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Quantifizierung von Fluorid in Serum, Knochen und Zähnen in einem Mausmodell mittels Hexamethyldisiloxan-unterstützter Diffusion und ionenselektiver Elektrodenmessungen

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DOI:

10.3791/71488

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28. August 2026

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1Department of Oral Science and Translational Research, College of Dental Medicine, Nova Southeastern University, 2Department of Biological Sciences, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo, 3Department of Restorative Dentistry and Endodontology, Osaka University Graduate School of Dentistry, 4Unit of Dentistry, Osaka University Hospital, 5Department of Biomedical Sciences, Adams School of Dentistry, The University of North Carolina at Chapel Hill

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Diffusionsgefäßen mit hexamethyldisiloxan (HMDS)-unterstützter Diffusion, gefolgt von Messungen mit einer ionenselektiven Elektrode zur Quantifizierung der Fluoridionenmasse im Serum, Knochen und Zähnen von Mäusen. Die Methode bietet einen empfindlichen, kalibrierungsbasierten Ansatz zur Bewertung der Fluoridakkumulation in biologischen Proben.

Zusammenfassung

Die Quantifizierung von Fluoridgehalten in biologischen Geweben ist entscheidend, um Fluoridexposition, -stoffwechsel und -toxizität zu verstehen. Dieses Protokoll beschreibt eine empfindliche und reproduzierbare Methode zur Bestimmung der Fluoridionenmasse in Serum, Knochen und Zähnen mittels HMDS-(Hexamethyldisiloxan-)vermittelter Diffusion, gefolgt von einer Analyse mit einer ionenselektiven Elektrode (ISE). Biologische Proben, einschließlich Serum, Femurknochen und Unterkiefer-Schneidezähne, werden von Mäusen gesammelt, die kontrollierten Fluoridbehandlungen ausgesetzt wurden. Knochen- und Zahnproben werden verascht, gemahlen und hydratisiert, während das Serum direkt aufgearbeitet wird. Jede Probe wird in eine Diffusionskammer mit ultrareinem Wasser überführt und mit einem mit Vaseline beschichteten Deckel verschlossen, der Tropfen aus Natriumhydroxid enthält und als Fluoridfalle dient. Die Injektion von mit HMDS gesättigter Schwefelsäure löst die Freisetzung und Diffusion von Fluorid aus, wodurch die freigesetzten Fluoridionen quantitativ in den Fallen aufgefangen werden. Nach einer über Nacht andauernden Diffusion werden die Tropfen der Fluoridfalle zu einer Einzelprobe vereinigt, auf den erforderlichen pH-Bereich angesäuert und auf ein definiertes Volumen eingestellt, um die ISE-Messung durchzuführen. Kalibrations-Diffusionskammern, die mit bekannten Fluoridmengen hergestellt wurden, erzeugen eine Standardkurve zur Quantifizierung, und Qualitätskontrollproben überprüfen die Stabilität der Elektrode. Repräsentative Ergebnisse von jugendlichen und ausgewachsenen Mäusen, die 0 oder 125 ppm Fluorid ausgesetzt waren, zeigen die Fähigkeit dieser Methode, alters- und dosisabhängige Unterschiede in den Fluoridgehalten in Serum, Knochen und Zähnen nachzuweisen. Dieses Protokoll bietet einen robusten, kalibrationsbasierten Ansatz zur Quantifizierung von Fluorid in verschiedenen biologischen Matrizes und eignet sich besonders gut für Studien zur Fluoridexposition, Gewebeablagerung und toxikologischen Wirkungen in murinen Modellen. Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode liegt in ihrer Fähigkeit, Fluorid in extrem kleinen Proben genau zu quantifizieren, einschließlich der 3–5 mg Asche, die aus einzelnen Mausschneidezähnen gewonnen werden, da der Diffusionsprozess das gesamte freigesetzte Fluorid in einem messbaren Probenvolumen von weniger als 100 µL anreichert.

