Ein hemisphärengetrenntes Protokoll zur morphologischen Beobachtung und kombinierten RNA-Protein-Extraktion in murinen Gehirnregionen

Xinyu Zhu; Yukun Li; Lianjun Zhang; Yiyun Zou; Shanxiang Gao; Yuan Tian; Jing Xu; Chunqing Liu

doi:10.3791/71465

Methodenartikel

Ein hemisphärengetrenntes Protokoll zur morphologischen Beobachtung und kombinierten RNA-Protein-Extraktion in murinen Gehirnregionen

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DOI:

10.3791/71465

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1. September 2026

Xinyu Zhu^*¹^,² , Yukun Li^*³ , Lianjun Zhang³ , Yiyun Zou³ , Shanxiang Gao³ , Yuan Tian³ , Jing Xu⁴ , Chunqing Liu¹

¹College of Medical Laboratory, Dalian Medical University, ²The Transvascular Implant Instrument Research Institute, ³The Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, ⁴College of Basic Medical Sciences of Dalian Medical University

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll teilt murine Gehirne in zwei Hälften. Eine Hemisphäre wird für die morphologische Färbung verwendet, die andere für die Gewinnung von RNA und Proteinen. Diese Strategie verringert den Tierverbrauch, folgt den 3R-Prinzipien und minimiert die Variabilität zwischen Tieren.

Zusammenfassung

In der täglichen neurowissenschaftlichen Forschung erfordern morphologische Färbungen und molekulare Analysen von Nukleinsäuren/Proteinen typischerweise separate Versuchstiere, was den Tierversuchsaufwand erhöht und nicht mit dem 3R-Tierschutzprinzip vereinbar ist. Dieses Protokoll beschreibt einen Gewebeallokierungsworkflow für murines Hirngewebe, der es ermöglicht, aus einem einzigen Tier gepaarte morphologische und molekulare Analysen durchzuführen. Nach transkardialer Perfusion mit 0,9 %iger Kochsalzlösung wird das Gehirn in zwei Hemisphären geteilt. Eine Hemisphäre wird in 4 % Paraformaldehyd fixiert, um Immunhistochemie und Immunfluoreszenz durchzuführen; Schnitte, die in einer Lösung aus Saccharose, Ethylenglykol und Polyvinylpyrrolidon (PVP) gelagert werden, behalten bis zu sieben Jahre lang eine zuverlässige Färbungsqualität. Die kontralaterale Hemisphäre wird bei -80 °C kryokonserviert, um RNA und Protein gemeinsam zu extrahieren, wobei die Ausbeute ausreicht für nachgeschaltete qPCR- und Western-Blot-Analysen. Bei 9–10 mg schweren Entorhinalkortex-Stanzproben ergibt dieses Verfahren geringere RNA- und Proteinmengen als die getrennte Extraktion von RNA oder Protein allein, doch die gewonnenen Biomoleküle sind weiterhin ausreichend für die molekulare Detektion. Dieser Workflow reduziert den Tierversuchsaufwand und eliminiert interindividuelle Unterschiede zwischen gepaarten morphologischen und molekularen Analysen. Er stellt eine praktikable Methode zur Gewebepräparation für die mehrdimensionale Profilierung diskreter muriner Hirnsubregionen bereit.

Einleitung

Die Neurowissenschaftsforschung hat in den letzten Jahrzehnten stark zugenommen und dabei wesentliche Mechanismen aufgedeckt, die die Physiologie des menschlichen Gehirns, das Auftreten neurologischer Erkrankungen und die Entwicklung von Therapien steuern. Tierversuche bleiben für neurowissenschaftliche Untersuchungen unverzichtbar, da sie kontrollierbare und reproduzierbare Plattformen bieten, um die neuronale Entwicklung, die physiologische Funktion und pathologische Prozesse zu erforschen. Durch experimentelle Eingriffe und histologische Beobachtungen an Mäusen können Forscherende neuronale Signalübertragung, die Bildung neuronaler Schaltkreise sowie neuronale Verhaltensassoziationen charakterisieren. Parallel zu technischen Fortschritten ist die Tierexperimentelle Ethik zu einem zentralen Anliegen geworden. Die 3R-Prinzipien (Ersatz, Reduktion und Verfeinerung) gelten heute weltweit als Standard für alle Tierversuche¹^,² und verlangen von Forschenden, den Einsatz von Tieren so gering wie möglich zu halten, ohne dabei die Zuverlässigkeit der experimentellen Ergebnisse zu beeinträchtigen.

Innovative Werkzeuge wie bedingte Knockout-Systeme ermöglichen eine präzise genetische Manipulation in definierten Teilbereichen des murinen Gehirns³. Diese Fortschritte haben die intensive Erforschung mikroskaliger Gehirnareale, wie dem hippocampalen CA1, CA3 und DG, die Lernen, Gedächtnis und Stimmung regulieren, vorangebracht⁴. Die Entschlüsselung der komplexen Funktionen dieser kleinen Gehirnregionen erfordert koordinierte morphologische, transkriptionelle und proteinebenebezogene Messungen. Leider stellt ihr geringes Gewebevolumen eine erhebliche technische Hürde für die parallele Detektion mehrerer Parameter dar.

Die morphologische Färbung, die RNA-Quantifizierung und der immunologische Protein-Nachweis sind drei routinemäßige zentrale Analyseverfahren in der Neurowissenschaft. Traditionelle Versuchsdesigns erfordern drei separate Tiergruppen von Nagern, um diese drei Testarten durchzuführen. Diese Vorgehensweise erhöht den Tierversuchsaufwand erheblich und führt zu beträchtlichen biologischen Unterschieden zwischen den Tieren, was die Vergleichbarkeit zwischen histologischen und molekularen Datensätzen beeinträchtigt. Ein einheitlicher Arbeitsablauf, der morphologische und molekulare Signale aus einem einzigen Tier gewinnt, würde diese beiden entscheidenden Einschränkungen deutlich verringern und besser dem Reduktionsprinzip der 3R-Grundsätze entsprechen.

