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Methodenartikel

Zeitraffer-Bildgebung der antikörpergesteuerten Phagozytose von grün fluoreszenzproteinmarkierten triple-negativen Brustkrebszellen durch Makrophagen

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DOI:

10.3791/71461

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14. August 2026

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1Department of Surgery, National Taiwan University Hospital, 2School of Chinese Medicine, China Medical University, 3Graduate Institute of Biomedical Science, China Medical University, 4Chinese Medicine Research Center, China Medical University, 5Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Zeitrafferaufnahme-Methode zur Live-Cell-Bildgebung, um die antikörperabhängige Phagozytose grün fluoreszierend markierter triple-negativer Brustkrebszellen durch aus peripheren mononukleären Blutzellen abgeleitete Makrophagen mithilfe eines automatisierten Mikroskops zu visualisieren.

Zusammenfassung

Die antikörperabhängige zelluläre Phagozytose ist ein zentraler Mechanismus, durch den Makrophagen Antikörper-opsonierte Krebszellen aufnehmen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode der Zeitrafferaufnahme an lebenden Zellen, um die antikörperabhängige Phagozytose grün fluoreszierend markierter, CD24-exprimierender triple-negativer Brustkrebszellen durch Makrophagen sichtbar zu machen. Die Makrophagen werden aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen gewonnen, mit Makrophagen-Koloniestimulierendem Faktor differenziert und mittels Interferon-gamma und Lipopolysaccharid polarisiert, um ein proinflammatorisches Phänotyp zu erzeugen. Vor der Kokultur mit Makrophagen in einem definierten Effektor-zu-Target-Verhältnis werden die Krebszellen mit einem monoklonalen Anti-CD24-Antikörper opsoniert. Phagozytosevorgänge werden über einen Zeitraum von 16 Stunden mithilfe eines automatisierten Mikroskops mit Umweltkontrolle zur Aufrechterhaltung physiologischer Bedingungen aufgezeichnet. Die Aufnahmen erfolgen in Hellfeld- und Fluoreszenzkanälen, wodurch die Identifizierung der Krebszellen und die Beobachtung ihrer Internalisierung durch Makrophagen ermöglicht wird. Repräsentative Zeitrafferbilder zeigen die fortschreitende Aufnahme fluoreszierender Krebszellen im Zeitverlauf. Zur quantitativen Bewertung wird ein paralleler Endpunkt-Assay unter identischen Kokulturbedingungen durchgeführt, bei dem nicht internalisierte Krebszellen vor der Bildaufnahme entfernt werden, um eine genaue Quantifizierung der Phagozytosevorgänge zu ermöglichen. Diese Methode bietet einen standardisierten und reproduzierbaren Ansatz zur Visualisierung der antikörpervermittelten Makrophagenphagozytose in vitro. Insbesondere ermöglicht die Kombination von Zeitrafferaufnahmen mit der quantitativen Endpunktanalyse eine komplementäre Beurteilung der Kinetik und des Ausmaßes der Phagozytose. Dieses Protokoll unterstützt die Evaluierung therapeutischer Antikörper und makrophagengerichteter Krebsimmuntherapien in einem kontrollierten in-vitro-System.

Einleitung

Brustkrebs ist weltweit die häufigste bei Frauen diagnostizierte maligne Erkrankung und macht jährlich etwa 2,3 Millionen neue Fälle aus1. Die Erkrankung ist klinisch heterogen und wird basierend auf dem Status der Hormonrezeptoren – Östrogenrezeptor (ER) und Progesteronrezeptor (PR) – sowie der Expression des Onkogens humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) in mindestens vier wichtige molekulare Subtypen eingeteilt2. Luminal-A-Tumoren exprimieren ER und/oder PR ohne HER2-Überexpression (ER/PR+ und HER2−); Luminal-B-Tumoren exprimieren sowohl ER/PR als auch HER2 (ER/PR+ und HER2+); HER2+-Tumoren zeichnen sich durch eine hohe HER2-Expression unabhängig vom Hormonrezeptorstatus aus; und der triple-negativen Brustkrebs (TNBC) weist keinen Nachweis aller drei Marker auf (ER−, PR− und HER2−)2,3. Unter diesen Subtypen stellt TNBC die klinisch herausforderndste Form dar und macht etwa 15–20 % aller Brustkrebsfälle aus. Patientinnen mit TNBC weisen den aggressivsten Krankheitsverlauf auf, mit der schlechtesten Prognose und der kürzesten Überlebensrate innerhalb von fünf Jahren, bedingt durch schlechte Ansprechen auf herkömmliche Chemotherapien und das Fehlen wirksamer zielgerichteter Therapien3,4. Darüber hinaus zeigt TNBC eine signifikant hohe Neigung zu viszeralen Metastasen, insbesondere zu den Lungen innerhalb von fünf Jahren nach der Diagnosestellung, und Patientinnen mit fortgeschrittenem oder metastasierendem TNBC (mTNBC) haben eine mediane Überlebensdauer, die selten zwei Jahre überschreitet5,6. Diese Statistiken unterstreichen die dringende, bisher unerfüllte Notwendigkeit neuer therapeutischer Strategien für TNBC.

Die Tumormikroumgebung (TME) spielt eine entscheidende Rolle bei der Progression von Brustkrebs und der Immunvermeidung. Tumorzugeordnete Makrophagen gehören zu den häufigsten Immunzellen innerhalb der TME und wurden kürzlich als entscheidende Vermittler der angeborenen Anti-Tumor-Immunität anerkannt7,8,9. Während TAMs historisch in proinflammatorische „M1“- und protumorale „M2“-Zustände unterteilt wurden, vermag dieses binäre Modell die tatsächliche Heterogenität der Makrophagen nicht abzubilden. Vielmehr besetzen TAMs ein dynamisches funktionelles Spektrum, das sich als Reaktion auf die vielfältigen biochemischen Signale innerhalb der TME entwickelt. In diesem komplexen Umfeld unterwandern Krebszellen aktiv die Makrophagenaktivität durch verschiedene Strategien der Immunvermeidung, insbesondere durch die Überexpression von „nicht fressen“-Signalen. Die CD47/SIRPα-Achse war in diesem Zusammenhang der erste identifizierte Checkpoint der angeborenen Immunität6,10; kürzlich hat sich CD24 als neuartiges und starkes antiphagozytäres Signal erwiesen11,12. CD24 ist ein kleines, stark glykosyliertes, mucinartiges Glykoprotein, das über eine glycosylphosphatidylinositolartige Verankerung an der Zellmembran haftet13. Unter physiologischen Bedingungen wird CD24 in verschiedenen Immunzelllinien exprimiert, ist jedoch häufig in soliden Tumoren überexprimiert, darunter Brust-, Eierstock-, Pankreas- und kolorektale Karzinome14. Auf Tumorzellen bindet CD24 an den inhibitorischen Rezeptor Sialinsäure-bindendes immunglobulinähnliches Lektin 10 (Siglec-10), der auf Makrophagen exprimiert wird. Diese Interaktion löst die Phosphorylierung der immuntypischen Tyrosin-basierten inhibitorischen Motivdomänen im zytoplasmatischen Schwanz von Siglec-10 aus und aktiviert dadurch die Phosphatasen SHP-1 und SHP-2, welche die nachgeschaltete phagozytäre Signalübertragung unterdrücken11. Die Blockade der CD24/Siglec-10-Interaktion mittels monoklonaler Antikörper hat sich als wirksame Maßnahme erwiesen, um die Phagozytose von CD24-exprimierenden menschlichen Tumoren durch Makrophagen deutlich zu verstärken. In einer kürzlich durchgeführten Studie zeigten wir außerdem, dass der Knockout von CD24a in Brustkrebszellen deren Anfälligkeit für die phagozytäre Aufnahme durch Makrophagen in einem murinen Modell des triple-negativen Brustkrebs erhöht9.

