Method Article

Multiplex-fluoreszierende mRNA-In-situ-Hybridisierung sich entwickelnder kraniofacialer Gewebe in FFPE-Mausproben

DOI:

10.3791/71475

⸱

May 8th, 2026

 ,  , 
1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 2Department of Surgery, Harvard Medical School, 3Shriners Hospital for Children, 4Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health

In This Article

Summary

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Die konventionelle in-situ-Hybridisierung hat Schwierigkeiten, mRNA im kraniofacialen Gewebe sichtbar zu machen, aufgrund komplexer Architektur, hohem Hintergrund, begrenzter Probe-Spezifität und Sensitivität. Dieses Protokoll beschreibt eine multiplex-fluoreszierende RNA-In-situ-Hybridisierungsmethode zur sensitiven, spezifischen Detektion mehrerer mRNA-Ziele in FFPE-Maus-embryonalem kraniofacial Gewebe und überwindet dabei bisherige Einschränkungen.

Abstract

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Die kraniofaciale Entwicklung hängt von der koordinierten Aktivität vielfältiger, spezialisierter Zellpopulationen ab, die innerhalb komplexer Gewebearchitekturen interagieren, um normale Gewebestruktur und Funktion zu bilden und aufrechtzuerhalten. Das Verständnis, wie diese Zellen miteinander und mit ihrer lokalen Mikroumgebung kommunizieren, ist entscheidend, um die molekularen Mechanismen zu definieren, die ihre Bildung und Homöostase regulieren. Eine Störung dieser Prozesse kann zu angeborenen kraniofazialen Erkrankungen führen, darunter Zahnagenese, Gaumenspalte und Lippenspalte, entweder allein oder als Teil von syndromischen Erkrankungen. Obwohl quantitative Techniken wie RT-PCR eine hohe Sensitivität und einen hohen Wirkungsbereich bieten, erfordern sie RNA-Extraktion aus homogenisiertem Gewebe, was zu einem Verlust des räumlichen und zellulären Kontexts führt – eine besonders kritische Einschränkung für heterogene kraniofaaziale Gewebe, bei denen der zelluläre Ursprung der Transkripte nicht aufgelöst werden kann. Multiplex-fluoreszierende RNA-In-situ-Hybridisierung überwindet diese Einschränkung, indem sie eine empfindliche und spezifische Detektion mehrerer mRNA-Transkripte ermöglicht, während gleichzeitig die Gewebearchitektur erhalten bleibt. Dieser fortschrittliche Ansatz ermöglicht eine präzise Lokalisierung der Genexpression auf zellulärer Ebene und liefert wertvolle Einblicke in die räumliche Regulation von Entwicklungsprozessen und Krankheitsmechanismen in der kraniofazialen Biologie.

Introduction

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Die Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ist aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit und ihres breiten Dynamikumfangs der Goldstandard für Genexpressionsanalyse; allerdings wird RNA aus homogenisierten Geweben extrahiert, was zum Verlust des räumlichen und zellulären Kontextsführt. Diese Einschränkung ist besonders problematisch für heterogene Gewebe wie kraniofaciale Gewebe während der embryonalen Entwicklung, bei denen die zelluläre Quelle der detektierten Transkripte nicht aufgelöst werden kann. RNA-in-situ-Hybridisierung (ISH), eine 1968 von Joseph Gall und Mary Lou Pardue entwickelte Technik, überwindet diese Einschränkung, indem sie die Lokalisierung der mRNA-Expression innerhalb der intakten Gewebearchitektur2 ermöglicht. Dennoch ist konventionelle RNA-ISH technisch anspruchsvoll und stark abhängig von optimaler Gewebefixierung und Probenvorbereitung, um RNA-Integritätzu erhalten. Diese Herausforderungen verschärfen sich in stark verkalkten Geweben, die Entkalkungsverfahren erfordern, die oft aggressive Chemikalien oder langwierige Verarbeitung erfordern, was zum RNA-Abbau führt. Daher erfordert RNA-ISH im kraniofacialen Gewebe, das komplexe Zellgemischte umfasst, sorgfältige Optimierung und technisches Fachwissen, ist zeitaufwendig und birgt ein erhebliches Risiko suboptimaler Färbungen. Die Herausforderung, die mRNA-Expression sichtbar zu machen, ist in Zahngeweben noch ausgeprägter, die eine hochkomplexe Struktur und Zusammensetzung besitzen. Die Zähne bestehen aus mineralisierten Bestandteilen wie Zahnschmelz, Dentin, Zement und dem umgebenden Knochen sowie weicheren Geweben wie der Pulpa und dem Parodontalband. Diese Gewebe sind von einer Vielzahl von Zelltypen besiedelt, die eine entscheidende Rolle bei der Zahnentwicklungspielen. Diese Merkmale erfordern eine sorgfältige Standardisierung, um eine zuverlässige Signalerkennung sicherzustellen. Daher eignet sich das beschriebene Protokoll besonders gut zur Untersuchung der Genexpression während der Entwicklungs- und postnatalen Stadien der Zahnbildung.