Hier berichten wir über ein reproduzierbares Protokoll zur hemisphärischen Trennung von murinem Hirngewebe. Nach systemischer Spülung mit Kochsalzlösung wird das gesamte Gehirn in zwei Hemisphären geteilt: Eine Hemisphäre wird für morphologische Untersuchungen fixiert, die kontralaterale Hemisphäre hingegen kryokonserviert, um gleichzeitig RNA und Proteine zu isolieren. Gewebe, das fixiert und in einem schützenden Puffer aus Saccharose-Ethylenglykol-Polyvinylpyrrolidon (PVP) gelagert wird, zeigt bis zu sieben Jahre lang stabile, hochwertige Färbesignale für immunhistochemische und immunfluoreszenztechnische Analysen. Wir validierten diese Methode anhand winziger 9–10 mg schwerer Gewebeproben aus der entorhinalen Rinde, einem Gewebe, das leichter ist als häufig untersuchte Regionen wie Hippocampus und präfrontaler Kortex. Der erfolgreiche Nachweis in dieser kleinen Gewebeprobe zeigt, dass auch kleinere Hirnsubregionen wie Hypothalamus und Amygdala mit diesem Arbeitsablauf kompatibel sind. Obwohl das Protokoll geringere RNA- und Protein-Konzentrationen ergibt als spezialisierte, auf einen einzigen Zweck ausgelegte Extraktionskits, besitzen die isolierten Biomoleküle eine ausreichende Qualität, um standardmäßige nachgeschaltete qPCR- und Western-Blot-Analysen zu ermöglichen. Dieser Arbeitsablauf reduziert den Tierversuchsbedarf und eliminiert interindividuelle Unterschiede zwischen gepaarten morphologischen und molekularen Analysen. Er stellt eine praktikable Gewebeprotektionsmethode für die mehrdimensionale Profilierung diskreter muriner Hirnsubregionen bereit.

Protokoll

Ethische Erklärung

Alle in dieser Studie durchgeführten Tierversuche wurden von dem Institutional Animal Care and Use Committee der Dalian Medical University (Genehmigungsnummer AEE18026 für Rattenversuche und Nummer AEE24261 für Mausversuche), Volksrepublik China, genehmigt. Alle experimentellen Protokolle wurden gemäß den ethischen Richtlinien für Labortiere umgesetzt und entsprachen vollständig den 3R-Grundsätzen (Reduktion, Ersetzung und Verfeinerung) für die Tierversuchsforschung. Während des gesamten experimentellen Ablaufs wurden strenge Maßnahmen ergriffen, um Leid und Belastung der Tiere wirksam zu verringern. Gleichzeitig wurde die Anzahl der Versuchstiere auf das notwendige Minimum beschränkt, um die Zuverlässigkeit und Aussagekraft der statistischen Analyseergebnisse sicherzustellen. Eine vollständige Liste der in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und Geräte finden Sie in der Tabelle der Materialien.

1. Vorbereitung der Versuchstiere und transkardiale Perfusionschirurgie

Anästhesie und präoperative Vorbereitung
1. Verwenden Sie für dieses Protokoll erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten oder C57BL/6-Mäuse im spezifizierbaren-pathogenfreien (SPF) Status. Halten Sie die Tiere in einer temperaturgeregelten Umgebung (22 ± 2 °C) mit einem 12-Stunden-Licht-/Dunkelwechsel. Geben Sie den Tieren ad libitum Zugang zu sterilisierter Nahrung und Wasser.
2. Verabreichen Sie Natriumpentobarbital mittels intraperitonealer Injektion in einer Dosis von 80 mg/kg für Ratten oder 50 mg/kg für Mäuse zur Einleitung der Anästhesie (siehe Abbildung 1).
Transkardiale Perfusionsprozedur
1. Fixieren Sie die anästhesierten Tiere in Rückenlage auf einem Operationsbrett.
2. Öffnen Sie die Bauchdecke mittig mit einer geraden Schere vom Xiphoidanhang bis zur Schambeinfuge. Durchtrennen Sie bilateral die seitliche Brustwand, um das Herz vollständig freizulegen.
3. Perfundieren Sie das Tier mit eiskalter 0,9%iger Kochsalzlösung bei konstanter Flussrate: 100–150 mL über 10–15 Minuten für Ratten und 20–30 mL über 5–8 Minuten für Mäuse.
Gehirnentnahme und Hemisphärenseparation
1. Amputieren Sie den Kopf der Tiere nach Abschluss der Perfusion mit einer großen chirurgischen Schere. Schneiden Sie die Kopfhaut entlang der Mittellinie auf, um den Schädel freizulegen.
2. Heben Sie das Gehirn vorsichtig mit einem sterilen Spatel aus der Schädelhöhle. Überführen Sie das gesamte Gehirn rasch in eine sterile Petrischale, die auf Eis liegt.
3. Teilen Sie das Gehirn mit einer sterilen, RNase-freien Rasierklinge entlang der sagittalen Naht symmetrisch in die linke und rechte Hemisphäre.
4. Überführen Sie die linke Hemisphäre unverzüglich in ein 15-mL-Zentrifugenröhrchen, das 10 mL eiskalte 4%ige Paraformaldehydlösung enthält, zur Fixierung. Überführen Sie die rechte Hemisphäre in ein beschriftetes, RNase-freies Kryoröhrchen, schockgefrieren Sie sie in flüssigem Stickstoff und lagern Sie sie bei -80 °C bis zur RNA- und Proteingewinnung.

2. Fixierung, Schnitt und Langzeitlagerung von Hirngewebe

Fixierung und Dehydrierung
1. Das linke Hemisphäre vollständig in eine 4%ige Paraformaldehydlösung eintauchen und das Gewebe 24 h bei 4 °C fixieren. Nach Abschluss der Fixierung das Gehirnhemisphäre in ein 15-mL-Zentrifugenröhrchen mit 30%iger Saccharoselösung überführen und das Gewebe bei 4 °C dehydrieren.
2. Die 30%ige Saccharoselösung alle 24 Stunden erneuern, bis das Hirngewebe auf den Boden des Röhrchens sinkt.
Vorbereitung von Kryoschnitten
1. Das dehydrierte Gehirnhemisphäre aus der Saccharoselösung nehmen und überschüssige Flüssigkeit vorsichtig mit steriler Filterpapier abtupfen.
2. Das Gehirnhemisphäre mit einem Eintauchmedium für optimale Schneidebedingungen (OCT) auf die Probenaufnahme des Kryostaten montieren.
3. Serielle koronare Gehirnschnitte mit einer Dicke von 30 µm mithilfe eines Kryostaten schneiden. Aufeinanderfolgende Schnitte in einer 24-Loch-Platte mit steriler 0,01 M PBS sammeln.
Langzeitlagerung von Gehirnschnitten
1. Die Kryoprotektionslösung zur Konservierung von Gehirnschnitten im Voraus herstellen: 2 g PVP400, 60 g Saccharose und 60 mL Ethylenglycol zu 100 mL 0,01 M PBS hinzufügen. Die Lösung bei Raumtemperatur umrühren, bis alle Bestandteile vollständig gelöst sind, und bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.

