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Zeitraffer-Bildgebung der antikörpergesteuerten Phagozytose von grün fluoreszenzproteinmarkierten triple-negativen Brustkrebszellen durch Makrophagen

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DOI:

10.3791/71461

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14. August 2026

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1Department of Surgery, National Taiwan University Hospital, 2School of Chinese Medicine, China Medical University, 3Graduate Institute of Biomedical Science, China Medical University, 4Chinese Medicine Research Center, China Medical University, 5Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Zeitrafferaufnahme-Methode zur Live-Cell-Bildgebung, um die antikörperabhängige Phagozytose grün fluoreszierend markierter triple-negativer Brustkrebszellen durch aus peripheren mononukleären Blutzellen abgeleitete Makrophagen mithilfe eines automatisierten Mikroskops zu visualisieren.

Zusammenfassung

Die antikörperabhängige zelluläre Phagozytose ist ein zentraler Mechanismus, durch den Makrophagen Antikörper-opsonierte Krebszellen aufnehmen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode der Zeitrafferaufnahme an lebenden Zellen, um die antikörperabhängige Phagozytose grün fluoreszierend markierter, CD24-exprimierender triple-negativer Brustkrebszellen durch Makrophagen sichtbar zu machen. Die Makrophagen werden aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen gewonnen, mit Makrophagen-Koloniestimulierendem Faktor differenziert und mittels Interferon-gamma und Lipopolysaccharid polarisiert, um ein proinflammatorisches Phänotyp zu erzeugen. Vor der Kokultur mit Makrophagen in einem definierten Effektor-zu-Target-Verhältnis werden die Krebszellen mit einem monoklonalen Anti-CD24-Antikörper opsoniert. Phagozytosevorgänge werden über einen Zeitraum von 16 Stunden mithilfe eines automatisierten Mikroskops mit Umweltkontrolle zur Aufrechterhaltung physiologischer Bedingungen aufgezeichnet. Die Aufnahmen erfolgen in Hellfeld- und Fluoreszenzkanälen, wodurch die Identifizierung der Krebszellen und die Beobachtung ihrer Internalisierung durch Makrophagen ermöglicht wird. Repräsentative Zeitrafferbilder zeigen die fortschreitende Aufnahme fluoreszierender Krebszellen im Zeitverlauf. Zur quantitativen Bewertung wird ein paralleler Endpunkt-Assay unter identischen Kokulturbedingungen durchgeführt, bei dem nicht internalisierte Krebszellen vor der Bildaufnahme entfernt werden, um eine genaue Quantifizierung der Phagozytosevorgänge zu ermöglichen. Diese Methode bietet einen standardisierten und reproduzierbaren Ansatz zur Visualisierung der antikörpervermittelten Makrophagenphagozytose in vitro. Insbesondere ermöglicht die Kombination von Zeitrafferaufnahmen mit der quantitativen Endpunktanalyse eine komplementäre Beurteilung der Kinetik und des Ausmaßes der Phagozytose. Dieses Protokoll unterstützt die Evaluierung therapeutischer Antikörper und makrophagengerichteter Krebsimmuntherapien in einem kontrollierten in-vitro-System.

Einleitung

Brustkrebs ist weltweit die häufigste bei Frauen diagnostizierte maligne Erkrankung und macht jährlich etwa 2,3 Millionen neue Fälle aus1. Die Erkrankung ist klinisch heterogen und wird basierend auf dem Status der Hormonrezeptoren – Östrogenrezeptor (ER) und Progesteronrezeptor (PR) – sowie der Expression des Onkogens humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) in mindestens vier wichtige molekulare Subtypen eingeteilt2. Luminal-A-Tumoren exprimieren ER und/oder PR ohne HER2-Überexpression (ER/PR+ und HER2−); Luminal-B-Tumoren exprimieren sowohl ER/PR als auch HER2 (ER/PR+ und HER2+); HER2+-Tumoren zeichnen sich durch eine hohe HER2-Expression unabhängig vom Hormonrezeptorstatus aus; und der triple-negativen Brustkrebs (TNBC) weist keinen Nachweis aller drei Marker auf (ER−, PR− und HER2−)2,3. Unter diesen Subtypen stellt TNBC die klinisch herausforderndste Form dar und macht etwa 15–20 % aller Brustkrebsfälle aus. Patientinnen mit TNBC weisen den aggressivsten Krankheitsverlauf auf, mit der ungünstigsten Prognose und der kürzesten Fünf-Jahres-Überlebensrate, bedingt durch schlechte Ansprechen auf herkömmliche Chemotherapien und das Fehlen wirksamer zielgerichteter Therapien3,4. Zudem zeigt TNBC eine signifikant hohe Neigung zu viszeralen Metastasen, insbesondere zu den Lungen innerhalb von fünf Jahren nach der Diagnosestellung, und Patientinnen mit fortgeschrittenem oder metastasierendem TNBC (mTNBC) haben eine mediane Überlebensdauer, die selten zwei Jahre überschreitet5,6. Diese Statistiken unterstreichen die dringende, bisher unerfüllte Notwendigkeit neuer therapeutischer Strategien für TNBC.

Die Tumormikroumgebung (TME) spielt eine entscheidende Rolle bei der Progression von Brustkrebs und der Immunvermeidung. Tumorzugeordnete Makrophagen gehören zu den häufigsten Immunzellen innerhalb der TME und wurden kürzlich als entscheidende Vermittler der angeborenen Anti-Tumor-Immunität anerkannt7,8,9. Während TAMs historisch in proinflammatorische „M1“- und protumorale „M2“-Zustände unterteilt wurden, vermag dieses binäre Modell die tatsächliche Heterogenität der Makrophagen nicht abzubilden. Vielmehr nehmen TAMs ein dynamisches funktionelles Spektrum ein, das sich als Reaktion auf die vielfältigen biochemischen Signale innerhalb der TME entwickelt. In diesem komplexen Umfeld unterwandern Krebszellen aktiv die Makrophagenaktivität durch verschiedene Strategien der Immunvermeidung, insbesondere durch die Überexpression von „nicht fressen“-Signalen. Die CD47/SIRPα-Achse war der erste identifizierte angeborene Immun-Checkpoint in diesem Zusammenhang6,10; kürzlich hat sich CD24 als neuartiges und starkes antiphagozytäres Signal erwiesen11,12. CD24 ist ein kleines, stark glykosyliertes Mukin-Typ-Glykoprotein, das über eine glycosylphosphatidylinositol-Verankerung an der Zellmembran haftet13. Unter physiologischen Bedingungen wird es auf verschiedenen Immunzelllinien exprimiert, ist jedoch häufig in soliden Tumoren überexprimiert, darunter Brust-, Eierstock-, Pankreas- und kolorektale Karzinome14. Auf Tumorzellen bindet CD24 an den inhibitorischen Rezeptor Sialinsäure-bindendes immunglobulinähnliches Lektin 10 (Siglec-10), der auf Makrophagen exprimiert wird. Diese Interaktion löst die Phosphorylierung der immuntypischen Tyrosin-basierten inhibitorischen Motiv-Domänen im zytoplasmatischen Schwanz von Siglec-10 aus und aktiviert dadurch die Phosphatasen SHP-1 und SHP-2, welche die nachgeschaltete phagozytäre Signalübertragung unterdrücken11. Die Blockade der CD24/Siglec-10-Interaktion mittels monoklonaler Antikörper hat sich als wirksame Maßnahme erwiesen, um die Phagozytose von CD24-exprimierenden menschlichen Tumoren durch Makrophagen deutlich zu verstärken. In einer kürzlich durchgeführten Studie zeigten wir außerdem, dass der Knockout von CD24a in Brustkrebszellen deren Anfälligkeit für die phagozytäre Aufnahme durch Makrophagen in einem murinen Modell des triple-negativen Brustkrebs erhöht9.

Die antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP) ist ein zentraler Mechanismus, durch den Antikörper Makrophagen anweisen, Tumorzellen zu phagozytieren15,16. Nach Bindung an auf Tumorzellen exprimierte Antigene bindet die Fc-Region des Antikörpers an Fcγ-Rezeptoren (FcγRs) auf Makrophagen und löst dadurch intrazelluläre Signaltransduktionskaskaden aus, die in einer Umorganisation des Zytoskeletts, der Bildung einer phagozytotischen Mulde und der Einschließung der Zielzelle münden17.