Die antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP) ist ein zentraler Mechanismus, durch den Antikörper Makrophagen anweisen, Tumorzellen zu phagozytieren15,16. Nach Bindung an auf Tumorzellen exprimierte Antigene erkennt die Fc-Region des Antikörpers Fcγ-Rezeptoren (FcγR) auf Makrophagen und löst dadurch intrazelluläre Signalwege aus, die in einer Umorganisation des Zytoskeletts, der Bildung einer phagozytotischen Mulde und dem Einhüllen der Zielzelle münden17.

In dieser Studie haben wir ein Zeitrafferaufnahmeverfahren für die Live-Cell-Bildgebung entwickelt und validiert, um die antikörpervermittelte Phagozytose von Brustkrebszellen durch Makrophagen zu messen. Die Methode verwendet aus peripheren mononukleären Blutkörperchen (PBMCs) von gesunden menschlichen Spenderinnen und Spendern stammende Makrophagen, die mit makrophagenkoloniestimulierendem Faktor (M-CSF) differenziert und anschließend mit Lipopolysaccharid (LPS) und Interferon-Gamma (IFN-γ) stimuliert werden. Die Durchflusszytometrie bestätigte die Hochregulation von CD80 innerhalb der CD11b⁺-Population nach Stimulation (Abbildung 1), was das klassisch aktivierte Phänotyp unterstützt. Dieser Aktivierungszustand verleiht eine starke antikörpervermittelte phagozytische Kapazität und eignet sich daher gut zur Beurteilung der antikörperabhängigen zellulären Phagozytose (ADCP). GFP-markierte CD24-positive Brustkrebszellen dienen als Zielzellen und werden vor der Kokultur mit einem therapeutischen anti-CD24 monoklonalen Antikörper opsonisiert. Phagozytische Ereignisse werden über einen Zeitraum von 16 Stunden mithilfe eines automatisierten Mikroskops unter kontrollierten Umweltbedingungen aufgezeichnet. Um eine quantitative Bewertung parallel zur dynamischen Visualisierung zu ermöglichen, wird ein separates Endpunkt-Assay unter identischen Kokulturbedingungen durchgeführt, wodurch eine exakte Messung der Phagozytose nach Entfernung nicht internalisierter Zielzellen möglich ist. Dieses Protokoll bietet eine standardisierte, reproduzierbare und visuell informative Plattform zur Beurteilung der durch einen anti-CD24-Antikörper vermittelten ADCP. Wichtig ist, dass die Kombination von Zeitrafferaufnahmen mit einer komplementären, auf Endpunkten basierenden Quantifizierungsstrategie die gleichzeitige Evaluierung von Phagozytosekinetik und -ausmaß ermöglicht. Die Methode kann angepasst werden, um andere makrophagengerichtete immuntherapeutische Zielstrukturen zu untersuchen. Dieses Protokoll eignet sich am besten zur Beurteilung der ADCP, die durch therapeutische monoklonale Antikörper gegen Oberflächenantigene auf Krebszellen vermittelt wird. Es ist gut geeignet für den vergleichenden Screening von Kandidatenantikörpern, die Charakterisierung von Dosis-Wirk-Beziehungen sowie für mechanistische Studien zur Bindung zwischen Fc und FcγR, einschließlich der Effekte der Blockade von „Nicht-fress-mich“-Signalen (z. B. CD47–SIRPα). Da der Assay primäre humane Makrophagen verwendet, eignet er sich auch für translationsmedizinische Studien, bei denen die Variabilität zwischen Spenderinnen und Spendern vor der klinischen Entwicklung bewertet werden muss.

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Abbildung 1. Erzeugung und Validierung mittels Durchflusszytometrie von aus peripheren mononukleären Blutzellen abgeleiteten, mit IFN-γ/LPS stimulierten Makrophagen. Oberes Feld: Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) werden aus Vollblut gesunder Spender durch Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von Ficoll-Lösung bei 400 × g für 30 min bei 20 °C isoliert, wobei alle Reagenzien zuvor auf 20 °C ± 2 °C vorgeglichen wurden. Die isolierten PBMCs werden 7 Tage lang in ImmunoCult-SF-Medium, ergänzt mit 100 ng/mL makrophagenkoloniestimulierendem Faktor (M-CSF), kultiviert, um die Differenzierung zu Makrophagen zu induzieren (Tag 0–7), wobei am Tag 5 eine erneute Mediumzugabe erfolgt. Am Tag 8 werden die differenzierten Makrophagen 48 h lang mit 100 ng/mL IFN-γ und 1 µg/mL LPS stimuliert (Tag 8–10). Anschließend werden die Zellen einer Durchflusszytometrie-Analyse unterzogen. Unteres Feld: Durchflusszytometrische Analyse der Makrophagen. Die Zellen wurden mit einem Oberflächenantikörperset bestehend aus CD11b-FITC, CD80-PE und CD206-PerCP-Cy5.5 gefärbt und vor der Messung mit DAPI versetzt, um tote Zellen auszuschließen. Gating-Strategie: Zunächst erfolgte die Auswahl lebender Zellen (DAPI⁻), gefolgt von der Identifizierung von CD11b⁺-Zellen in einem CD11b-FITC- vs. FSC-A-Diagramm zur Bestätigung der Makrophagen-Identität. Anschließend wurden die lebenden CD11b⁺-Ereignisse in einem CD80- vs. CD206-Dotplot analysiert, um die durch IFN-γ/LPS-Stimulation induzierte CD80⁺CD206⁻-Population nachzuweisen. Rechts: Repräsentativer Dotplot von CD11b-FITC vs. FSC-A, der zeigt, dass 99,8 % der selektierten Zellen CD11b⁺ waren und somit die Makrophagen-Identität bestätigt wird. Links: Der Großteil der CD11b⁺-Zellen befand sich innerhalb des CD80⁺CD206⁻-Gates (Q1: 95,2 %), was das erwartete proinflammatorische Phänotyp unter den angewendeten Stimulationsbedingungen anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Anwender sollten mehrere Einschränkungen berücksichtigen, wenn sie diese Technik anwenden. Erstens kann die Spendervariabilität bei aus PBMCs abgeleiteten Makrophagen eine erhebliche Varianz der phagozytotischen Aktivität verursachen; wir empfehlen daher die Verwendung mehrerer Spender (n ≥ 3), wobei die Einzeldaten der Spender zusammen mit den gepoolten Ergebnissen angegeben werden sollten. Zweitens bildet das 2D-Kokultursystem die Tumormikroumgebung nicht vollständig ab, und die Ergebnisse sollten vor klinischer Interpretation in 3D- oder In-vivo-Modellen validiert werden. Drittens erfasst das 16-stündige Bildaufnahmeintervall frühe phagozytotische Ereignisse, spiegelt jedoch keine langfristigeren Prozesse wie die Antigenpräsentation oder die sekundäre Immunaktivierung wider. Daher bietet die kombinierte Anwendung von Echtzeit-Bildgebung und Endpunkt-Quantifizierung ein ergänzendes Rahmenwerk, das die Interpretierbarkeit und Reproduzierbarkeit von ADCP-Messungen verbessert.