3. RNA-Extraktion mit TRIzol

Gewebehomogenisierung und Phasentrennung
1. Homogenisieren Sie das entorhinale kortikale Gewebe in 1 mL TRIzol-Reagenz unter Verwendung eines ultrafeinen Homogenisators und inkubieren Sie das Homogenat 15 min auf Eis. Zentrifugieren Sie 5 min bei 8.000 × g bei 4 °C.
2. Geben Sie 200 µL Chloroform hinzu und wirbeln Sie 10 s im Vortex. Zentrifugieren Sie 15 min bei 5.600 × g bei 4 °C. Überführen Sie anschließend die obere wässrige Phase in ein RNase-freies Röhrchen. Fügen Sie 500 µL Isopropanol hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei -20 °C, um die RNA auszufällen. Zentrifugieren Sie erneut.
RNA-Fällung, Waschen und Qualitätsbeurteilung
1. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie den RNA-Pellet mit 1 mL 75 %igem Ethanol. Zentrifugieren Sie 5 min bei 5.600 × g bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand, trocknen Sie den Pellet 10 min bei Raumtemperatur und lösen Sie die RNA 10 min in 20 µL DEPC-behandeltem Wasser auf.
2. Bestimmen Sie die RNA-Konzentration und -reinheit (A₂₆₀/A₂₈₀) mithilfe eines Spektrophotometers. Lagern Sie die RNA bis zur weiteren Analyse bei -80 °C.

4. Gesamtproteingewinnung mit dem Minute-Kit

Gewebelyse und Homogenisierung
1. Spin-Säule und Sammelröhrchen auf Eis vorkühlen. Das Gewebe in 100 µL Zelllysepuffer mit einem feinen Homogenisator homogenisieren. Den Homogenisator mit weiteren 100 µL Zelllysepuffer ausspülen und die Lysate vereinigen.
Proteingewinnung und Quantifizierung
1. Das Homogenat in die Spin-Säule überführen und 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
2. Bei 11.000–14.300 × g 2 min zentrifugieren.
3. Das Sammelröhrchen unmittelbar nach der Zentrifugation auf Eis stellen und die Spin-Säule entsorgen. Die Protein-Konzentration mittels BCA-Assay bestimmen.

5. Gleichzeitige RNA- und Proteingewinnung aus dem entorhinalen Kortex (9–10 mg)

Vorbereitung vor dem Experiment und Reagenzvorbereitung
1. Verwenden Sie das DNA/RNA/Protein-Kit für alle Extraktionsschritte. Verwenden Sie ausschließlich zertifizierte RNase-freie und DNase-freie Verbrauchsmaterialien (siehe Abbildung 2).
2. Stellen Sie den Lysepuffer unmittelbar vor der Verwendung frisch her: Geben Sie Proteaseinhibitorcocktail im Verhältnis 1:100 zum vom Kit bereitgestellten Lysepuffer hinzu.
Gewebelyse und Phasentrennung
1. Entnehmen Sie die gefrorene rechte Gehirnhemisphäre aus der Lagerung bei -80 °C und legen Sie sie auf Eis. Sammeln Sie mithilfe eines sterilen, RNase-freien Stanzgeräts 9–10 mg Gewebe aus der Zielregion des Gehirns.
2. Homogenisieren Sie das Gewebe vollständig auf Eis mit einem elektrischen Gewebehomogenisator, bis keine sichtbaren Gewebefragmente mehr vorhanden sind. Inkubieren Sie das Homogenat 10 min auf Eis, um eine vollständige Lyse sicherzustellen.
3. Geben Sie 200 µL des vom Kit bereitgestellten Trennreagens zum Homogenat hinzu. Vortexen Sie das Gefäß kräftig für 30 s und inkubieren Sie es 3 min bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie das Gefäß 15 min bei 4 °C mit 8.000 × g, um eine vollständige Phasentrennung zu erreichen.
RNA-Reinigung und Elution
1. Entnehmen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase mit einer RNase-freien Pipettenspitze. Überführen Sie die gewonnene wässrige Phase in ein neues, RNase-freies 1,5-mL-Gefäß. Fügen Sie ein gleiches Volumen an 100 % Ethanol zur wässrigen Phase hinzu und mischen Sie gründlich.
2. Überführen Sie 700 µL der Mischung in die vom Kit bereitgestellte RNA-Reinigungssäule. Zentrifugieren Sie die Säule 1 min bei Raumtemperatur mit 5.600 × g.
3. Geben Sie 500 µL des vom Kit bereitgestellten RNA-Waschpuffers 1 auf die Säule. Zentrifugieren Sie die Säule 1 min bei Raumtemperatur mit 5.600 × g.
4. Fügen Sie anschließend 500 µL des vom Kit bereitgestellten RNA-Waschpuffers 2 zur Säule hinzu und zentrifugieren Sie erneut. Zentrifugieren Sie die leere Säule 2 min bei Raumtemperatur mit 8.000 × g, um restliches Ethanol vollständig aus der Säulenmembran zu entfernen.
5. Überführen Sie die Säule in ein neues, RNase-freies 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 30–50 µL RNase-freies Wasser (vorgewärmt auf 60 °C) direkt in die Mitte der Säulenmembran. Inkubieren Sie die Säule 2 min bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Säule 1 min bei Raumtemperatur mit 8.000 × g, um die RNA zu eluieren.
Proteinfällung und Auflösung
1. Geben Sie 750 µL Isopropanol zur verbleibenden organischen Phase und Interphase im ursprünglichen Gefäß nach Entfernung der wässrigen Phase für die RNA-Extraktion hinzu. Inkubieren Sie die Mischung 30 min bei -20 °C, um Proteine auszufällen.
2. Zentrifugieren Sie das Gefäß 10 min bei 4 °C mit 8.000 × g. Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie das Proteinpellet intakt am Boden des Gefäßes auf.
3. Geben Sie 1 mL 95 % Ethanol zum Proteinpellet. Vortexen Sie das Gefäß kurz, um das Pellet zu waschen. Zentrifugieren Sie das Gefäß 5 min bei 4 °C mit 8.000 × g und entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Waschschritt insgesamt dreimal.
4. Trocknen Sie das Proteinpellet 5–10 min bei Raumtemperatur, bis es durchscheinend wird und kein sichtbares Restethanol mehr vorhanden ist.
5. Geben Sie 50–100 µL einer 5–10 %igen SDS-Lösung zum getrockneten Pellet hinzu. Vortexen Sie das Gefäß kräftig für 1 min und inkubieren Sie es 10 min auf Eis, um das Protein vollständig aufzulösen. Zentrifugieren Sie das Gefäß 5 min bei 4 °C mit 8.000 × g. Sammeln Sie den Überstand als endgültigen Proteinauszug.