In dieser Studie haben wir ein Zeitrafferverfahren mit Live-Cell-Imaging zur Messung der antikörpervermittelten Phagozytose von Brustkrebszellen durch Makrophagen entwickelt und validiert. Die Methode verwendet aus peripheren mononukleären Blutkörperchen (PBMCs) gesunder menschlicher Spender gewonnene Makrophagen, die mit makrophagenkoloniestimulierendem Faktor (M-CSF) differenziert und anschließend mit Lipopolysaccharid (LPS) und Interferon-Gamma (IFN-γ) stimuliert werden. Die Durchflusszytometrie bestätigte die Hochregulation von CD80 innerhalb der CD11b⁺-Population nach Stimulation (Abbildung 1), was das klassisch aktivierte Phänotyp unterstützt. Dieser Aktivierungszustand verleiht eine starke antikörpervermittelte phagozytotische Kapazität und eignet sich daher gut zur Bewertung der antikörperabhängigen zellulären Phagozytose (ADCP). GFP-markierte, CD24-positive Brustkrebszellen dienen als Zielzellen und werden vor der Kokultur mit einem therapeutischen anti-CD24 monoklonalen Antikörper opsonisiert. Phagozytoseereignisse werden über einen Zeitraum von 16 Stunden mithilfe eines automatisierten Mikroskops unter kontrollierten Umweltbedingungen aufgezeichnet. Um eine quantitative Bewertung parallel zur dynamischen Visualisierung zu ermöglichen, wird ein separates Endpunkt-Assay unter identischen Kokulturbedingungen durchgeführt, wodurch eine exakte Messung der Phagozytose nach Entfernung nicht internalisierter Zielzellen möglich ist. Dieses Protokoll bietet eine standardisierte, reproduzierbare und visuell informative Plattform zur Beurteilung der durch einen anti-CD24-Antikörper vermittelten ADCP. Wichtig ist, dass die Kombination von Zeitrafferaufnahmen mit einer komplementären, auf Endpunkten basierenden Quantifizierungsstrategie die gleichzeitige Analyse von Phagozytosekinetik und -ausmaß ermöglicht. Die Methode kann angepasst werden, um andere makrophagengerichtete immuntherapeutische Zielstrukturen zu untersuchen. Dieses Protokoll eignet sich am besten zur Bewertung der ADCP, die durch therapeutische monoklonale Antikörper gegen Oberflächenantigene auf Krebszellen vermittelt wird. Es ist gut geeignet für den vergleichenden Screening von Kandidatenantikörpern, die Charakterisierung von Dosis-Wirk-Beziehungen sowie für mechanistische Studien zur Fc–FcγR-Bindung, einschließlich der Effekte der Blockade von „nicht-fress-mich“-Signalen (z. B. CD47–SIRPα). Da der Test primäre humane Makrophagen verwendet, eignet er sich auch für translationsmedizinische Studien, die die Beurteilung der Variabilität zwischen Spendern vor der klinischen Entwicklung erfordern.

Diagramm zur Isolierung peripherer mononukleärer Blutzellen mit Durchflusszytometrie zur Analyse von Makrophagen.
Abbildung 1. Erzeugung und Validierung mittels Durchflusszytometrie von aus peripheren mononukleären Blutzellen abgeleiteten, mit IFN-γ/LPS stimulierten Makrophagen. Oberes Panel: Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) werden aus Vollblut gesunder Spender mittels Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von Ficoll-Lösung bei 400 × g für 30 min bei 20 °C isoliert, wobei alle Reagenzien zuvor auf 20 °C ± 2 °C vorgeglichen wurden. Die isolierten PBMCs werden 7 Tage lang in ImmunoCult-SF-Medium, ergänzt mit 100 ng/mL makrophagenkoloniestimulierendem Faktor (M-CSF), kultiviert, um die Differenzierung zu Makrophagen zu induzieren (Tag 0–7), wobei am Tag 5 eine Nachsupplementierung des Mediums erfolgt. Am Tag 8 werden die differenzierten Makrophagen 48 Stunden lang mit 100 ng/mL IFN-γ und 1 µg/mL LPS stimuliert (Tag 8–10). Anschließend werden die Zellen einer Durchflusszytometrie-Analyse unterzogen. Unteres Panel: Durchflusszytometrische Analyse der Makrophagen. Die Zellen wurden mit einem Oberflächenantikörperset bestehend aus CD11b-FITC, CD80-PE und CD206-PerCP-Cy5.5 gefärbt und vor der Messung mit DAPI versetzt, um tote Zellen auszuschließen. Gating-Strategie: Zunächst erfolgte die Auswahl lebender Zellen (DAPI⁻), gefolgt von der Identifizierung von CD11b⁺-Zellen in einem CD11b-FITC- vs. FSC-A-Diagramm zur Bestätigung der Makrophagen-Identität. Anschließend wurden die lebenden CD11b⁺-Ereignisse in einem CD80- vs. CD206-Dotplot analysiert, um die durch IFN-γ/LPS-Stimulation induzierte CD80⁺CD206⁻-Population zu bestätigen. Rechts: Repräsentativer Dotplot von CD11b-FITC vs. FSC-A, der zeigt, dass 99,8 % der selektierten Zellen CD11b⁺ waren und somit die Makrophagen-Identität bestätigt wird. Links: Der Großteil der CD11b⁺-Zellen lag innerhalb des CD80⁺CD206⁻-Gates (Q1: 95,2 %), was das erwartete proinflammatorische Phänotyp unter den angewendeten Stimulationsbedingungen bestätigt. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Anwender sollten mehrere Einschränkungen berücksichtigen, wenn sie diese Technik anwenden. Erstens kann die Spendervariabilität bei aus PBMCs abgeleiteten Makrophagen eine erhebliche Varianz der phagozytotischen Aktivität verursachen; wir empfehlen daher die Verwendung mehrerer Spender (n ≥ 3), wobei die Einzeldaten der Spender zusammen mit den gepoolten Ergebnissen angegeben werden sollten. Zweitens bildet das 2D-Kokultursystem die Tumormikroumgebung nicht vollständig ab, und die Ergebnisse sollten vor klinischer Interpretation in 3D- oder In-vivo-Modellen validiert werden. Drittens erfasst das 16-stündige Bildaufnahmeintervall frühe phagozytotische Ereignisse, spiegelt jedoch keine langfristigeren Prozesse wie die Antigenpräsentation oder sekundäre Immunaktivierung wider. Daher bietet die kombinierte Anwendung von Echtzeit-Bildgebung und Endpunkt-Quantifizierung ein ergänzendes Rahmenwerk, das die Interpretierbarkeit und Reproduzierbarkeit von ADCP-Messungen verbessert.

Protokoll

Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von primären Makrophagen, die aus Blutproben gesunder Spender gewonnen wurden. Die Sammlung und Aufbereitung der Proben erfolgte gemäß den Richtlinien der Institutional Review Board (IRB) der China Medical University.

1. Herstellung von PBMC-abgeleiteten Makrophagen

HINWEIS: Führen Sie alle Verfahren mit menschlichem Blut unter Genehmigung der zuständigen institutionellen IRB (z. B. CMUH IRB) durch. Ziehen Sie vor der Blutentnahme die informierte Einwilligung gesunder Spender ein.

VORSICHT: Alle menschlichen Blutprodukte unter Bedingungen der Biosicherheitsstufe 2 unter Anwendung universeller Vorsichtsmaßnahmen handhaben.

