Methodenartikel

Ein translationales Frühlingsferkelmodell für neonatale Sepsis

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DOI:

10.3791/71456

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10. Juli 2026

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1Comparative Pediatrics, Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Copenhagen, 2BRIDGE Translational Excellence Programme, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Modelle der bakteriellen Sepsis bei Frühgeborenen sind essenziell, doch bestehende Nagetiermodelle haben keine klinische Relevanz. Ein hochtranslationales Modell der neonatalen Sepsis wurde unter Verwendung von Frühgeborenen entwickelt, die mit lebenden Staphylococcus epidermidis infiziert waren.

Zusammenfassung

Frühgeborene sind besonders anfällig für bakterielle Infektionen, die sich schnell zu lebensbedrohlicher Sepsis entwickeln können, einem Zustand übermäßiger Entzündungen und Organfunktionsstörungen. Um Krankheitsmechanismen zu untersuchen und die therapeutische Entwicklung voranzutreiben, werden robuste translationale Tiermodelle benötigt, die die komplexe Pathophysiologie und klinische Präsentation der neonatalen Sepsis nachbilden. Dieses Protokoll präsentiert ein klinisch relevantes Modell für vorzeitige Ferkel der neonatalen Sepsis, das kurz nach der Geburt oder am postnatalen Tag drei durch eine intraarterielle Infusion von lebendem Staphylococcus epidermidis induziert wird. Die Ferkel werden bei 90 % Schwangerschaft per Kaiserschnitt entbunden und unter neonatalen Intensivstationen betreut. Dazu gehören temperatur- und sauerstoffkontrollierte Brutgeräte sowie ein einwohnender nabelartiger arterieller Katheter, der die Versorgung parenteraler Ernährung und die serielle Blutentnahme ermöglicht. Nach einer Infektion mit S. epidermidis werden die Ferkel 24–48 Stunden überwacht. Die Häufigkeit und Schwere der Sepsis können durch die Bakteriendosis und die Versorgung mit parenteraler Glukose moduliert werden. Eine höhere Bereitstellung von parenteraler Glukose beschleunigt die proinflammatorisken Immunantworten und führt zu klinischer Verschlechterung. Lethale Sepsis und humane Endpunkte werden durch arterielle Blutgasparameter (pH ≤ 7,1) definiert, kombiniert mit klinischen Anzeichen einer hämodynamischen Beeinträchtigung wie Lethargie, Hautverfärbungen und Tachypnoe. Dieses Modell bietet eine einzigartige Plattform, um zu erforschen, wie Energiestoffwechsel und immunmodulatorische Interventionen die bakterielle Beseitigung, systemische Entzündungen und Gewebeschäden während einer neonatalen Infektion beeinflussen. Sie birgt erhebliches Potenzial, klinische Strategien zur Prävention und Behandlung von neonataler Sepsis zu informieren.

Einleitung

Eine neonatale Infektion ist weltweit eine der Hauptursachen für Sterblichkeit und langfristige Morbidität, insbesondere bei Frühgeborenen, aber auch bei Termingeborenen mit niedrigem Geburtsgewicht oder perinatalen Komplikationen 1,2. Die frühe Diagnose bleibt aufgrund unspezifischer klinischer Anzeichen, unreifer und sehr variabler Immunantworten sowie fehlender sensibler und spezifischer Biomarker, die Infektion von nicht-infektiöser Entzündungunterscheiden können, weiterhin schwierig. Infolgedessen beginnen Kliniker häufig empirische Breitbandantibiotikatherapien, oft vor der mikrobiologischen Bestätigung, was zur Übernutzung von Antibiotika, zur Störung der frühen mikrobiellen Besiedlung und zur Entwicklung antimikrobieller Resistenzenbeiträgt 5.

Neonatale Sepsis ist eine lebensbedrohliche Erkrankung, die durch eine dysregulierte Wirtsreaktion auf eine Infektion verursacht wird, die zu Organfunktionsstörungenführt. Obwohl Infektion und Sepsis unterschiedliche biologische und klinische Einheiten darstellen, werden die Begriffe in der neonatologischen Literatur oft synonym verwendet. Klinisch wird neonatale Sepsis üblicherweise als früh- oder späteinsetzende Sepsis (EOS, LOS) klassifiziert und tritt vor oder nach 72 Stunden Lebenszeit auf. EOS wird typischerweise durch Krankheitserreger verursacht, die während der Geburt übertragen werden, wie Escherichia coli oder Gruppe-B-Streptokokken. Im Gegensatz dazu zeigt sich LOS häufig mit unspezifischen Symptomen, kann kulturnegativ sein und ist mit Risikofaktoren wie invasiven Eingriffen, parenteraler Ernährung und längerem Krankenhausaufenthalt verbunden. Die häufigsten Erreger sind Koagulase-negative Staphylokokken, insbesondere Staphylococcus epidermidis, sowie gram-negative Bakterien, obwohl auch Pilz- und polymikrobielle Infektionenauftreten. Unabhängig von der Ursache können neonatale Infektionen auf einen häufigen Sepsis-Phänotyp 1,2 konvergieren. Wichtig ist, dass Frühgeborene eine Entwicklungsunreife sowohl der angeborenen als auch der adaptiven Immunität sowie begrenzter Stoffwechselreserven aufweisen, was die Reaktionsfähigkeit auf Infektionen beeinflussen kann7.

Fortschritte bei Diagnose und Behandlung wurden durch Einschränkungen bestehender experimenteller Systeme behindert. In-vitro-Ansätze ermöglichen mechanistische Studien der Immunwege, können jedoch die integrierte Physiologie komplexer Immunantworten nicht erfassen. Nagermodelle, die zwar für genetische und molekulare Studien neonataler Immunantworten wertvoll sind, unterscheiden sich jedoch erheblich von Menschen in Immunontogene, Stoffwechsel und Größe 8,9. Das klinische Management von Sepsis ist in diesen Modellen schwer zu untersuchen, da die Möglichkeiten für intensive Überwachung, wiederholte Blutproben und klinische Tests einer klinisch realistischen unterstützenden oder therapeutischen Versorgung begrenzt sind.

Großtiermodelle, insbesondere Frühgeborene neugeborene Ferkel, bieten einen kraftvollen ergänzenden Ansatz. Schweine weisen enge anatomische, physiologische und immunologische Ähnlichkeiten mit Menschen auf, darunter vergleichbare Immunzellpopulationen, Mustererkennungsrezeptor-Signalübertragung und metabolische Regulation 10,11,12,13,14. Wichtig ist, dass Schweine weit verbreitet als Vorbilder für Sepsis13,15 bei Erwachsenen verwendet werden. Die physische Größe der Schweine ermöglicht den Einsatz klinisch relevanter Instrumente, kontinuierliche physiologische Überwachung, wiederholte Bioprobenentnahme und standardisierte Intensivpflegeinterventionen wie parenterale Ernährung, Flüssigkeitstherapie, Antibiotika und Atemunterstützung. Experimentelle Infektionen können auch im Kontext der Entwicklungsunreife untersucht werden, was die Untersuchung von Krankheitsverläufen, Wirtsreaktionen und Behandlungseffekten unter Bedingungen ermöglicht, die der klinischen Praxis sehr ähneln.