6. Immunhistochemische (IHC) Färbung

Vorbehandlung der Schnitte und Inaktivierung endogener Enzyme
1. Entnehmen Sie die Gehirnschnitte aus der -20 °C-Kryoschutzlagerung. Überführen Sie die Schnitte mit einer Glasnadel in eine 24-Loch-Platte, die 0,01 M PBS (pH 7,4) enthält.
2. Waschen Sie die Schnitte dreimal mit 0,01 M PBS, jeweils 5 min, bei Raumtemperatur auf einem Schüttler.
3. Incubieren Sie die Schnitte 10 min bei Raumtemperatur mit einer 3 %igen Wasserstoffperoxid-Peroxidase-Blocker-Lösung, um die endogene Peroxidase-Aktivität zu hemmen. Wiederholen Sie die Waschschritte nach der Blockade.
Permeabilisierung und unspezifische Blockade
1. Incubieren Sie die Schnitte 30 min bei Raumtemperatur auf einem Schüttler in 0,5 % Triton X-100 zur Permeabilisierung der Zellmembran. Wiederholen Sie die Waschschritte.
2. Incubieren Sie die Schnitte 30 min bei Raumtemperatur in 4 % Rinderserumalbumin, gefolgt von einer Inkubation mit einem unspezifischen Färbungsinhibitor für weitere 30 min bei Raumtemperatur.
Inkubation mit primären und sekundären Antikörpern
1. Verdünnen Sie die primären Antikörper in 1 % BSA-Lösung in folgenden optimierten Verdünnungen: Doublecortin (DCX, 1:4000), neuronales nukleäres Antigen (NeuN, 1:3000), ionisiertes Calcium-bindendes Adapterprotein 1 (Iba-1, 1:2000) und gliales fibrilläres saures Protein (GFAP, 1:2000).
2. Geben Sie 200 µL der verdünnten primären Antikörperlösung in jedes Loch, wobei sichergestellt werden muss, dass die Schnitte vollständig bedeckt sind.
3. Geben Sie 200 µL biotinmarkierten sekundären Antikörper in jedes Loch. Inkubieren Sie die Schnitte 30 min bei Raumtemperatur.
4. Waschen Sie die Schnitte dreimal mit 0,01 M PBS, jeweils 5 min. Geben Sie 300 µL Streptavidin-Peroxidase-Konjugat in jedes Loch. Inkubieren Sie die Schnitte 30 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie die Waschschritte nach der Inkubation.
Chromogene Entwicklung mit 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) und Abdecken mit Deckgläsern
1. Geben Sie 200 µL DAB-Arbeitslösung in jedes Loch. Überwachen Sie die chromogene Reaktion unter dem Lichtmikroskop.
2. Bringen Sie die Schnitte mit einer Glasnadel auf mit Gelatine beschichtete Objektträger auf. Lassen Sie die Objektträger vollständig bei Raumtemperatur trocknen.
3. Dehydrieren Sie die Objektträger durch eine aufsteigende Ethanolreihe (50 %, 70 %, 90 %, 95 %, 100 %, 100 % Ethanol, jeweils 5 min), gefolgt von zwei Klärungen in Xylol zu je 5 min.

7. Immunfluoreszenz-(IF-)Färbung

Vorbehandlung und Permeabilisierung der Schnitte
1. Entnehmen Sie die Gehirnschnitte aus der Kryokonservierungslösung bei -20 °C. Überführen Sie die Schnitte in eine 24-Loch-Platte, die 0,01 M PBS (pH 7,4) enthält.
2. Waschen Sie die Schnitte dreimal mit 0,01 M PBS, jeweils 5 min pro Waschgang, bei Raumtemperatur auf einem Schüttler.
3. Incubieren Sie die Schnitte 30 min bei Raumtemperatur auf einem Schüttler in 0,5 % Triton X-100.
4. Waschen Sie die Schnitte nach der Permeabilisierung dreimal mit 0,01 M PBS, jeweils 10 min pro Waschgang.
Blockieren und Inkubation mit primärem Antikörper
1. Incubieren Sie die Schnitte 1 h bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer in einer Blockierungslösung, die 4 % BSA und einen Inhibitor für unspezifische Färbung enthält.
2. Aspirieren Sie die Blockierungslösung. Verdünnen Sie die primären Antikörper in einer 1 %igen BSA-Lösung in optimierten Konzentrationen und geben Sie 300 µL der verdünnten primären Antikörperlösung in jedes Loch. Inkubieren Sie die Schnitte über Nacht bei 4 °C in einer feuchten, lichtdichten Kammer.
Inkubation mit sekundärem Antikörper
1. Am nächsten Tag erwärmen Sie die Schnitte 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln vor. Sammeln Sie die primäre Antikörperlösung wieder auf und waschen Sie die Schnitte dreimal mit 0,01 M PBS, jeweils 10 min pro Waschgang, auf einem Schüttler im Dunkeln.
2. Verdünnen Sie fluorophor-markierte sekundäre Antikörper in 1 %iger BSA-Lösung gemäß der vom Hersteller empfohlenen Verdünnung. Geben Sie 300 µL der sekundären Antikörperlösung in jedes Loch. Inkubieren Sie die Schnitte 1–2 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
3. Waschen Sie die Schnitte fünfmal mit 0,01 M PBS, jeweils 5 min pro Waschgang, im Dunkeln.

8. Quantitative Echtzeit-PCR (qPCR)-Analyse

RNA-Genomisches DNA-Entfernung und Reverse Transkription
1. Führen Sie die Reverse Transkription zur Synthese von cDNA unter Verwendung eines Reverse-Transkriptions-Kits mit jeweils 1 µg Gesamt-RNA pro 20 µL Reaktionssystem durch. Verwenden Sie das vom Hersteller empfohlene thermische Zyklenprogramm: 25 °C für 5 min, 50 °C für 15 min, 85 °C für 5 min, anschließend Haltephase bei 4 °C.
2. Verdünnen Sie die synthetisierte cDNA im Verhältnis 1:5 mit RNase-freiem Wasser. Lagern Sie die cDNA bei -20 °C bis zur qPCR-Amplifikation.
qPCR-Systemvorbereitung und Amplifikation
1. Stellen Sie das qPCR-Reaktionssystem auf Eis in einer dedizierten, RNase-freien PCR-Werkbank her. Das 20 µL-Reaktionssystem enthält: 10 µL qPCR-Master-Mix, 0,4 µL Vorwärtsprimer (10 µM), 0,4 µL Rückwärtsprimer (10 µM), 2 µL verdünnte cDNA-Vorlage und 7,2 µL RNase-freies Wasser.
2. Führen Sie die qPCR-Amplifikation mit folgendem Programm durch: 95 °C für 30 s zur initialen Denaturierung; 40 Zyklen mit jeweils 95 °C für 10 s und 60 °C für 30 s; anschließend Dissociationskurvenanalyse von 60 °C bis 95 °C mit Erhöhung um 0,5 °C je 5 s.