Multiple Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungs- (FISH)-basierte Techniken zur räumlichen RNA-Detektion existieren, darunter sondenbasierte amplifizierte RNA FISH 5,6,7,8,9, Hybridisierungskettenreaktion FISH6, Einzelmolekül-RNA FISH10, Signalverstärkung durch Austauschreaktion FISH5 sowie stark multiplexierte FISH-Plattformen wie MERFISH11 und seqFISH12.13. Unter diesen wird Multiplex-fluoreszierende RNA ISH 7,8,9 aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit beim Nachweis eines einzelnen RNA-Moleküls aufgrund des Doppel-Z-Probe-Designs, bei dem zwei benachbarte Sonden zur Zielsequenz hybridisieren müssen, um die Signalverstärkung zu initiieren. Dieses duale Erkennungsdesign verbessert die Spezifität erheblich und reduziert abweichende Signale. Die Methode unterstützt den Multiplex-Nachweis von 2–4 Zielen (die mit ähnlichen Techniken bis zu 12 oder mehr Ziele erweitert werden können), erhält die Gewebemorphologie und ist kompatibel mit formalinfixiertem Paraffin-eingebetteten (FFPE)7,8,9, frisch gefrorenem und ausgewähltem verkalktem Gewebe, was sie für komplexe Proben geeignet macht, wie sie bei der kraniofacialen und dentalen Entwicklung vorkommen. Die Methode ist standardisiert, reproduzierbar, unterstützt von etablierten Sondenbibliotheken und weitgehend validiert, sodass barrierefreie und zuverlässige Ergebnisse in verschiedenen Laboren gewährleistet sind.

Multiplex-fluoreszierende RNA (ISH) verwendet mehrere Sonden, die auf unterschiedliche Bereiche desselben Transkripts abzielen, kombiniert mit einer verstärkten Signalverstärkung, was eine hochsensitive und spezifische Detektion auch für mRNAs mit geringer Häufigkeit oder teilweise degradierter Störungermöglicht. Während multiplex-fluoreszierende RNA (ISH) erfolgreich auf entkalkifizierte Knochenproben16 angewendet wurde und ihre Verwendung in komplexen kraniofacialen Geweben zuvor 7,8,9 berichtet wurde; Ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll, das seine Anwendung in diesem Zusammenhang beschreibt, wurde jedoch bisher nicht veröffentlicht.

Kraniofacetische Strukturen bestehen aus komplexen Gewebearchitekturen mit verschiedenen Zelltypen, darunter Osteoblasten, Osteoklasten, Osteozyten, Ameloblasten, Odontoblasten, Fibroblasten, Stammzellen, Immunzellen, Gefäßgefäße und sensorische Neuronen, deren räumlich koordinierte Interaktionen für Gewebebildung, Funktion, Regeneration und immunologischen Schutz unerlässlich sind4. Die Untersuchung lokalisierter Genexpressionen in diesen Geweben ist daher entscheidend, und multiplex-fluoreszierende RNA ISH stellt einen führenden Ansatz für solche Analysen dar.

In dieser Studie beschrieben wir, wie multiplexfluoreszierende RNA (ISH) basierend auf RNAscope-Sonden und -Technologie zur Untersuchung komplexer kraniofazialer Gewebe eingesetzt werden kann (Abbildung 1). Darüber hinaus haben wir einen optimierten FFPE-Schnitt-Workflow etabliert, der die RNA-Integrität erhält und eine hochwertige, räumlich aufgelöste Genexpressionsanalyse ermöglicht.

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Protocol

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Alle Tierverfahren wurden vom National Institutes of Health, dem National Institute of Child Health and Human Development Animal Care and Use Committee (IACUC) unter dem Animal Study Protocol #24-031 genehmigt.

