscheint, abhängig vom zu transkribierenden Editor, mit minimalen Verschmieren oder Produkten mit niedrigem Molekulargewicht. Vertreiben Sie RNA-Proben, die erheblichen Abbau, Verschmieren oder mehrere unerwartete Bänder aufweisen.

3. Entwurf und Herstellung von Leit-RNAs

HINWEIS: Identifizieren Sie Protospacer-angrenzende Motiv-(PAM)-Sequenzen innerhalb des Zielgenomlocus und wählen Sie Leit-RNAs aus, die mit dem gewählten Editor und der geplanten genomischen Modifikation kompatibel sind. Guide-RNA-Designplattformen wie CHOPCHOP, CRISPOR, CRISPRware, IDT Cas9 Checker, Benchling und VectorBuilder können verwendet werden, um Leit-RNAs mit günstiger vorhergesagter Aktivität und Spezifität 6,7,8,9,10,11,12,13 zu priorisieren.

  1. Identifizieren Sie PAM-Stellen innerhalb des Zielgenomlocus, die mit der ausgewählten Nukleasevariante kompatibel sind, einschließlich NGN-kompatibler Varianten, mithilfe von Guide-RNA-Designwerkzeugen.
  2. Wählen Sie Guide-RNAs mit hoher vorhergesagter On-Target-Aktivität und niedriger Off-Target-Aktivität. Bestätigen Sie das Bearbeitungsfenster für die Guide-RNA.
  3. Für Basis- oder Prime-Editing-Anwendungen wählen Sie Führungs-RNAs, die die beabsichtigte Bearbeitung im optimalen Aktivitätsfenster des ausgewählten Editors positionieren.
  4. Bestellen Sie sgRNA oder pegRNA mit 2'-O-Methyl-Basenanalogen für die ersten 3 und letzten 3 Nukleotide sowie 3'-Phosphorothioat-Bindung zwischen den ersten 3 und den letzten 2 Basen der Guides.
  5. Die Leit-RNAs werden in nukleasefreiem Wasser oder TE-Puffer (100 μM) neu suspendiert. Bereite 5 μL Aliquots vor und lagere die Aliquots bei −80 °C. Zum Zeitpunkt der Anwendung tauen und verdünnen Sie im Elektroporationspuffer vor der Elektroporation.

4. Zellkulturvorbereitung

HINWEIS: Untersuchen Sie die Zellintegrität mittels Mikroskopie und Viabilitätstests vor der Elektroporation.

  1. Kultivieren Sie primäre Fibroblasten oder HEK293T Zellen in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, 4,5 g· L-1 Glukose, GlutaMAX und 110 mg· L-1 Natriumpyruvat. Plattieren Sie die Zellen auf sterilen T75-Kolben (TC-Oberfläche) mit 20 % Konfluenz pro Kolben. Halten Sie die Zellen zwischen den Passagen 1 und 20 aufrecht. Spalte Zellen bei 80 % Konfluenz und verwende Zellen bei 70–80 % Konfluenz für die Elektroporation.
  2. Kultur pluripotenter Stammzellen in mTeSR Plus Medien. Die Zellen werden auf sterilen T75-Kolben mit Geltrex beschichtet, mit 20 % Konfluenz pro Kolben. Wechsle das Medium täglich und halte die Zellen zwischen Passagen 1 und 20 aufrecht. Fügen Sie für die 24 Stunden nach jedem Durchgang einen CEPT-Cocktail in das Medium hinzu. Spalte Zellen bei 80 % Konfluenz und verwende Zellen bei 70–80 % Konfluenz für die Elektroporation.
  3. Halten Sie die Zellen bei 37 °C bei 5 % CO₂, bis die Zellen die passende Dichte für die Elektroporation erreichen, typischerweise 70 %–80 % Konfluenz.
  4. Entfernen Sie das Medien, wenn die Zellen eine angemessene Anzahl und Zusammenfluss für die Elektroporation erreichen.
  5. Gib den Zellen das TrypLE-Expressenzym (1 ml für eine T75-Flasche) hinzu und inkubiere bei 37 °C für 5 Minuten. Führe die Zellen vorsichtig gegen die Kolbe, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Stoppen Sie die Dissoziation, indem Sie 3 ml Zellkulturmedium hinzufügen, und bestätigen Sie vor dem Zählen das Fehlen großer Zellklumpen.
  6. Pelletieren Sie die Zellen bei 1.000 × g für 5 Minuten, waschen Sie die Zellen einmal mit 15 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) und zentrifugieren Sie die Zellen erneut.
  7. Untersuchen Sie die Zellkonzentration und -lebensfähigkeit mit einem automatisierten Viabilitätsassay wie dem Nucleocounter NC-3000 mit Lösung 13. Vor der Messung auf dem Nukleozähler werden 11,4 μL Zellen mit 0,6 μL Lösung 13 kombiniert. Beginnen Sie mit der Elektroporation nur, wenn die Zelllebensfähigkeit mindestens 85 % beträgt, und entsorgen oder bereiten Sie Proben unterhalb dieses Schwellenwerts erneut vor.
  8. Die Zellen werden mit einer Dichte von etwa 0,5 × 106–2 × 106 Zellen·mL-1 in DPBS wieder suspendiert. Zählen Sie die Zellen und bewerten Sie die Lebensfähigkeit mit einem Hämozytometer oder Zellzähler.
  9. Fahren Sie nur fort, wenn die Zelllebensfähigkeit ≥ 85 % beträgt.
  10. Suspendieren Sie die Zellen im Elektroporationspuffer neu. Suspendieren Sie 2 × 105 Zellen in 5 μL Kaltelektroporationspuffer pro Reaktion.
  11. Bereiten Sie den Elektroporationspuffer mit der Ergänzungslösung gemäß den Anweisungen des Herstellers unmittelbar vor der Verwendung vor und halten Sie den Puffer auf Eis.
  12. Halten Sie die Zellen kalt und gehen Sie zügig vor. Halten Sie die Zellen auf Eis und beginnen Sie sofort mit der Elektroporationseinrichtung.