9. Westernblot

Proteinquantifizierung und Probenvorbereitung
1. Verdünnen Sie die Proteine mit einer 5–10%igen SDS-Lösung auf gleiche Konzentrationen, basierend auf den Ergebnissen des BCA-Assays.
SDS-PAGE-Elektrophorese und Proteinübertragung
1. Stellen Sie ein 10%iges Trenngel und ein 5%iges Stapelgel gemäß Standardprotokollen der Molekularbiologie her.
2. Geben Sie 20 µg Gesamtprotein pro Vertiefung in das Gel. Bei Gradienten-Lade-Experimenten laden Sie 15 µg, 30 µg und 45 µg Protein pro Vertiefung auf.
3. Führen Sie die Elektrophorese 30 Minuten lang bei 80 V durch, bis der Proteinmarker in das Trenngel eindringt, erhöhen Sie anschließend die Spannung auf 120 V und führen Sie die Elektrophorese weitere 60–90 Minuten durch, bis die Bromphenolblau-Farbe den unteren Rand des Gels erreicht.
4. Stellen Sie das Transfersandwich in der folgenden Reihenfolge (von Kathode zu Anode) zusammen: Schwamm, Filterpapier, Gel, PVDF-Membran, Filterpapier und Schwamm. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen zwischen Gel und Membran verbleiben.
5. Führen Sie den nassen Transfer 90 Minuten lang bei konstanten 300 mA in einem Eisbad durch.
Blockierung der Membran und Inkubation mit Antikörpern
1. Spülen Sie die PVDF-Membran nach Abschluss des Transfers kurz mit TBST-Puffer. Inkubieren Sie die Membran 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln in 5% BSA, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren.
2. Verdünnen Sie die primären Antikörper in 5% BSA-Lösung in optimierten Konzentrationen. Inkubieren Sie die Membran über Nacht bei 4 °C unter Schütteln mit der primären Antikörperlösung.
3. Waschen Sie die Membran am nächsten Tag dreimal mit TBST-Puffer, jeweils 10 Minuten lang, unter Schütteln.
4. Verdünnen Sie das mit Horseradish Peroxidase (HRP) konjugierte sekundäre Antikörper in 5%iger Magermilchlösung gemäß den vom Hersteller empfohlenen Verdünnungen. Inkubieren Sie die Membran 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln mit der sekundären Antikörperlösung.
5. Waschen Sie die Membran nach der Inkubation mit dem sekundären Antikörper dreimal mit TBST-Puffer, jeweils 10 Minuten lang. Inkubieren Sie die Membran anschließend 1–2 Minuten im Dunkeln mit der ECL-Substratlösung.

Ergebnisse

Bestimmung der RNA-Konzentration, Agarosegelelektrophorese und qPCR

Wie gezeigt, wurden Gesamt-RNA und Protein aus Entorhinalkortex-Proben (9–10 mg) mithilfe des DNA/RNA/Protein-Kits gleichzeitig isoliert. Parallel verarbeitete Proben, die entweder mit TRIzol (für RNA) oder mit einem Proteinextraktionskit behandelt wurden, dienten als Kontrollen. Das Protokoll ergab 235 ± 12 ng µL⁻¹ RNA, was 36 % weniger als bei der TRIzol-Methode war (p < 0,05) (Abbildung 3A). Dennoch zeigten Agarosegele scharfe 28S- und 18S-rRNA-Banden sowie 5S-Signale, was auf intakte RNA hindeutet (Abbildung 3B). Die qPCR für CD86, IL-1β, TNF-α und IL-6 ergab jeweils eine einzige, symmetrische Dissoziationskurve (Abbildung 3C); niedrigere Ct-Werte wurden in dieser Gruppe beobachtet (Abbildung 3D); es sind jedoch weitere Untersuchungen, einschließlich Analysen zur RNA-Integrität, erforderlich, um zu klären, ob diese Unterschiede auf eine verbesserte RNA-Qualität oder eine höhere Extraktionsausbeute zurückzuführen sind. Obwohl die RNA-Ausbeute geringer war als bei der TRIzol-Extraktion, deuten klare 28S- und 18S-rRNA-Banden und spezifische qPCR-Amplifikationskurven darauf hin, dass die gewonnene RNA von ausreichender Qualität für nachfolgende qPCR-Analysen ist.

Bestimmung der Proteinkonzentration, SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse

In Übereinstimmung mit den RNA-Daten ergab das Doppel-Extraktionsprotokoll niedrigere Gesamtproteinkonzentrationen als der Protein-Kit (p < 0,05). Dennoch zeigten Western Blots deutlich stärkere immunreaktive Banden für jedes untersuchte Zielprotein (Abbildung 4A). Konsistent mit den Ergebnissen der RNA-Quantifizierung isoliert das RNA–Protein-Ko-Extraktionsprotokoll weniger Gesamtprotein als der spezialisierte Einzweck-Protein-Kit, was anhand der CBB-Gesamtproteinfärbung sichtbar wird (Abbildung 4B–C). Das Housekeeping-Protein β-Tubulin zeigte unter beiden Extraktionsmethoden klare und stabile Banden mit vergleichbarer Signalintensität. Das selten vorkommende ULK-Protein wurde ebenfalls erfolgreich in den ko-extrahierten Proben nachgewiesen. Bemerkenswerterweise waren die Bandensignale von PSD-95, p-ERK und p-NFκB p65 in der Ko-Extraktionsgruppe im Vergleich zum einzelnen Protein-Extraktionskit deutlich stärker. Eine serielle Proteinbeladung von 15 µg bis 45 µg erzeugte dosisabhängige Bandengradienten für alle detektierten Zielstrukturen in beiden Gruppen. Insgesamt ist, obwohl die Gesamtprotein-Ausbeute des Doppel-Extraktionsworkflows niedriger ist, die Proteinqualität ausreichend für Standard-Western-Blot-Analysen, und die Gesamtnachweisleistung ist herkömmlichen Einzel-Protein-Extraktionskits nicht unterlegen.

Immunhistochemie und Immunfluoreszenz

Die Immunhistochemie an Gehirnschnitten, die 0,5–7 Jahre lang gelagert wurden, zeigte eine robuste Markierung von DCX⁺ neuen Neuronen, AVP⁺ sekretorischen Zellen sowie von MAP2/NeuN⁺ Neuronen mit intakter Morphologie und Fasern (Abbildung 5A). Die Immunfluoreszenz von 5–7 Jahre alten Schnitten zeigte deutlich sichtbare GFAP⁺ Astrozyten, Iba-1⁺ Mikrogliazellen und FosB⁺ aktivierte Neuronen (Abbildung 5B). Repräsentative Schnitte, die 0,5–sieben Jahre lang aufbewahrt wurden, wiesen unter den getesteten Bedingungen nachweisbare immunhistochemische und immunfluoreszenzbasierende Signale auf. Somit erhält die Konservierungslösung die Gewebestrukturintegrität und Antigenität aufrecht und ermöglicht eine zuverlässige Langzeitlagerung.