1. Zeitgesteuerte Paarung und Gewebesammlung von Embryonen

  1. Richte zeitlich begrenzte Paarungen ein.
    1. Am späten Nachmittag paaren Sie ein gesundes, fruchtbares Männchen und ein Weibchen Mus musculus. Am nächsten Morgen sollten Sie auf einen vaginalen Plug achten. Geben Sie den Tag, an dem ein Plug beobachtet wird, als embryonalen Tag (E) 0,5 fest.
  2. Lassen Sie das schwangere Weibchen einschläfern.
    1. In der gewünschten Entwicklungsphase wird die trächtige weibliche Maus mittels CO₂-Inhalation und anschließend zervikaler Verrenkung gemäß den institutionellen Richtlinien zur Tierpflege eingeschläfert.
    2. Positioniere die Maus auf dem Rücken auf einer sterilen, absorbierenden Oberfläche. Desinfizieren Sie den Bauchbereich mit 70 % Ethanol entlang der vorgesehenen Schnittstelle.
  3. Entblößen und isolieren Sie die Gebärmutterhörner.
    1. Machen Sie mit einer sterilen chirurgischen Schere einen Bauchschnitt in der Mitte und öffnen Sie dann die Peritonealwand mit einer mikrochirurgischen Schere, um die Gebärmutterhörner freizulegen.
    2. Verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um die Gebärmutterkette vorsichtig nach außen zu führen. Lasse das Gebärmuttergewebe entlang des Myometriums frei und schneide den Eileiter sowie den medianen Gebärmutterhornansatz durch, um die Embryonen zu isolieren.
  4. Ganze Embryonen übertragen.
    1. Übertragen Sie sofort die Gebärmutterkette mit Embryonen in eine 10 cm große Petrischale mit eiskaltem, sterilem 1× PBS (pH 7,4).
  5. Einzelne Embryonen sezieren.
    1. Trennen Sie vorsichtig jeden Embryo von den umgebenden Gebärmutter-, Amnion- und Chorionmembranen.
    2. Übertragen Sie die gereinigten Embryonen in eine frische 10-cm-Schale mit eiskaltem, sterilem PBS.
  6. Sezieren Sie Embryonköpfe der Maus.
    1. Mit einer sterilen chirurgischen Klinge werden die Köpfe seziert und die dissektionierten Köpfe einmal in eiskalten PBS ausgespült, bevor sie weiterverarbeitet werden.
      HINWEIS: Sammeln und sezieren Sie die neonatalen Mäuse im gewünschten Entwicklungsstadium gemäß dem Tierprotokoll.

2. Fixierung und Verarbeitung von Gewebe

  1. Repariere das Gewebe.
    1. Das dissektionierte Gewebe sofort in 10 % neutrales Formalin eintauchen und über Nacht bei Zimmertemperatur auf einem Shaker fixieren.
      HINWEIS: Eine ordnungsgemäße Erhaltung der RNA ist entscheidend für den Erfolg von In-situ-Hybridisierungsanalysen. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass der Standardansatz – das Fixieren von Gewebeproben in 10 % neutralem Formalin für Dauern von 6 bis 48 Stunden, abhängig von der spezifischen Größe und dem Alter des Gewebes – zuverlässige Ergebnisse für die RNA-Konservierungliefert. In früheren embryonalen Stadien (E12.5 und niedriger) ist das Eindringen des Fixativs schnell, und die Fixierungszeit sollte entsprechend verkürzt werden, um eine Überfixierung zu verhindern. Ab dem embryonalen Tag 17.5 (E17.5) sowie in postnatalen Proben kann das Eindringen des Fixativs aufgrund der Haut am Kopf, die als physische Barriere wirkt, weniger effizient sein. Daher sollte die Haut vom gesamten Kopf entfernt werden, um ein effizientes Eindringen der Fixierungslösung zu ermöglichen. Entkalkung kann in 0,5 M EDTA (pH 8,0) erfolgen, die 0,5 % methanolfreies Formaldehyd bei 4 °C7 enthalten. Die Dauer der Entkalkung kann durch eine schnelle Mikro-CT-Untersuchung überwacht und je nach Mineralisationsgrad und spezifischem Gewebetyp angepasst werden; für E18.5-Embryonen reichen in der Regel 24–48 Stunden aus.
  2. Spülen und verarbeiten Sie das Gewebe.
    1. Entferne das Fixativ und spüle die Proben mit PBS aus. Das Gewebe wird auf 70 % Ethanol übertragen und bei 4 °C bis zur weiteren Verarbeitung (1–4 Wochen) gelagert. Führen Sie Gewebedehydrierung, -reinigung und Paraffininfiltration mit einem automatisierten Gewebeprozessor gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
      HINWEIS: Das typische Gewebeverarbeitungsprotokoll ist folgendes: 70 % Ethanol für 30 Minuten, gefolgt von 95 % Ethanol für 30 Minuten (2 Mal) und 100 % Ethanol für 30 Minuten (3 Mal) zur Dehydrierung; Reinigen in Xylol für 1 Stunde (3 Mal) und anschließend Infiltration mit Paraffinwachs bei 60 °C für 1 Stunde (3 Mal), bevor es in Paraffingewebeblöcke eingebettet wird.
  3. Einbetten Sie das Gewebe.
    1. Die Köpfe werden in Paraffin eingebettet und die Proben je nach experimentellen Anforderungen entweder in der koronalen oder sagittalen Ebene ausgerichtet.
    2. Übertragen Sie die eingebetteten Blöcke auf eine Paraffinblock-Kaltplatte, damit das Wachs etwa 30 Minuten aushärtet, wobei das Timing je nach Blockgröße angepasst wird.
  4. Speichere die FFPE-Blöcke.
    1. Lass das Paraffin vollständig erstarren. Nehmen Sie Blöcke aus Formen, legen Sie sie in beschriftete luftdichte Behälter oder Ziplock-Beutel und lagern Sie sie bei 4 °C, bis sie zum Teilen bereit sind.
      HINWEIS: FFPE-Blöcke mit gut konservierter RNA können mehrere Jahre vor dem Schnitt gelagert werden, ohne die Gewebeintegrität zu beeinträchtigen.