5. Elektroporation

HINWEIS: Bereiten Sie die Bearbeitungsladung in PCR-Streifenröhren vor, um das Mehrkanal-Pipettieren zu erleichtern. Nach der Elektroporation werden die Zellen in einem mit einem CEPT-Cocktail ergänzten Medium wieder suspendiert, um das Zellüberlebenzu verbessern.

  1. Bereite die RNA-Ladung vor.
    1. Bereiten Sie die RNA-Ladung auf Eis vor, indem Sie den Editor mRNA und die Führungs-RNA(n) im Elektroporationspuffer kombinieren.
    2. Für Baseneditoren und Nukleasen bereiten Sie eine endgültige Elektroporationslösung vor, die 1,5 μL (3 μg) mRNA, 0,5 μL (50 pmol) Guide-RNA und 15 μL Elektroporationspuffer pro Probe enthält.
    3. Für Prime-Editoren bereiten Sie eine endgültige Elektroporationslösung vor, die 0,5 μL (1 μg) mRNA, 1,5 μL (150 pmol) Führungs-RNAs und 15 μL Elektroporationspuffer pro Probe enthält.
    4. Bereiten Sie die RNA-Frachtlösungen als 1,2× Mastermischung vor, um Volumenverluste während des Transfers und der Probenbehandlung auszugleichen. Optimieren Sie die Reagenzienvolumen und -verhältnisse für jede Zielseite und jede Editor-Variante nach Bedarf.
  2. Zellen, Fracht und Elektroprotation abgeben.
    1. Fügen Sie 5 μL der Zellsuspension zu jedem Elektroporationsbrunnen hinzu.
    2. Fügen Sie 17 μL RNA-Ladung im Elektroporationspuffer zu 5 μL Zellen hinzu. Mischen Sie die Aufhängung, indem Sie zweimal pipetteren.
      Vorsicht: Fahren Sie nach der Kombination der Zellen und der RNA-Ladung zügig vor, da von den Zellen ausgeschiedene RNasen die mRNA des Editors schnell abbauen können. Schließen Sie die Elektroporation innerhalb von 2 Minuten nach dem Mischen der Zellen und der RNA-Ladung ab.
    3. Führen Sie das Elektroporationsprogramm aus, das für den ausgewählten Zelltyp optimiert ist (Tabelle 6; Abbildung 2; Abbildung 3).
      1. Für primäre menschliche Hautfibroblasten oder HEK293T Zellen verwenden Sie das Lonza 4D-Elektroporationssystem mit Puffer-SF. Fügen Sie pro Reaktion 200.000 Zellen zu einer 20-μL-Elektroporationscuvette hinzu. Programm CM-130 ausführen. Fügen Sie sofort 80 μL vorgewärmtes DMEM + 10 % FBS, 4,5 g· hinzu. L-1 Glukose, 4 mM L-Glutamin und 110 mg· L-1 Natriumpyruvat. Cellen 10 Minuten regenerieren, bevor sie in 96- oder 24-Well-Platten verdünnt werden.
      2. Für pluripotente Stammzellen verwenden Sie das Lonza 4D-Elektroporationssystem mit Puffer P3. Fügen Sie pro Reaktion 200.000 Zellen einer 20-μL-Elektroporationscuvette hinzu. Programm DN-100 ausführen. Fügen Sie sofort 80 μL vorgewärmtes mTeSR Plus-Medium hinzu. Cellen für 10 Minuten wiederholen, bevor sie in 24-Well-Platten verdünnt werden.
    4. Untersuchen Sie die Zellen täglich nach dem Plattieren, um die Zellgesundheit und -erholung zu überwachen.

6. Genomische DNA-Extraktion

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass genomische DNA vor der PCR-Amplifikation von ausreichender Qualität und frei von Inhibitoren ist, da die DNA-Qualität die Vorbereitung von Sequenzierungsbibliotheken und die genaue Quantifizierung der Genom-Editierungsergebnisse beeinflussen kann(9,10,11).