Dieses Papier beschreibt ein standardisiertes neonatales Sepsismodell bei Frühgeborenen Ferkeln, das als flexible translationale Plattform konzipiert wurde. Das Modell ermöglicht die kontrollierte Induktion einer systemischen bakteriellen Infektion und die longitudinale Beurteilung klinischer, immunologischer und metabolischer Reaktionen, die genutzt werden können, um die Pathophysiologie der neonatalen Sepsis zu erforschen und die Wirksamkeit neuartiger präventiver und therapeutischer Interventionen zu bewerten.

Protokoll

Alle detaillierten Verfahren wurden gemäß der EU-Richtlinie 2010/63/EU für Tierversuche durchgeführt und von der dänischen Tierversuchsinspektion genehmigt (Lizenznummer: 2020-15-0201-00520).

1. Verfahren rund um die Geburt

  1. Durchführung eines elektiven Kaiserschnitts zur Entbindung von Frühchen bei 90 % der Schwangerschaft (Gestationstage 106–107).
    1. Holen Sie eine trächtige Sau (Landrace × Large White, dritte oder vierte Parität) von einer kommerziellen Farm ohne spezifische Krankheitserreger.
      HINWEIS: Die Sau muss durch künstliche Befruchtung (× Duroc) befruchtet werden, um sicherzustellen, dass der genaue Tag der Empfängnis bekannt ist.
    2. Fasten Sie die Sau über Nacht (mindestens 12 Stunden) mit Ad-Libitum-Zugang zu Wasser vor der Operation. Sedierung durch intramuskuläre Injektion eines Cocktails mit Atropin (2 ml pro Sau), Butorphanol (2 mL/100 kg Körpergewicht; 10 mg/mL) und Zoletil 50 Vet (3,3 mL/100 kg Körpergewicht; Tiletamin 25/mL und Zolazepam 25 mg/mL) induzieren.
    3. Nach der Sedierung wird ein Ohrvenenkatheter eingesetzt und mit Propofol (10 mg/mL) eine Vollnarkose eingeleitet, das bis zum Verlust des Palpebralreflexs und des Kiefertonus erreicht ist.
    4. Führen Sie eine endotracheale Intubation unter direkter Laryngoskopie durch, um die Atemwege zu sichern. Halten Sie während des Kaiserschnitts eine chirurgische Anästhesieebene mit verdampftem Isofluran, das mit 100 % Sauerstoff (1–2 L/min) über einen kalibrierten Verdampfer geliefert wird.
    5. Beginnen Sie bei 5 % und halten Sie bei 1,5–2,5 %, wobei die Konzentration auf die niedrigste effektive Dosis basierend auf Herzfrequenz und peripherer Sauerstoffsättigung getitert wird.
      HINWEIS: Wenn eine Apnoe auftritt, beginnen Sie mit einer mechanischen Beatmung, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung sicherzustellen.
    6. Positionieren Sie die Sau in rechte seitliche Liegeposition. Führen Sie eine aseptische Vorbereitung der Operationsstelle durch. Verabreichen Sie ein Gesamtvolumen von 120 ml Lidocain (10 mg/ml) über subkutane und intramuskuläre Infiltration entlang der vorgesehenen Schnittlinie an der linken Flanke.
    7. Führen Sie eine Laparotomie an der linken Flanke mit einem Skalpell durch, um die Gebärmutterhörner freizulegen und zu exteriorisieren. Schneiden Sie die Gebärmutterhörner entlang der größeren Krümmung ein, um einzelne Ferkel zur Welt zu bringen.
    8. Vor dem Durchschneiden der Nabelschnur wird die Nabelschnur 2–3 Mal zum Ferkel gemolken, um die Hämoglobinkonzentration und die Eisenvorräte zu erhöhen. Legen Sie eine Nabelklemme mit der Bezeichnung A–Z zusammen mit Mull um die Nabelschnur und Mull, um Blutungen zu verhindern, und schneiden Sie die Nabelschnur durch.
    9. Unmittelbar nach der Geburt werden jedes Ferkel in einen Polythenbeutel gelegt, wobei der Kopf freiliegt. Der Beutel minimiert den Wärmeverlust und verringert so das Risiko einer Unterkühlung.
    10. Verabreichen Sie ein festes Volumen von 0,1 ml Doxapram (20 mg/ml) und 0,1 ml Flumazenil (0,1 mg/ml) intramuskulär im Hals. Doxapram regt die spontane Atmung an, während Flumazenil, ein Benzodiazepin-Antagonist, die während des Kaiserschnitts von der Sau übertragenen Anästhesie teilweise umkehrt.
    11. Bringen Sie die Ferkel auf eine neonatale Intensivstation.
  2. Wiederbelebung, Randomisierung und Katheterisierung
    1. Wägen und bestimmen Sie das Geschlecht jedes Ferkels bei der Überführung auf die neonatale Intensivstation.
    2. Bei Ferkeln, die nicht spontan atmen können, führen Sie eine Wiederbelebung individuell durch. Wiederholen Sie die Doxapram- und/oder Flumazenil-Dosen und sorgen Sie bei Bedarf für eine Überdruckbeatmung, um die Atmung zu stabilisieren.
    3. Sobald die Ferkel physiologisch stabil sind und noch unter Betäubung durch mütterlich übertragene Anästhesie betäubt sind, wird mit aseptischer Technik ein Nabelarterienkatheter (4 Fr PVC-Ernährungsschlauch) in eine der Arterien der durchschnittenen Nabelschnur eingesetzt. Schieben Sie die Katheterspitze zur dorsalen Aorta vor. Befestigen Sie den Katheter mit Nähten an der Haut und verbinden Sie ihn mit einer Infusionsleitung zur Versorgung mit parenteraler Ernährung.
      HINWEIS: Beim Frühgeborenen ist die intraarterielle Verabreichung der etablierte Standard über der Nabelvene, um eine mögliche hepatische Nekrose zu vermeiden, die durch das hohe Risiko einer Katheterspitzenfehlstellung im Leberparenchym und nicht im Ductusvenosus 21 verursacht wird.
    4. Schichten Sie Ferkel nach Geburtsgewicht und Geschlecht und ordnen Sie sie zufällig Behandlungsgruppen zu.
  3. Wohnverhältnisse
    1. Jedes Ferkel einzeln in einem beheizten, gepolsterten Inkubator mit kontrollierter Belüftung unterzubringen.
    2. Geben Sie bis zu 12 Stunden nach der Geburt zusätzlichen Sauerstoff (1–2 L/min), um Hypoxie vorzubeugen.
    3. Überwachen Sie die rektale Temperatur in den ersten 12 Stunden nach der Geburt. Heizbedingungen werden bei Bedarf angepasst, um eine Kerntemperatur von 38–39 °C (Ziel: 38,5 °C) zu halten.
      HINWEIS: Eine kurze Phase der Unterkühlung wird unmittelbar nach der Geburt und während des Kathetereinsetzens erwartet.

2. Passive Immunisierung durch Plasmainfusion

HINWEIS: Da Schweine keine Immunglobuline transplacent übertragen, sollten Experimente mit längerer als 24 Stunden eine partielle passive Immunisierung anbieten, um spontane Infektionen zu verhindern.

  1. Sammeln Sie das mütterliche Blut der Sau nach dem Kaiserschnitt in einen sterilen, mit Heparin beschichteten Behälter. Zentrifugiere das Blut in sterilen Falcon-Röhrchen bei 4 °C, 2500 × g für 10 Minuten und wiederhole das einmal. Nach der Trennung wird das Plasma vorsichtig in neue sterile Falcon-Röhren gesammelt und bei 4 °C bis zum Gebrauch gelagert.
  2. Innerhalb von 12 Stunden nach der Geburt wird das Plasma mit einer Dosis von 8 mL/kg als 30-minütige kontinuierliche intraarterielle Infusion mit einer Infusionspumpe verabreicht.