  1. Blutentnahme
    1. Entnehmen Sie Vollblut von einem gesunden Spender in 10-mL-Vakuumröhrchen mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Beschichtung.
  2. Blutverdünnung
    1. Verdünnen Sie das Vollblut im Verhältnis 1:1 mit eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; Ca2⁺-/Mg2⁺-frei) (z. B. 10 mL Blut + 10 mL PBS).
    2. Mischen Sie durch dreimaliges bis fünfmaliges Vorsichtig Umstülpen.
      HINWEIS: Halten Sie PBS vor der Verwendung auf Eis. Die kalte Temperatur hilft, die Zellviabilität während der Verarbeitung zu erhalten.
  3. Überlagerung mit Dichtegradient
    1. Überschichten Sie das verdünnte Blut vorsichtig im Volumenverhältnis 2:1 (V/V) über Ficoll–Paque PLUS in einem kegelförmigen Reaktionsgefäß (z. B. 8 mL Blut über 4 mL Ficoll in einem 15-mL-Röhrchen oder 30 mL über 15 mL in einem 50-mL-Röhrchen).
    2. Stellen Sie sowohl das verdünnte Blut als auch Ficoll–Paque PLUS vor der Überlagerung auf 20 °C ± 2 °C ein.
    3. Nehmen Sie Ficoll–Paque PLUS mindestens 30 Minuten vor der Verwendung aus dem 4 °C-Kühlschrank heraus oder erwärmen Sie es kurz in einem Wasserbad bei 20 °C ± 2 °C.
    4. Verwenden Sie keine kalten Reagenzien, da die Dichte von Ficoll für 20 °C ± 2 °C kalibriert ist und Abweichungen die Trennleistung und die PBMC-Ausbeute beeinträchtigen.
      HINWEIS: Kippen Sie das Röhrchen unter einem Winkel von 45° und pipettieren Sie das Blut langsam entlang der Wand, um eine scharfe Grenzfläche zu erhalten. Stören Sie die Ficoll-Schicht nicht.
  4. Zentrifugation
    1. Zentrifugieren Sie bei 400 × g für 30 Minuten bei 20 °C ohne Bremse (Abbildung 1).
      HINWEIS: Das Bremsen stört den Dichtegradienten und verringert die PBMC-Ausbeute.
  5. PBMC-Gewinnung
    1. Aspirieren Sie vorsichtig nur die Buffy-Coat-Schicht (die weißliche Grenzfläche zwischen Plasma- und Ficoll-Schicht), ohne das darüberliegende Plasma oder die darunterliegende Ficoll-Schicht zu stören, mithilfe einer serologischen Pipette.
    2. Überführen Sie die gewonnene Schicht in ein neues 50-mL-Kegelröhrchen.
  6. PBMC-Waschen
    1. Fügen Sie PBS hinzu, um das Gesamtvolumen in einem 50-mL-Kegelröhrchen auf 25 mL aufzufüllen.
    2. Verwenden Sie ein 50-mL-Röhrchen, um eine ordnungsgemäße Zentrifugation und Auswuchtung sicherzustellen.
    3. Zentrifugieren Sie bei 300 × g für 10 Minuten.
  7. Lysieren der roten Blutkörperchen (RBC)
    1. Entfernen Sie den Überstand.
    2. Suspendieren Sie das Pellet durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mit einer serologischen Pipette in 5 mL Lysispuffer für rote Blutkörperchen (RBC-Lysispuffer), bis das Pellet vollständig dispergiert ist und keine sichtbaren Klumpen mehr vorhanden sind.
    3. Inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur.
      ACHTUNG: Eine vollständige Dispersion ist erforderlich, um eine gleichmäßige Lyse sicherzustellen; vermeiden Sie jedoch heftiges Pipettieren oder Vortexen, da dies die PBMCs beschädigen kann. Überschreiten Sie nicht 5 Minuten Inkubationszeit mit dem RBC-Lysispuffer, da eine längere Exposition die Viabilität der PBMCs beeinträchtigen kann.
  8. Pellettieren der PBMCs
    1. Zentrifugieren Sie bei 500 × g für 5 Minuten, um die PBMCs zu pelletieren und lysierte RBC-Reste zu entfernen.
  9. Endgültige Resuspension
    1. Entfernen Sie den Überstand.
    2. Suspendieren Sie das Pellet in 5 mL ImmunoCult-SF-Makrophagenmedium.
      HINWEIS: Unter Standardbedingungen ergibt 10 mL Vollblut typischerweise 1,5–2,0 × 107 PBMCs.

2. Differenzierung von Makrophagen (Tag 0–7)

HINWEIS: Verwenden Sie nicht für Gewebekultur (TC) behandelte Petrischalen, um durch Adhärenz differenzierte Makrophagen aus Monozyten auszuwählen. Nicht-adhärente Lymphozyten werden während der anschließenden Kultivierung abgewaschen.

  1. Tag 0: Zellansaat
    1. Führen Sie eine Zellzählung durch und säen Sie 1 × 107 PBMCs in eine nicht TC-behandelte 10 cm Petrischale aus.
    2. Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 10 mL mit ImmunoCult-SF-Makrophagenmedium, das mit 100 ng/mL M-CSF ergänzt wurde (hergestellt durch direktes Zugabe des M-CSF-Stammlösung zum vollständigen Medium unmittelbar vor der Verwendung und Mischen durch vorsichtiges Umstülpen).
      HINWEIS: Das Protokoll kann proportional skaliert werden, um Variationen im PBMC-Ertrag des Spenders zu berücksichtigen, wobei eine Ansiedlungsdichte ab 1 × 106 Zellen/mL als Grundlage dient.
  2. Inkubation und Überwachung
    1. Inkubieren Sie bei 37°C mit 5% CO₂ in einem befeuchteten Inkubator.
    2. Überwachen Sie täglich die Bildung schwimmender Monozyten-Cluster und das Auftreten von anhaftenden Zellen.
      HINWEIS: Die Monozyten nehmen allmählich an Größe zu und bilden Cluster, während die Differenzierung fortschreitet. Einige Monozyten beginnen, sich an der Platte anzulagern. In diesem Schritt ist kein Eingriff erforderlich.
  3. Tag 5: Mediumnachsupplementierung
    1. Geben Sie vorsichtig 5 mL frisches ImmunoCult-SF-Makrophagenmedium, ergänzt mit 100 ng/mL M-CSF, hinzu, wobei darauf geachtet werden muss, die anhaftenden Makrophagen nicht zu stören.
    2. Setzen Sie die Kultur weitere 2 Tage fort (bis Tag 7).
      ACHTUNG: Geben Sie das frische Medium vorsichtig entlang der Seite der Schale hinzu, um die anhaftenden Makrophagen nicht zu stören, da mechanische Störungen die Differenzierungseffizienz und Zellausbeute beeinträchtigen können.
      HINWEIS: Vermeiden Sie das Ersetzen des Mediums, um autokrine/parakrine Faktoren zu erhalten, die die Makrophagendifferenzierung unterstützen.
  4. Tag 7: Morphologische Beurteilung
    1. Überprüfen Sie die Effizienz der Makrophagendifferenzierung unter einem invertierten Mikroskop.
    2. Anhaftende Zellen zeigen eine charakteristische Makrophagenmorphologie: groß, abgeflacht und unregelmäßig geformt, mit sichtbaren Pseudopodien.
    3. Am Tag 7 sollten gut differenzierte Makrophagen sichtbar sein.
      ACHTUNG: Die morphologische Beurteilung am Tag 7 dient als entscheidende Voraussetzung für die anschließende Validierung mittels Durchflusszytometrie. Gut differenzierte Makrophagen sollten deutlich unter dem Mikroskop erkennbar sein; ein höherer Anteil an anhaftenden Zellen mit Makrophagenmorphologie spiegelt eine größere Differenzierungseffizienz wider (eine Konfluenz von etwa 70 % an anhaftenden Makrophagen mit charakteristischer Morphologie gilt als Hinweis auf eine erfolgreiche Differenzierung). Kulturen mit spärlicher Anheftung, überwiegend runden Zellen oder sonst schlechter morphologischer Differenzierung werden voraussichtlich keine zuverlässigen Ergebnisse in der Durchflusszytometrie liefern und sollten nicht zur Stimulation und Färbung weiterverarbeitet werden.

3. Makrophagen-Polarisierung (Tage 8–10)

  1. Sammlung und Klärung des konditionierten Mediums
    1. Am Tag 8 vorsichtig die 15 mL Medium aus der Kulturschale aspirieren, ohne die anhaftenden Makrophagen zu stören, und in ein steriles 50-mL-Konischgefäß überführen.
    2. Das gesammelte Medium 5 min bei 400 × g zentrifugieren, um Zelltrümmer zu pelletieren.
    3. Den geklärten Überstand für den nächsten Schritt aufbewahren.
  2. Stimulation mit Interferon-gamma (IFN-γ) und Lipopolysaccharid (LPS)
    1. Den geklärten 15-mL-Überstand in ein neues steriles Gefäß überführen und mit 100 ng/mL IFN-γ sowie 1 µg/mL LPS supplementieren.
    2. Sorgfältig durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren (5–10 Mal) mischen, um eine gleichmäßige Zytokindistribution sicherzustellen, ohne Blasen zu erzeugen.
    3. Das gesamte 15 mL Zytokin-supplementierte Medium in die ursprüngliche Kulturschale zurückgeben und dabei sanft entlang der Innenwand pipettieren, um die anhaftenden Makrophagen nicht zu stören.
    4. 48 h bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren (Tag 8 bis Tag 10).
      HINWEIS: Konditioniertes (altes) Medium verwenden, um autokrine/parakrine Faktoren zu erhalten. Die Kombination aus IFN-γ und LPS dient dazu, Makrophagen in ein proinflammatorisches Phänotyp zu polarisieren. Unter den in diesem Protokoll verwendeten Stimulationsbedingungen mit IFN-γ (100 ng/mL) und LPS (1 µg/mL) zeigen Makrophagen charakteristische morphologische Veränderungen, einschließlich verlängerter Lamellipodien, die mit einem aktivierten proinflammatorischen Zustand übereinstimmen, sowie die Expression von CD11b und CD80.
      ACHTUNG: LPS gemäß den geeigneten Laborsicherheitsvorschriften handhaben, da es sich um ein bioaktives Endotoxin handelt, das bei Exposition entzündliche Reaktionen auslösen kann.