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Protokoll

Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von primären Makrophagen, die aus Blutproben gesunder Spender gewonnen wurden. Die Sammlung und Aufbereitung der Proben erfolgte gemäß den Richtlinien der Institutional Review Board (IRB) der China Medical University.

1. Herstellung von PBMC-abstammenden Makrophagen

HINWEIS: Führen Sie alle Verfahren mit menschlichem Blut unter Genehmigung der zuständigen institutionellen IRB (z. B. CMUH IRB) durch. Ziehen Sie vor der Blutentnahme die informierte Einwilligung gesunder Spender ein.

ACHTUNG: Alle menschlichen Blutprodukte unter Bedingungen der Sicherheitsstufe 2 unter Anwendung universeller Vorsichtsmaßnahmen handhaben.

  1. Blutentnahme
    1. Entnehmen Sie Vollblut von einem gesunden Spender in 10 mL mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) beschichtete Vakuumröhrchen.
  2. Blutverdünnung
    1. Verdünnen Sie das Vollblut im Verhältnis 1:1 mit eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; Ca2⁺-/Mg2⁺-frei) (z. B. 10 mL Blut + 10 mL PBS).
    2. Mischen Sie durch dreimaliges bis fünfmaliges Vorsichtig Umkippen.
      HINWEIS: Halten Sie PBS vor der Verwendung auf Eis. Die kalte Temperatur hilft, die Zellviabilität während der Verarbeitung zu erhalten.
  3. Überlagerung mit Dichtegradient
    1. Schichten Sie das verdünnte Blut vorsichtig im Volumenverhältnis 2:1 (v/v) über Ficoll–Paque PLUS in ein kegelförmiges Reaktionsgefäß (z. B. 8 mL Blut über 4 mL Ficoll in einem 15 mL-Röhrchen oder 30 mL über 15 mL in einem 50 mL-Röhrchen).
    2. Stellen Sie vor der Überlagerung sicher, dass sowohl das verdünnte Blut als auch Ficoll–Paque PLUS eine Temperatur von 20 °C ± 2 °C aufweisen.
    3. Nehmen Sie Ficoll–Paque PLUS mindestens 30 Minuten vor der Verwendung aus dem 4 °C-Kühlschrank heraus oder erwärmen Sie es kurz in einem Wasserbad mit 20 °C ± 2 °C.
    4. Verwenden Sie keine kalten Reagenzien, da die Dichte von Ficoll für 20 °C ± 2 °C kalibriert ist und Abweichungen die Trennleistung und die Ausbeute an PBMCs beeinträchtigen.
      HINWEIS: Kippen Sie das Röhrchen unter einem Winkel von 45° und pipettieren Sie das Blut langsam entlang der Wand, um eine scharfe Grenzfläche zu erhalten. Stören Sie die Ficoll-Schicht nicht.
  4. Zentrifugation
    1. Zentrifugieren Sie 30 Minuten bei 400 × g und 20 °C ohne Bremse (Abbildung 1).
      HINWEIS: Das Einschalten der Bremse stört den Dichtegradienten und verringert die PBMC-Ausbeute.
  5. Sammlung der PBMCs
    1. Aspirieren Sie vorsichtig nur die Buffy-Coat-Schicht (die weißliche Grenzfläche zwischen Plasma- und Ficoll-Schicht), ohne das überstehende Plasma oder die darunterliegende Ficoll-Schicht zu stören, mithilfe einer serologischen Pipette.
    2. Überführen Sie die gesammelte Schicht in ein neues 50 mL kegelförmiges Reaktionsgefäß.
  6. Waschen der PBMCs
    1. Fügen Sie PBS hinzu, um in einem 50 mL kegelförmigen Reaktionsgefäß ein Gesamtvolumen von 25 mL zu erreichen.
    2. Verwenden Sie ein 50 mL-Röhrchen, um eine ordnungsgemäße Zentrifugation und Auswuchtung zu gewährleisten.
    3. Zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 300 × g.
  7. Lysieren der roten Blutkörperchen (RBCs)
    1. Entfernen Sie den Überstand.
    2. Suspendieren Sie das Pellet durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mit einer serologischen Pipette in 5 mL Lysispuffer für rote Blutkörperchen (RBC-Lysispuffer), bis das Pellet vollständig dispergiert ist und keine sichtbaren Klumpen mehr vorhanden sind.
    3. Inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur.
      ACHTUNG: Eine vollständige Dispersion ist erforderlich, um eine gleichmäßige Lyse sicherzustellen; vermeiden Sie jedoch starkes Pipettieren oder Vortexen, da dies die PBMCs beschädigen kann. Überschreiten Sie keine Inkubationszeit von 5 Minuten mit dem RBC-Lysispuffer, da eine längere Exposition die Viabilität der PBMCs beeinträchtigen könnte.
  8. Einpelletieren der PBMCs
    1. Zentrifugieren Sie 5 Minuten bei 500 × g, um die PBMCs zu pelletieren und lysiertes RBC-Material zu entfernen.
  9. Endgültige Resuspension
    1. Entfernen Sie den Überstand.
    2. Suspendieren Sie das Pellet in 5 mL ImmunoCult-SF-Makrophagenmedium.
      HINWEIS: Unter Standardbedingungen ergibt sich aus 10 mL Vollblut typischerweise eine Ausbeute von 1,5–2,0 × 107 PBMCs.

2. Differenzierung von Makrophagen (Tag 0–7)

HINWEIS: Verwenden Sie Petrischalen, die nicht für die Gewebekultur (TC) behandelt wurden, um differenzierte Makrophagen, die aus Monozyten durch Adhärenz entstehen, mittels Adhärenz anzureichern. Nicht-anklebende Lymphozyten werden in der anschließenden Kultur ausgewaschen.