Einleitung

Fluorid ist ein natürlich vorkommendes Anion, und die optimale Fluoridkonzentration ist wirksam bei der Prävention von Zahnkaries1,2,3,4,5. In den Vereinigten Staaten (U.S.) wurde die Fluoridierung von Trinkwasser in einer Konzentration von 0,7 ppm als öffentliche Gesundheitsmaßnahme zur Verringerung der Kariesinzidenz und zur Förderung der Mundgesundheit eingeführt6. Langfristige Aufnahme übermäßiger Mengen an Fluorid kann jedoch mehrere Gewebe negativ beeinflussen. Eine hohe Fluoridexposition stört die Schmelzbildung7,8,9, verändert die Knochenbildung10 und beeinträchtigt die Skelettintegrität11.

Auf zellulärer Ebene führt eine Fluorid-Exposition zu mehreren Störungen des Stoffwechsels, einschließlich oxidativem Stress12, endoplasmatischem Retikulum-Stress13, epigenetischen Modifikationen, die die Genexpression verändern14, und Apoptose in Ameloblasten15,16,17,18. Weltweit stellen erhöhte Fluoridkonzentrationen im Grundwasser (>1,5 ppm) ein erhebliches Gesundheitsrisiko dar. Eine aktuelle Studie mit prädiktiver Modellierung schätzte, dass weltweit etwa 180 Millionen Menschen möglicherweise durch übermäßige Fluorid-Exposition betroffen sind, wobei die höchste Belastung in Asien und Afrika auftritt1. Neben Trinkwasser erfolgt die Fluorid-Exposition auch über Lebensmittel (z. B. Meeresfrüchte; ~1,9 ppm), Getränke (z. B. Tee; 0,5–6 ppm19) und zahnmedizinische Produkte wie Zahnpasta20 (1.000–1.500 ppm).

Daher ist das Verständnis der Fluoridexposition, des Stoffwechsels und der Ablagerung im Gewebe unerlässlich, um sowohl die therapeutischen Vorteile als auch mögliche toxikologische Folgen zu bewerten. Die genaue Quantifizierung von Fluorid in biologischen Proben – einschließlich Urin, Serum, Knochen und Zähnen – ist ein entscheidender Bestandteil dieser Arbeit. Die Messung ist jedoch analytisch herausfordernd, da Fluorid aufgrund seines chemischen Verhaltens und seiner starken Affinität zu calciumreichen Matrizes schwer zu bestimmen ist. Etwa 99 % des im Körper enthaltenen Fluorids befinden sich in mineralisierten Geweben wie Knochen und Zähnen21. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, wurden verschiedene analytische Methoden entwickelt, darunter die potentiometrische Messung mit einer ionenselektiven Elektrode (ISE), die Ionenchromatographie, farbmetrische Assays, titrimetrische Verfahren sowie nukleare oder aktivitätsbasierte Methoden22. Unter diesen hat sich die mit Hexamethyldisiloxan (HMDS) unterstützte Diffusionstechnik in Kombination mit der Messung mittels fluoridselektiver Elektrode als eine der zuverlässigsten und am häufigsten verwendeten Methoden für biologische Matrizes etabliert, da sie hohe Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Verträglichkeit mit unterschiedlichen Probentypen aufweist23,24,25,26,27,28,29.