  1. Waschen und entnehmen Sie die Zellen.
    1. Sammeln Sie die Zellen 2-3 Tage nach der Elektroporation. Waschen Sie die Zellen einmal mit DPBS und beginnen Sie sofort mit der genomischen DNA-Extraktion.
    2. Bereiten Sie einen unvollständigen Lysepuffer vor, indem Sie 10 ml 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 5 ml 10 % (Wt/vol) Natriumdodecylsulfat (SDS)-Lösung und nukleasefreies Wasser zu einem Endvolumen von 1 L kombinieren. Lagern Sie den unvollständigen Lysispuffer bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur.
    3. Frisch bereiten Sie einen vollständigen Lysispuffer vor, indem Sie Proteinase K mit einer Verdünnung von 1:1.000 (Vol/Vol) zu einem Aliquot mit unvollständiger Lysepuffer hinzufügen. Fügen Sie den vollständigen Lysepuffer zu den Zellen, um die Lyse einzuleiten. Fügen Sie 40 μL vollständigen Lysispuffer zu jedem Brunnen mit etwa 80.000 Zellen in einer 96-Brunnen-Platte hinzu. Nicht auf und ab pipeten, da dies zu Probenverlust führen könnte.
  2. Verdauen Sie die Proben.
    1. Inkubieren Sie die Proben bei 37 °C für 60 Minuten, um die Zelllyse abzuschließen und die Proteinase-K-Verdauung abzuschließen.
  3. Inaktiviere Proteinase K.
    1. Übertragen Sie die Lysate auf PCR-Röhrchen oder eine 96-Well-PCR-Platte. Inkubieren Sie die Proben bei 80 °C für 30 Minuten, um die Proteinase K zu inaktivieren.
  4. Bewahren Sie die Lysate auf.

Pausenpunkt: Lagern Sie die Lysate bei −20 °C bis zur PCR-Verstärkung.

7. Gezielte Amplicon-Sequenzierung für die Bearbeitungsanalyse

HINWEIS: Poolen Sie PCR-Produkte in äquimolaren Mengen vor der Sequenzierung. Ungefähr 10.000 Sequenzierungs-Reads pro Probe reichen in der Regel aus, um massenhafte Genom-Editierungsergebnisse zu quantifizieren.

  1. Entwerfen lokusspezifische Primer, die etwa 300 bp-Amplicons erzeugen, die mindestens 25 bp stromaufwärts und 25 bp stromabwärts der Bearbeitungsstelle umfassen (Tabelle 7).
  2. Amplifizieren Sie den Zielgenomlocus durch Durchführung von PCR1 gemäß den in Tabelle 8, Tabelle 9 angegebenen Bedingungen.
  3. Fügen Sie eindeutige Stichprobeindizes per PCR unter Verwendung des PCR1-Produkts als Vorlage hinzu, wie zum Beispiel bei den Primern in Tabelle 7 unter dem Reiter "Beispiel-PCR-Indexierung". Verwenden Sie PCR-Bedingungen wie auf Tab 2 von Tabelle 8 und Tabelle 9 gezeigt.
  4. Führen Sie die PCR1- und PCR2-Produkte mit einem 1,5%igen Agarosegel aus, um das Vorhandensein von Einzelbändern in den erwarteten Größen zu bestätigen.
  5. Sammeln Sie die PCR2-Produkte in äquimolaren Mengen. Reinigen Sie die zusammengepoolte PCR2-Bibliothek mit dem AMPure XP Bead-to-Sample-Verhältnis von 0,65:1 gemäß den Herstelleranweisungen. Elutieren Sie die gereinigte Bibliothek in 30 μL nukleasefreiem Wasser und überprüfen Sie die Entfernung der Adapterdimere mittels Gelelektrophorese vor der Sequenzierung.
  6. Quantifizieren Sie die endgültig zusammengefasste Bibliothek mit einem fluorometrischen dsDNA-Assay. Bewerten Sie die Fragmentgrößenverteilung mittels Kapillarelektrophorese.
  7. Sequenzieren Sie die Bibliotheken mit Single-End-300-Zyklus-Lesungen auf einem Illumina MiSeq-Instrument. Verdünne die endgültig zusammengefasste Bibliothek auf 4 nM. Kombinieren Sie 5 μL die gepoolte 4-nM-Bibliothek mit 5 μL 0,1 M NaOH und pipetieren Sie das Mix. Inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur zur Denaturierung und fügen Sie dann 990 μL gekühlten HT-Puffer hinzu, der mit dem MiSeq-Kit geliefert wird, um die Lösung zu neutralisieren und auf 20 pM zu verdünnen. Spitze bei 15 % PhiX-Kontrolle. Laden Sie die Bibliothek auf eine Illumina MiSeq-Kartusche und führen Sie eine Single-End-Sequenzierung mit 300 Zyklen unter Verwendung der Standardlaufeinstellungen des Herstellers aus. Zielen Sie darauf ab, etwa 30.000 Lesearten pro Probe zu erzeugen, wobei 10.000 Lesevorgänge pro Probe für Bearbeitungsanalysen ausreichen12. MiSeq-Sequenzierung kann bei einigen Unternehmen wie Genewiz oder Quintara pro Probe durchgeführt werden.

8. Analyse von Ergebnissen der Genomeditierung

Hinweis: Die CRISPResso2-Analyse ermöglicht die Quantifizierung der Gesamt-Bearbeitungseffizienz, der Nukleotid-Konversionshäufigkeiten sowie der Einfügungs-/Löschhäufigkeiten (Indel) und kann verwendet werden, um Bearbeitungsergebnisse über experimentelle Bedingungen hinweg zu charakterisieren15.