3. Verarbeitung von FFPE-Gewebe für multiplex fluoreszierende RNA ISH

  1. Bereiten Sie einen RNase-freien Arbeitsplatz vor.
    1. Desinfizieren Sie alle Arbeitsflächen und Instrumente mit 70 % Ethanol. Behandeln Sie Oberflächen, Werkzeuge und Handschuhe mit einer RNase-Dekontaminationslösung, um den RNA-Abbau zu minimieren.
    2. Richte das Mikrotom ein und setze eine neue Klinge ein. Stellen Sie den Abstandswinkel auf 10° ein. Behandeln Sie Pinzetten und Pinsel vor der Anwendung mit einer RNase-Dekontaminationslösung.
      HINWEIS: Verwenden Sie immer eine neue Klinge zum Schneiden, um präzise Gewebeschnitte zu erhalten. Der Klingenwinkel beeinflusst die Schnittqualität, die Gewebeintegrität, die Gleichmäßigkeit der Dicke und die Erhaltung morphologischer Merkmale erheblich.
  2. Bereite das Wasserbad vor.
    1. Füllen Sie ein Schwimmbad mit ultrareinem, labortauglichem Wasser.
    2. Passen Sie die Temperatur je nach Embryonalstadium und Gewebemerkmale zwischen 40 und 43 °C an.
  3. Trimmen und montieren Sie den FFPE-Block.
    1. Entfernen Sie überschüssiges Paraffin rund um das eingebettete Gewebe. Kühle den FFPE-Block auf Eis und befestige ihn auf der Mikrotom-Kaltstufe.
  4. Schneiden Sie auf die gewünschte Region zu.
    1. Richten Sie die Paraffinblockfläche mit der Mikrotom-Klinge aus und schneiden Sie in 12 μm Schritten, bis der relevante Bereich (z. B. der angrenzende zum Molaren oder Schneidezahn) in koronalen Schnitten erscheint.
    2. Block und Klinge werden bei Bedarf für symmetrische, richtig ausgerichtete koronale oder sagittale Querschnitte des ganzen Kopfes neu positioniert.
  5. Schneiden Sie das Gewebe ab.
    1. Sobald der Interessenbereich erreicht ist, schneiden Sie 5–7 μm Abschnitte. Lassen Sie die Abschnitte im Wasserbad schwimmen, um sanfte Entspannung und Glättung zu ermöglichen, bevor Sie sie auf die Rutschen übertragen.
  6. Montiere und trockne die Abschnitte.
    1. Montiere die Abschnitte auf positiv geladene Glas-Objektträger. Untersuchen Sie die Objektträger unter einem Lichtmikroskop, um die korrekte Ausrichtung und Gewebeintegrität zu bestätigen.
    2. Trocknen Sie die Objektträger über Nacht auf einem Objektträgerwärmer bei 40 °C, bevor Sie den multiplex-fluoreszenten RNA-ISH-Test durchführen.

4. Tag 1: Deparaffinisierung und Rehydrierung

  1. Backe die Folien.
    1. Backen Sie die Folien mit FFPE-Stücken 1 Stunde bei 60 °C.
      HINWEIS: Wenn der Objektträger nicht sofort verwendet wird, sollte er 1–4 Wochen lang nicht bei Raumtemperatur (RT) mit Austrocknungsmitteln gebacken werden. Eine längere Lagerung kann zu RNA-Abbau führen.
  2. Gleiche die Folien aus.
    1. Lassen Sie den FFPE-Gewebe-Folie 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) ausgleichen.
  3. Deparaffinisieren und rehydrieren Sie die Abschnitte.
    1. Tauchen Sie die Objektträger 5–10 Minuten in Xylen oder einen Xylen-Ersatz mit sanftem Rühren unter Tritt ein. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal, um die vollständige Entfernung des Paraffins sicherzustellen.
      HINWEIS: Die Arbeit mit Xylol sollte in einer chemischen Abzugshaube durchgeführt werden. Wenn ein Xylenersatz mit niedriger Toxizität verwendet wird, kann er außerhalb der chemischen Abzugshaube verwendet werden.
    2. Transferiere die Objektträger auf 100 % Ethanol und inkubiere sie 2 Minuten bei RT. Wiederhole einmal, um die Reste von Xylol zu entfernen. Die Abschnitte 2 Minuten in 70 % Ethanol rehydrieren.
    3. Spüle die Abschnitte dreimal mit PBS ab. Gib dann einen Tropfen PBS dazu, der die Abschnitte vollständig abdeckt, und gehe sofort zum nächsten Schritt über.

5. Multiplex-fluoreszierende RNA ISH auf FFPE-Gewebeschnitten

HINWEIS: Diese Studie folgte den Anweisungen des Herstellers zur Durchführung des multiplexen fluoreszierenden RNA-ISH auf FFPE-Gewebeschnitten mit RNAscope-Technologie21.