Trotz der Verfügbarkeit mehrerer analytischer Methoden weist jeder Ansatz Einschränkungen auf, die seine Anwendung in experimenteller oder klinischer Forschung begrenzen können. Die Ionenchromatographie bietet eine hohe Empfindlichkeit und Selektivität, erfordert jedoch spezielle Instrumentierung und umfangreiche Probenvorbereitung30,31. Farbmessverfahren wie die SPADNS-Methode (Natrium-2-(parasulfophenylazo)-1,8-dihydroxynaphthalin-3,6-disulfonat) sind einfach und kostengünstig, jedoch anfällig für Störungen durch Trübung und endogene Chromophore, was ihre Zuverlässigkeit in komplexen biologischen Proben einschränkt22,32,33. Titrimetrische Methoden sind kosteneffizient und unkompliziert, weisen jedoch nicht die erforderliche Empfindlichkeit für die Spurenerfassung von Fluorid in den meisten biologischen Proben auf34. Nukleare oder aktivierungs-basierte Techniken bieten außergewöhnliche Empfindlichkeit, erfordern jedoch Zugang zu Reaktoren oder beschleunigerbasierten Neutronenquellen und sind daher für den routinemäßigen Laborbetrieb unpraktisch35. Im Gegensatz dazu bietet die HMDS-vermittelte Diffusion gefolgt von ISE-Messung ein praktikables Gleichgewicht aus Empfindlichkeit, Kosten und Zugänglichkeit und stellt gleichzeitig eine vollständige Freisetzung von Fluorid sowohl aus Weich- als auch aus mineralisierten Geweben sicher. Dies ist besonders vorteilhaft für Studien an kleinen Tieren, bei denen die Gewebeverfügbarkeit begrenzt ist und mineralisierte Strukturen wie Mausincisiven nur 3–5 mg Asche pro Zahn liefern.

Die Fähigkeit der Diffusions-ISE-Methode, sämtlichen freigesetzten Fluorid in einem kleinen, definierten Volumen anzureichern, ermöglicht eine genaue Quantifizierung selbst bei äußerst geringen Probenmengen. Dadurch eignet sich die Methode gut für toxikokinetische Studien, Dosis-Wirkungs-Experimente sowie Untersuchungen des Fluorid-Stoffwechsels über verschiedene Entwicklungsstadien hinweg. Kleine Nagetiere, insbesondere C57BL/6J-Mäuse, werden häufig als tierische Modelle verwendet, um die Wirkungen von Fluorid zu erforschen7,9,12,29,36.

In diesem Protokoll wenden die Autoren die HMDS-unterstützte Diffusionstechnik in Kombination mit der Messung mittels fluoridselektiver Elektrode an, um Fluorid in Serum, Knochen und Zähnen von Mäusen zu quantifizieren, die einer hohen Fluoriddosis (125 ppm) ausgesetzt waren, im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen. Die Autoren vergleichen zudem die Fluoridakkumulation in adolescenten (6 Wochen zum Behandlungsbeginn) und ausgewachsenen (18 Wochen zum Behandlungsbeginn) Mäusen, um altersabhängige Unterschiede im Fluoridstoffwechsel und in der Gewebeablagerung zu bewerten. Unterkieferincisiven wurden als repräsentatives Zahngewebe gewählt, da die Incisiven von Nagetieren kontinuierlich nachwachsen und im Alter von etwa 7 Wochen ein stationäres Gleichgewicht zwischen Nachwachsen und okklusalem Verschleiß erreichen. Dieses kontinuierliche Wachstumsmuster bietet einen konsistenten und leicht zugänglichen Gradienten der Zahnschmelzentwicklung und macht die Mausincisiven zu einem weit verbreiteten und gut validierten Modell zur Untersuchung der Schmelzbildung und der dentalen Fluorose.

Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden gemäß den Richtlinien und Vorschriften für den Umgang mit Wirbeltieren durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Nova Southeastern University (Protokoll Nr. 2023.02.MSuz1) genehmigt wurden und die durch die Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) akkreditiert ist. Alle Tierversuche entsprachen den Leitlinien zur Pflege und Nutzung von Labor­tieren sowie den Richtlinien der American Veterinary Medical Association (AVMA) für die Euthanasie von Tieren. Alle in dieser Studie verwendeten Materialien sind in der Tabelle der Materialien aufgelistet.