3. Induktion experimenteller Infektion

HINWEIS: Die experimentelle Infektion kann entweder 3–4 Stunden nach der Geburt oder am postnatalen Tag 3 ausgelöst werden.

  1. Herstellung der bakteriellen Suspension
    1. Tauen Sie das gefrorene Fläschchen von S. epidermidis (WT-1457, 15–25 % Glycerol) bei Zimmertemperatur auf. Vortex kurz (2–3 s), um eine homogene Suspension zu erhalten.
      HINWEIS: Laut der Risikogruppenklassifikation für Infektionserreger wird S. epidermidis als WHO-Risikogruppe 1-Mikroorganismus eingestuft. WHO-Risikogruppe-1-Mikroorganismen verursachen wahrscheinlich keine menschlichen Krankheiten und erfordern keine besonderen Überlegungen.
    2. Bereiten Sie eine Übernachtkultur vor, indem Sie 20 ml Herzinfusionsbrühe (BHI) mit 5 μL des aufgetauten S. epidermidis-Lagers in einem sterilen 100-ml-Erlenmeyer-Kolben inokulieren. Inkubieren Sie bei 37 °C mit Orbitalschütteln bei 180 U/min für ~16 Stunden, sodass die Kultur die stationäre Phase erreichen kann. Führen Sie unter identischen Bedingungen eine uninokulierte BHI-Brühe ein, um die Mittelsterilität zu überprüfen.
    3. Bereiten Sie eine neue Kultur vor, indem Sie 20 ml BHI-Brühe mit 200 μL der Übernachtkultur (1:100 Verdünnung) in einer sterilen 100 mL Erlenmeyer-Flasche inokulieren. Bereite eine ausreichende Kultur vor, um alle Ferkel zu infizieren (siehe Berechnungen in den Schritten 3.1.4 – 3.1.6). Inkubieren Sie bei 37 °C mit orbitalem Schütteln bei 180 U/min für 2,5 Stunden, bis die Bakterien die früh-logarithmische Wachstumsphase erreichen (ergänzende Abbildung 1A).
    4. Schätzen Sie das gesamte Kulturvolumen, das zur Infektion aller Ferkel erforderlich ist, basierend auf der getitrierten Zieldosis, dem durchschnittlichen Körpergewicht, der Anzahl der Ferkel und der Kulturdichte.
    5. Angenommen, die Kultur erreicht nach der 2,5-stündigen Inkubation eine optische Dichte bei 600 nm (OD) von ≥1 (Ergänzende Abbildung 1B) und verwendet eine etablierte Umrechnungsrate von OD von 1 = 3 × 108 Koloniebildungseinheiten (CFU)/mL.
    6. Rechnen Sie 15 % zusätzliches Volumen ein, um die Verluste zu bewältigen. Berechnen Sie das geschätzte Kulturvolumen mit folgender Formel:
      V-Schätzung = [Zieldosis (CFU/kg BW) × BW) × BW × N × 1,15] / 3 × 108 CFU/mL (1)
      wobei:
      V-Schätzung = geschätztes Gesamtkulturvolumen (mL)
      BW = durchschnittliches Körpergewicht des Ferkels (kg)
      N = Gesamtzahl der Ferkel
    7. Nach der Brutzeit wird die OD der Kultur bestimmt. Verdünnen Sie die Probe nach Bedarf, um die Messwerte im linearen Bereich des Spektrophotometers zu halten.
    8. Berechnen Sie das Endkulturvolumen, das erforderlich ist, um die Ziel-CFU-Konzentration zu erreichen, mit folgender Formel:
      VFinale = OD1 · V-Schätzung / Gemessener OD (2)
      wobei:
      VEndwert = Endkulturvolumen erforderlich (mL)
    9. Übertragen Sie das berechnete VFinal in 50 mL Falcon-Röhren und zentrifugieren Sie bei 3.000 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
    10. Entsorge das Supernatant vorsichtig.
    11. Ziehen Sie das bakterielle Pellet in 3 x VFinal der sterilen 0,9 % Kochsalzlösung erneut auf, um sich auf die intraarterielle Verabreichung vorzubereiten (3 ml/kg Körpergewicht über 3 Minuten). Stellen Sie sicher, dass die Lösung frei von Aggregaten ist.
    12. Bereiten Sie 50-ml-Infusionsspritzen mit der bakteriellen Suspension vor.
    13. Bereiten Sie eine separate 50-ml-Infusionsspritze mit steriler 0,9%iger Kochsalzlösung für nicht infizierte Kontrollpersonen vor.
  2. Infektionsverfahren
    1. Verabreichen Sie jedem Ferkel die bakterielle Suspension oder sterile Kochsalzlösung über den Nabelarterienkatheter mit einer Infusionspumpe, die die Zieldosis über 3 Minuten verabreicht. Halten Sie einen Abstand von 5 Minuten zwischen aufeinanderfolgenden Ferkeln ein.
    2. Unmittelbar nach der Infektion beginnen Sie mit der kontinuierlichen Infusion der parenteralen Ernährung, um den Katheter zu spülen und die gesamte Dosis zu verabreichen.
    3. Bestätigen Sie die Dosis, indem Sie die bakterielle Suspension bei 4 °C aufbewahren. Später kann dies verdünnt und auf Blutagarplatten aufgetragen werden, um die bakterielle Dichte zu bestimmen (siehe Schritt 8)

4. Parenterale Ernährung

  1. Versorgen Sie die Ferkel während der gesamten Experimentsdauer mit kompletter parenteraler Ernährung (TPN). Verwenden Sie zum Beispiel einen dreikammerigen menschlichen TPN-Beutel, wie Kabiven 1900 kcal, der modifiziert ist, um den Makronährstoffbedarf neugeborener Ferkel zu decken.
  2. Bereiten Sie die parenterale Nährlösung unter sterilen Bedingungen vor.
    1. Entferne 300 ml aus der Glukosekammer.
    2. Entferne 70 ml aus der Lipidkammer.
    3. Gib 155 ml 50 % Glukose in die Glukosekammer.
    4. Gib 214 ml Vamin in die Glukosekammer.
    5. Gib 150 ml steriles Wasser in die Glukosekammer.
    6. Gib 0,1 mL Heparin (5000 IE/mL) in die Glukosekammer.
    7. Mische den Inhalt aller drei Kammern gründlich.
      HINWEIS: Dies führt zu einer parenteralen Nährlösung mit der in Tabelle 1 gezeigten Makronährstoffzusammensetzung. Verwenden Sie diese Formulierung als Standard-Kontrolldiät, wenn Sie die Auswirkungen alternativer Ernährungsregime auf Infektionsreaktionen bewerten.
    8. Lagern Sie die parenterale Ernährung bis zur Anwendung bei 4 °C. Bereiten Sie die Lösung in Chargen vor und verwenden Sie sie nicht länger als 48 Stunden nach der Zubereitung.
      HINWEIS: Das Modell kann so modifiziert werden, dass die Auswirkungen von enteraler Ernährung und Darmstimulation bewertet werden, indem Ferkel mit orogastrischen Ernährungssonden versorgt werden.
  3. Abgabe von parenteraler Ernährung
    1. Füllen Sie 50 ml sterile Infusionsspritzen mit parenteraler Ernährung und geben Sie kontinuierlich mit einer Infusionspumpe kontinuierlich durch den intraarteriellen Katheter ein.
    2. Stellen Sie die Infusionsrate auf 6 mL/kg/h ein. Wiegen Sie die Ferkel täglich und passen Sie die Dosis entsprechend dem aktualisierten Körpergewicht an.
      HINWEIS: Bei längerfristigen Studien sollte bei Beobachtung eines peripheren Ödems (Überhydration) die Infusionsrate auf 4 mL/kg/h reduziert werden.
    3. Überwachen Sie regelmäßig die Infusionspumpen, um sicherzustellen, dass die Spritzen nicht leer sind. Füllen Sie die Spritzen bei Bedarf nach.