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Abbildung 1: Integrierter Arbeitsablauf zur Hemisphärentrennung für die morphologische und molekulare Analyse des Gehirns. Dieses Schema veranschaulicht die gesamte experimentelle Vorgehensweise, einschließlich der transkardialen Spülung von Nagern mit Kochsalzlösung, der medianen Bisektion des isolierten Gesamthirns, der Fixierung und Herstellung von Kryoschnitten aus der linken Hemisphäre für IHC/IF-Färbungen sowie der Kryokonservierung der kontralateralen Hemisphäre zur anschließenden simultanen Co-Extraktion von RNA und Protein, qPCR und Western Blot-Analyse. Alle Mausdarstellungen wurden ursprünglich von Jimeng AI erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Arbeitsablauf für die gleichzeitige Gewinnung von RNA und Protein aus gefrorenem Nagetierhirngewebe. Das Diagramm zeigt die einzelnen Schritte, beginnend mit dem Entnehmen des Zielgewebes aus gefrorenen Hemisphären, gefolgt von Gewebelyse und dreiphasiger Trennung, RNA-Reinigung und Elution für die qPCR sowie Proteinpräzipitation, Waschen und Auflösen zur Probenvorbereitung für die Western-Blot-Detektion. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Bewertung der RNA-Ausbeute, RNA-Integrität und qPCR-Vereinbarkeit unter Verwendung von mikroskaligen Proben des entorhinalen Cortex von Ratten. (A) Quantifizierte RNA-Konzentrationen, ermittelt mittels Ko-Extraktionskit im Vergleich zur TRIzol-Methode (Mittelwert ± SEM). (B) Agarosegelelektrophorese, die intakte 28S- und 18S-rRNA-Banden beider Extraktionsgruppen zeigt. (C) Einzige Schmelzkurven bestätigen die spezifische Amplifikation der Ziel-Entzündungsgene sowie von GAPDH als Referenzgen. (D) Ct-Werte der nachgewiesenen Entzündungsgene bei identischem RNA-Einsatz über beide Extraktionsmethoden hinweg. *p < 0,05, **p < 0,01 im Vergleich zur TRIzol-Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Western-Blot-Analyse von Proteinen, die mit dem RNA/Protein-Ko-Extraktionsprotokoll gewonnen wurden. (A) Gradientenförmige Proteinbeladung (15/30/45 µg), die dosisabhängige Bandensignale von synaptischen und Signalproteinen zeigt. (B) Nachweis des ULK1-Proteins mit hohem Molekulargewicht mit CBB-Gesamtprotein-Färbung als Beladungsreferenz. (C) Western Blot-Vergleich der Zielproteine bei gleicher Beladung zwischen zwei Extraktionsabläufen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 5: Immunhistochemische und immunfluoreszente Färbung von frei schwimmenden Gehirnschnitten, die 0,5–7 Jahre lang konserviert wurden. (A) Hellfeld-Mikrofotografien immunhistochemischer Färbungen, aufgenommen mit 200× und 400× Vergrößerung. Die Färbungen für DCX und AVP wurden an Mausgewebeproben durchgeführt, während die Färbungen für MAP2 und NeuN an Rattengewebeproben durchgeführt wurden. (B) Repräsentative Immunfluoreszenzbilder, erhalten von Rattengewebeproben. GFAP markiert Astrozyten, IBA-1 markiert Mikrogliazellen und FOSB zeigt neuronale Aktivität an. Alle in diesem Panel gezeigten Immunfluoreszenzfärbungsversuche wurden an Rattenproben durchgeführt, um die Expression neuronaler Marker und die zelluläre Lokalisation zu bewerten, Mikrofotografien mit 200× Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

In der murinen Forschung erfordern morphologische Analysen und Nukleinsäure-/Proteinanalysen aufgrund ihrer unterschiedlichen Probenvorbereitungsverfahren oft getrennte Tierproben. Dies erhöht den Tierverbrauch und führt zu biologischen Schwankungen zwischen einzelnen Tieren, was die Vergleichbarkeit zwischen histologischen und molekularen Datensätzen beeinträchtigen kann. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir einen Arbeitsablauf entwickelt, der es ermöglicht, histologische und molekulare Daten aus demselben Tier zu gewinnen.

Das zentrale Konstruktionsprinzip dieses Arbeitsablaufs ist die hemisphärische Aufteilung des Gehirngewebes nach transkardialer Perfusion mit 0,9%iger Kochsalzlösung.⁵^,⁶. Eine Hemisphäre wird für die Immunhistochemie und Immunfluoreszenz in 4 % Paraformaldehyd fixiert, während die kontralaterale Hemisphäre bei −80 °C für anschließende RNA-Protein-Ko-Extraktion, qPCR und Western Blotting. Die ausgewählten Messgrößen könnten jedoch zwischen den beiden Großhirnhälften nicht vollständig vergleichbar sein. Strukturelle und funktionelle Lateralisierung wurde bereits bei Nagetieren beschrieben, und solche hemisphärischen Unterschiede könnten eine Variabilität hervorrufen, wenn Analysen an entgegengesetzten Seiten durchgeführt werden⁷^,⁸Daher sollten Forscher das Gewebe entsprechend ihren Forschungszielen konsequent aus der gleichen Großhirnhälfte auswählen.

Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode ist die langfristige Konservierung fixierter, schwimmender Hirnschnitte. Nach Dehydrierung mit 30 %iger Saccharoselösung werden 30 µm dicke koronare Schnitte in einer Saccharose-Ethylenglykol-PVP-Konservierungslösung aufbewahrt. Frühere Studien haben gezeigt, dass kryoprotektive Lösungen aus Saccharose, Ethylenglykol und PVP dabei helfen, die Gewebemorphologie und Antigenizität während der Langzeitlagerung zu bewahren⁹^,¹⁰. Allerdings wurden bisher nur wenige Untersuchungen zu Lagerdauern über mehrere Jahre hinweg durchgeführt. Unsere Laborergebnisse erweitern diese Befunde: repräsentative Schnitte, die bis zu sieben Jahre lang gelagert wurden, wiesen unter den getesteten Bedingungen nachweisbare immunhistochemische und immunfluoreszenzmarkierte Signale auf. Diese Beobachtungen untermauern die Machbarkeit, schwimmende Hirnschnitte über mehrere Jahre hinweg für retrospektive Analysen und Folgeexperimente aufzubewahren.

Bemerkenswert ist, dass dieser Arbeitsablauf einen weiteren entscheidenden Vorteil bietet, nämlich die gleichzeitige RNA–Protein-Ko-Extraktion aus einer einzigen gefrorenen Gehirnhälfte. Obwohl dieses Ko-Extraktionsverfahren etwas geringere Mengen an RNA und Protein liefert als herkömmliche Methoden zur Extraktion eines einzelnen Zielmoleküls, sind die gewonnenen Biomaterialien dennoch ausreichend für eine robuste Detektion mittels qPCR und Western Blot. Entscheidend ist, dass die Ko-Extraktion die Quantifizierung von Transkript- und Proteinmengen aus identischen Gewebeproben ermöglicht, wodurch biologische Variationen, die durch die separate Verarbeitung von Proben entstehen, eliminiert werden und eine hochgradig konsistente, integrierte molekulare Profilierung ermöglicht wird¹¹^,¹². Darüber hinaus erfordert dieser Ansatz nur eine geringe Gewebemenge von etwa 9–10 mg, was ihn besonders geeignet für Analysen diskreter, regionspezifischer Gehirnsubpopulationen mit begrenzter Probenverfügbarkeit macht.