4. Bestätigung der Marker für das inflammatorische Phänotyp von IFN-γ- und LPS-stimulierten Makrophagen mittels Durchflusszytometrie

  1. Zellgewinnung
    1. Gewinnen Sie am Tag 10 einen Teil der polarisierten Makrophagen zur Phänotypisierung.
    2. Fügen Sie 10 mM EDTA in PBS hinzu und inkubieren Sie 10–15 min bei 37 °C.
    3. Lösen Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren.
      HINWEIS: Verlängern Sie die EDTA-Inkubation um zusätzliche 30 min bei 37 °C, falls die Zellen weiterhin adhärent sind, und wiederholen Sie anschließend das vorsichtige Pipettieren. Vermeiden Sie kräftiges Pipettieren oder mechanisches Abkratzen, um die Zellviabilität und Integrität der Oberflächenmarker zu erhalten.
  2. Vorbereitung der Antikörperfärbung
    1. Färben Sie die Zellen mit fluorochrom-konjugierten Antikörpern gegen CD11b (Pan-Makrophagen-Linienmarker), CD80 (Entzündungsmarker) und CD206 (anti-inflammatorischer Marker, der als negativer Ausschlussmarker zur Identifizierung des entzündlichen Phänotyps verwendet wird).
  3. Färbeprotokoll
    1. Überführen Sie 5 × 105 abgelöste Makrophagen in ein Durchflusszytometrie-Röhrchen mit 100 µL kaltem PBS.
    2. Fügen Sie CD11b-FITC-, CD80-PE- und CD206-PerCP-Cy5.5-Antikörper jeweils bis zu einer Endkonzentration von 1 µg/mL hinzu.
    3. Mischen Sie die Zellsuspension durch vorsichtiges Pipettieren.
    4. Inkubieren Sie die Proben 1 h auf Eis, lichtgeschützt.
    5. Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 × g für 1 min bei 4 °C.
    6. Aspirieren Sie das Überstandsvolumen vorsichtig.
    7. Fügen Sie 0,5 mL kaltes PBS hinzu, um das Zellpellet zu waschen.
    8. Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 × g für 1 min bei 4 °C.
    9. Entfernen Sie den Überstand.
    10. Suspendieren Sie das Zellpellet erneut in 200 µL kaltem PBS.
    11. Fügen Sie DAPI bis zu einer Endkonzentration von 1 µg/mL hinzu.
      HINWEIS: Verwenden Sie geeignete Isotyp-Kontrollen und eine Vitalitätsfarbe (z. B. DAPI oder Viobility 405/452 Fixable Dye).
  4. Durchflusszytometrische Analyse
    1. Analysieren Sie die gefärbten Proben mittels Durchflusszytometrie.
    2. Bestätigen Sie die Expression von CD11b und CD80 in der Makrophagenpopulation.
    3. Fahren Sie mit dem Phagozytose-Assay erst fort, nachdem die Markerexpression den Merkmalen eines entzündlichen Phänotyps entspricht.
  5. Durchflusszytometrische Datenaufnahme und Geräteeinstellung
    1. Gerätekonfiguration
      1. Richten Sie den Durchflusszytometer mit folgenden Kanälen ein: Pacific Blue/V450 (DAPI), FITC (CD11b), PE (CD80) und PerCP-Cy5.5 (CD206).
      2. Stellen Sie den Aufnahmeparameter so ein, dass 10.000 Ereignisse pro Probe innerhalb des definierten Elterngates erfasst werden.
    2. Schwellenwert- und Verstärkungskalibrierung
      1. Öffnen Sie vier Punktdiagramme mit FSC auf der x-Achse und einem Fluorochromkanal auf der y-Achse.
      2. Bereiten Sie Zellen vor, die mit entsprechenden Isotyp-Kontrollantikörpern für jedes Fluorochrom gefärbt wurden.
      3. Erfassen Sie die Isotyp-Kontrollproben.
      4. Stellen Sie die Verstärkung jedes Kanals so ein, dass die Isotyp-Kontrollpopulation unterhalb von 101 auf der logarithmischen Skala liegt.
      5. Verwenden Sie diesen Schwellenwert zur Definition der Hintergrundsignalintensität.
        HINWEIS: Verwenden Sie einen logarithmischen Skalenbereich von 101 bis 101·5, um eine zuverlässige Trennung zwischen Hintergrund- und Spezifischem Signal zu gewährleisten.
    3. Kompensation
      1. Geben Sie einen Tropfen Kompensationsperlen in ein 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen.
      2. Fügen Sie den entsprechenden fluorochrom-konjugierten Antikörper bis zu einer Endkonzentration von 1 µg/mL hinzu.
      3. Inkubieren Sie 30 min auf Eis, lichtgeschützt.
      4. Zentrifugieren Sie bei 400 × g für 1 min.
      5. Entfernen Sie den Überstand.
      6. Suspendieren Sie die Perlen erneut in 200 µL kaltem PBS.
      7. Erfassen Sie Einzelfarbkontrollen.
      8. Wenden Sie spektrale Kompensation an, um Fluorochrom-Überlagerungen zu korrigieren.
    4. Gate-Strategie
      1. Auswahl lebender Zellen
        1. Tragen Sie Pacific Blue/V450 (DAPI) auf der y-Achse und FSC auf der x-Achse ab.
        2. Legen Sie ein Gate auf DAPI-negative Ereignisse (unterhalb von 101), um lebende Zellen auszuwählen.
      2. Identifizierung von Makrophagen
        1. Verwenden Sie die Population lebender Zellen als Elterngate.
        2. Tragen Sie FITC (CD11b) auf der y-Achse und FSC auf der x-Achse ab.
        3. Legen Sie ein Gate auf CD11b⁺-Ereignisse (oberhalb von 101).
      3. Identifizierung des entzündlichen Phänotyps
        1. Verwenden Sie die CD11b⁺-Population als Elterngate.
        2. Tragen Sie PE (CD80) auf der y-Achse und PerCP-Cy5.5 (CD206) auf der x-Achse ab.
        3. Wenden Sie eine Quadrantengating-Methode mit einem Schwellenwert von 101.5 auf beiden Achsen an.
        4. Identifizieren Sie CD80⁺CD206⁻-Zellen im oberen linken Quadranten (Q1).
  6. Akzeptanzkriterien
    1. Stellen Sie sicher, dass ≥90 % der Zellen innerhalb des CD11b⁺-Elterngates CD80⁺CD206⁻ sind.
    2. Fahren Sie erst mit dem Phagozytose-Assay fort, wenn dieser Schwellenwert erreicht ist.
    3. Wiederholen Sie die PBMC-Isolierung, die M-CSF-Differenzierung und die IFN-γ/LPS-Stimulation, falls die Proben dieses Kriterium nicht erfüllen.

5. Antikörperabhängiger Phagozytose-Assay

HINWEIS: Überprüfen Sie vor dem Assayaufbau die stabile GFP-Expression in Krebszellen. Bestätigen Sie die CD24-Expression auf Zielzellen vor dem Assay. Verwenden Sie Krebszellen mit 50 %–100 % CD24-Positivität für optimale Ergebnisse. Die in diesem Protokoll verwendeten MDA-MB-468-Zellen weisen 100 % CD24-Positivität auf.