  1. Demultiplexieren Sie die Sequenzierungsdaten und organisieren Sie die FASTQ-Dateien nach genomischem Locus und experimentellen Zustand.
  2. Installiere CRISPResso2 gemäß den Anweisungen im Github-Repository (https://github.com/pinellolab/crispresso2).
  3. Führen Sie eine CRISPResso2-Batchanalyse mit batch.txt Dateien aus, die die Eingabe-FASTQ-Dateien und Analyseparameter angeben (Beispiele in Tabelle 7). Setze den Mindestwert für die Lesequalität auf 30. Setze die "w"-Fensterbreite auf 20. Bei Verwendung von Cytosin-Baseneditoren können einige Indels zusätzlich zur Nickstelle um die basenbearbeiteten Nukleotide zentriert werden. In diesem Fall stellen Sie das "wc"-Fensterzentrum auf -10 statt auf das Standardzentrum an der Nickstelle ein, um diese Indels bestmöglich zu erfassen.
  4. Extrahiere quantitative Ausgaben, wie Nukleotid-Umwandlungsfrequenzen, Einfügungs-/Löschfrequenzen (Indel) und (falls zutreffend) HDR- oder Prime-Bearbeitungsfrequenzen aus den entsprechenden Zusammenfassungsausgabedateien. Diese finden sich typischerweise in Dateien namens "CRISPRessoBatch_quantification_of_editing_frequency.txt" und "Nucleotide_percentage_summary.txt", die in Microsoft Excel oder anderen Tabellenkalkulations-Bearbeitungsprogrammen geöffnet werden können.
  5. Exportiere die quantitativen Bearbeitungswerte für das Downstream-Plotten und die Dateninterpretation, wie in den Abbildungen 3-4. Verwenden Sie die "alleles_frequency_table_around_sgRNA.pdf"-Dateien (wie in Abbildung 5 dargestellt), um Allel-Bearbeitungsergebnisse zu bewerten.

Ergebnisse

Die Verwendung eines effizienten Editors mit einem leicht zugänglichen Teststandort, wie den ABE8e-Basiseditor mit dem HEK3-Kontrollstandort, kann oft zu Bearbeitungseffizienzen von über 90 % führen, wenn das Liefersystem gut für die im Experiment verwendeten Zellen geeignet ist. Geringere Bearbeitungseffizienz kann auftreten, wenn es Probleme mit der mRNA des Editors, der Führungs-RNA, der Zielstelle oder den Abgabebedingungen gibt, die die Bearbeitung weniger geeignet machen. Die Verwendung von Cas9-Varianten, die vielseitigere PAM-Sequenzen nutzen, diese aber weniger fest binden oder Editoren an Nukleotide ausrichten, die außerhalb ihres idealen Bearbeitungsfensters liegen, kann die Bearbeitungseffizienz verringern. Erfolgreiche IVT-generierte Editor-mRNAs erscheinen typischerweise als ein vorherrschendes Band mit minimalem Verschmieren oder niedrigmolekularem Abbau, was auf eine hohe Transkriptintegrität hinweist, die für die nachgelagerte Elektroporation geeignet ist (Abbildung 2).

Nach der Elektroporation von Editor-mRNA und synthetischen Guide-RNAs erholen sich die meisten Zellen innerhalb von 24–48 Stunden und behalten ihre typische Morphologie mit geeigneten Elektroporationsprogrammen bei. Die Elektroporationsbedingungen sollten auf den spezifischen Zelltyp zugeschnitten werden, da verschiedene Puffer deutlich unterschiedliche Ergebnisse erzielen können. Das Online-Lonza Knowledge Center gibt Empfehlungen für Puffer- und Elektroporationscodes für gängige Zelltypen, und Lonza bietet separate Optimierungskits für Zelllinien und Primärzellen an. Der empirische Vergleich von Puffern kann helfen, optimale Bedingungen für eine effiziente Abgabe zu identifizieren. Ungeeignete Programme können dazu führen, dass die Zelle gar nicht abgegeben, oder sie können für die Zellen hochgiftig sein (durch einen Verlust von über 50 % oder die Verhinderung des Fortbestehens des Zellzyklus). Repräsentative Optimierungsexperimente zeigten erhebliche Unterschiede in den Bearbeitungsergebnissen über Elektroporationsbedingungen hinweg, wobei einige Programme hohe Bearbeitungseffizienzen erzielten, während andere nur minimale Bearbeitung erzielten, was die Bedeutung empirischer Optimierung für jeden Zelltyp unterstreicht (Abbildung 3–4).