5. Klinische Überwachung

  1. Untersuchen Sie die Ferkel regelmäßig während der Studie, um festzustellen, ob Maßnahmen notwendig sind. Nach der bakteriellen Infusion sollten die Tiere alle 1–2 Stunden von erfahrenem Personal überwacht werden, bis eine geplante Euthanasie erfolgt.
    HINWEIS: Klinische Verschlechterung, also der Übergang von keinen Symptomen zu humanen Endpunkten, kann innerhalb von 30–60 Minuten schnell auftreten.
    1. Beobachte Symptome im Zusammenhang mit der Atmung, darunter Tachypnoe, Atemnot, Zyanose und agonale Atmung.
      HINWEIS: Bei Hypoxie (Sauerstoffsättigung < 80 %) sollte die Sauerstoffversorgung eingeleitet oder erhöht werden.
    2. Beobachten Sie Symptome im Zusammenhang mit der Durchblutung, darunter Verfärbungen, kalte Extremitäten, verlängerte Kapillarnachfüllungszeit, Tachykardie und Bradykardie.
    3. Beobachte Symptome, die mit der Aktivität zusammenhängen, einschließlich Lethargie, Unfähigkeit zu stehen oder zu gehen (relevant ab dem postnatalen Tag 3) und Reaktivität auf Schmerzreize.
    4. Beobachten Sie Symptome im Zusammenhang mit der Gerinnung, wie Ekchymose oder petechiale Blutungen in der Haut. Üben Sie sanften Druck auf verfärbte Bereiche aus; Wenn die Rötung nicht bleicht, klassifizieren Sie den Befund als Hautblutung.
  2. Wenn klinische Symptome festgestellt werden, führen Sie Blutgasmessungen durch, um pH-Werte, Laktat, Sauerstoffsättigung und den Partialdruck von Kohlendioxid im Verhältnis zu den Ausgangswerten zu beurteilen (siehe Schritt 6.3).
    HINWEIS: Kontinuierliche klinische Überwachung (z. B. von Blutdruck, Herzfrequenz und Atemfrequenz) kann verwendet werden, wird in diesen Experimenten jedoch nicht routinemäßig angewendet.

6. Blutprobenentnahme

HINWEIS: Longitudinale Blutproben können bei Ferkeln über den intraarteriellen Katheter oder durch Venenpunktion der Jugularvenigruppe durchgeführt werden. Das insgesamt beprobte Blutvolumen sollte 7,5 % des geschätzten Gesamtvolumens (~7 % des Körpergewichts) nicht überschreiten. Alle Blutprobennahmeverfahren müssen den örtlichen ethischen Richtlinien entsprechen.

  1. Intraarterielle Katheter-Blutprobe
    1. Mit sauberen, behandschuhten Händen erreichen Sie vorsichtig den Katheterport. Desinfizieren Sie die Zugangsstelle vor der Öffnung mit Ethanol. Vermeiden Sie eine Kontamination der Infusionsleitung.
    2. Entnehmen Sie mindestens 2 ml Blut und legen Sie es beiseite, da dieses Volumen möglicherweise mit parenteraler Ernährung aus der Infusionsleitung kontaminiert ist. Halten Sie die Sterilität der entnommenen Probe aufrecht.
    3. Sammeln Sie das erforderliche Blutvolumen für die Analyse. Beispielsweise sollte Blut für hämatologische Analysen in EDTA-beschichteten Röhren entnommen werden, während Proben für Blutgasanalysen mit Heparin-beschichteten Spritzen entnommen werden sollten.
    4. Nach Abschluss der Probenahme werden die ursprünglich entnommenen 2 ml Blut in das Ferkel nachgegeben und der Katheter vorsichtig wieder an die parenterale Nährstoffinfusionsleitung angeschlossen.
  2. Blutprobe der Jugularpunktion
    1. Nehmen Sie das Ferkel aus seinem Inkubator und legen Sie es in dorsale Rückenruhe, um den Halsbereich freizulegen. Sichern Sie das Ferkel sicher, um eine Bewegung zu verhindern und einen sicheren Zugang zur Halsschlagvene zu ermöglichen.
      HINWEIS: Die Venenpunktur der Halsschlagader ist mit potenziellen Risiken verbunden, darunter Blutungen, Hämatombildung und Atemwegsbeeinträchtigung. Die Entscheidung, dieses Verfahren durchzuführen, sollte sorgfältig gegen die wissenschaftliche Bedeutung der Ergebnisse abgewogen werden.
    2. Identifizieren Sie den ungefähren anatomischen Standort der Jugularvene und desinfizieren Sie die Stichstelle mit Ethanol.
    3. Führen Sie eine Jugularvenippunktion mit einem Vacutainer-System durch und entnehmen Sie das erforderliche Blutvolumen. Zum Beispiel sollten 0,2 ml Blut entnommen werden und die Probe bei 4 °C gelagert, bis die Bakterien verpangert sind.
    4. Druck auf die Venenpunktionsstelle ausüben, bis eine Hämostase erreicht ist. Dann bringt das Ferkel zurück in seinen Brutkasten.
    5. Beobachten Sie das Ferkel weiterhin auf Anzeichen einer erneuten Blutung. Bei erheblichen Blutungen sollten Sie das Ferkel einschläfern. Achten Sie außerdem auf die Bildung subkutaner Hämatome oder innere Blutungen, die die Atemwege beeinträchtigen könnten.
  3. Blutgasmessungen
    1. Untersuchen Sie die Blutprobe in der heparinisierten Spritze auf Luftblasen. Wenn Blasen vorhanden sind, stoßen Sie sie vorsichtig durch Klopfen auf die Spritze aus oder lösen Sie sie, um Veränderungen der Gasmessungen zu vermeiden.
    2. Bringen Sie die Probe zum Blutgasanalysator und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie sicher, dass die Probe rechtzeitig verarbeitet wird, um die Genauigkeit zu gewährleisten.