  1. Tag 1: Vorbehandlung und Sondenhybridisierung
    1. Zeichnen Sie eine hydrophobe Barriere.
      1. Mit einem Barrierestift zeichnen Sie eine hydrophobe Barriere um jeden Gewebeabschnitt. Lassen Sie die Objektträger etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) an der Luft trocknen.
      2. Stellen Sie sicher, dass Gewebeschnitte jederzeit mit PBS bedeckt bleiben, um ein Austrocknen zu verhindern.
        HINWEIS: Verwenden Sie ein fusselfreies Tuch (Linsentuch), um den Objektträger um das Gewebe herum zu trocknen und das Gewebe feucht zu halten. Stellen Sie sicher, dass die Barrierenstift-Tinte nicht mit dem Gewebeschnitt in Kontakt kommt.
    2. Vorbehandlung durchführen.
      1. Tragen Sie das maßgefertigte Vorbehandlungsreagenz auf, um jeden Abschnitt vollständig abzudecken. Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten bei 40 °C in einer befeuchteten Kammer, die in einem Hybridisierungsofen platziert ist.
        HINWEIS: Für alle in Tropfenflaschen gelieferten Reagenzien werden genügend Tropfen hinzugefügt, um den Abschnitt innerhalb der Barriere vollständig abzudecken. Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien vor der Verwendung zur RT gebracht werden.
    3. Spülen Sie die Abschnitte ab.
      1. Spüle die Abschnitte mehrmals mit PBS ab und inkubiere dann 2 Minuten in frischem PBS bei RT.
        HINWEIS: Verwenden Sie eine 5-mL Transferpipette, um jeden Slide einzeln mit PBS zu waschen. Während der 2-minütigen Wäsche sollten die Abschnitte vollständig mit PBS bedeckt bleiben.
    4. Dämpfen Sie die endogene Peroxidase-Aktivität.
      1. Auf jeden Abschnitt 3 % Wasserstoffperoxid auftragen und 10 Minuten bei RT inkubieren, um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren.
    5. Wiederhole den Ablauf.
      1. Waschen Sie die Folien 2 Minuten lang in PBS bei RT. Wiederholen Sie das zweimal.
    6. Bereitet die Sonden vor.
      1. Die Sonden 10 Minuten bei 40 °C vorwärmen. Lass die Sonden vor der Nutzung auf RT abkühlen.
    7. Bereite die Sondenmischung vor.
      1. Die C1-Sonde wird als 1×-Arbeitslösung geliefert; Nutze das direkt.
      2. Im Gegensatz dazu werden C2-, C3- und C4-Sonden als 50×-Konzentrate bereitgestellt; diese Sonden mit der C1-Sondenlösung verdünnen. Wenn die C1-Sonde nicht verwendet wird, verdünnen Sie C2-, C3- und/oder C4-Sonden mit dem vom Hersteller gelieferten Sondenverdünner.
    8. Hybridisieren Sie die Sonden.
      1. Tragen Sie 30–40 μL Sondenmischung auf jeden Gewebeschnitt auf, um eine vollständige Abdeckung sicherzustellen. Inkubieren Sie die Objektträger 2 Stunden bei 40 °C in einer befeuchteten Kammer im Hybridisierungsofen.
        HINWEIS: Beim Erlernen der RNAscope-Technik wird empfohlen, während Testläufen sowohl Negativ- als auch Positivkontrollproben einzubauen. Dieser Ansatz hilft, den Test zu validieren und die Qualität des Verfahrens zu bestätigen. Eine mögliche Einschränkung ist, dass einige vom Hersteller bereitgestellte positive Kontrollproben möglicherweise nicht im interessierten Gewebe ausgedrückt werden. Um dies zu beheben, können zelltypspezifische Sonden verwendet werden. Zum Beispiel ist Col1a1 eine zuverlässige positive Kontrolle für Bindegewebe. Die Färbung auf Col1a1 (oder ein anderes Gen mit bekannter hoher Expression) kann als erster Schritt durchgeführt werden, um RNA-Erhaltung und Gewebemorphologie in den Proben zu bewerten. Sobald die Technik beherrscht ist, werden Negativkontrollen typischerweise durchgeführt, indem Objektträger ohne Sonden verarbeitet werden, aber mit allen anderen Lösungen behandelt werden. Diese Methode liefert wichtige Informationen über das Hintergrundsignal in allen Detektionskanälen. Das Standard-Multiplex-V2-Kit ermöglicht die gleichzeitige Färbung und Bildgebung von bis zu vier verschiedenen Sonden. Wenn die Genexpressionswerte durch frühere Transkriptomik-Studien festgelegt sind, ist es ratsam, Gene mit niedriger Expression den Cy5- und Cy7-Kanälen zuzuordnen. Gene, die hoch exprimiert sind, sollten für optimale Detektion in den GFP- und RFP-Kanälen platziert werden. In Fällen, in denen keine der Sonden Gene mit hoher Expression anvisiert, sollte der GFP-Kanal ungenutzt bleiben. Dadurch kann der GFP-Kanal als Referenz für die Hintergrundsubtraktion vom RFP-Kanal dienen und so die Genauigkeit der Signalerkennung für niedrig ausdruckbare Ziele verbessern.