  1. Tag 0: Zellansaat
    1. Führen Sie eine Zellzählung durch und säen Sie 1 × 107 PBMCs in eine nicht TC-behandelte 10-cm-Petri-Schale aus.
    2. Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 10 mL mit ImmunoCult-SF-Makrophagenmedium, das mit 100 ng/mL M-CSF ergänzt wurde (hergestellt durch direktes Zugabe des M-CSF-Stammlösung zum vollständigen Medium unmittelbar vor der Verwendung und Mischen durch vorsichtiges Umstülpen).
      HINWEIS: Das Protokoll kann proportional skaliert werden, um Variationen in der PBMC-Ausbeute des Spenders zu berücksichtigen, wobei eine Ansiedlungsdichte von 1 × 106 Zellen/mL als Ausgangsbasis dient.
  2. Inkubation und Überwachung
    1. Inkubieren Sie bei 37°C mit 5 % CO₂ in einem befeuchteten Inkubator.
    2. Überwachen Sie täglich die Bildung schwimmender Monozyten-Cluster und das Auftreten adhärenter Zellen.
      HINWEIS: Die Monozyten nehmen allmählich an Größe zu und bilden Cluster, während die Differenzierung fortschreitet. Einige Monozyten beginnen, sich an der Platte anzulagern. In diesem Schritt ist kein Eingriff erforderlich.
  3. Tag 5: Mediumnachsupplementierung
    1. Geben Sie vorsichtig 5 mL frisches ImmunoCult-SF-Makrophagenmedium, ergänzt mit 100 ng/mL M-CSF, hinzu, wobei darauf geachtet werden muss, die adhärenten Makrophagen nicht zu stören.
    2. Setzen Sie die Kultur weitere 2 Tage fort (bis Tag 7).
      ACHTUNG: Frisches Medium vorsichtig entlang der Seite der Schale hinzufügen, um die adhärenten Makrophagen nicht zu stören, da mechanische Störungen die Differenzierungseffizienz und Zellausbeute beeinträchtigen können.
      HINWEIS: Vermeiden Sie das Ersetzen des Mediums, um autokrine/parakrine Faktoren zu erhalten, die die Makrophagendifferenzierung unterstützen.
  4. Tag 7: Morphologische Beurteilung
    1. Überprüfen Sie die Effizienz der Makrophagendifferenzierung unter einem invertierten Mikroskop.
    2. Adhärente Zellen zeigen eine charakteristische Makrophagenmorphologie: groß, abgeflacht und unregelmäßig geformt, mit sichtbaren Pseudopodien.
    3. Am Tag 7 sollten gut differenzierte Makrophagen sichtbar sein.
      ACHTUNG: Die morphologische Beurteilung am Tag 7 dient als entscheidende Voraussetzung für die anschließende Validierung mittels Durchflusszytometrie. Gut differenzierte Makrophagen sollten deutlich unter dem Mikroskop erkennbar sein; ein höherer Anteil adhärenter Zellen mit Makrophagenmorphologie deutet auf eine größere Differenzierungseffizienz hin (eine Konfluenz von etwa 70 % adhärenter Makrophagen mit charakteristischer Morphologie gilt als Hinweis auf eine erfolgreiche Differenzierung). Kulturen mit geringer Adhärenz, überwiegend runden Zellen oder sonst schlechter morphologischer Differenzierung werden voraussichtlich keine zuverlässigen Ergebnisse in der Durchflusszytometrie liefern und sollten nicht zur Stimulation und Färbung weiterverarbeitet werden.

3. Makrophagen-Polarisierung (Tage 8–10)

  1. Sammlung und Klärung des konditionierten Mediums
    1. Am Tag 8 das 15 mL Medium vorsichtig aus der Kulturschale aspirieren, ohne die anhaftenden Makrophagen zu stören, und in ein steriles 50 mL-Konischglas überführen.
    2. Das gesammelte Medium 5 min bei 400 × g zentrifugieren, um Zelltrümmer zu pelletieren.
    3. Das geklärte Überstand für den nächsten Schritt aufbewahren.
  2. Stimulation mit Interferon-gamma (IFN-γ) und Lipopolysaccharid (LPS)
    1. Das geklärte 15 mL-Überstand in ein neues steriles Gefäß überführen und mit 100 ng/mL IFN-γ sowie 1 µg/mL LPS anreichern.
    2. Sorgfältig durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren (5–10 Mal) mischen, um eine gleichmäßige Zytokilverteilung sicherzustellen, ohne Blasen einzuschließen.
    3. Das gesamte 15 mL Zytokin-angereicherte Medium zurück in die ursprüngliche Kulturschale geben, dabei sanft entlang der Innenwand pipettieren, um die anhaftenden Makrophagen nicht zu stören.
    4. 48 h bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren (Tag 8 bis Tag 10).
      HINWEIS: Konditioniertes (altes) Medium verwenden, um autokrine/parakrine Faktoren zu erhalten. Die Kombination aus IFN-γ und LPS dient zur Polarisation der Makrophagen in ein proinflammatorisches Phänotyp. Unter den in diesem Protokoll verwendeten Stimulationsbedingungen mit IFN-γ (100 ng/mL) und LPS (1 µg/mL) zeigen Makrophagen charakteristische morphologische Veränderungen, einschließlich verlängerter Lamellipodien, die mit einem aktivierten proinflammatorischen Zustand einhergehen, sowie die Expression von CD11b und CD80.
      VORSICHT: LPS unter Beachtung der geeigneten Laborsicherheitsmaßnahmen handhaben, da es sich um ein bioaktives Endotoxin handelt, das bei Exposition entzündliche Reaktionen auslösen kann.

4. Bestätigung der Marker für das entzündliche Phänotyp von IFN-γ- und LPS-stimulierten Makrophagen mittels Durchflusszytometrie