7. Sepsis-Kriterien und humane Endpunkte

  1. Euthanasiere Ferkel nach Erreichen vordefinierter humaner Endpunkte, die auf eine Sepsis hindeuten.
    HINWEIS: Für andere Pathologien oder iatrogene Verletzungen konsultieren Sie lokale ethische Richtlinien für humane Endpunkte.
    1. Verwenden Sie den Blut-pH-Wert als Hauptindikator für die Sepsis und den primären humanen Endpunkt. Euthanasiere Ferkel mit einem Blut-pH-Wert ≤ 7,1 sofort. Bei Ferkeln mit einem Blut-pH-Wert ≤ 7,2 werden alle 15–30 Minuten Blutgasmessungen wiederholt und auf sekundäre humane Endpunkte geachtet.
    2. Als sekundäre humane Endpunkte werden Ferkel unabhängig vom Blut-pH-Wert eingeschläfert, sobald sich eine disseminierte intravaskuläre Gerinnung manifestiert, einschließlich Ekchymose oder petechiale Blutungen, Atemstillstand, starke Lethargie und/oder mangelnde Reaktionsfähigkeit auf Schmerzreize (bestätigt durch das Ausbleiben eines Entzugsreflexes nach einem sanften Kneifen des interdigitalen Raums mit anatomischer Pinzette).
  2. Betäuben Sie das Ferkel durch eine intramuskuläre Injektion einer Zoletil-basierten Mischung (0,1 mL/kg).
    HINWEIS: Rekonstituieren Sie ein Fläschchen Zoletil 50 Vet (Tiletamin 125 mg, Zolazepam 125 mg) auf 10 ml mit 6,25 ml Xylazin (20 mg/mL), 1,25 mL Ketamin (100 mg/ml) und 2,5 mL Butorphanol (10 mg/ml). Die Endkonzentrationen betragen jeweils 12,5 mg/ml von Tiletamin, Zolazepam, Xylazin, Ketamin und 2,5 mg/mL Butorphanol.
  3. Bestätigen Sie eine ausreichende Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen eines Entzugsreflexes als Reaktion auf einen schmerzhaften Reiz (siehe Schritt 7.1.2).
  4. Führen Sie eine Euthanasie durch intrakardiale Injektion einer Überdosis von Natriumpentobarbital (3 mL/kg; 400 mg/mL) durch.
    HINWEIS: Vor der Euthanasie kann vor der Euthanasie eine intrakardiale Blutentnahme mit einem Vacutainer-System durchgeführt werden.

8. Bakterielle Beschichtung und Quantifizierung

  1. Quantifizieren Sie die bakterielle Blutdichte mithilfe von Jugularvenenpunkturproben, die während des Experiments entnommen wurden, sowie Herzpunktionsproben, die bei der Euthanasie gesammelt wurden.
    HINWEIS: Verwenden Sie kein Blut, das aus dem arteriellen Katheter entnommen wurde, da es Restbakterien der ursprünglichen experimentellen Infektion enthalten kann, was die Quantifizierungen verheiraten könnte.
    1. Bereiten Sie für jede Blutprobe eine Schafblut-Agarplatte vor, markieren Sie unten die Quadranten 0, -1, -2 und -3 und beschriften Sie die Platte mit der Tier-ID und dem Zeitpunkt.
    2. Verwenden Sie 50 μL Blut aus jeder Probe und bereiten Sie 10-fache Verdünnungen von 10-1, 10-2 und 10-3 in 450 μL sterilem PBS in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor.
    3. Jede Platte wird mit drei 20-μL-Tropfen der entsprechenden Verdünnung im zugewiesenen Quadranten platziert, um Abstandstropfen zu vermeiden, Kontakt oder Übertragung zu vermeiden und Aerosolisierung zu verhindern.
    4. Teller über Nacht bei 37 °C inkubieren und dann die Teller bei 4 °C aufbewahren, bis du zählst.
    5. Zählen Sie alle bakteriellen Kolonien in der Verdünnung, die etwa 10 Kolonien pro Fleck enthalten. Es werden nur Kolonien von S. epidermidis aufgenommen, die typischerweise weiß, rund und glattkantig sind. Inspizieren und dokumentieren Sie sorgfältig alle Kolonien mit veränderter Morphologie, da diese auf eine Kontamination hinweisen können, z. B. durch Probenahmen. Berechnen Sie CFU/mL mit folgender Gleichung:
      (CFU/mL) = [(Kolonienanzahl · Verdünnungsfaktor)/(3 · 20 μL)] · [1000μL/mL] (3)

Ergebnisse

Ein Dosis-Wirkungs-Experiment wurde an Frühgeborenen durchgeführt, die bis zum postnatalen Tag 5 aufgezogen wurden (Abbildung 1). Am postnatalen Tag 3 erhielten die Ferkel entweder eine niedrige Dosis S. epidermidis (109 CFU/kg, n = 9), eine hohe Dosis S. epidermidis (5 × 109 CFU/kg, n = 9) oder Kochsalzlösung als Kontrollgruppe (n = 3) und wurden 44 Stunden überwacht.

Nach der S. epidermidis-Infusion blieb die bakterielle Blutbelastung während der gesamten 44-stündigen Nachbeobachtungszeit bei Ferkeln, die die hohe Dosis erhielten, im Vergleich zur Gruppe mit niedriger Dosis höher (Abbildung 2A, P < 0,05). Nur Ferkel der Hochdosisgruppe (3/9) entwickelten eine Sepsis, deren Beginn etwa 12–15 Stunden nach der Infektion erfolgte (Abbildung 2B). Im Einklang damit zeigten Ferkel, die die hohe S. epidermides-Dosis erhielten, einen niedrigeren Blut-pH-Wert nach 12 Stunden (Abbildung 2C, P < 0,001), begleitet von einem deutlichen Anstieg des Partialdrucks von Kohlendioxid (pCO₂) (Abbildung 2D, P < 0,01), im Vergleich zur Gruppe mit niedriger Dosis.

Während der akuten Infektionsphase (6 H) zeigten beide infizierten Gruppen einen niedrigeren Basenüberschuss und höhere Laktatspiegel im Vergleich zu Kochsalzkontrollen, mit ausgeprägteren Veränderungen, die bis 12 Stunden in der hochdosierten S. epidermidis-Gruppe anhielten (Abbildung 2E, F, P < 0,01 – 0,05). Die Blutzuckerwerte unterschieden sich nicht zwischen den Gruppen (Abbildung 2G).

Nach 6 Stunden zeigten beide infizierten Gruppen auch eine robuste Blut-Neutrophilen-Depletion im Vergleich zu nicht infizierten Kontrollgruppen (Abbildung 3A, beide P< 0,001). Später im Verlauf der Infektion wurde in beiden infizierten Gruppen eine Neutrophillen-Erneuerung beobachtet, war jedoch in der niedrig dosierten S. epidermidis-Gruppe größer (Abbildung 3A, P < 0,05). Beide infizierten Gruppen entwickelten während des Experiments Thrombozytopenie; allerdings gingen die Thrombozytenzahlen in der hochdosierten S. epidermitis-Gruppe früher und deutlicher zurück als sowohl in der Gruppe mit niedriger Dosis als auch in der nicht infizierten Kontrollgruppe (Abbildung 3B, P < 0,01–0,05). Die Plasmawerte von TNF-α, IL-6 und IL-10 waren in beiden infizierten Gruppen 6 und 12 Stunden nach der Infektion im Vergleich zu Kontrollgruppen erhöht (Abbildung 3C, P < 0,001–0,05). Nach 24 Stunden blieben die Plasmaspiegel von TNF-α und IL-10 nur in der hochdosierten S. epidermidis-Gruppe erhöht im Vergleich zu nicht infizierten Kontrollpersonen (P < 0,05), während nach 44 Stunden nur noch die TNF-α-Spiegel erhöht waren (P < 0,05).