1. Tiere und Vorbereitung sowie Verabreichung von Natriumfluorid in einem murinen Modell

  1. Tiere: Ordnen Sie männliche C57BL/6J-Mäuse zwei Alterskategorien zu: adolescent, 6 Wochen zum Beginn der Behandlung, und ausgewachsen, 18 Wochen zum Beginn der Behandlung.
    1. Stellen Sie jeder Gruppe entweder deionisiertes, fluoridfreies Wasser (0 ppm F⁻) oder fluoridhaltiges Trinkwasser mit Natriumfluorid (125 ppm F⁻) für einen Expositionszeitraum von 6 Wochen zur Verfügung.
    2. Schließen Sie jeweils fünf Tiere pro Alters- und Behandlungsbedingung ein (N = 5/Gruppe).
    3. Am Ende der Expositionsphase gewinnen Sie Serum, Femora und mandibuläre Schneidezähne und bereiten alle gesammelten Proben für die nachfolgende Analyse vor.
      ​HINWEIS: Probe: Verarbeitetes Material wie veraschte Knochen, veraschte Zähne und Serum.
  2. Tierhaltung und Ernährung: Halten Sie die Mäuse unter standardisierten Laborbedingungen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser (ad libitum).
    1. Verabreichen Sie eine fluoridfreie Diät ab einer Woche vor der Sammlung von Zähnen, Knochen und Serum, um Hintergrundfluoridgehalte zu minimieren.
  3. Natriumfluorid-Trinkwasser
    1. Zur Herstellung fluoridangereicherten Trinkwassers lösen Sie Natriumfluorid (NaF) in deionisiertem Wasser, um die gewünschte Fluoridkonzentration zu erreichen (z. B. 125 ppm F⁻).
    2. Filtrieren Sie die Lösung durch einen 0,2-µm-Vakuumfilter in eine autoklavierte Flasche. Bereiten Sie alle zwei Tage eine frische Lösung zu.
      ACHTUNG: NaF ist giftig bei Einnahme und kann Haut- und Augenreizungen verursachen. Handhaben Sie es im Abzug unter Tragen eines Laborkittels, von Nitrilhandschuhen und Schutzbrille.
  4. Für fluoridfreies Kontrollwasser filtrieren Sie deionisiertes Wasser durch einen 0,2-µm-Vakuumfilter in eine autoklavierte Flasche. Bereiten Sie alle zwei Tage frisches Wasser zu.
  5. Stellen Sie fluoridangereichertes oder fluoridfreies Trinkwasser ad libitum für die gewünschte Dauer der Fluoridbehandlung zur Verfügung. Überwachen Sie den Wasserstand täglich und wechseln Sie die Flaschen alle zwei Tage.
  6. Am Ende der Expositionsphase euthanasieren Sie die Tiere durch Kohlendioxidinhalation (CO₂), gefolgt von Enthauptung. Die Euthanasieverfahren wurden gemäß den AVMA-Leitlinien für die Euthanasie von Tieren durchgeführt und als Teil des institutionellen IACUC-Protokolls genehmigt.
    ACHTUNG: CO2 ist ein Erstickungsgas. Führen Sie die Prozeduren in gut belüfteter Umgebung durch und stellen Sie sicher, dass die Kammer ordnungsgemäß funktioniert. Vermeiden Sie direkte Inhalationsexposition.