  1. Aussaat der Makrophagen
    1. Die IFN-γ- und LPS-stimulierten Makrophagen, wie in Schritt 4 validiert, mit einer Dichte von 2 × 105 Zellen pro Vertiefung in einer 24-Loch-Zellkulturplatte aussäen.
    2. Die Platte 12–16 h bei 37 °C unter statischen Bedingungen mit 5 % CO₂ inkubieren, um die Zelladhärenz zu ermöglichen (Abbildung 2A).
      HINWEIS: Vor Fortsetzung sicherstellen, dass die Makrophagen fest angeheftet sind. Schlecht angeheftete Makrophagen können während der Bildaufnahme ablösen und die Ergebnisse verfälschen.
  2. Vorbereitung der Krebszellen
    1. CD24-positive, mit GFP markierte Brustkrebszellen (MDA-MB-468) bis zu einer Konfluenz von 70 %–80 % kultivieren.
    2. Das Kulturmedium absaugen.
    3. Die Zellmonoschicht einmal mit PBS waschen.
  3. Lösung der Krebszellen
    1. 10 mM EDTA in PBS zur Kulturschale hinzufügen.
    2. Die Zellen 5–10 min bei 37 °C inkubieren.
    3. Die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren lösen, um eine vollständige Freisetzung der Zellen zu erreichen.
      HINWEIS: Trypsin zur Zelllösung vermeiden. Enzymatische Verdauung kann CD24 von der Zelloberfläche spalten und die Antikörperbindung beeinträchtigen.
  4. Sammlung und Zählung der Krebszellen
    1. Die gelösten Zellen in ein Zentrifugenröhrchen sammeln.
    2. Die Zellen 5 min bei 300 × g zentrifugieren.
    3. Den Überstand verwerfen.
    4. Den Zellpellet in vollständigem RPMI-Medium resuspendieren.
    5. Lebensfähige Zellen zählen.
  5. Antikörper-Opsonisierung der Krebszellen
    1. Die Krebszellen mit einer Dichte von 2 × 105 Zellen/mL in 0,5 mL vollständigem RPMI-Medium resuspendieren.
    2. Den monoklonalen Anti-CD24-Antikörper auf eine Endkonzentration von 1 µg/mL hinzufügen.
    3. Die Zellsuspension durch vorsichtiges Pipettieren mischen, um eine gleichmäßige Verteilung der Antikörper sicherzustellen.
    4. Die Zellen 30 min bei 37 °C unter statischen Bedingungen inkubieren.
      HINWEIS: Als negativen Kontrollansatz für die antikörperabhängige Phagozytose einen isotypgepaarten IgG-Kontrollantikörper in derselben Konzentration mitführen.
  6. Vorbereitung der Kokultur
    1. Die Zellen nach der Opsonisierung nicht waschen.
    2. Unmittelbar mit der Kokultur fortfahren, um die Antikörperbeschichtung auf der Zelloberfläche aufrechtzuerhalten.
  7. Einrichten der Kokultur
    1. 1 × 105 antikörperopsonisierte, mit GFP markierte Brustkrebszellen zu jeder Vertiefung mit Makrophagen hinzufügen.
    2. Ein Effektor-zu-Target-Verhältnis von 2:1 beibehalten.
      HINWEIS: Das Effektor-zu-Target-Verhältnis je nach experimentellem Design anpassen. Um die Häufigkeit des Zell-Zell-Kontakts zu erhöhen und die Detektion phagozytotischer Ereignisse zu verbessern, können höhere Makrophagen-zu-Krebszellen-Verhältnisse als das beschriebene 2:1-Verhältnis (z. B. 3:1 oder 5:1) verwendet werden.

Zeitrafferdiagramm der Interaktion zwischen Makrophagen und GFP-markierten Zellen im Abbildungsexperiment.
Abbildung 2. Zeitrafferaufnahmen der antikörperabhängigen zellulären Phagozytose. (A) Schematische Übersicht des Kokultursystems und der Zeitrafferbildgebung. Die Bildgebung umfasste ein Zeitintervall von 10 min über eine Gesamtaufnahmezeit von 16 h (97 Einzelbilder) unter Verwendung eines 10×-Objektivs mit Phasenkontrast und GFP-Kanälen. (B) Repräsentative Zeitrafferbilder von 1 h bis 16 h, die Phagozytoseereignisse zeigen, die sich durch die Internalisierung von GFP-positiven Krebszellen durch Makrophagen im Zeitverlauf auszeichnen. Gelbe gestrichelte Kreise markieren repräsentative Phagozytosevorgänge. Im Phasenkontrastkanal erscheinen die aufgenommenen Krebszellen als phasenhelle intrazelluläre Strukturen im Makrophagenzytoplasma (weiße Pfeile). Im GFP-Kanal bestätigt die Fluoreszenz innerhalb der Makrophagen die Internalisierung. (C) Vergrößerte Ansichten repräsentativer Phagozytoseereignisse zu den Zeitpunkten 0, 1, 4 und 16 h, die den schrittweisen Prozess der Makrophagen-vermittelten Aufnahme von GFP-markierten Krebszellen veranschaulichen. Die Bildsequenz wurde aufgrund klarer Visualisierung makrophagenvermittelter Phagozytoseereignisse als repräsentativ ausgewählt. Weiße Pfeile zeigen Makrophagen, die mit Zielzellen interagieren und diese internalisieren. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

6. Zeitrafferaufnahmen (automatisiertes Live-Cell-Bildgebungssystem)

HINWEIS: Konfigurieren Sie das Bildgebungsprotokoll mithilfe eines automatisierten Live-Cell-Bildgebungssystems Lionheart und der Software Gen5 für die automatisierte Live-Cell-Bildgebung vor dem Assay. Erhalten Sie eine geeignete Schulung, bevor Sie das Bildgebungssystem bedienen, um eine genaue Einrichtung, optimale Leistung und sichere Anwendung sicherzustellen.

  1. Instrumentenvorbereitung
    1. Schalten Sie das Abbildungssystem, das Umweltkontrollmodul und die CO₂-Gasversorgung mindestens 1 Stunde vor der Bildaufnahme ein.
    2. Öffnen Sie das Umweltkontrollfenster in der Software für automatisierte Live-Zell-Bildgebung.
    3. Stellen Sie die Temperatur auf 37 °C und den CO₂-Gehalt auf 5 % ein.
    4. Vergewissern Sie sich, dass die Kammer temperaturstabil innerhalb von ± 0,2 °C und der CO₂-Gehalt bei 5,0 % ± 0,1 % liegt, bevor Sie die Platte einsetzen.
  2. Plattenvorbereitung
    1. Platzieren Sie die 24-Loch-Platte in die Abbildungskammer des Abbildungssystems.
  3. Erstkonfiguration
    1. Öffnen Sie den Task-Manager der Software für automatisierte Live-Zell-Bildgebung.
    2. Wählen Sie [Imager manueller Modus].
    3. Klicken Sie auf [Jetzt aufnehmen], um die Bildaufnahmeparameter zu initialisieren.
    4. Wählen Sie ein 10×-Objektiv.
    5. Wählen Sie Mikroplatte als Filtereinstellung.
    6. Wählen Sie eine 24-Loch-Platte aus der Plattenbibliothek der Software für automatisierte Live-Zell-Bildgebung.
  4. Fokus- und Bildaufbau
    1. Wählen Sie den Phasenkontrastkanal.
    2. Wählen Sie ein repräsentatives Loch (z. B. A1).
    3. Aktivieren Sie den Autofokus vor der zeitraffenden Aufnahme.
    4. Nehmen Sie ein Bild mithilfe des Kamerasymbols auf.
    5. Überprüfen Sie die Zellmorphologie und die Fokusqualität.
    6. Navigieren Sie zu [Verarbeiten/Analysieren].
    7. Wählen Sie [Experiment aus einem Bildsatz erstellen], um das Experiment zu konfigurieren.
  5. Parameter für die zeitraffende Aufnahme
    1. Öffnen Sie das Einstellungsfenster [Verfahren].
    2. Stellen Sie die Temperatur auf 37 °C und den CO₂-Gehalt auf 5 % ein.
    3. Legen Sie unter [Kinetic starten] die Laufzeit auf 16:00:00 fest.
    4. Stellen Sie das Bildaufnahmeintervall auf 0:10:00 ein.
    5. Stellen Sie die Gesamtanzahl der Messungen auf 97 ein.
    6. Verwenden Sie ein Bildaufnahmeintervall von 10–15 Minuten, um zeitliche Auflösung und Phototoxizität auszugleichen, während frühe phagozytische Ereignisse erfasst werden.
  6. Konfiguration der Bildkanäle
    1. Stellen Sie Kanal 1 auf Phasenkontrast ein.
    2. Stellen Sie Kanal 2 auf GFP (Ex 469/35, Em 525/39) ein.
    3. Wählen Sie ein 10×-Objektiv für optimale Sichtfeldgröße und Auflösung.
    4. Stellen Sie Beleuchtung, Integrationszeit und Verstärkung auf [Automatisch] oder passen Sie diese manuell an.
    5. Verwenden Sie eine typische GFP-Belichtungszeit von 100–300 ms, um Signalüberlastung zu vermeiden.
    6. Wenden Sie identische Bildaufnahmebedingungen auf allen Löchern an.
  7. Einrichtung der Bildaufnahmepositionen
    1. Öffnen Sie das Menü [Beacons definieren].
    2. Deaktivieren Sie die Z-Stapel-Aufnahme.
    3. Deaktivieren Sie die Montageaufnahme.
    4. Führen Sie die Bildaufnahme in einer einzigen Fokusebene durch.
    5. Definieren Sie die Bildaufnahmepositionen manuell, indem Sie repräsentative, nicht überlappende Bereiche in jedem Loch mithilfe des Mikroskopsymbols auswählen.
    6. Behalten Sie identische Bildaufnahmepositionen über alle Zeitpunkte hinweg bei.
    7. Wählen Sie pro Loch mindestens 4–6 Sichtfelder aus.
  8. Zeitraffende Aufnahme
    1. Klicken Sie auf [Abspielen], um die automatisierte zeitraffende Bildaufnahme zu starten.
  9. Datenexport und Visualisierung
    1. Öffnen Sie die gespeicherte Experimentdatei nach Abschluss der Aufnahme.
    2. Wählen Sie die Bildaufnahmepositionen aus.
    3. Exportieren Sie die zeitraffenden Daten im MP4-Format.
    4. Öffnen Sie das [Verarbeitungswerkzeug].
    5. Wenden Sie gegebenenfalls [Bildentfaltung] an, um die Visualisierung zu verbessern und repräsentative Phagozytoseereignisse zu identifizieren.
      HINWEIS: Verwenden Sie die zeitraffende Bildaufnahme ausschließlich zur qualitativen Visualisierung. Nicht internalisierte GFP-positive Krebszellen können mit Makrophagen überlappen oder vorübergehend assoziieren, was zu falsch-positiven Signalen führen kann. Führen Sie quantitative Analysen mithilfe eines separaten Endpunktassays durch.