  1. Zellgewinnung
    1. Gewinnen Sie am Tag 10 einen Teil der polarisierten Makrophagen zur Phänotypisierung.
    2. Fügen Sie 10 mM EDTA in PBS hinzu und inkubieren Sie 10–15 min bei 37 °C.
    3. Lösen Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren.
      HINWEIS: Verlängern Sie die Inkubation mit EDTA bei 37 °C um weitere 30 min, falls die Zellen weiterhin adhärent sind, und wiederholen Sie anschließend das vorsichtige Pipettieren. Vermeiden Sie kräftiges Pipettieren oder mechanisches Abkratzen, um die Zellviabilität und Integrität der Oberflächenmarker zu erhalten.
  2. Antikörper-Färbungsvorbereitung
    1. Färben Sie die Zellen mit fluorochrom-konjugierten Antikörpern gegen CD11b (Pan-Makrophagen-Linienmarker), CD80 (Entzündungsmarker) und CD206 (anti-inflammatorischer Marker, der als negativer Ausschlussmarker zur Identifizierung des inflammatorischen Phänotyps verwendet wird).
  3. Färbeprozedur
    1. Überführen Sie 5 × 105 abgelöste Makrophagen in ein Durchflusszytometrie-Röhrchen mit 100 µL kaltem PBS.
    2. Fügen Sie CD11b-FITC-, CD80-PE- und CD206-PerCP-Cy5.5-Antikörper jeweils auf eine Endkonzentration von 1 µg/mL hinzu.
    3. Mischen Sie die Zellsuspension durch vorsichtiges Pipettieren.
    4. Inkubieren Sie die Proben 1 h auf Eis, lichtgeschützt.
    5. Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 × g für 1 min bei 4 °C.
    6. Aspirieren Sie das Überstandvolumen vorsichtig.
    7. Fügen Sie 0,5 mL kalten PBS hinzu, um das Zellpellet zu waschen.
    8. Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 × g für 1 min bei 4 °C.
    9. Entfernen Sie den Überstand.
    10. Lösen Sie das Zellpellet in 200 µL kaltem PBS auf.
    11. Fügen Sie DAPI auf eine Endkonzentration von 1 µg/mL hinzu.
      HINWEIS: Verwenden Sie geeignete Isotyp-Kontrollen und eine Viabilitätsfarbe (z. B. DAPI oder Viobility 405/452 Fixable Dye).
  4. Durchflusszytometrische Analyse
    1. Analysieren Sie die gefärbten Proben mittels Durchflusszytometrie.
    2. Bestätigen Sie die Expression von CD11b und CD80 in der Makrophagenpopulation.
    3. Fahren Sie mit dem Phagozytose-Assay erst fort, nachdem die Markerexpression den Anforderungen eines inflammatorischen Phänotyps entspricht.
  5. Durchflusszytometrische Datenaufnahme und Geräteeinstellung
    1. Geräteeinstellung
      1. Konfigurieren Sie den Durchflusszytometer mit den folgenden Kanälen: Pacific Blue/V450 (DAPI), FITC (CD11b), PE (CD80) und PerCP-Cy5.5 (CD206).
      2. Stellen Sie den Aufnahmeparameter so ein, dass 10.000 Ereignisse pro Probe innerhalb des definierten Elterntors erfasst werden.
    2. Schwellenwert- und Verstärkungskalibrierung
      1. Öffnen Sie vier Punktdiagramme mit FSC auf der x-Achse und einem Fluorophor-Kanal auf der y-Achse.
      2. Bereiten Sie Zellen vor, die mit entsprechenden Isotyp-Kontroll-Antikörpern für jeden Fluorophor gefärbt wurden.
      3. Analysieren Sie die Isotyp-Kontrollproben.
      4. Passen Sie die Verstärkung jedes Kanals so an, dass die Isotyp-Kontrollpopulation unterhalb von 101 auf der logarithmischen Skala liegt.
      5. Verwenden Sie diese Schwelle zur Definition des Hintergrundsignals.
        HINWEIS: Verwenden Sie einen logarithmischen Bereich von 101 bis 101·5, um eine zuverlässige Trennung zwischen Hintergrund und spezifischem Signal zu gewährleisten.
    3. Kompensation
      1. Fügen Sie einen Tropfen Kompensationsperlen in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen hinzu.
      2. Fügen Sie den entsprechenden fluorophor-konjugierten Antikörper auf eine Endkonzentration von 1 µg/mL hinzu.
      3. Inkubieren Sie 30 min auf Eis, lichtgeschützt.
      4. Zentrifugieren Sie bei 400 × g für 1 min.
      5. Entfernen Sie den Überstand.
      6. Lösen Sie die Perlen in 200 µL kaltem PBS auf.
      7. Analysieren Sie Einzelfarben-Kontrollen.
      8. Wenden Sie spektrale Kompensation an, um Fluorophor-Übersprechen zu korrigieren.
    4. Torgestrategie
      1. Auswahl lebender Zellen
        1. Tragen Sie Pacific Blue/V450 (DAPI) auf der y-Achse und FSC auf der x-Achse ab.
        2. Definieren Sie ein Tor um DAPI-negative Ereignisse (unterhalb von 101), um lebende Zellen auszuwählen.
      2. Identifizierung von Makrophagen
        1. Verwenden Sie die Population lebender Zellen als Elterntor.
        2. Tragen Sie FITC (CD11b) auf der y-Achse und FSC auf der x-Achse ab.
        3. Definieren Sie ein Tor um CD11b⁺-Ereignisse (oberhalb von 101).
      3. Identifizierung des inflammatorischen Phänotyps
        1. Verwenden Sie die CD11b⁺-Population als Elterntor.
        2. Tragen Sie PE (CD80) auf der y-Achse und PerCP-Cy5.5 (CD206) auf der x-Achse ab.
        3. Wenden Sie eine Quadrantentoreinteilung bei 101,5 auf beiden Achsen an.
        4. Identifizieren Sie CD80⁺CD206⁻-Zellen im oberen linken Quadranten (Q1).
  6. Akzeptanzkriterien
    1. Stellen Sie sicher, dass ≥90 % der Zellen innerhalb des CD11b⁺-Elterntors CD80⁺CD206⁻ sind.
    2. Fahren Sie erst mit dem Phagozytose-Assay fort, wenn dieser Schwellenwert erreicht ist.
    3. Wiederholen Sie die PBMC-Isolierung, M-CSF-Differenzierung und IFN-γ/LPS-Stimulation, falls die Proben dieses Kriterium nicht erfüllen.

5. Antikörperabhängiger Phagozytose-Assay

HINWEIS: Überprüfen Sie vor dem Assayaufbau die stabile GFP-Expression in Krebszellen. Bestätigen Sie die CD24-Expression auf Zielzellen vor dem Assay. Verwenden Sie Krebszellen mit 50 %–100 % CD24-Positivität für optimale Ergebnisse. Die in diesem Protokoll verwendeten MDA-MB-468-Zellen weisen 100 % CD24-Positivität auf.