2. Probenvorbereitung zur Fluorid-Messung

  1. Blutentnahme
    1. Töten Sie die Mäuse durch CO₂-Inhalation und entnehmen Sie unverzüglich Blut mittels terminaler Herzpunktion unter Verwendung einer 1-mL-Tuberkulinspritze. Überführen Sie das Blut in 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen. Entsorgen Sie alle verwendeten Nadeln und Spritzen in einem genehmigten, institutionellen Spitzabfallbehälter.
      ACHTUNG: Spritzenadeln sind scharf und können Stichverletzungen verursachen; gehen Sie vorsichtig damit um.
    2. Lagern Sie das Blut 30 min bei Raumtemperatur, anschließend zentrifugieren Sie 10 min bei 2.000 × g.
    3. Überführen Sie den Überstand (Serum) in ein Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie bei −80 °C.
      ACHTUNG: Tieftemperaturgefriergeräte bergen Erfrierungsgefahren. Tragen Sie isolierende Handschuhe beim Umgang mit Röhrchen und vermeiden Sie längeren Hautkontakt mit kalten Oberflächen.
  2. Knochen
    1. Entnahme der Femora: Nach der Tötung sezieren Sie die Hinterbeine an den Hüftgelenken.
    2. Entfernen Sie vorsichtig alle Weichgewebe von den Femora. Waschen Sie die Gewebe dreimal mit entionisiertem Wasser. Lagern Sie die Knochen bei -80 °C, bis sie weiterverarbeitet werden. Entsorgen Sie entfernte Weichgewebe und kontaminierte Materialien im institutionellen biologischen Abfallstrom.
      HINWEIS: Gewebe können zur Langzeitlagerung in 70 % Ethanol 12–16 h in 4 % Paraformaldehyd mit 2 % Saccharose fixiert werden. Dieses Fixierverfahren beeinträchtigt die Genauigkeit der nachfolgenden Fluoridquantifizierung nicht.
    3. Spülen Sie die Knochen gründlich mit entionisiertem Wasser. Entfernen Sie überschüssige Feuchtigkeit mit einem fusselfreien Papiertuch.
    4. Überführen Sie die Knochen in 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen mit geöffneten Deckeln, um Verdunstung zu ermöglichen, und stellen Sie sie für 12–16 h in einen Trockenofen bei 60 °C.
      ACHTUNG: Der Trockenofen kann Verbrennungen verursachen. Verwenden Sie hitzebeständige Handschuhe beim Umgang mit Proben.
    5. Veraschung der Knochen: Überführen Sie die getrockneten Knochen in Aluminiumoxid-Tiegel. Stellen Sie die Tiegel in einen Muffelofen und erhitzen Sie auf 600 °C mit einer Aufheizrate von 150 °C/h und halten Sie dann 6 h bei dieser Temperatur. Lassen Sie den Ofen auf unter 200 °C abkühlen, bevor Sie die Tiegel entnehmen. Entsorgen Sie verbleibende Knochenfragmente oder kontaminierte Verbrauchsmaterialien im institutionellen biologischen Abfallstrom.
      ACHTUNG: Der Muffelofen und die Tiegel erreichen extreme Temperaturen und stellen eine schwere Verbrennungsgefahr dar. Lassen Sie den Ofen stets vollständig abkühlen, bevor Sie die Tiegel anfassen. Tragen Sie beim Entnehmen des Laborkittels, Schutzbrille und hitzebeständige Handschuhe und verwenden Sie lange Pinzetten, um direkten Kontakt mit heißen Oberflächen zu vermeiden.
      ENTSCHLÜSSELER SCHRITT: Unvollständige Veraschung beeinträchtigt nachfolgende Analysen. Stellen Sie sicher, dass das Knochenmaterial vollständig oxidiert ist, bevor Sie fortfahren; verbleibender Kohlenstoff stört nachfolgende Messungen.
      ​HINWEIS: Korrekt veraschte Knochen sollten einheitlich hellgrau bis weiß erscheinen. Dunklere Partikel – insbesondere schwarze oder holzkohleartige Rückstände – deuten auf unvollständige Verbrennung hin. Bei Verfärbungen verlängern Sie die Veraschungsdauer, um organische Bestandteile vollständig zu entfernen.