7. Quantifizierung der Phagozytose zum Versuchsende

  1. Entfernung von nicht internalisierten Zellen
    1. Führen Sie den Assay unter identischen Co-Kulturbedingungen durch.
    2. Beenden Sie das Experiment nach 4 h.
    3. Entfernen Sie das Kulturmedium.
    4. Geben Sie 10 mM EDTA in PBS hinzu.
    5. Inkubieren Sie 5 min bei 37 °C.
    6. Spülen Sie vorsichtig mit PBS, um nicht internalisierte, GFP-positive Zellen zu entfernen.
    7. Geben Sie frisches Makrophagen-Medium hinzu.
  2. Bildaufnahme zur Quantifizierung
    1. Nehmen Sie Bilder unter Verwendung von Phasenkontrast- und GFP-Kanälen auf.
    2. Erfassen Sie mindestens 4–6 Bildfelder pro Vertiefung.
    3. Analysieren Sie mindestens drei Vertiefungen pro Bedingung.
  3. Definition phagozytotischer Ereignisse
    1. Identifizieren Sie Makrophagen, die vollständig innerhalb der zellulären Grenze liegende GFP-positive Signale enthalten.
  4. Bildanalyse
    1. Öffnen Sie die Bilder in der ImageJ-Software.
    2. Verwenden Sie das Cell-Counter-Plugin.
    3. Zählen Sie die Gesamtanzahl der Makrophagen.
    4. Zählen Sie die Makrophagen, die internalisierte GFP-positive Zellen enthalten.
  5. Berechnung des Phagozytoseindex
    1. Berechnen Sie: Formel für den Phagozytoseindex; Verhältnis der aufgenommenen GFP-positiven Zellen zur Gesamtanzahl der Makrophagen; Gleichung.
    2. Führen Sie die Analyse verblindet durch.
    3. Wiederholen Sie die Analyse in mindestens drei unabhängigen Experimenten.
  6. Darstellung der Daten
    1. Zeigen Sie repräsentative Zeitrafferbilder chronologisch an (Abbildung 2B und Abbildung 2C).
    2. Zeigen Sie repräsentative Endpunkt-Bilder an (Abbildung 3A und Abbildung 3B).

Analyse der Phagozytose: Makrophagen-Kokultur, anti-CD24 mAb; Mikroskopiebilder, Daten-Diagramm-Vergleich.
Abbildung 3. Quantifizierung der antikörperabhängigen Makrophagenphagozytose mittels Endpunktanalyse. (A) Repräsentative Phasenkontrast- und GFP-Fluoreszenzbilder von Makrophagen, die vier Stunden lang mit GFP-markierten Brustkrebszellen koinkubiert wurden, gefolgt von der Entfernung nicht internalisierter Zellen durch EDTA-Behandlung. Die Phasenkontrast- und GFP-Kanäle wurden überlagert, um Makrophagen und internalisierte GFP-positive Zielstrukturen zu identifizieren. Makrophagen (Zähler 0) und GFP-positive phagozytierende Makrophagen (Zähler 1) wurden mithilfe des Cell Counter-Plugins in ImageJ gezählt. Unter Kontrollbedingungen mit IgG wurden keine phagozytotischen Ereignisse beobachtet, während die Behandlung mit anti-CD24 monoklonalem Antikörper deutliche intrazelluläre GFP-positive Signale innerhalb der Makrophagen zeigte, was auf aktive Phagozytose hinweist. Maßstab = 200 µm. (B) Quantifizierung des Phagozytoseindex, definiert als Anteil der Makrophagen, die GFP-positive Zellen internalisiert haben, bezogen auf die Gesamtzahl der Makrophagen. Der anti-CD24 monoklonale Antikörper erhöhte den Phagozytoseindex im Vergleich zur IgG-Kontrolle signifikant (0,00 ± 0,00 % vs. 18,76 ± 4,01 %, Mittelwert ± SD; n = 6 Felder pro Gruppe; ***p < 0,001, Welch’s ungepaarter t-Test). Die Daten sind repräsentativ für mindestens drei unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergebnisse

Die erfolgreiche Generierung und Polarisation von Makrophagen aus PBMCs wurde mittels morphologischer Beurteilung und Durchflusszytometrie-Analyse bestätigt (Abbildung 1). PBMCs, die durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert wurden, wurden in einem mit M-CSF angereicherten Medium kultiviert, wodurch sich bis zum Tag 7 adhärente Zellen mit charakteristischer Makrophagen-Morphologie bildeten. Nach Stimulation mit IFN-γ und LPS zeigten die Zellen ein Phänotyp, der mit einer Aktivierung unter den angewendeten Bedingungen übereinstimmt. Die Durchflusszytometrie-Analyse zeigte, dass 99,8 % der analysierten Zellen für CD11b positiv waren, was eine effiziente Differenzierung in Makrophagen bestätigt (Abbildung 1). Unter den CD11b-positiven Zellen befand sich die Mehrheit im CD80⁺CD206⁻-Quadranten (95,2 %), was auf eine erfolgreiche Polarisation unter den angegebenen Stimulationsbedingungen hinweist. Diese Ergebnisse bestätigen, dass das Protokoll zuverlässig Makrophagen mit dem erwarteten Markerexpressionsprofil erzeugt.

Mithilfe der Zeitrafferaufnahmen konnte die antikörperabhängige zelluläre Phagozytose direkt visualisiert werden (Abbildung 2). Der Arbeitsablauf zur Bildanalyse sowohl der gewonnenen Zeitrafferdaten als auch der Endpunktdaten ist in Abbildung S1 zusammengefasst. GFP-markierte CD24-positive Brustkrebszellen wurden mit Makrophagen koinkubiert, und phagozytotische Ereignisse wurden anhand der fortschreitenden Internalisierung von GFP-positiven Zellen in Makrophagen im Zeitverlauf identifiziert. Im Fluoreszenzkanal erschienen die eingefangenen Krebszellen als lokalisierte GFP-Signale innerhalb der Makrophagengrenzen, während die entsprechenden Hellfeldaufnahmen phasenhelle intrazelluläre Strukturen zeigten. Die sequenzielle Bildgebung von 1 h bis 16 h verdeutlichte den dynamischen Phagozytoseprozess, einschließlich des initialen Zell-Zell-Kontakts, der Membraninteraktion und der vollständigen Internalisierung der Zielzellen (Abbildung 2B und Abbildung 2C). Hervorgehobene Bereiche und vergrößerte Ansichten zeigen einzelne Aufnahmeeignisse mit klarer zeitlicher Progression der Aufnahme von Krebszellen durch Makrophagen. Im Vergleich zu den IgG-Kontrollbedingungen wiesen die mit Antikörpern behandelten Koinkubationen eine höhere Häufigkeit beobachtbarer phagozytotischer Ereignisse auf.