  1. Ansiedlung von Makrophagen
    1. Ansiedeln von IFN-γ- und LPS-stimulierten Makrophagen, wie in Schritt 4 validiert, mit 2 × 105 Zellen pro Vertiefung in einer 24-Loch-Gewebekulturplatte.
    2. Die Platte 12–16 h bei 37 °C unter statischen Bedingungen mit 5 % CO₂ inkubieren, um die Zelladhärenz zu ermöglichen (Abbildung 2A).
      HINWEIS: Stellen Sie eine feste Adhärenz der Makrophagen sicher, bevor Sie fortfahren. Schlecht angeheftete Makrophagen könnten während der Bildaufnahme ablösen und die Ergebnisse verfälschen.
  2. Vorbereitung der Krebszellen
    1. Kultivieren Sie CD24-positive, mit GFP markierte Brustkrebszellen (MDA-MB-468) bis zu einer Konfluenz von 70 %–80 %.
    2. Das Kulturmedium absaugen.
    3. Die Zellmonoschicht einmal mit PBS waschen.
  3. Lösen der Krebszellen
    1. 10 mM EDTA in PBS der Kulturschale hinzufügen.
    2. Die Zellen 5–10 min bei 37 °C inkubieren.
    3. Die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren lösen, um eine vollständige Freisetzung zu erreichen.
      HINWEIS: Verwenden Sie kein Trypsin zur Zelllöse. Enzymatische Verdauung könnte CD24 von der Zelloberfläche spalten und die Antikörperbindung beeinträchtigen.
  4. Sammlung und Zählung der Krebszellen
    1. Die gelösten Zellen in ein Zentrifugenröhrchen sammeln.
    2. Die Zellen 5 min bei 300 × g zentrifugieren.
    3. Den Überstand verwerfen.
    4. Das Zellpellet in komplettem RPMI Medium resuspendieren.
    5. Lebensfähige Zellen zählen.
  5. Antikörper-Opsonierung der Krebszellen
    1. Die Krebszellen in 0,5 mL komplettem RPMI Medium mit einer Dichte von 2 × 105 Zellen/mL resuspendieren.
    2. Den monoklonalen Anti-CD24-Antikörper in einer Endkonzentration von 1 µg/mL hinzufügen.
    3. Die Zellsuspension durch vorsichtiges Pipettieren mischen, um eine gleichmäßige Verteilung des Antikörpers sicherzustellen.
    4. Die Zellen 30 min bei 37 °C unter statischen Bedingungen inkubieren.
      HINWEIS: Als negativen Kontrollansatz für die antikörperabhängige Phagozytose einen isotyp-kompatiblen IgG-Kontrollantikörper in gleicher Konzentration verwenden.
  6. Vorbereitung für die Kokultur
    1. Die Zellen nach der Opsonierung nicht waschen.
    2. Unmittelbar mit der Kokultur fortfahren, um die Antikörperbeschichtung auf der Zelloberfläche aufrechtzuerhalten.
  7. Einrichtung der Kokultur
    1. 1 × 105 mit Antikörpern opsonierte, mit GFP markierte Brustkrebszellen jeder Vertiefung mit Makrophagen hinzufügen.
    2. Ein Effektor-zu-Target-Verhältnis von 2:1 beibehalten.
      HINWEIS: Das Effektor-zu-Target-Verhältnis je nach experimentellem Design anpassen. Um die Häufigkeit des Zell-Zell-Kontakts zu erhöhen und die Detektion phagozytischer Ereignisse zu verbessern, können höhere Makrophagen-zu-Krebszellen-Verhältnisse als das beschriebene 2:1-Verhältnis verwendet werden (z. B. 3:1 oder 5:1).

figure-protocol-1
Abbildung 2. Zeitrafferaufnahmen der antikörperabhängigen zellulären Phagozytose. (A) Schematische Übersicht des Ko-Kultursystems und der Zeitrafferaufnahmen. Die Bildaufnahme erfolgte im 10-minütigen Intervall über eine Gesamtdauer von 16 h (97 Einzelbilder) mit einem 10×-Objektiv unter Verwendung von Phasenkontrast und GFP-Kanal. (B) Repräsentative Zeitrafferaufnahmen von 1 h bis 16 h, die Phagozytoseereignisse zeigen, die sich durch die Internalisierung von GFP-positiven Krebszellen durch Makrophagen im Zeitverlauf auszeichnen. Gelbe gestrichelte Kreise markieren repräsentative Phagozytosevorgänge. Im Phasenkontrastkanal erscheinen die aufgenommenen Krebszellen als phasenhelle intrazelluläre Strukturen im Makrophagenzytoplasma (weiße Pfeile). Im GFP-Kanal bestätigt die Fluoreszenz innerhalb der Makrophagen die Internalisierung. (C) Vergrößerte Ansichten repräsentativer Phagozytoseereignisse zu den Zeitpunkten 0, 1, 4 und 16 h, die den schrittweisen Prozess der Makrophagen-vermittelten Aufnahme GFP-markierter Krebszellen veranschaulichen. Die Bildsequenz wurde aufgrund einer klaren Visualisierung makrophagenvermittelter Phagozytoseereignisse als repräsentativ ausgewählt. Weiße Pfeile zeigen Makrophagen, die mit Zielzellen interagieren und diese internalisieren. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

6. Zeitrafferaufnahmen (automatisiertes Live-Cell-Bildgebungssystem)

HINWEIS: Konfigurieren Sie das Bildgebungsprotokoll mithilfe eines automatisierten Live-Cell-Bildgebungssystems Lionheart und der Software Gen5 für die automatisierte Live-Cell-Bildgebung vor dem Assay. Erhalten Sie eine geeignete Schulung, bevor Sie das Bildgebungssystem bedienen, um eine genaue Einrichtung, optimale Leistung und sichere Anwendung sicherzustellen.

  1. Instrumentenvorbereitung
    1. Schalten Sie das Abbildungssystem, das Umweltkontrollmodul und die CO₂-Gasversorgung mindestens 1 Stunde vor der Bildaufnahme ein.
    2. Öffnen Sie das Umweltkontrollfenster in der Software für automatisierte Live-Cell-Bildgebung.
    3. Stellen Sie die Temperatur auf 37 °C und den CO₂-Gehalt auf 5 % ein.
    4. Vergewissern Sie sich, dass die Kammer temperaturmäßig innerhalb von ± 0,2 °C stabilisiert ist und der CO₂-Gehalt bei 5,0 % ± 0,1 % liegt, bevor Sie die Platte einsetzen.
  2. Plattenvorbereitung
    1. Platzieren Sie die 24-Loch-Platte in die Abbildungskammer des Abbildungssystems.
  3. Erstkonfiguration
    1. Öffnen Sie den Task-Manager der Software für automatisierte Live-Cell-Bildgebung.
    2. Wählen Sie [Imager manueller Modus].
    3. Klicken Sie auf [Jetzt aufnehmen], um die Bildgebungparameter zu initialisieren.
    4. Wählen Sie ein 10×-Objektiv.
    5. Wählen Sie Mikroplatte als Filtereinstellung.
    6. Wählen Sie eine 24-Loch-Platte aus der Plattenbibliothek der Software für automatisierte Live-Cell-Bildgebung.
  4. Fokussierung und Bildaufbau
    1. Wählen Sie den Phasenkontrastkanal.
    2. Wählen Sie ein repräsentatives Loch (z. B. A1).
    3. Aktivieren Sie den Autofokus vor der zeitraffenden Aufnahme.
    4. Nehmen Sie ein Bild mithilfe des Kamerasymbols auf.
    5. Überprüfen Sie die Zellmorphologie und die Fokusqualität.
    6. Navigieren Sie zu [Verarbeiten/Analysieren].
    7. Wählen Sie [Experiment aus einem Bildsatz erstellen], um das Experiment zu konfigurieren.
  5. Parameter für die zeitraffende Aufnahme
    1. Öffnen Sie das Einstellungsfenster [Verfahren].
    2. Stellen Sie die Temperatur auf 37 °C und den CO₂-Gehalt auf 5 % ein.
    3. Legen Sie unter [Kinetic starten] die Laufzeit auf 16:00:00 fest.
    4. Stellen Sie das Bildaufnahmeintervall auf 0:10:00 ein.
    5. Stellen Sie die Gesamtanzahl der Messungen auf 97 ein.
    6. Verwenden Sie ein Bildaufnahmeintervall von 10–15 Minuten, um eine ausgewogene zeitliche Auflösung bei gleichzeitiger Minimierung der Phototoxizität zu erreichen, während frühe phagozytische Ereignisse erfasst werden.
  6. Konfiguration der Bildgebungskanäle
    1. Stellen Sie Kanal 1 auf Phasenkontrast ein.
    2. Stellen Sie Kanal 2 auf GFP (Ex 469/35, Em 525/39) ein.
    3. Wählen Sie ein 10×-Objektiv für ein optimales Sichtfeld und eine optimale Auflösung.
    4. Stellen Sie Beleuchtung, Integrationszeit und Verstärkung auf [Auto] oder passen Sie diese manuell an.
    5. Verwenden Sie eine typische GFP-Belichtungszeit von 100–300 ms, um eine Signalüberlastung zu vermeiden.
    6. Wenden Sie identische Bildgebungseinstellungen auf allen Löchern an.
  7. Einrichtung der Bildpositionen
    1. Öffnen Sie das Menü [Beacons definieren].
    2. Deaktivieren Sie die Z-Stapel-Aufnahme.
    3. Deaktivieren Sie die Montageaufnahme.
    4. Führen Sie die Bildaufnahme in einer einzigen Fokusebene durch.
    5. Definieren Sie die Bildaufnahmepositionen manuell, indem Sie repräsentative, sich nicht überlappende Bereiche in jedem Loch mithilfe des Mikroskopsymbols auswählen.
    6. Behalten Sie identische Bildaufnahmepositionen über alle Zeitpunkte hinweg bei.
    7. Wählen Sie mindestens 4–6 Sichtfelder pro Loch aus.
  8. Zeitraffende Aufnahme
    1. Klicken Sie auf [Abspielen], um die automatisierte zeitraffende Bildaufnahme zu starten.
  9. Datenexport und Visualisierung
    1. Öffnen Sie die gespeicherte Experimentdatei nach Abschluss der Aufnahme.
    2. Wählen Sie die Bildaufnahmepositionen aus.
    3. Exportieren Sie die zeitraffenden Daten im MP4-Format.
    4. Öffnen Sie das [Verarbeitungswerkzeug].
    5. Wenden Sie gegebenenfalls [Bildentfaltung] an, um die Visualisierung zu verbessern und repräsentative Phagozytoseereignisse zu identifizieren.
      HINWEIS: Verwenden Sie die zeitraffende Bildaufnahme ausschließlich zur qualitativen Visualisierung. Nicht-umhüllte GFP-positive Krebszellen können sich mit Makrophagen überlappen oder vorübergehend assoziieren, was zu falsch-positiven Signalen führen kann. Führen Sie quantitative Analysen mithilfe eines separaten Endpunktassays durch.