Über iPSCs, Fibroblasten und LCLs hinweg wird gezielte Amplicon-Sequenzierung gefolgt von der CRISPResso2-Analyse verwendet, um die Bearbeitungseffizienz und -nebenprodukte zu quantifizieren (Abbildung 4). Die Adeninbasis-Bearbeitung des HEK3-Testlokus ist hier dargestellt (Abbildung 4), was zu den beabsichtigten Nukleotid-Umwandlungen mit niedrigen Indelfrequenzen in den analysierten Proben führte. Die CRISPResso2-Analyse ermöglicht die Visualisierung von bearbeiteten und unbearbeiteten Allelen am Zielort und erleichtert die Quantifizierung der beabsichtigten Nukleotidkonversionen, Indelfrequenzen und anderer Bearbeitungsnebenprodukte, wodurch eine umfassende Bewertung der Bearbeitungsergebnisse ermöglicht (Abbildung 5). Die Bearbeitungseffizienz wird quantifiziert, indem die Häufigkeit dieser präzisen Einzelnukleotidsubstitution an der Zielstelle gemessen wird. Der HEK3-Lokus wird als Modelllokus verwendet, da er ein gut charakterisiertes Bearbeitungsprofil und seine Reproduzierbarkeit über experimentelle Systeme hinweg bietet, was eine robuste Bewertung der Basisbearbeitungsleistung unter verschiedenen Bedingungen ermöglicht. Wir empfehlen, diesen Leitfaden als positive Kontrolle in menschlichen Zellen zu testen, wenn neue Bearbeitungsverfahren optimiert werden. Die Basisbearbeitung wird typischerweise für beabsichtigte Nukleotid-Umwandlungen mit niedrigen Indel-Frequenzen angereichert, während die Prime-Bearbeitung eine Mischung aus präzisen Bearbeitungen und niederfrequenten Nebenproduktenliefert 3,12. Die Bearbeitungseffizienz variierte je nach Bedingungen, wobei deutliche Unterschiede zwischen Zelltypen und Elektroporationsprogrammen beobachtet wurden (Abbildung 3-4). Diese Variationen spiegeln wahrscheinlich Unterschiede in zellulärer Aufnahme, Lebensfähigkeit und DNA-Reparaturaktivität sowie den Einfluss von Elektroporationsparametern auf die Abgabeeffizienz wider. Zusammen unterstreichen diese Ergebnisse die Bedeutung der zelltypenspezifischen Optimierung der Elektroporationseinstellungen, um konsistente und maximale Bearbeitungsergebnisse zu erzielen.