Um die antikörperabhängige Phagozytose zu quantifizieren, wurde in einem separaten Experiment nach 4-stündiger Kokultur eine Endpunktanalyse durchgeführt, nachdem nicht internalisierte GFP-positive Krebszellen durch eine Behandlung mit 10 mM EDTA entfernt worden waren (Abbildung 3). Phasenkontrast- und GFP-Fluoreszenzbilder wurden verwendet, um Makrophagen und internalisierte GFP-positive Zielstrukturen zu identifizieren. Unter den Kontrollbedingungen mit IgG wurden in allen analysierten Feldern keine phagozytotischen Ereignisse detektiert, was auf eine minimale Basalphagozytose hinweist (Abbildung 3A, oben). Im Gegensatz dazu führte die Behandlung mit anti-CD24 monoklonalem Antikörper zu zahlreichen intrazellulären GFP-positiven Signalen innerhalb der Makrophagen, was mit einer aktiven antikörperabhängigen zellulären Phagozytose übereinstimmt (Abbildung 3A, unten). Die Quantifizierung des Phagozytoseindex zeigte eine signifikante Zunahme von 0,00 ± 0,00 % in der IgG-Gruppe auf 18,76 ± 4,01 % in der mit anti-CD24 behandelten Gruppe (Mittelwert ± SD; n = 6 Felder pro Gruppe; p < 0,001; Abbildung 3B), was eine starke und reproduzierbare antikörpervermittelte phagozytotische Aktivität belegt.

Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass der beschriebene Protokollansatz eine reproduzierbare Differenzierung und Polarisation von Makrophagen ermöglicht und die Echtzeit-Visualisierung sowie die Endpunkt-Quantifizierung der antikörperabhängigen Phagozytose von Krebszellen unterstützt.

Abbildung 1 (Zusatzmaterial). Ablaufschema der Bildanalyse zur Quantifizierung der antikörperabhängigen zellulären Phagozytose. Schematische Übersicht über die Bildaufnahme und -analyse für die antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP). Makrophagen werden unter Kontroll- oder Antikörper-behandelten Bedingungen mit GFP-markierten Krebszellen kultiviert. Die Zeitrafferaufnahme ermöglicht eine qualitative Visualisierung der phagozytotischen Dynamik, während die Endpunkt-Aufnahme aus einem separaten Experiment für die quantitative Analyse verwendet wird. Die Bilder werden mittels Phasenkontrast- und GFP-Fluoreszenzkanälen über mehrere Bildfelder und Vertiefungen aufgenommen. Phagozytoseereignisse werden definiert als Makrophagen, die vollständig innerhalb der zellulären Grenzen liegende GFP-positive Signale enthalten. Die Zellen werden manuell mit dem Cell Counter-Plugin der Bildanalyse-Software ImageJ gezählt, und der Phagozytoseindex wird als Prozentsatz der Makrophagen, die internalisierte GFP-positive Zellen enthalten, im Verhältnis zur Gesamtpopulation der Makrophagen berechnet. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung über biologische Wiederholungen unter Verwendung des Welch’schen ungepaarten t-Tests angegeben.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Mehrere Schritte in diesem Protokoll sind entscheidend, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Erstens beeinflusst die Qualität und Reinheit der PBMC-Isolierung direkt die Ausbeute an Makrophagen und die Differenzierungseffizienz. Ein sorgfältiges Aufschichten verdünnten Blutes auf die Ficoll-Dichtegradienten und die Zentrifugation mit ausgeschalteter Bremse sind unerlässlich, um die Buffy-Coat-Grenzschicht zu erhalten. Unvollständige Erythrozytenlyse oder übermäßige Inkubation mit dem Lysepuffer beeinträchtigen die PBMC-Vitalität. Zweitens muss die proinflammatorische Makrophagenpolarisation vor dem Phagozytose-Assay mittels Durchflusszytometrie überprüft werden; Makrophagen, die CD80 nicht hochregulieren, können eine verminderte phagozytotische Kapazität aufweisen und die Interpretation der durch anti-CD24-Antikörper vermittelten Effekte verfälschen. Drittens ist die Methode der Krebszell-Detachierung wichtig – die Verwendung von Trypsin sollte vermieden werden, da enzymatische Verdauung CD24 von der Zelloberfläche spalten kann, wodurch die Antikörper-Bindungseffizienz verringert wird. Die Detachierung mittels EDTA erhält die Integrität der Oberflächenantigene und wird deshalb empfohlen.

Dieses Protokoll kann an unterschiedliche experimentelle Zielsetzungen angepasst werden. Das E:Z-Verhältnis kann im Vergleich zum hier beschriebenen angepasst werden; höhere Makrophagen-zu-Krebszellen-Verhältnisse als das beschriebene 2:1-Verhältnis (z. B. 3:1 oder 5:1) erhöhen die Häufigkeit phagozytotischer Ereignisse pro Bildausschnitt, was vorteilhaft sein kann, wenn mit Krebszelllinien gearbeitet wird, die eine geringere CD24-Expression aufweisen. Die Konzentration des anti-CD24-Antikörpers (1 µg/mL) wurde für die in dieser Studie verwendeten Zelllinien optimiert, jedoch wird eine Dosis-Wirkungs-Titration empfohlen, wenn das Protokoll an andere Tumormodelle oder andere Kandidatenantikörper angepasst wird. Falls bei Langzeit-Aufnahmen ein Verlust des GFP-Signals beobachtet wird, kann eine Verringerung der Anregungslichtintensität in Kombination mit einer Erhöhung der Belichtungszeit oder des Kameraverstärkungsgrades (Gain) eine Photobleiche vermindern, ohne die zeitliche Auflösung zu beeinträchtigen. Fokale Drift während der 16-stündigen Aufnahme kann durch eine Verlängerung der Equilibrierungsphase auf 30 min und die Aktivierung der Autofokus-Funktion des automatisierten Mikroskops ausgeglichen werden. Falls während der Bildaufnahme ein Ablösen der Makrophagen beobachtet wird, sollte der Schritt der nächtlichen Adhärenz verlängert werden, und die Platte sollte beim Übertragen auf den Mikroskoptisch mit minimalem Rütteln behandelt werden.

Diese Methode weist mehrere Einschränkungen auf, die berücksichtigt werden sollten. Erstens bewertet das derzeitige Protokoll die Phagozytose anhand des Verschwindens des GFP-Signals oder der Kolokalisation mit Makrophagen, was jedoch keine Unterscheidung zwischen vollständigem Einschluss, Trogozytose (Membran-Nibbeln) und der Eliminierung von Krebszellen durch andere Mechanismen ermöglicht18. Das Protokoll basiert auf zweidimensionalen Monolayer-Kokulturen, die die dreidimensionale Architektur und zelluläre Komplexität der Tumormikroumgebung (TME) nicht vollständig nachbilden19. Faktoren wie die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix, Hypoxie und Interaktionen mit anderen Immunzellpopulationen (z. B. regulatorischen T-Zellen und myeloischen suppressorischen Zellen), die das phagozytische Verhalten von Makrophagen in vivo beeinflussen, werden in diesem System nicht erfasst. Außerdem zeigen Makrophagen, die aus PBMCs stammen, eine Spender-abhängige Variabilität hinsichtlich Differenzierungseffizienz, Polarisationsstatus und Siglec-10-Expressionsniveau, was zu experimentellen Unterschieden in den Phagozytoseraten beitragen kann. Daher wird empfohlen, mindestens drei unabhängige biologische Wiederholungen mit Makrophagen verschiedener Spender durchzuführen. Ergänzende Assays wie konfokale Z-Stack-Bildgebung oder pH-sensible Farbstoffe (z. B. pHrodo) können eingesetzt werden, um die echte Internalisierung in den phagolysosomalen Kompartiment zu bestätigen. Außerdem kann die Variabilität der CD24-Expressionsniveaus in den Zielzellen das Ausmaß der antikörperabhängigen Phagozytose beeinflussen. Daher sollte der CD24-Oberflächenexpression auf Tumorzellen vor dem Assayaufbau überprüft und nur Zellpräparationen mit konsistenten und ausreichenden CD24-Expressionsniveaus verwendet werden, um die Reproduzierbarkeit über verschiedene Experimente hinweg sicherzustellen.