7. Quantifizierung der Phagozytose zum Versuchsende

  1. Entfernung von nicht-internalisierten Zellen
    1. Führen Sie den Assay unter identischen Co-Kultur-Bedingungen durch.
    2. Beenden Sie das Experiment nach 4 h.
    3. Entfernen Sie das Kulturmedium.
    4. Geben Sie 10 mM EDTA in PBS hinzu.
    5. Inkubieren Sie 5 min bei 37 °C.
    6. Spülen Sie vorsichtig mit PBS, um nicht-internalisierte GFP-positive Zellen zu entfernen.
    7. Geben Sie frisches Makrophagen-Medium hinzu.
  2. Bilddokumentation zur Quantifizierung
    1. Nehmen Sie Bilder unter Verwendung der Phasenkontrast- und GFP-Kanäle auf.
    2. Erfassen Sie mindestens 4–6 Blickfelder pro Mulde.
    3. Analysieren Sie mindestens drei Mulden pro Bedingung.
  3. Definition phagozytotischer Ereignisse
    1. Identifizieren Sie Makrophagen, die vollständig innerhalb der zellulären Grenze liegende GFP-positive Signale enthalten.
  4. Bildanalyse
    1. Öffnen Sie die Bilder in der ImageJ-Software.
    2. Verwenden Sie das Cell Counter-Plugin.
    3. Zählen Sie die Gesamtzahl der Makrophagen.
    4. Zählen Sie die Makrophagen, die internalisierte GFP-positive Zellen enthalten.
  5. Berechnung des Phagozytose-Index
    1. Berechnen Sie: figure-protocol-2
    2. Führen Sie die Analyse verblindet durch.
    3. Wiederholen Sie die Analyse in mindestens drei unabhängigen Experimenten.
  6. Darstellung der Daten
    1. Zeigen Sie repräsentative Zeitrafferbilder chronologisch an (Abbildung 2B und Abbildung 2C).
    2. Zeigen Sie repräsentative Endpunkt-Bilder an (Abbildung 3A und Abbildung 3B).

figure-protocol-3
Abbildung 3. Quantifizierung der antikörperabhängigen Makrophagenphagozytose durch Endpunktanalyse. (A) Repräsentative Phasenkontrast- und GFP-Fluoreszenzbilder von Makrophagen, die vier Stunden lang mit GFP-markierten Brustkrebszellen koinkubiert wurden, gefolgt von der Entfernung nicht phagozytierte Zellen mittels EDTA-Behandlung. Die Phasenkontrast- und GFP-Kanäle wurden überlagert, um Makrophagen und internalisierte GFP-positive Zielstrukturen zu identifizieren. Makrophagen (Zähler 0) und GFP-positive phagozytierende Makrophagen (Zähler 1) wurden mit dem Cell Counter-Plugin in ImageJ gezählt. Unter den IgG-Kontrollbedingungen wurden keine phagozytotischen Ereignisse beobachtet, während die Behandlung mit anti-CD24 monoklonalem Antikörper deutliche intrazelluläre GFP-positive Signale innerhalb der Makrophagen zeigte, was auf aktive Phagozytose hinweist. Maßstab = 200 µm. (B) Quantifizierung des Phagozytoseindex, definiert als Prozentsatz der Makrophagen, die internalisierte GFP-positive Zellen enthalten, bezogen auf die Gesamtpopulation der Makrophagen. Der anti-CD24 monoklonale Antikörper erhöhte den Phagozytoseindex im Vergleich zur IgG-Kontrolle signifikant (0,00 ± 0,00 % vs. 18,76 ± 4,01 %, Mittelwert ± SD; n = 6 Felder pro Gruppe; ***p < 0,001, Welch’s ungepaarter t-Test). Die Daten sind repräsentativ für mindestens drei unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Ergebnisse

Die erfolgreiche Generierung und Polarisation von Makrophagen aus PBMCs wurde mittels morphologischer Beurteilung und Durchflusszytometrie-Analyse bestätigt (Abbildung 1). PBMCs, die durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert wurden, wurden in einem mit M-CSF angereicherten Medium kultiviert, wodurch sich bis zum Tag 7 adhärente Zellen mit charakteristischer Makrophagen-Morphologie bildeten. Nach Stimulation mit IFN-γ und LPS zeigten die Zellen ein Phänotyp, der mit einer Aktivierung unte...