Trotz dieser erheblichen Vorteile weist diese Methode auch bestimmte Grenzen auf, die erwähnt werden müssen. Erstens könnten die vergleichsweise geringen Ausbeuten an RNA und Proteinen die Anwendbarkeit für Experimente einschränken, die große Mengen an Nukleinsäuren oder Proteinen erfordern, wie beispielsweise die Proteinreinigung im großen Maßstab oder die RNA-Sequenzierung mit hoher Sequenztiefe. Zweitens kann, obwohl die langfristige Lagerung von Schnitten bis zu sieben Jahre wirksam ist, im Laufe der Zeit eine allmähliche Zersetzung bestimmter labiler Antigene oder Nukleinsäuren auftreten, was die Färbungsintensität oder die Empfindlichkeit der molekularen Detektion beeinträchtigen könnte. Drittens ist die Methode derzeit für murines Hirngewebe optimiert und könnte für die Anwendung auf anderes Gewebe oder alternative Tiermodelle angepasst werden müssen, da sich die Gewebestruktur und -zusammensetzung zwischen Arten und Organen unterscheidet. Schließlich kann 5–10 % SDS die Massenspektrometrie, Enzymaktivitätsassays, Untersuchungen zu Protein-Protein-Interaktionen¹³^,¹⁴ und andere SDS-empfindliche Anwendungen stören. Daher könnten zusätzliche Verfahren zur Entfernung des Detergens oder zum Pufferaustausch erforderlich sein.

Zusammenfassend ermöglicht dieser Arbeitsablauf zur hemisphärischen Probenaufteilung gepaarte morphologische und molekulare Analysen am selben Tier, wodurch der Tierverbrauch sowie interindividuelle Variationen reduziert werden. Dieser Arbeitsablauf wäre nützlich für Studien, die gepaarte histologische und molekulare Analysen erfordern, insbesondere wenn die Gewebeverfügbarkeit begrenzt ist. Die Möglichkeit, Schnittserien langfristig zu lagern, könnte außerdem retrospektive Analysen und eine standardisierte Probensicherung erleichtern, während die Verwendung kleiner Gehirnareale regionenspezifische Untersuchungen unterstützt. Zu den Hauptnachteilen zählen geringere RNA- und Proteinmengen, mögliche hemisphärische Asymmetrie, die Beschränkung auf murines Gehirngewebe sowie eine eingeschränkte Verträglichkeit mit SDS-empfindlichen Anwendungen. Künftige Studien sollten die Rückgewinnung von Biomolekülen optimieren, den Arbeitsablauf in anderen Geweben und Spezies validieren und die Langzeitstabilität weiterer molekularer Zielstrukturen bewerten.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine bekannten konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die die in dieser Arbeit beschriebenen Ergebnisse beeinflusst haben könnten.