    6. Lagerung der veraschten Knochen: Überführen Sie die Knochen unmittelbar nach der Veraschung in 1,5 mL-Mikrozentrifugenröhrchen. Verschließen Sie die Röhrchen mit Parafilm und lagern Sie sie bis zur Verwendung in einem Vakuum-Exsikkator.
  3. Zähne
    1. Entnahme der Unterkieferincisiven: Führen Sie einen horizontalen Schnitt auf Höhe des Kiefergelenks durch, um den Unterkiefer vom Oberkiefer zu trennen.
    2. Führen Sie median-sagittale Schnitte durch, um sowohl Ober- als auch Unterkiefer in linke und rechte Hälften zu teilen.
    3. Waschen Sie die Gewebe dreimal mit entionisiertem Wasser und entnehmen Sie vorsichtig die Unterkieferincisiven. Lagern Sie die entnommenen Incisiven bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung. Entsorgen Sie entnommenes Weichgewebe und kontaminierte Verbrauchsmaterialien im institutionellen biologischen Abfallstrom.
      ACHTUNG: Verwenden Sie scharfe Präparationsinstrumente vorsichtig bei Schnitten am Kiefergelenk und in der median-sagittalen Ebene, um Verletzungen zu vermeiden. Tragen Sie geeignete PSA, einschließlich Handschuhe, Laborkittel und Schutzbrille.
      HINWEIS: Gewebe können zur Langzeitlagerung in 70 % Ethanol 12–16 h in 4 % Paraformaldehyd mit 2 % Saccharose fixiert werden. Dieses Fixierverfahren beeinträchtigt die Genauigkeit der nachfolgenden Fluoridquantifizierung nicht.
    4. Zahnvorbereitung zur Veraschung: Spülen Sie die Zähne gründlich mit entionisiertem Wasser und legen Sie sie für 12–16 h in 1 % Wasserstoffperoxid (H₂O₂). Entsorgen Sie verbrauchte Wasserstoffperoxidlösungen als gefährlichen chemischen Abfall.
    5. Spülen Sie erneut mit entionisiertem Wasser, tupfen Sie kurz mit einem fusselfreien Tuch trocken und überführen Sie in 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen mit geöffneten Deckeln. Stellen Sie die Röhrchen für 12–16 h in einen Trockenofen bei 60 °C.
      ACHTUNG: Wasserstoffperoxid ist ein Oxidationsmittel und kann Haut- und Augenreizungen verursachen. Handhaben Sie es in einer Abzugshaube unter Tragen eines Laborkittels, von Nitrilhandschuhen und Schutzbrille. Vermeiden Sie Kontakt mit brennbaren Materialien.
    6. Veraschung der Zähne: Überführen Sie die getrockneten Zähne in Aluminiumoxid-Tiegel und veraschen Sie sie in einem Muffelofen bei einer Haltezeittemperatur von 600 °C für 20 h bei einer Aufheizrate von 150 °C/h.
    7. Entnehmen Sie die Tiegel erst, nachdem der Ofen unter 200 °C abgekühlt ist.
      ACHTUNG: Der Muffelofen und die Tiegel erreichen extreme Temperaturen und stellen eine schwere Verbrennungsgefahr dar. Lassen Sie den Ofen unter 200 °C abkühlen, bevor Sie die Tiegel anfassen. Tragen Sie beim Entnehmen Laborkittel, Schutzbrille und hitzebeständige Handschuhe und verwenden Sie lange Pinzetten, um direkten Kontakt mit heißen Oberflächen zu vermeiden.
      ENTSCHLÜSSELER SCHRITT: Stellen Sie eine vollständige Oxidation sicher; verbleibender Kohlenstoff stört nachfolgende Analysen.
      HINWEIS: Veraschtes Zahnmaterial sollte einheitlich hellgrau bis weiß erscheinen. Wiederholen Sie die Veraschung, wenn schwarze Rückstände verbleiben.
    8. Lagerung des veraschten Zahnmaterials: Überführen Sie die Zähne unmittelbar nach der Veraschung in 2-mL-Rundboden-Mikrozentrifugenröhrchen.
    9. Verschließen Sie die Röhrchen mit Parafilm und lagern Sie sie bis zur Verwendung in einem Vakuum-Exsikkator.