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Diskussion

Mehrere Schritte in diesem Protokoll sind entscheidend, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Erstens beeinflusst die Qualität und Reinheit der PBMC-Isolierung direkt die Ausbeute an Makrophagen und die Differenzierungseffizienz. Ein sorgfältiges Aufschichten verdünnten Blutes auf die Ficoll-Dichtegradienten und die Zentrifugation mit ausgeschalteter Bremse sind unerlässlich, um die Buffy-Coat-Grenzschicht zu erhalten. Unvollständige Erythrozytenlyse oder übermäßige Inkubation mit dem Lysepuffer bee...

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Offenlegungen

Die Autoren geben keinen Interessenkonflikt an.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Cancer Biology and Precision Therapeutics Center der China Medical University im Rahmen des Featured Areas Research Center Programms im Rahmen des Higher Education Sprout Project des Ministeriums für Bildung (MOE) in Taiwan (CBPTC-PROJ-5-2) unterstützt.

Wir danken dem Cancer Biology and Precision Therapeutics Center für die finanzielle Unterstützung und akademische Förderung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-StammlösungSigma-Aldrich (oder gleichwertig)E7889 (oder gleichwertig)Wird zur Herstellung einer 10 mM EDTA-Arbeitslösung in PBS für die Zellablösung verwendet
24-Loch-Gewebekulturplatten (TC-behandelt)Corning (oder gleichwertig)3524Wird für die Kokultur von Makrophagen und Krebszellen während des Phagozytose-Assays verwendet
Anti-humanes CD206-Antikörper (Durchflusszytometrie)BioLegend (oder gleichwertig)321122 (oder gleichwertig)Marker für das alternative Makrophagen-Phänotyp
Anti-humaner monoklonaler CD24-AntikörperThermo Fisher Scientific (oder gleichwertig)MA1-91384 (oder gleichwertig)Wird zum Opsonieren von Krebszellen für die antikörperabhängige Phagozytose verwendet
Automatisiertes Live-Cell-Imaging-System mit Umweltkammer (z. B. Lionheart FX)Agilent Technologies (oder gleichwertig)BioTek Lionheart FX Automated MicroscopeErmöglicht langfristige Zeitrafferaufnahmen unter kontrollierten Temperatur- und 2-Bedingungen
Bildgebungssoftware für automatisiertes Live-Cell-Imaging (z. B. Gen5)Agilent Technologies (oder gleichwertig)N/VWird zur Aufnahme und Analyse von Zeitrafferaufnahmen verwendet
Zentrifuge (Schwenkkorbrotor)Thermo Fisher Scientific (oder gleichwertig)Multifuge X4R Pro mit TX-1000-Rotor (oder gleichwertig)Wird für die PBMC-Isolierung und Zellwaschschritte verwendet
2-Inkubator (37°C, 5 % 2)Thermo Fisher Scientific (oder gleichwertig)Forma Direct Heat 2-Inkubator (oder gleichwertig)Sichert physiologische Bedingungen für die Zellkultur
2-Gasversorgung mit DruckreglerAgilent Technologies (oder gleichwertig)N/VLiefert 2 für die Umweltsteuerung im Inkubator und im Imaging-System
Kegelröhrchen (15 mL und 50 mL)Corning (oder gleichwertig)352070 (oder gleichwertig)Wird für PBMC-Isolierung, Waschen und Zentrifugationsschritte verwendet
EDTA-beschichtete Blutentnahmeröhrchen (Vacutainer)BD Biosciences (oder gleichwertig)367863 (oder gleichwertig)Wird zur Entnahme von Vollblutproben von Spendern verwendet
Ficoll-Paque PLUSCytiva (oder gleichwertig)17144003 (oder gleichwertig)Dichtegradientenmedium zur Isolierung von PBMCs
Durchflusszytometer (z. B. FACSCanto II)BD Biosciences (oder gleichwertig)BD FACSCanto II Wird für die phänotypische Analyse von Makrophagen verwendet
Kompensationsperlen (Durchflusszytometrie)Biolegend (oder gleichwertig)424602Wird für Einzelfarben-Kompensationskontrollen verwendet
FITC-markierter anti-humaner CD11b-Antikörper (Durchflusszytometrie)BioLegend (oder gleichwertig)101205 (oder gleichwertig)Marker zur Identifizierung von Makrophagen
PE-markierter anti-humaner CD80-Antikörper (Durchflusszytometrie)BioLegend (oder gleichwertig)375410 (oder gleichwertig)Marker, der mit dem aktivierten Makrophagen-Phänotyp assoziiert ist
GFP-exprimierende Brustkrebszelllinie (MDA-MB-468)ATCC (oder gleichwertig)HTB-132 (oder gleichwertig)Zielzellen im Phagozytose-Assay; GFP ermöglicht die Visualisierung
ImmunoCult-SF-MakrophagenmediumSTEMCELL Technologies (oder gleichwertig)10961 (oder gleichwertig)Serumfreies Medium zur Differenzierung von Makrophagen
Dulbecco’s modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific (oder gleichwertig)12100046Wird für die Kultur und Resuspension von Krebszellen verwendet
Isotyp-Kontrollantikörper (IgG)Bio X Cell (oder gleichwertig)BE0297 (oder gleichwertig)Negativer Kontrollantikörper für den antikörperabhängigen Phagozytose-Assay
Lipopolysaccharid (LPS)Sigma-Aldrich (oder gleichwertig)L2630 (oder gleichwertig)Stimulus zur Aktivierung von Makrophagen in Kombination mit IFN-γ
Rekombinanter humaner Interferon-gamma (IFN-γ)STEMCELL Technologies (oder gleichwertig)78020 (oder gleichwertig)Zytokin zur Aktivierung von Makrophagen
Rekombinanter humaner Makrophagen-Koloniestimulierender Faktor (M-CSF)STEMCELL Technologies (oder gleichwertig)78057 (oder gleichwertig)Wachstumsfaktor zur Differenzierung von Makrophagen
Pasteur-Pipetten oder serologische PipettenJetbiofil (oder gleichwertig)GSP010010 (oder gleichwertig)Wird für die Flüssigkeitshandhabung während der PBMC-Isolierung und Zellkultur verwendet
PBS (Ca2+-/Mg2+-frei)Thermo Fisher Scientific (oder gleichwertig)BP399-500 (oder gleichwertig)Puffer zur Zellwäsche und Verdünnungsschritte
Petri-Schalen (100 mm, nicht–gewebekulturbehandelt)Corning (oder gleichwertig)430591Wird für die Differenzierung von Makrophagen mittels Adhärenzselektion verwendet
Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen (RBC)BioLegend (oder gleichwertig)420301 (oder gleichwertig)Wird zur Entfernung roter Blutkörperchen während der PBMC-Isolierung verwendet
Viobility 405/452 Fixierbarer FarbstoffMiltenyi Biotec (oder gleichwertig)130-130-404 (oder gleichwertig)Wird zur Beurteilung der Zellviabilität während der Durchflusszytometrie-Analyse verwendet
DAPISigma-Aldrich (oder gleichwertig)D9542 (oder gleichwertig)Wird zur Ausschließung toter Zellen in der Durchflusszytometrie verwendet

Referenzen

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