    9. Spülen Sie mit Waschpuffer.
      HINWEIS: Der kommerziell erhältliche 20× Wash Buffer wurde vor der Verwendung auf 1 × mit RNase-freiem Wasser verdünnt.
      1. Wasche die Folien 2 Minuten lang bei RT in dem 1× Waschpuffer, der mit dem Kit geliefert wird. Wiederhole das zweimal.
    10. Inkubieren Sie in einem 5-fachen Kochsalz-Natriumcitrat-(SSC)-Puffer.
      HINWEIS: Der kommerziell erhältliche 20× SSC-Puffer (3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat, pH 7,0) wurde vor der Verwendung auf 5 × mit RNase-freiem Wasser verdünnt.
      1. Nach dem Waschen inkubieren Sie die Abschnitte über Nacht in einem 5× SSC-Puffer bei RT.
  2. Tag 2: Signalverstärkung, fluoreszierende Markierung und Montage
    1. Wasche die Folien.
      1. Wasche die Objektträger in 1× Waschpuffer für 2 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Wiederhole das zweimal.
    2. Führen Sie die Verstärkungsschritte durch.
      1. Wenden Sie Amplification 1-Reagenz auf jeden Abschnitt auf und inkubieren Sie 30 Minuten bei 40 °C in einer befeuchteten Kammer.
      2. Zweimal in 1 Phase spülen× Puffer 2 Minuten bei RT waschen.
      3. Wenden Sie das Amplification 2-Reagenz auf und inkubieren Sie 30 Minuten bei 40 °C.
      4. Zweimal in 1 Phase spülen× Puffer 2 Minuten bei RT waschen.
      5. Wenden Sie das Amplifikations-3-Reagenz auf und inkubieren Sie 15 Minuten bei 40 °C.
        HINWEIS: Alle drei Verstärkungsschritte sind unabhängig davon erforderlich, welche Kanäle (Sonden) entwickelt werden.
      6. Zweimal in 1 Phase spülen× Puffer 2 Minuten bei RT waschen.
    3. Entwickeln Sie Meerrettichperoxidase (HRP) und Fluorophor.
      1. Berechnen Sie das benötigte Volumen des Fluorophors (in der Regel 100–200 μL pro Objektträger) und verdünnen Sie die Opal-Fluorophor-Schäden.
        HINWEIS: Der empfohlene Verdünnungsbereich für Fluorophor liegt bei 1:300–1:1500. In diesen Experimenten wurde Opal Polaris 780 (Fluorophor-Reagens) um 1:500 im Antikörperverdünner verdünnt, und alle anderen Farbstoffe um 1:1000 im TSA-Puffer. Minimieren Sie die Lichteinwirkung auf die Objektträger, wann immer möglich.
      2. Trage das HRP-C1-Reagenz auf und inkubiere 15 Minuten bei 40 °C.
      3. Zweimal in 1 Phase spülen× Puffer 2 Minuten bei RT waschen.
      4. Tragen Sie 30–40 μL Opalfarbe (z. B. Opal 570 oder Opal 690) auf jede Sektion auf. 30 Minuten bei 40 °C inkubieren.
      5. Zweimal in 1 Phase spülen× Puffer 2 Minuten bei RT waschen.
      6. Trage HRP-Blocker auf und inkubiere 15 Minuten bei 40 °C.
      7. Zweimal in 1 Phase spülen× Puffer 2 Minuten bei RT waschen.
      8. Trage HRP-C2- oder HRP-C3-Reagenz auf und inkubiere bei 40 °C für 15 Minuten.
      9. Zweimal in 1 Phase spülen× Puffer 2 Minuten bei RT waschen.
      10. Tragen Sie 30–40 μL des zweiten Opalfarbstoffs auf und inkubieren Sie 30 Minuten bei 40 °C.
      11. Zweimal in 1 Phase spülen× Puffer 2 Minuten bei RT waschen.
      12. Trage HRP-Blocker auf und inkubiere 15 Minuten bei 40 °C.
      13. Zweimal in 1 Phase spülen× Puffer 2 Minuten bei RT waschen.
      14. Trage HRP-C3- oder HRP-C4-Reagenz auf und inkubiere 15 Minuten bei 40 °C.
      15. Zweimal in 1 Phase spülen× Puffer 2 Minuten bei RT waschen.
    4. Führen Sie Tyramid-Signalverstärkung mit Digoxigenin (TSA-DIG) und Fluorophor-Markierung durch (falls zutreffend).
      1. Trage pro Abschnitt 30–40 μL verdünntes TSA-DIG-Reagenz auf und inkubiere 30 Minuten bei RT.
      2. Zweimal in 1 Phase spülen× Puffer 2 Minuten bei RT waschen.
      3. Tragen Sie Blockreagenz auf und inkubieren Sie 15 Minuten bei 40 °C.
      4. Zweimal in 1 Phase spülen× Puffer 2 Minuten bei RT waschen.