Bei der Euthanasie, wenn Ferkel entweder humane Endpunkte erreichten oder zum geplanten Zeitpunkt von 44 Stunden nach der Infektion eingeschläfert wurden, wurden Plasmawerte negativer akuter Reaktanten und Marker für Organschäden gemessen (Abbildung 4A–G). Von diesen war nur Cholesterin (ein negativer akuter Reaktant) bei Ferkeln mit hoher Dosis S. epidermidis signifikant niedriger als in der Gruppe mit niedriger Dosis (Abbildung 4B, P < 0,05). Die mittleren Werte von Leberschädigungsmarkern, darunter Alanin-Aminotransferase und Aspartat-Aminotransferase, sowie Nierenschädigungsmarker wie Kreatinin und Blut-Harnstoffstoff, waren in der hochdosierten S. epidermitis-Gruppe numerisch höher als bei nicht infizierten Kontrollgruppen (Abbildung 4D–G).

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Abbildung 1: Versuchsdesign. Frühgeborene Ferkel wurden zu 90 % der Schwangerschaft per Kaiserschnitt entbunden. Am postnatalen Tag 3 erhielten die Ferkel eine intraarterielle Infusion mit lebendem S. epidermidis bei 109 oder 5 × 109 CFU/kg oder Kochsalzlösung als Kontroll. Nach der Infektion wurden die Ferkel 44 Stunden lang überwacht, wobei zu festgelegten Zeitpunkten längs Blutentnahme durchgeführt wurde. Figur, die mit Biorender.com erstellt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Blutbakterielle Belastung, Überlebens- und Blutgasparameter bei Frühgeborenen Ferkeln nach arterieller Infusion mit Kochsalzlösung (CON) oder Infektion mit lebender S. epidermidis. (A) Dichte von S. epidermidis in Blutproben, die 6, 24 und 44 Stunden nach der Infektion entnommen wurden. (B) Überlebenskurven zeigen die Zeit bis zum humanen Endpunkt oder geplanten Euthanasie 44 Stunden nach der Infektion. (C–G) Arterielle Blutgaswerte 0, 6, 12, 24 und 44 Stunden nach der Infektion. Die Daten werden als Mittelwert ± SD. (A), Überlebenskurven (B) oder Violin-Dot-Diagramme präsentiert, einschließlich Median (durchgezogene Linie) und IQR (gepunktete Linien) (C–G). n = 9 für jede infizierte Gruppe; n = 3 für die nicht infizierte Kontrolle. Die Daten wurden mit einem linearen Mixed-Effects-Modell analysiert, das Gruppen- ×-Zeitinteraktionen (A, C–G) oder ein Cox-Proportionalhazard-Modell (B) einbezieht. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Abkürzungen; CON = Kontrolle; pCO2 = Partialdruck vonCO2; SE = S. epidermidis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Zirkulierende Entzündungsmarker bei Frühgeborenen nach arterieller Infusion mit Kochsalzlösung (CON) oder Infektion mit lebender S. epidermidis. (A, B) Zirkulierende Neutrophilen- und Thrombozytenzahlen bei 6, 12, 24 und 44 Stunden nach der Infektion. (C) Plasmaspiegel von TNF-α, IL-6 und IL-10 bei 6, 12, 24 und 44 Stunden nach der Infektion. Die Daten werden als Violin-Dot-Plots präsentiert, einschließlich Median (durchgezogene Linie) und IQR (gestrichelte Linien) (A–C). n = 9 für jede infizierte Gruppe; n = 3 für die nicht infizierte Kontrolle. Die Daten wurden mit einem linearen Mixed-Effects-Modell analysiert, das Gruppen- × Zeitinteraktionen (A–C) einbezieht. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Abkürzungen; CON = Kontrolle; IL = Interleukin; SE = S. epidermidis; TNF = Tumornekrosefaktor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Biochemische Plasmaparameter bei Frühlingen nach arterieller Infusion mit Kochsalzlösung (CON) oder Infektion mit lebender S. epidermidis (109 oder 5 × 109 CFU/kg). (A–G) Plasmaspiegel von Albumin, Cholesterin, ALP, ALAT, ASAT, Kreatinin und BUN am humanen Endpunkt oder bei geplanter Euthanasie 44 Stunden nach der Infektion. Die Daten werden als Whisker-Diagramme dargestellt, die den gesamten Bereich (Minimum bis Maximum) (A–G) zeigen. Einzelne Datenpunkte in dunkelviolettem Licht deuten auf Ferkel hin, die eine Sepsis entwickelt haben. n = 9 für jede infizierte Gruppe; n = 3 für die nicht infizierte Kontrolle. Die Daten wurden mit einem mehrfachen linearen Regressionsmodell (A–G) analysiert. *P < 0,05. Abkürzungen; ALAT = Alanin-Aminotransferase; ALP = alkalische Phosphatase; ASAT = Aspartat-Aminotransferase; BUN = Blutharnstoff-Stickstoff; CON = Kontrolle; SE = S. epidermidis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

GesamtbetragSchwerpunkt
Energie7762kJ3525kJ/L
Makronährstoffe
Aminosäuren92g42g/L
Fett66g30g/L
Glukose221g100g/L
Mikronährstoffe
Na64mmol29mmol/L
K48mmol22mmol/L
Mg8mmol4mmol/L
Ca4mmol2mmol/L
PO418mmol8mmol/L
SO48mmol4mmol/L
Cl93mmol42mmol/L
Acetat78mmol35mmol/L

Tabelle 1: Zusammensetzung der modifizierten Gesamtparenteral-Ernährung. Die Gesamtmengen und Konzentrationen von Energie, Makronährstoffen (Aminosäuren, Fett und Glukose) sowie Mikronährstoffen in der parenteralen Ernährungslösung.

Ergänzende Abbildung 1: Wachstumskinetik von S. epidermidis WT-1457. Die Bakterien wurden in einer Herzbrühe im Gehirn bei 37 °C kultiviert, wobei das Orbital-Schütteln bei 180 U/min erfolgte. Die optische Dichte wurde über die Zeit bei 600 nm gemessen. Die Daten werden auf logarithmischer (A) und linearer Skala (B) dargestellt (n = 3 unabhängige Experimente). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Ein standardisiertes Modell der neonatalen Sepsis bei Frühgeborenen wurde entwickelt, um eine systemische bakterielle Infektion unter klinisch relevanten Bedingungen neonataler Unreife zu untersuchen. Das Modell kombiniert die Kontrolle des Schwangerschaftsalters, Wiederbelebung und Intensivpflege, Infektionszeitpunkt und longitudinale Blutprobennahme. Dieser Ansatz zielt darauf ab, die Lücke zwischen Nagetier- und in-vitro-experimentellen Systemen sowie der komplexen Physiologie infizierter Neugeborener zu überbrücken. Wichtig ist, dass dieses Modell verwendet wurde, um den bekannten Zusammenhang zwischen Geschlecht, niedrigem Geburtsgewicht und Gestationsalter mit der Sepsissensitivität zu bestätigen, die bei menschlichen Frühgeborenenbeobachtet wurde.

Schweine sind ein sehr relevantes Großtiermodell für die Infektionsforschung, da es erhebliche Ähnlichkeiten mit Menschen in der Immunfunktion und Physiologie gibt. Wichtige Komponenten des angeborenen Immunsystems, darunter Leukozyten-Untergruppen, Mustererkennungsrezeptor-Signalübertragung und Zytokinantworten, zeigen eine enge Entsprechung zwischen Schweinen und Menschen. Die wichtigsten immunologischen Unterschiede zwischen neugeborenen Ferkeln und Menschen liegen in adaptiven Immunantworten. Da während der Schweine-Schwangerschaft kein transplacentaler Transfer von Immunglobulin G (IgG) stattfindet, werden neugeborene Ferkel in dieser Hinsicht naiv geboren19. Ebenso durchlaufen B-Zellen von Säuglingen vor dem Alter von 3–6 Monaten keinen Isoformwechsel von IgM zu IgG, während Porcine B-Zellen kurz nach derGeburt 20 IgG-Reaktionen entwickeln.