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Abbildung 1. Herstellung von Editor-mRNA durch In-vitro-Transkription.
Schematische Übersicht der mRNA-Generierung von Editoren. (Schritt 1) Vorbereitung einer Plasmidvorlage, die die Editor-Codierungssequenz und den T7-Promotor enthält. (Schritt 2) PCR-Amplifikation zur Erstellung einer linearen DNA-Vorlage. (Schritt 3) In-vitro-Transkription mit T7-RNA-Polymerase zur Synthese von gekappten mRNA. (Schritt 4) Reinigung von mRNA zur Entfernung von Schablounen-DNA, Enzymen und freien Nukleotiden. Die resultierende verschlossene mRNA eignet sich für die nachgeschaltete Abgabe in Säugetierzellen durch Elektroporation oder Lipidnanopartikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2. Beispielbild der mRNA-Gelelektrophorese 
Elektrophorese-Bild von drei Genom-Editor-mRNAs läuft auf einem 1%igen Agarosegel unter Verwendung von SYBR-Goldfärbung. Die ssRNA-Leiter von NEB ist links dargestellt, mit Größenmarkern, die mit ihrer Länge angegeben sind. Das Fehlen erheblicher Verschmierung oder kleiner Bänder deutet darauf hin, dass diese mRNAs von geeigneter Qualität sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3. Optimierung der Elektroporationsbedingungen für die Genomeditierung in induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs). 
Bearbeitungseffizienzen, die unter verschiedenen Elektroporationsbedingungen in iPSCs erzielt werden, werden gezeigt. Die Zellen wurden mit mehreren Puffern und Programmkombinationen elektroporiert, darunter CB-150 Puffer P4, CD-118 Puffer P3, DN-100 Puffer P3, DC-100 Puffer P3, alle auf dem Lonza 4D Nukleofection Gerät. Die Bearbeitung wurde mit dem Neon-Elektroporationsgerät mit Parametern (1600 V, 20 ms, 1 Impuls) bewertet. Die Bearbeitungseffizienz wurde durch gezielte Sequenzierungsanalyse des bearbeiteten Locus quantifiziert. N=1 pro Probe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4. Optimierung der Elektroporationsbedingungen für die Genom-Editierung in Fibroblasten.
Bearbeitungseffizienz nach der Elektroporation mit verschiedenen Nukleofektionsprogrammen. Fibroblasten wurden mit mehreren Lonza-Nukleofektor-Programmen (CA-137, CM-138, DS-150, EH-100, EN-150, EO-114 und FF-113) elektroporiert, und die Bearbeitungsergebnisse wurden durch gezielte Sequenzierung quantifiziert. Die Ergebnisse werden für zwei Replikate (P2, P3) dargestellt. Eine Negativkontrolle ohne Editor-Übertragung ist enthalten. Der Vergleich von Elektroporationscodes hebt Unterschiede in der Bearbeitungseffizienz zwischen den Elektroporationssettings hervor und ermöglicht die Identifikation optimaler Parameter für die Fibroblast-Genom-Editierung. N=1 pro Probe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 5. Charakterisierung der Genom-Editierungsergebnisse am Zielort. 
Allelenfrequenztabellenausgabe von CRISPResso2, die die relative Häufigkeit von bearbeiteten und unbearbeiteten Allelen rund um die sgRNA-Zielregion anzeigt, wie sie durch Hochdurchsatz-Sequenzierungsanalyse nach der Bearbeitung bestimmt wurde. Rote Annotationen zeigen das Basis-Bearbeitungsfenster und den bereits vorhandenen heterozygoten Polymorphismus in der verwendeten Zelllinie an. Die Guide-RNA-Spacer-Sequenz ist grau unterstrichen. "Vorhergesagte Spaltposition", dargestellt durch eine gestrichelte Linie, ist relativ zur typischen "PAM minus 3"-Position für SpCas9 verschoben, da das Fensterzentrum "wc" in unserer Analyse-Batchdatei (Beispiel in Tabelle 8) geändert wurde. Dies verschiebt die tatsächlich vorhergesagte Spaltungsposition nicht, aber die Ausgabe wird so dargestellt, dass Indels rund um die gestrichelte Linie innerhalb eines Fensters von 20 Nukleotiden bewertet werden, wobei sowohl Indels im eigentlichen Nick-Zentrum als auch die an den deaminierten Nukleotiden zentrierten Indelen erfasst werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 1. In dieser Studie verwendete Editoren und Sequenzen 
Spalte 1: Genom-Editoren verfügbar auf AddGene für In-vitro-Transkription. Namen und Addgen-IDs für Plasmide verfügbar, die für die in diesem Protokoll beschriebene In-vitro-Transkription geeignet sind. Spalte 2: Sequenzen von Leit-RNA-Spacern, die in dieser Studie verwendet wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2. PCR-Reagenzien zur Amplifikation der mRNA-Plasmidvorlage.
Die Liste der Reagenzien und Reaktionskomponenten, die für die PCR-Amplifikation der Plasmidvorlage zur Erzeugung linearer DNA für nachgelagerte Anwendungen verwendet werden, sowie die Sequenz der Vorwärts- und Rückwärts-Transkriptionsprimer. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3. PCR-Zyklusbedingungen für die Amplifikation der mRNA-Vorlage. 
Diese Tabelle listet die thermocyclischen Bedingungen auf, die für die PCR-Amplifikation der mRNA-Schablone aus der Plasmid-DNA vor nachgelagerten Anwendungen verwendet wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4. Reagenzien, die für In-vitro-Transkriptionsreaktionen (IVT) verwendet werden. 
Diese Tabelle listet die Reagenzien und Reaktionskomponenten auf, die für die In-vitro-Transkription verwendet werden, um die Editor-mRNA aus der linearen DNA-Vorlage zu synthetisieren. Eine Beispiel-Vorlagensequenz (ABE8e) wird mit farbcodierten Elementen dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 5. Leitfaden zur Fehlerbehebung zu den wichtigsten Schritten im Genom-Editing-Workflow. 
Diese Tabelle fasst häufige technische Probleme zusammen, die während der mRNA-Vorbereitung des Editors durch in vitro Transkription (IVT) und der MiSeq-Sequenzierungsanalyse auftreten können. Für jeden Schritt des Workflows werden potenzielle Probleme, mögliche Ursachen und empfohlene Lösungen bereitgestellt, um die Bearbeitungseffizienz zu optimieren und eine genaue Erkennung von Bearbeitungsergebnissen sicherzustellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 6. Optimale Elektroporationsprogramme für verschiedene Säugetierzelltypen. 
Diese Tabelle listet die Elektroporationsprogrammcodes und Pufferbedingungen auf, die für die effiziente Abgabe von Editor-mRNA und Guide-RNAs in verschiedene Säugetierzelltypen verwendet werden. Die aufgeführten Elektroporationsparameter wurden getestet, um Bedingungen zu identifizieren, die die Effizienz der Genombearbeitung maximieren und gleichzeitig die Zelllebensfähigkeit erhalten. Das gleiche Programm funktioniert möglicherweise nicht für jede Zelllinie oder Quelle der Primärzellen, daher wird empfohlen, Alternativen aus dieser Liste zu testen, falls die Bearbeitung zunächst nicht erfolgreich ist. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 7. CRISPResso2-Analyseparameter zur Quantifizierung von Genom-Editierungsergebnissen. 
Der erste Tab zeigt ein Beispiel des HTS1-Primer-Designs, das zur Verstärkung des Ziellokus verwendet wird. Der zweite Tab bietet ein Beispiel für die Indexierungs-Primer, die bei der Bibliotheksvorbereitung verwendet werden. Der dritte Tab zeigt ein Beispiel für die Indexierung, mit der während der Sequenzierung eindeutige Indizes an jede Stichprobe zugewiesen wird. Der vierte Tab enthält eine Beispiel-Eingabe-Batchdatei für die CRISPResso2-Analyse, und der fünfte Tab bietet ein zusätzliches Beispiel für eine CRISPResso2-Analyse-Input-Batch-Datei. Beachten Sie, dass das Fensterzentrum "wc" für Basiseditoren angepasst wird, um die Erkennung von Indels zu erleichtern, die auf den deaminierten Basen zentriert sind, zusätzlich zu denen, die auf dem Nukleaseschnitt oder der Schnittstelle zentriert sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 8. PCR1 (Tab 1) und PCR2 (Tab 2) Reagenzien zur Vorbereitung der MiSeq-Bibliothek.
Diese Tabelle listet die Reagenzien und Reaktionskomponenten auf, die in Tab 1 (PCR1) zur Amplifizierung der Zielgenomloci verwendet wurden, und in Tab 2 (PCR2) zur Integration probenspezifischer Indexsequenzen und Illumina-Sequenzierungsadapter, wodurch sequenzierungsfähige Bibliotheken für die MiSeq-Analyse generiert werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 9. PCR1 (Tab 1) und PCR2 (Tab 2) Zyklusbedingungen zur Vorbereitung der MiSeq-Bibliothek.