      5. Tragen Sie 30–40 μL verdünntes Fluorophorreagenz auf und inkubieren Sie 30 Minuten bei 40 °C.
      6. Zweimal in 1 Phase spülen× Puffer 2 Minuten bei RT waschen.
    5. Führen Sie Gegenfärben und Montage durch.
      1. Trage 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) auf und inkubiere 5 Minuten im Dunkeln bei RT.
      2. Spülen Sie DAPI und montieren Sie die Abschnitte umgehend mit Anti-Fade-Mountant, legen Sie den Deckdeckel vorsichtig auf und vermeiden Sie das Einfangen von Luftblasen. Wählen Sie eine Bedeckungsgröße, die zur Gewebeabdeckung passt.
      3. Trockne die Objektträger 2 Stunden bei RT im Dunkeln und bewahre sie dann bei 4 °C für die Langzeitlagerung auf.
        HINWEIS: Fluoreszenz kann bis zu einem Jahr erhalten bleiben, wenn sie bei 4 °C im Dunkeln mit einer ordnungsgemäßen Anti-Fade-Montage gelagert wird.
    6. Führen Sie Bildgebung durch.
      1. Führen Sie Bildgebung mit einem Mehrkanal-Fluoreszenzmikroskop mit LED-Beleuchtung und Filtern für spektrale Trennung durch (Abbildung 2A). Verwenden Sie die Anregungs- und Emissionswellenlängen wie folgt: DAPI (353/465 nm), FITC (495/519 nm), Cy3 (548/561 nm), Cy5 (650/673 nm) und Cy7 (747/773 nm). Spezifische Filter minimieren spektrale Überschneidungen und unterscheiden blaue, grüne, orange, rote und nahinfrarote Signale.
      2. Nehmen Sie alle Bilder mit identischen Belichtungs- und Beleuchtungseinstellungen über die Proben hinweg auf, um Konsistenz zu gewährleisten und eine zuverlässige vergleichende Analyse zu ermöglichen.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mit dem beschriebenen Protokoll (Abbildung 1) demonstrieren wir die Multiplex-fluoreszierende mRNA-ISH-Transkripterkennung in einem ganzen Mauskopf, der auf einer Zeiss-Mikroskopplattform abgebildet wurde (Abbildung 2B). Bestimmte Bildansichten können über den Seitentab (gelbes Feld) ausgewählt werden, während mehrere Kanäle gleichzeitig mit dem Kanal-Tab (rotes Feld) visualisiert werden können. Helligkeit, Gamma und Kontrast de...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die In-situ-Hybridisierung ist seit mehr als vier Jahrzehnten ein grundlegendes Werkzeug zur Untersuchung der Genexpression und wurde kontinuierlich weiterentwickelt. Konventionelle ISH-Ansätze sind jedoch oft durch geringe Empfindlichkeit, ein starkes Hintergrundsignal und langwierige, arbeitsintensive Verfahren eingeschränkt. Diese Einschränkungen haben ihre breitere Anwendung eingeschränkt, insbesondere in komplexen kraniofacialen Geweben, wo präzise räumliche Auflösung und E...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken dem Personal der NICHD-Tiereinrichtung für die Unterstützung bei der Tierhaltung und Zucht. Wir danken Dr. Vincent Schram vom Microscopy and Imaging Core (NIH/NICHD) für die Unterstützung bei der Fluoreszenzbildgebung. Das aktuelle Manuskript wird durch Mittel von NIH/NIDCR RO1DE033520 an M.B., dem Intramural Research Program, dem National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) bis E.M. sowie dem Research Grant Identifier ZIA HD009015 des National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) unterstützt. Der Förderer hatte keine Rolle bei der Studienplanung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1& Times; PBSThermo Fischer10010023Use  um während des Workflows Washes durchzuführen
20& Mal; SSCThermo FischerJ60839. K2Benutze sie, um die 1& akut zu machen; Waschpuffer
50 mL konische Röhren (Ambion) RNAse-freiThermo FischerAM12502Verwendung zur Aufbewahrung von Proben in verschiedenen Lösungen
Fortschrittlicher OrbitalshakerVWR6683-470Verwendung zum Schütteln von Geweben in der Fixationslösung während der Inkubation
Alkohol, 70 %, Fisherbrand, HistoPrepFisher ScientificHC-1000-1GLVerwenden Sie es, um den gesamten Arbeitsbereich zu reinigen und zu desinfizieren
Antikörper-Verdünner Akoya BiosciencesARD1001EAVerdünner für TSA-DIG
Automatisierter VakuumgewebeprozessorLeica BiosystemsASP300SVerwendung zum Klären, Dehydrieren, Rehydratieren und Wachsinfiltration von Proben