In diesem Modellsystem werden diese Unterschiede gemildert, indem kurz nach der Geburt eine Infektion induziert wird, bevor adaptive Immunantworten auftreten können, und durch die Versorgung der mütterlichen Immunglobuline mittels Plasmatransfusion. Dieser Ansatz führt zu zirkulierenden IgG-Werten, die denen von Neugeborenen, sehr frühgeborenen Säuglingen ähneln, die aufgrund einerFrühgeburt unterbrochenen transplacentalen IgG-Transfer unterbrochen werden. Außerdem stärkt die vergleichsweise große Körpergröße bei der Geburt (~800 g) das Modell im Vergleich zu neugeborenen Mäusen (~3 g) weiter. Daher ähneln Umwelteinflüsse wie Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Sauerstoffspannung eher denen von menschlichen Neugeborenen. Diese Größenordnung ermöglicht außerdem den Einsatz klinischer Geräte, invasiver Überwachung und unterstützender Versorgungsmodalitäten wie Gefäßzugang, Atemunterstützung und kontinuierlicher physiologischer Überwachung, die in neonatalen Nagetiermodellen nicht praktikabel sind. Insbesondere wird der Gefäßzugang bei Infusionen, wie der parenteralen Ernährung, im Frühzeitschweinemodell über einen Nabelarterienkatheter erreicht. Obwohl dies im Gegensatz zum üblichen intravenösen Weg in der klinischen Neonatologie steht, ist es durch die anatomischen Einschränkungen von Frühgeborenen notwendig, bei denen Nabelvenenkatheter selten spontan den Ductus venosus durchqueren und stattdessen eine Fehlposition im Leberparenchym21 stattfinden. Die intraarterielle Verabreichung bietet einen zuverlässigen und reproduzierbaren Weg für eine kontinuierliche Infusion ohne das hohe Risiko einer Lebernekrose, die mit einer Fehlstellung der Nabelvene einhergeht. Ebenso kann arterielles Blut für die Blutgasanalyse entnommen werden.

Die systemische Infektion in diesem Modell wird durch intraarterielle Infusion von lebender S. epidermidis induziert, einer der Hauptursachen für spät einsetzende Sepsis in neonatalen Intensivstationen 1,2. Eine Vielzahl von Krankheitserregern verursacht jedoch eine neonatale Sepsis, und koagulase-negative Staphylokokken wie S. epidermidis sind ebenfalls dafür bekannt, weniger schwere Infektionen und ein geringeres Sepsisrisiko zu verursachen als andere, virulentere Krankheitserreger wie E. coli 1,2. Obwohl das Modell einen Krankheitserreger mit niedriger Virulenz verwendet, spiegeln die beobachtete klinische Verschlechterung, entzündliche Aktivierung und physiologische Instabilität alle zentrale Merkmale der neonatalen Sepsis wider. Die nicht infizierte Kontrollgruppe (n = 3) in dieser Studie dient als Ausgangspunkt, um den physiologischen Zustand von "gesunden" Frühgeborenen Ferkeln unter identischen Intensivbehandlungsbedingungen nachzuweisen. Obwohl dies zu einem Designungleichgewicht führt, sollen diese Vergleiche die Reaktion des Wirts auf eine Infektion darstellen. Wie in Abbildung 2 gezeigt, gab es eine klare Dosis-Wirkung-Beziehung mit steigenden S. epidermidis-Dosen, was mit früheren Befunden bei Ferkeln am ersten Lebenstag22 infizierte Ferkel übereinstimmt. Nur Ferkel, die die höchste S. epidermidis-Dosis erhielten, verschlechterten sich bis zu den humanen Endpunkten, die eine Euthanasie erforderten. Beide infizierten Gruppen entwickelten jedoch eine metabolische Azidose, während eine erhebliche respiratorische Komponente (erhöhtes pCO₂) nur in der hochdosierten S. epidermidis-Gruppe beobachtet wurde. Ähnlich zeigten beide Gruppen eine ausgeprägte Neutropenie 6 Stunden nach der Infektion, gefolgt von Neutrophilenauffüllung nach 24 Stunden, was in der Gruppe mit niedriger Dosis höher war. Thrombozytopenie war ebenfalls in beiden Gruppen vorhanden, begleitet von erhöhten Plasmazytokinen und Organschädigungsmarkern, mit ausgeprägteren Reaktionen bei Ferkeln mit der höchsten S. epidermidis-Dosis.

Bei Frühgeborenen auslöst die S. epidermidis-Infektion am postnatalen Tag 1 die gleichen paraklinischen Anzeichen einer neonatalen Sepsis (metabolische Azidose, Leukopenie, Thrombozytopenie, Entzündung) sowie Lethargie, Koagulopathie und Komplementkonsum 17,22,23. Die Infektion verursacht außerdem systemische Störungen im Energiestoffwechsel, insbesondere eine verminderte mitochondriale oxidative Phosphorylierung sowie Veränderungen im Plasmaproteom und Metabolom, ähnlich denen bei neonatalen Sepsis-Patienten 24,25,26. Außerdem entwickeln Frühgeborene Ferkel (90 % Trächtigkeit) viel häufiger eine Sepsis als Ferkel, die mit volljährigen17 Jahren geboren werden. Die Ernährungszusammensetzung beeinflusst zudem die klinischen und immunologischen Reaktionen. Glukosebasierte TPN treibt den glykolytischen Stoffwechsel an, der pro-inflammatoriske Immunantworten verstärkt und gleichzeitig die Krankheitstoleranz in peripheren Geweben beeinträchtigt24,26. Die Kombination dieser Reaktionen ist mit einer Organschädigung und dem Fortschreiten zum Sepsis-Phänotyp27 verbunden. Die Modulation der TPN-Zusammensetzung, entweder durch Reduzierung des Glukosegehalts oder durch alternative Makronährstoffe wie Galaktose, glukogene Aminosäuren oder β-Hydroxybutyrat28,29, dämpft die Entzündungsreaktion und erhält die Toleranz gegenüber Geweben gegenüber Krankheiten. Eine hohe Glukosesupplementierung über TPN führt ebenfalls zu Hyperglykämie (≈10–20 mM). Es bleibt jedoch unklar, inwieweit die beobachteten glykolysegebundenen Entzündungsreaktionen direkt durch erhöhte Blutzuckerwerte vermittelt werden.