Die Bedeutung dieses Protokolls liegt in seiner Fähigkeit, die dynamische, kinetische Natur der antikörperabhängigen Phagozytose zu erfassen, was mit herkömmlichen Endpunkt-Assays nicht möglich ist. Phagozytose-Assays auf Basis der Durchflusszytometrie liefern, obwohl sie quantitativ und hochdurchsatzfähig sind, lediglich eine Messung zu einem einzigen Zeitpunkt und erfordern das Sammeln der Zellen, wodurch die Kokultur gestört wird und eine longitudinale Beobachtung derselben Zellpopulationen ausgeschlossen ist. Bisherige Zeitrafferaufnahmeverfahren zur makrophagenvermittelten Phagozytose konzentrierten sich weitgehend auf Kokulturen von IFN-γ- und LPS-polarisierten Makrophagen ohne antikörpervermittelte Opsonierung oder auf komplementvermittelte Phagozytose von roten Blutkörperchen statt auf antikörpergesteuerte Phagozytose von Krebszellen20. Die vorliegende Methode befasst sich gezielt mit der Evaluierung der Blockade von angeborenen immunologischen Checkpoints, indem sie die Opsonierung mit anti-CD24-Antikörpern mit aus humanen PBMCs stammenden Makrophagen und GFP-markierten Krebszellen kombiniert und so ein physiologisch relevantes sowie visuell aussagekräftiges Ergebnis liefert. Der Einsatz eines automatisierten Mikroskops mit Umweltkontrolle ermöglicht eine objektive, mehrfache Datenaufnahme über längere Zeiträume, wodurch Beobachterbias verringert und die statistische Aussagekraft erhöht wird.

Dieses Protokoll hat breite potenzielle Anwendungen in den Bereichen Krebsimmunologie und Immuntherapie. Es kann direkt zur Bewertung anderer potenzieller Makrophagen-Checkpoint-Ziele angepasst werden, indem der geeignete blockierende Antikörper verwendet wird. Über Brustkrebs hinaus kann das Protokoll auf jede CD24-überexprimierende maligne Erkrankung angewendet werden, einschließlich Ovarialkarzinom, Pankreasadenokarzinom und kleinzelligem Lungenkrebs, indem die entsprechenden GFP-markierten Tumorzelllinien verwendet werden. Diese standardisierte Bildgebungsplattform kann als wertvolles präklinisches Werkzeug dienen, um den Wirkmechanismus neuartiger makrophagengerichteter Immuntherapien zu charakterisieren und die rationale Entwicklung von Kombinationsbehandlungsregimen zu unterstützen.

Offenlegungen

Die Autoren geben keinen Interessenkonflikt an.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Cancer Biology and Precision Therapeutics Center der China Medical University im Rahmen des Featured Areas Research Center Programms im Rahmen des Higher Education Sprout Project des Ministeriums für Bildung (MOE) in Taiwan (CBPTC-PROJ-5-2) unterstützt.

Wir danken dem Cancer Biology and Precision Therapeutics Center für die finanzielle Unterstützung und akademische Förderung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-StammlösungSigma-Aldrich (oder gleichwertig)E7889 (oder gleichwertig)Wird zur Herstellung einer 10 mM EDTA-Arbeitslösung in PBS für die Zellablösung verwendet
24-Loch-Gewebekulturplatten (TC-behandelt)Corning (oder gleichwertig)3524Wird für die Kokultur von Makrophagen und Krebszellen während des Phagozytose-Assays verwendet
Anti-humanes CD206-Antikörper (Durchflusszytometrie)BioLegend (oder gleichwertig)321122 (oder gleichwertig)Marker für das alternative Makrophagen-Phänotyp
Anti-humaner monoklonaler CD24-AntikörperThermo Fisher Scientific (oder gleichwertig)MA1-91384 (oder gleichwertig)Wird zum Opsonieren von Krebszellen für die antikörperabhängige Phagozytose verwendet
Automatisiertes Live-Cell-Imaging-System mit Umweltkammer (z. B. Lionheart FX)Agilent Technologies (oder gleichwertig)BioTek Lionheart FX Automated MicroscopeErmöglicht langfristige Zeitrafferaufnahmen unter kontrollierten Temperatur- und 2-Bedingungen
Bildgebungssoftware für automatisiertes Live-Cell-Imaging (z. B. Gen5)Agilent Technologies (oder gleichwertig)N/VWird zur Aufnahme und Analyse von Zeitrafferaufnahmen verwendet
Zentrifuge (Schwenkkorbrotor)Thermo Fisher Scientific (oder gleichwertig)Multifuge X4R Pro mit TX-1000-Rotor (oder gleichwertig)Wird für die PBMC-Isolierung und Zellwaschschritte verwendet
2-Inkubator (37°C, 5 % 2)Thermo Fisher Scientific (oder gleichwertig)Forma Direct Heat 2-Inkubator (oder gleichwertig)Sichert physiologische Bedingungen für die Zellkultur
2-Gasversorgung mit DruckreglerAgilent Technologies (oder gleichwertig)N/VLiefert 2 für die Umweltsteuerung im Inkubator und im Imaging-System
Kegelröhrchen (15 mL und 50 mL)Corning (oder gleichwertig)352070 (oder gleichwertig)Wird für PBMC-Isolierung, Waschen und Zentrifugationsschritte verwendet
EDTA-beschichtete Blutentnahmeröhrchen (Vacutainer)BD Biosciences (oder gleichwertig)367863 (oder gleichwertig)Wird zur Entnahme von Vollblutproben von Spendern verwendet
Ficoll-Paque PLUSCytiva (oder gleichwertig)17144003 (oder gleichwertig)Dichtegradientenmedium zur Isolierung von PBMCs
Durchflusszytometer (z. B. FACSCanto II)BD Biosciences (oder gleichwertig)BD FACSCanto II Wird für die phänotypische Analyse von Makrophagen verwendet
Kompensationsperlen (Durchflusszytometrie)Biolegend (oder gleichwertig)424602Wird für Einzelfarben-Kompensationskontrollen verwendet
FITC-markierter anti-humaner CD11b-Antikörper (Durchflusszytometrie)BioLegend (oder gleichwertig)101205 (oder gleichwertig)Marker zur Identifizierung von Makrophagen
PE-markierter anti-humaner CD80-Antikörper (Durchflusszytometrie)BioLegend (oder gleichwertig)375410 (oder gleichwertig)Marker, der mit dem aktivierten Makrophagen-Phänotyp assoziiert ist
GFP-exprimierende Brustkrebszelllinie (MDA-MB-468)ATCC (oder gleichwertig)HTB-132 (oder gleichwertig)Zielzellen im Phagozytose-Assay; GFP ermöglicht die Visualisierung
ImmunoCult-SF-MakrophagenmediumSTEMCELL Technologies (oder gleichwertig)10961 (oder gleichwertig)Serumfreies Medium zur Differenzierung von Makrophagen
Dulbecco’s modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific (oder gleichwertig)12100046Wird für die Kultur und Resuspension von Krebszellen verwendet
Isotyp-Kontrollantikörper (IgG)Bio X Cell (oder gleichwertig)BE0297 (oder gleichwertig)Negativer Kontrollantikörper für den antikörperabhängigen Phagozytose-Assay
Lipopolysaccharid (LPS)Sigma-Aldrich (oder gleichwertig)L2630 (oder gleichwertig)Stimulus zur Aktivierung von Makrophagen in Kombination mit IFN-γ
Rekombinanter humaner Interferon-gamma (IFN-γ)STEMCELL Technologies (oder gleichwertig)78020 (oder gleichwertig)Zytokin zur Aktivierung von Makrophagen
Rekombinanter humaner Makrophagen-Koloniestimulierender Faktor (M-CSF)STEMCELL Technologies (oder gleichwertig)78057 (oder gleichwertig)Wachstumsfaktor zur Differenzierung von Makrophagen
Pasteur-Pipetten oder serologische PipettenJetbiofil (oder gleichwertig)GSP010010 (oder gleichwertig)Wird für die Flüssigkeitshandhabung während der PBMC-Isolierung und Zellkultur verwendet
PBS (Ca2+-/Mg2+-frei)Thermo Fisher Scientific (oder gleichwertig)BP399-500 (oder gleichwertig)Puffer zur Zellwäsche und Verdünnungsschritte
Petri-Schalen (100 mm, nicht–gewebekulturbehandelt)Corning (oder gleichwertig)430591Wird für die Differenzierung von Makrophagen mittels Adhärenzselektion verwendet
Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen (RBC)BioLegend (oder gleichwertig)420301 (oder gleichwertig)Wird zur Entfernung roter Blutkörperchen während der PBMC-Isolierung verwendet
Viobility 405/452 Fixierbarer FarbstoffMiltenyi Biotec (oder gleichwertig)130-130-404 (oder gleichwertig)Wird zur Beurteilung der Zellviabilität während der Durchflusszytometrie-Analyse verwendet
DAPISigma-Aldrich (oder gleichwertig)D9542 (oder gleichwertig)Wird zur Ausschließung toter Zellen in der Durchflusszytometrie verwendet

Referenzen

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