Diese Tabelle listet die Thermocycling-Bedingungen auf, die in Tab 1 (PCR1) zur Amplifizierung der Zielgenomregionen verwendet werden, und in Tab 2 (PCR2) zur Integration probenspezifischer Indexsequenzen und Illumina-Sequenzierungsadapter, wodurch sequenzierungsfähige Bibliotheken für die MiSeq-Analyse generiert werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Protokoll bietet einen Workflow für die Genomeditierung in primären Säugetierzellen unter Verwendung der Elektroporation von Editor-mRNA und synthetischen Guide-RNAs. Die Abgabe als mRNA führt tendenziell zu einer effizienteren Editierung im Vergleich zur Plasmidabgabe, und mRNA ist zwischen den Chargen im Vergleich zum Editor-Protein oder Ribonukleoprotein meist einfacher und konsistenter. Wenn mRNA- und Ribonukleoproteinformen von Baseneditoren in einigen früheren Arbeiten direkt verglichen wurden, hat mRNA eine bessere Editierungseffizienzerzielt 3. Im Vergleich zu Plasmid- oder viralen Abgabemethoden ermöglicht die mRNA-basierte Abgabe eine vorübergehende Expression und ein reduziertes Risiko der genomischen Integration, obwohl sie für verschiedene Zelltypen optimiert werden kann. Neben der geringeren Bearbeitungseffizienz birgt die Verwendung von Plasmid-DNA für die Genombearbeitung das Risiko einer zufälligen Integration in das Genom der Zielzellen und kann das Risiko von Off-Target-Editierungen durch verlängerte Expression des Editors erhöhen. Die Kombination aus gezielter Amplicon-Sequenzierung und CRISPResso2 ermöglicht eine standardisierte Quantifizierung der Bearbeitungseffizienz und die Charakterisierung beliebiger Allelergebnisse3.

Mehrere Faktoren sind entscheidend für den Erfolg. Wichtige Schritte in diesem Protokoll sind die Aufrechterhaltung der RNA-Integrität durch strikte RNase-freie Handhabung, die Auswahl optimaler Leit-RNAs und die sorgfältige Optimierung der Elektroporationsbedingungen für jeden Zelltyp. RNA-Integrität und sorgfältige RNase-Kontrolle beeinflussen die Ergebnisse stark, und die RNA-Auswahl bleibt ein Hauptfaktor für Effizienz und Nebenproduktprofile. Elektroporationssettings erfordern empirische Optimierung nach Zelltyp, und einige Programme mit hoher Bearbeitung können ebenfalls Toxizität verursachen. Wenn eine geringe Bearbeitungseffizienz festgestellt wird, sollte eine Optimierung der Elektroporationsparameter, RNA-Qualität oder des Führungs-RNA-Designs in Betracht gezogen werden. Tritt eine übermäßige Toxizität auf, kann die Verringerung der Elektroporationsstärke oder RNA-Eingabe die Zellviabilität verbessern. Weitere Optimierungsstrategien umfassen das Testen alternativer Elektroporationspuffer und Programme, die auf den Zielzelltyp zugeschnitten sind, oder die Modifikation der RNA-Konzentrationen von Editoren oder Guides. Dieser Workflow bietet eine praktische Plattform, um Editoren zu benchmarken und modifizierte Zellen zu erstellen, bevor nachgelagertes Einzelzellklonen, Phänotypisierung, In-vivo-Studien oder translationale Entwicklung erfolgen. Dieser Workflow ist breit anwendbar für die Bewertung von Genom-Editierungsstrategien in Primärzellen und ermöglicht einen systematischen Vergleich von Bearbeitungsmodalitäten über genomische Kontexte und Zelltypen hinweg. Sie unterstützt die Krankheitsmodellierung durch die Einführung oder Korrektur klinisch relevanter Varianten sowie die funktionale Untersuchung kodierender und nicht-kodierender regulatorischer Elemente. Darüber hinaus bietet es eine Plattform zur Optimierung therapeutischer Bearbeitungsansätze, einschließlich Bewertung der Zielgenauigkeit, der Off-Target-Aktivität und der Bearbeitungsdauer. Der Workflow kann auch genutzt werden, um Guide-RNAs und Editierungssysteme zu screenen und zu priorisieren, Verabreichungsstrategien zu bewerten und patientenspezifische Varianten in einem Präzisionsmedizin-Rahmen zu testen. Gemeinsam dient es als vielseitige Brücke zwischen grundlegender Genombiologie, translationaler Forschung und präklinischer Entwicklung. Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass die Effizienz der Elektroporation und die Lebensfähigkeit der Zellen zwischen den Zelltypen erheblich variieren können, was eine empirische Optimierung erfordert. Darüber hinaus können die Bearbeitungsergebnisse vom Design und der Reinheit der Guide-RNA sowie von der Zugänglichkeit des Ziellokus abhängen, was die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen experimentellen Systemen einschränken kann. Trotz dieser Einschränkungen kann eine sorgfältige Optimierung der experimentellen Parameter und des Leitdesigns die Variabilität mindern und so eine zuverlässige und reproduzierbare Anwendung dieses Ansatzes in verschiedenen zellulären Systemen ermöglichen.