Experimentelle Beobachtungen zeigen deutliche Unterschiede in den klinischen Reaktionen abhängig vom postnatalen Infektionstag. Sowohl das Risiko einer Sepsis als auch die Schwere der klinischen Symptome sind am höchsten, wenn die Infektion kurz nach der Geburt eingeleitet wird. Die Infektionsindduktion am postnatalen Tag 3 führt zu einem milderen Sepsephänotyp mit Krankheitsverhalten, Atem- und metabolischer Azidose während der ersten 24 Stunden nach der Einleitung, gefolgt von klinischer Genesung trotz erhöhter Marker für Organschädigungen. Die Mechanismen, die diesen Unterschieden zwischen früher und später Induktion zugrunde liegen, sind derzeit unbekannt und stellen ein laufendes Forschungsgebiet dar. Die Glukosehomöostase nach Beginn der parenteralen Ernährung verbessert sich jedoch in den ersten drei postnatalen Tagen bei Frühschweinchen, was trotz ähnlicher Glukoseaufnahme zu einer verminderten Hyperglykämie führt. Insgesamt ermöglicht die Variation des postnatalen Infektionstags und der Glukoseversorgung dem Modell, Merkmale sowohl akuter schwerer als auch lebensbedrohlicher Sepsis oder eines milderen Phänotyps zu erfassen. Zusammen ermöglichen diese Anpassungen das Testen gezielter Interventionen, die auf spezifische Krankheitsphänotypen zugeschnitten sind. Die klinische Anwendbarkeit dieses Modells könnte weiter gestärkt werden, indem es an etablierte sepsisbezogene neonatale Bewertungssysteme wie die neonatale Sequential Organ Failure Assessment (nSOFA) abgestimmt wird. Ein Echtzeit-basiertes nSOFA-basiertes Bewertungssystem wurde in der aktuellen Studie nicht implementiert, da eine kontinuierliche arterielle Blutdruckmessung und sofortige Blutplättchenzählungen für kardiovaskuläre und hämatologische Wertung unmöglich sind. Künftige Verfeinerungen des Protokolls könnten ein angepasstes nSOFA-Framework integrieren, um die Schwere der Krankheit besser zu kategorisieren.

Trotz seiner translationalen Stärken hat dieses Modell mehrere wichtige Einschränkungen. Diese Experimente sind ressourcenintensiv und erfordern spezialisierte Einrichtungen und hochqualifiziertes Personal für Kaiserschnitte, Neugeborenenwiederbelebung, postnatale Unterbringung und die Betreuung von Frühgeborenen. Infektionsexperimente erfordern zudem eine kontinuierliche, praktische Überwachung durch zwei bis drei erfahrene Mitarbeiter, um das Tierwohl und eine zuverlässige Datenerhebung sicherzustellen, und langfristige Nachverfolgung erhöht die Kosten. Im Vergleich zu Nagetiermodellen ist die Verfügbarkeit artspezifischer Reagenzien begrenzter, insbesondere für Immunhistochemie und Durchflusszytometrie, obwohl viele menschliche Antikörper nach geeigneter Validierung erfolgreich verwendet werden können. Darüber hinaus führt die Rassenatur der Schweine zu erheblichen biologischen Unterschieden innerhalb und zwischen Wurfen, was größere Gruppengrößen erfordert, um moderate Unterschiede in den Infektionsreaktionen zu erkennen. Während diese Variabilität die experimentelle Komplexität erhöht, spiegelt sie auch die Heterogenität in klinischen neonatalen Populationen besser wider und erhöht so die translationale Relevanz des Modells. Abschließend lässt sich sagen, dass dieses validierte Protokoll für neonatale Sepsis ein nützliches Werkzeug für zukünftige Untersuchungen in der Neonatologie und zum Testen neuartiger präventiver und therapeutischer Interventionen sein wird.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von Mitarbeitern der Gruppe Vergleichende Pädiatrie der Universität Kopenhagen unterstützt und von der Novo Nordisk Foundation (NNF23OC0085457 und NNF22OC0078747) finanziert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
 0,1–10 μL Pipettenspitzen “Optifit”Sartorius790010
1 mL Einwegspritzen (steril)e-power150001S
1 mL Spritze mit 25 G X 16 mm Nadel (steril)B. Braun Melsungen AG9161465V
1,5 mL RöhrchenEppendorf30125215
10 mL Einwegspritze (steril)e-power150010S
100 mL ErlenmeyerkolbenDuran Wheaton Kimble212162403
1000 μL PipetteSartorius 46880171
12 G “Intraflon 2” Nadeln (steril)Vygon122.27
16 G X 40 mm “Microlance 3” Nadeln (steril)Becton Dickinson300637
18 G X 40 mm “Microlance 3” Nadeln (steril)Becton Dickinson303262
19 G X 40 mm “Sterican” Nadeln (steril)B. Braun Melsungen AG466 5112
2 mL Einwegspritze (steril)e-power150002S
2-0 70 cm Naht “ Vicryl plus” (steril)Johnson & Johnson  VCP453
20 G X 25 mm “Microlance 3” Nadeln (steril)Becton Dickinson304827
20 mL Einwegspritze (steril)e-power150020S
20 μL PipetteSartorius46886095
200 μL PipetteSartorius39486615
20G Venflon "Pro" 1,1 x 32 mmBeckton Dickinson393255
21 G x 25 mm Vacutainer Blutentnahmenadeln (steril)Becton Dickinson301746
21 G X 40 mm “Sterican” Nadeln (steril)B. Braun Melsungen AG4665643
22 G X 50 mm “Microlance 3” Nadeln (steril)Becton Dickinson300094
23 G X 25 mm “Medoject” Nadeln (steril)Chirana T. InjectaCH23100
25 G X 16 mm “Microlance 3” Nadeln (steril)Beckton Dickinson300600
25 G X 25 mm “Sterican” Nadeln (steril)B. Braun Melsungen AG9186158
25 mL Kunststoffpipetten (steril)LP Italian Spa162510
30 mL Einwegspritzen (steril)e-power150030S
4L Kunststoff-GefrierbeutelCater.LineABN-105004
5–350 μL Pipettenspitzen “Optifit”Sartorius790350
5 mL Einwegspritze (steril)e-power150005S
5 mL Spritze (steril) B. Braun Melsungen AG4617053V
50–1200 μL Pipettenspitzen “Optifit”Sartorius791200
50 mL Luer Lock Original Perfusor Spritze B. Braun Melsungen AG8728844F-06
50 mL Röhrchen (steril)Sarstedt AG and Co. KG62.547.254
82% Ethanol + 0,5% Chlorhexidin DesinfektionstücherMediq527497
Atropin "ATROpin" 1 mg/mLAmgros741124
Verbandschere, rostfreier Stahl, 180 mmB. Braun Melsungen AGBC849R
Blutgasmessgerät ABL90Radiometer994-667 (Servicehandbuch)
Brain Heart Infusion Brühe (BHI/B)EigenproduktionN.A. Handelsübliches äquivalentes Produkt: Brain Heart Infusion Broth (Merck, Kat.-Nr. 53286)
Butorphanol "Butomidor vet" 10 mg/mLVetViva Richter53 19 43
Zellkulturinkubator “HeraCell 150i”Thermo Fisher Scientific51032719
Zentrifuge, Rotina 380 RHettich 1701
Klinisch-chemisches System “Advia 2120i”Siemens Healthcare GmbH10488923
Verschlusskegel “Combi-Stopper” (steril)B. Braun Melsungen AG4495101
Columbia-Agar + 5% Schafsblut PlattenBioRad63784
Einweg-Softunterlagen, Abri-Soft classicAbena4115
Doxapram-V 20 mg/mLDechra34144/G
EDTA 3 mL Entnahmeröhrchen (steril)Becton Dickinson368856
Endotrachealtubus (12 mm x 55 cm, 150 cc), Silikon, cuffiertMilaGVPmL-METC955
Enterale Ernährungssonde 04Fr-L.40cm - PVC (steril)Vygon310.04Verwendet als Nabelarterienkatheter
Ethanol 70% VWR83801.36
Verlängerungsleitung “Q-Style” (steril)Becton Dickinson385151
Sauerstoff-DurchflussmesserDamecaP/N 32018

Referenzen

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