Deckglasdicke 1,5, 25 mm x 25 mm&nlffel;Corning2850-25Verwendung zur Montage von Objektträgern im Visium HD Workflow
Individuelles VorbehandlungsreagenzACD, Bio-Techne300040Zur Optimierung der Gewebepermeabilisierung und Zielzugänglichkeit
EDTAMillipore Sigma03690Verwendung zur Entkalkung mineralisierter Gewebe
Ethanol zu 100 %AeroBase Gruppe6505001050000Verwenden Sie das Entfernen von Xylin und das Rehydratisieren der Proben während der Verarbeitung
HistoCore Wasserbad Leica BiosystemsHIS2326Man hat die Abschnitte bei 40-43 °F schwimmen lassen; C zur Entfernung von Falten aus FFPE-Abschnitten 
HybEZ BefeuchtungspapierACD, Bio-Techne310015Verwenden Sie sie im HybEZ-Ofen, um die Luftfeuchtigkeit zu erhalten und zu verhindern, dass Gewebeschnitte während der Hybridisierung austrocknen
HybEZ Ofen, Blech und GitterACD, Bio-Techne310011, 310012, 310014Verwendung zur Bereitstellung von kontrollierter Temperatur, Luftfeuchtigkeit und korrekter Positionierung während der Hybridisierung und Inkubationsschritte 
ImmEdge hydrophober BarrierestiftVektorlaborH-4000Verwenden Sie es, hydrophobe Grenzen auf Objektträgern zu zeichnen, um Reagenzien während der Färbung auf den Gewebeschnitt zu beschränken.
Einwegklingen mit niedrigem Profil DB80LXLeica Biosystems14035843496Verwendung zur Sektion von FFPE-Blöcken 
Neutral gepuffertes Formalin 10 %Azer ScientificNBF-4-GVerwendet wird, um das Gewebe zu reparieren
OPAL 520 REAGENSPAKETAkoya Biosciences, Inc.FP1487001KTZiel-RNA-Signale mit fluoreszierender Markierung zu amplifizieren und zu erkennen.
OPAL 570 REAGENZPAKETAkoya Biosciences, Inc.FP1488001KTZiel-RNA-Signale mit fluoreszierender Markierung zu amplifizieren und zu erkennen.
OPAL 620 REAGENSPAKETAkoya Biosciences, Inc.FP1495001KTZiel-RNA-Signale mit fluoreszierender Markierung zu amplifizieren und zu erkennen.
OPAL 690 REAGENZPAKETAkoya Biosciences, Inc.FP1497001KTZiel-RNA-Signale mit fluoreszierender Markierung zu amplifizieren und zu erkennen.
Opal Polaris 780 ReagenzpaketAkoya Biosciences, Inc.FP1501001KTZiel-RNA-Signale mit fluoreszierender Markierung zu amplifizieren und zu erkennen.
Prolong DiamondThermo FischerP36970Ein Antifade-Montagemedium zur Erhaltung der fluoreszenten Signale und zum Schutz des RNAscope-Signals während der Bildgebung
RNAscope 4-Plex Nebenkit SPEZIFISCHE BenutzeroberflächeACD, Bio-Techne323120Zusätzliche Materialien, die mit dem RNAscope Multiplex Fluorescent v2-Test verwendet werden
RNAscope DAPIACD, Bio-Techne320858Eine fluoreszierende Kernfärbung, die in RNAscope-Assays verwendet wird, um Zellkerne sichtbar zu sehen
RNAscope Multiplex Fluoreszierend Reagenz Kit v2ACD, Bio-Techne323100Durchführung einer multiplexen fluoreszierenden In-situ-Hybridisierung
RNAscope-Multiplex-TSA-PufferACD, Bio-Techne322810Ein Puffer, der in RNAscope verwendet wird, um Opalfarbstoffe zu verdünnen.
RNAscope Wash-PufferreagenzienACD, Bio-Techne310091Verwenden Sie es, um die Gewebeschnitte während des Tests auf Objektträgern zu waschen.
RNaseZap RNase-DekontaminationslösungThermo FischerAM9782Verwendung zum Reinigen und Entfernen von RNase
Halbautomatisches rotierendes MikrotomLeica BiosystemsRM2245Verwenden Sie FFPE-Blöcke, wie in den Richtlinien angegeben.
Slide BriteElektronenmikroskopie-Wissenschaft23401-01Für den Deparaffinisierungsschritt vor der RNA-Skop-Verarbeitung.
Rutschwärmer mit AbdeckungPremiere XH2004Verwendung für die Inkubation von Objektträgern bei unterschiedlichen Temperaturen
Superfrost Plus Slides Fisher Scientific12-550-15 Verwendung zum Anfügen von Abschnitten für Vsium HD
Surgipath ParaplastLeica Biosystems39601006Verwendung zur Gewebeinfiltration und Einbettung von Geweben
Gewebekultur DISH 100 x 20 mm 500/CSFisher Scientific877222Verwendung zum Sammeln und Zerlegen von Proben in 1 & akut; PBS
XylenFisher Scientific6.81001E+12Verwendet als Reinigungsmittel, um Alkohol zu entfernen und Gewebe transparent zu machen.

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