Offenlegungen

N.W. und E.V.B. haben Patentanmeldungen für Genom-Editierungstechnologien über die Johns Hopkins University eingereicht. G.A.N. hat Patentanmeldungen im Zusammenhang mit Genom-Editierungstechnologien über das Broad Institute und die Johns Hopkins University eingereicht.

Beitrag der Autoren:
M.V., J.N.W., E.V.B, D.M.E., J.D. und G.A.N. verfassten jeweils separate Textabschnitte. M.V. stellte den endgültigen Text zusammen und redigierte sie, gefolgt von Bearbeitungen aller Autoren.

Danksagungen

Wir danken Beatriz Olalla Sastre für hilfreiche Diskussionen zu diesem Protokoll. Diese Arbeit wurde durch den Big Beat Challenge Award der British Heart Foundation für CureHeart unterstützt (Auszeichnungsreferenz Nr. BBC/F/21/220106), der Cystic Fibrosis Foundation (Auszeichnung NEWBY23XX0) und den US National Institutes of Health (R00HL163805 und DP2OD038783 G.A.N.). J.N.W. erkennt Unterstützung durch NIH Grant Nr. T32 GM148383.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1M Tris-HCl, pH 8.0Thermo Fisher Scientific15568025
Agarose Thermo Fisher Scientific R0491 Agarose UltraPure 16500500 ThermoFisher 500g
AMPure XP SPRI Beads Beckman Coulter B23317 A63880, AMPure XP Beads für DNA-Reinigung, 5 mL, Beckman Coulter
ATP (100 mM) New England Biolabs N0450 
CEPT Cocktail Bio-Techne / Tocris 7200 
CleanCap AG Reagent TriLink Biotechnologies N-7113 CleanCap AG 3' OMe CleanScript IVT Kit, 125 x 20 µL rxns, 
CTP (100 mM) New England Biolabs N0450 
Custom DNA Primers Integrated DNA Technologies Custom 
DNA Loading Dye New England Biolabs B7024 
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific 14190-144 D8537-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11965-092 DMEM High Glucose [4.500 mg/L] mit [4,0 mM] L-Glutamin und [110 mg/L] Natriumpyruvat, 500 mL
Gel Extraction Kit Qiagen 28704 
GTP (100 mM) New England Biolabs N0450 
Illumina Indexing Primers Illumina FC-131-2001 10uM stocks
Illumina MiSeq Sequencer Illumina SY-410-1003 
Lithium Chloride RNA Precipitation Solution Thermo Fisher Scientific AM9480 
Lonza 4D Nucleofector System Lonza AAF-1002X 
ssRNA Ladder NEBNEBN0362S5ul/ Reaktion
MiSeq Reagent Kit v3 (300 cycles) Illumina MS-102-3002 
N1-Methyl-Pseudouridine-5’-Triphosphate TriLink Biotechnologies N-1081 
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix New England Biolabs M0544 
Nuclease-Free Water Thermo Fisher Scientific AM9937 
NucleoCounter NC Slide A8 ChemoMetec 941-0008 
NucleoCounter NC-3000 ChemoMetec NC-3000 10ul Zelllösung und 0,4167 µL DAPI-Lösung 
Solution 15, Hoechst 33342, 1 mL 910-3015 ChemometecChemometec910-3013 500 µg/ml ~ 0,9 mM ~ 0,05%
Nucleocuvette Strips Lonza V4XP-3032 
P3 Primary Cell Nucleofector Solution Lonza V4XP-3032 1 x 0,675 mL P3 Primary Cell Nucleofector® Solution
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530L 
Proteinase K Thermo Fisher Scientific EO0491 Menge: 1mL, >600 U/mL (~20 mg/mL)
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0491 2.000 Einheiten/ml 100 Einheiten 
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q33230 
Qubit RNA Broad Range Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q10211 
Qubit® Assay TubesThermo Fisher ScientificQ32856
RNA Gel Loading Dye (2x)Thermo Fisher ScientificR06415ul/ Reaktion
RNA Purification Kit Zymo Research R1017 
RNase Away Thermo Fisher Scientific 1236B62 
SDS, 10% LösungThermo Fisher Scientific 15553027
SYBR Gold Nucleic Acid Gel StainThermo Fisher ScientificS11494
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102 
Synthetic sgRNA / pegRNA Synthego / IDT Custom 2ug 
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit, 250 reactionsNew England Biolabs E2040L
TrypLE Express Enzyme Thermo Fisher Scientific 12604013 100 mL
TE buffer (Tris-EDTA)Thermo Fisher Scientific AM9849TE, pH 8,0, RNase-frei Thermo
Trypsin-EDTA (0,25%) Thermo Fisher Scientific 25200056 1X 
Fetal Bovine Serum (FBS), Premium, 500 mLThermo Fisher ScientificA5670701
mTSER PLUS STEM cell Technologies# 100-0276
Penicillin/Streptomycin Mixture 10.000 ug/mL, 100 mL, 4-packQuality Biological120-095-721 

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