Danksagungen

This work was supported by grants from the Education Department of Liaoning Province (General Research Project JYTMS20230571) and Dalian Medical University’s 2023 “Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Health and Wellness” initiative (H0.2XY2023KY10), both awarded to Prof. CQ Liu; and by the 2025 Liaoning Province Undergraduate Innovation & Entrepreneurship Training Program(S202510161061) and Dalian Medical University’s Undergraduate Innovative Talent Training and Teaching Reform Fund (112307010209), both awarded to YK Li.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL RNase-freie Mikrozentrifugenröhrchen	Axygen	MCT-150-C-S	Sammlung von Gewebeproben und RNA-/Protein-Extraktionsfraktionen.
15 mL konische Zentrifugenröhrchen	Biofil	CFT010150	Fixierung, Saccharose-Dehydrierung und Lösungslagerung.
24-Loch-Zellkulturplatten	NEST	702001	Sammlung, Färbung und Langzeitlagerung von frei schwimmenden Hirnschnitten.
30 %ige Saccharoselösung	Im Labor hergestellt	N/V	Kryoschutz fixierter Hirnhälften vor der Kryoschnitte.
4 %ige Paraformaldehydlösung	Biosharp	BL539A	Einweichfixierung der morphologisch bestimmten Hirnhälfte.
5×-Protein-Lade-Puffer	Beyotime Biotechnologie	DL101	Vorbereitung von Proteinstichproben für SDS-PAGE.
Agarose	Solarbio	Cat: A8201	Beurteilung der RNA-Integrität mittels Agarosegelelektrophorese.
Anti-Doublecortin-Antikörper	Abcam	ab18723	Primärantikörper für die Doublecortin-Immunhistochemie.
Anti-ERK-Antikörper	Beyotime	AB2014	Primärantikörper für die Western-Blot-Analyse von gesamtem ERK.
Anti-GFAP-Antikörper	Abcam	ab10062	Primärantikörper für die Immunfluoreszenz von Glialen Fibrillären Sauren Proteinen.
Anti-Iba1-Antikörper	Wako	NCNP24	Primärantikörper für die Immunfluoreszenz des ionisierten Calcium-bindenden Adaptorproteins 1.
Anti-NeuN-Antikörper	Millipore	A60	Primärantikörper für die Färbung des neuronalen nuklearen Antigens.
Anti-NF-κB p65-Antikörper	HUABIO	ET1603-12	Primärantikörper für die Western-Blot-Analyse von NF-κB p65.
Anti-phospho-ERK-Antikörper	Beyotime	ET1610-13	Primärantikörper für die Western-Blot-Analyse von phosphoryliertem ERK.
Anti-PSD95-Antikörper	HUABIO	ET1602-20	Primärantikörper für die Western-Blot-Analyse von PSD95.
Anti-ULK1-Antikörper	HUABIO	ET1704-63	Primärantikörper für die Western-Blot-Analyse von ULK1.
Anti-β-Tubulin-Antikörper	ABclonal	AC021	Primärantikörper zur Beladungskontrolle bei der Western-Blot-Analyse.
Antifade-Fluoreszenz-Einbettmedium	Beyotime	P0126-5	Einbettmedium für immunfluoreszenzgefärbte Schnitte.
Biotin-Streptavidin-Peroxidase-Detektionskit	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Sekundäres Nachweissystem für die DAB-Immunhistochemie.
Rinderserumalbumin	Qiansheng Biotech Co., Ltd.	QO3000	Blockierpuffer für Immunfärbungen und Western Blot.
C57BL/6-Mäuse	Liaoning Changsheng Biotechnologie Co., LTD	4 Wochen alte C57BL/6-Mäuse	Experimentelle Tiere zur Gewinnung von Mäusehirngewebe, falls enthalten.
Chemilumineszenz-Bildgebungssystem	Clinx Science Instruments Co., Ltd.	ChemiScope 6200 Touch	Nachweis chemilumineszierender Signale bei Western Blots.
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	Leica Microsystems CMS GmbH	SN: 591974	Bilddatenaufnahme bei immunfluoreszenzgefärbten Schnitten.
Kryoschutz-Präservierungslösung	Im Labor hergestellt	N/V	Langzeitlagerung von frei schwimmenden Hirnschnitten bei −20 °C.
Kryostat	Leica	CM1950	Herstellung von 30 μm dicken koronalen Hirnschnitten.
DAB-chromogenes Substratkit	Sigma	SLBP7387V	Chromogene Entwicklung für die Immunhistochemie.
DAPI-Kernfärbungslösung	Coolaber	SL7100	Kerngegenfärbung für die Immunfluoreszenz.
Digitales Lichtmikroskop	Ningbo Yongxin Optics Co., Ltd.	Modell NE910+FL-900	Überwachung der DAB-Entwicklung und Bildaufnahme bei lichtmikroskopisch gefärbten Schnitten.
DNase I	Vazyme	R223-01	Entfernung von verbleibender genomischer DNA vor der reversen Transkription.
Esel-Anti-Kaninchen-IgG, mit 488 konjugiert	Thermo Fisher Scientific	A21206	Fluoreszierender sekundärer Antikörper für die Immunfluoreszenz.
Esel-Anti-Kaninchen-IgG, mit 594 konjugiert	Abcam	ab150076	Fluoreszierender sekundärer Antikörper für die Immunfluoreszenz.
E.Z.N.A. DNA/RNA/Protein-Kit	Omega Bio-Tek	D3892-01
Elektrophorese-Stromversorgung	Bio-Rad	1645050	Stromquelle für Agarosegelelektrophorese und SDS-PAGE.
Ethylenglykol	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.	10009828	Komponente der Kryoschutz-Präservierungslösung.
Gel-Bildgebungssystem	Clinx Science Instruments Co., Ltd.	ChemiScope 6200 Touch	Bildaufnahme von Agarosegelen zur Beurteilung der RNA-Qualität.
mit Gelatine beschichtete Objektträger	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING CO.,LTD	REF: 10127105P P/N: 80312-2101	Einbettung von DAB-gefärbten frei schwimmenden Hirnschnitten.
Bildanalyse-Software	National Institutes of Health	ImageJ/Fiji	Densitometrische Analyse von Western-Blot-Banden und Bildverarbeitung.
Isopropanol	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.	80109218	Proteinpräzipitation aus der organischen/interphasierten Fraktion.
Kühlmikrozentrifuge	Yancheng Kaite Laboratory Instrument Co., Ltd.	TGL16M	Zentrifugation während der RNA-/Protein-Extraktion und Waschschritten.
Minute Protein Extraction Kit	Invent	MS-026
Neutrales Balsam-Einbettmedium	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, China	Katalog-Nr. S30509, CAS 96949-21-2	Abdecken von dehydrierten, DAB-gefärbten Schnitten.
OCT-Einbettmedium	Sakura	4583	Einbettmedium für die Kryoschnitte fixierter Hirnhälften.
Optische qPCR-Platten oder -Röhrchen	Axygen	PCR-0208-C	Reaktionsgefäße für die qPCR-Amplifikation.
Parafilm	amcor	PM996	Verschluss von Mehrfachplatten für die Langzeitlagerung von Schnitten.
Natriumpentobarbital	Hualan Bio	57-33-0	Anästhetikum vor der transkardialen Perfusion.
Petri-Schalen	Biosharp	BS-90-D	Handhabung des Gehirns auf Eis und Trennung der Hirnhälften.
Phenol/Guanidinium-RNA-Extraktionsreagenz	Sparklade	AC0101-B	Vergleichsreagenz für Kontrollexperimente zur RNA-Extraktion.
Phosphatase-Inhibitoren-Cocktail	APExBIO	K1015-100	Erhaltung der Phosphorylierung während der Proteinextraktion.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Biosharp	BL601A	Waschpuffer, Lösungsmittel für Saccharoselösung und Kryoschutzlösung.
Polyvinylidenfluorid-Membran	Millipore	IPVH08100	Membran für den Western-Blot-Transfer.
Polyvinylpyrrolidon K40	Sigma	9003-39-8	Komponente der Kryoschutz-Präservierungslösung.
Protease-Inhibitoren-Cocktail	Beyotime	P1045	Verhinderung des Proteinabbaus während der Gewebelyse.
Proteinextraktionskit	Invent	MS-026	Vergleichskit für Kontrollexperimente zur Gesamtproteinextraktion.
Echtzeit-PCR-System	Amolarray	MA6000	Quantitative PCR-Amplifikation und Schmelzkurvenanalyse.
Natriumlaurylsulfat	BioFroxx	3250GR500	Auflösung von Proteinpellets und Vorbereitung von SDS-PAGE-Proben.
Sterile Rasierklingen	Biosharp	BS-RB-11	Trennung der Hirnhälften und Gewebetrimmen auf Eis.
Streptavidin-Peroxidase-Konjugat	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Signalverstärkungs-/Nachweisreagenz für die DAB-Immunhistochemie.
Saccharose	Hushi	57-50-1	Kryoschutzlösung und Kryoschutz-Präservierungslösung.
SYBR qPCR-Mastermix	Vazyme	Q711-02	Quantitative PCR-Amplifikation.
Transfereinrichtung	Bio-Rad	1703930	Nass-Transfer von Proteinen aus SDS-PAGE-Gel auf Membran.
Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20	Im Labor hergestellt	N/V	Waschpuffer für Western-Blot-Membranen.
Triton X-100	Sinopharm	9002-93-1	Permeabilisierung von Hirnschnitten für Immunfärbungen.
Trizol	Sparklade	AC0101-B
UltraSensitive SP Immunhistochemie-Detektionskit (für primäre Antikörper von Maus/Kaninchen)	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Sekundärantikörper-/Nachweisreagenz für die DAB-Immunhistochemie.
Wistarratte	Liaoning Changsheng Biotechnologie Co., LTD	280–320 g, männlich	Experimentelle Tiere zur Gewinnung von Rattenhirngewebe, falls enthalten.
Xylol	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.	10023418	Entfettung von DAB-gefärbten Objektträgern vor dem Abdecken.
Neutrales Balsam-Einbettmedium	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, China	Katalog-Nr. S30509, CAS 96949-21-2	Abdecken von dehydrierten, DAB-gefärbten Schnitten.
Streptavidin-Peroxidase-Konjugat	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Signalverstärkungs-/Nachweisreagenz für die DAB-Immunhistochemie.
Triton X-100	Sinopharm	9002-93-1	Permeabilisierung von Hirnschnitten für Immunfärbungen.
UltraSensitive SP Immunhistochemie-Detektionskit (für primäre Antikörper von Maus/Kaninchen)	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Sekundärantikörper-/Nachweisreagenz für die DAB-Immunhistochemie.
Xylol	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.	10023418	Entfettung von DAB-gefärbten Objektträgern vor dem Abdecken.

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Hemisph rentrennung Morphologische F rbung Immunhistochemie Immunfluoreszenz Gewebeallokation Kryokonservierung des Gehirns Western Blot qPCR Analyse