3. Herstellung von HMDS-unterstützten Diffusionsplatten

  1. Reagenzien und Material
    1. 6 N Schwefelsäure: Mindestens zwei Tage vor der Herstellung der Diffusionsgefäße einen Vorrat an 6 N Schwefelsäure ansetzen.
      HINWEIS: Diffusionsgefäß: Ein versiegeltes Gefäß, das entwickelt wurde, um eine kontrollierte geschlossene Umgebung zu schaffen, in der freigesetzte Bestandteile aus einem behandelten biologischen Material durch eine an der Deckelinnenseite befestigte chemische Falle aufgefangen werden können. Das dichte Design verhindert den Austausch mit der Außenluft und stellt sicher, dass freigesetzte Analyten zur anschließenden Messung zur Falle geleitet werden.
    2. Einen 1 L-Plastikbecher mit einem Magnetrührstab auf einen Magnetrührer stellen und 416 mL ultrareines Wasser hinzufügen.
    3. Unter ständigem Rühren mit einer 50 mL-serologischen Pipette langsam 84 mL 36 N H₂SO₄ zum Wasser hinzufügen. Die Lösung wird heiß; auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Nicht verwendete oder verbrauchte Schwefelsäurelösungen als gefährliche chemische Abfälle über den institutionellen chemischen Abfallstrom entsorgen.
      ACHTUNG: Schwefelsäure ist stark ätzend. Im Abzug arbeiten und säurebeständige Handschuhe, Laborkittel und Schutzbrille tragen. Bei Kontakt sofort mit reichlich Wasser spülen.
    4. HMDS-gesättigte 6 N Schwefelsäure: Die 6 N Schwefelsäure in einen 2 L-Trenntrichter umfüllen und 15 mL Hexamethyldisiloxan (HMDS) hinzufügen.
    5. Sicherstellen, dass Stopfen und Hahn fest verschlossen sind, den Trenntrichter seitlich halten und kräftig schütteln, bis kleine HMDS-Tröpfchen sichtbar sind.
    6. Den Stopfen öffnen, um entstehendes Gas abzulassen, und diesen Vorgang zwei weitere Male wiederholen.
    7. Den Stopfen für mehrere Stunden leicht geöffnet lassen. Den Trenntrichter mit der 6 N HMDS-gesättigten Schwefelsäure in einem Ständer im Abzug aufbewahren. HMDS-haltige Schwefelsäure und kontaminierte Materialien als gefährliche chemische Abfälle entsorgen.
      ACHTUNG: HMDS ist entzündbar und durch Einatmen giftig. Im Abzug arbeiten und Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille tragen. Von Zündquellen fernhalten.
    8. 0,05 N Natriumhydroxid: 1 g NaOH-Perlen in 25 mL ultrareinem Wasser lösen, um eine 1 N-Stammlösung herzustellen.
    9. 2 mL der 1 N NaOH-Stammlösung mit 38 mL ultrareinem Wasser mischen, um eine 0,05 N NaOH-Lösung zu erhalten.
    10. Die 0,05 N NaOH-Lösung in 1,5 mL-Mikrozentrifugenröhrchen portionieren, die Deckel mit Parafilm sichern und die Röhrchen in einem Vakuum-Exsikkator aufbewahren, um die CO₂-Absorption zu minimieren. Nicht verwendete oder verbrauchte Natriumhydroxidlösungen als gefährliche chemische Abfälle entsorgen.
      ACHTUNG: Natriumhydroxid ist stark ätzend und kann schwere Verbrennungen verursachen. Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille tragen. Lösungen vorsichtig handhaben, um Spritzer zu vermeiden.
    11. 0,2 N Essigsäure: 575 µL reine Essigsäure zu ultrareinem Wasser hinzufügen und auf ein Endvolumen von 50 mL auffüllen, um 0,2 N Essigsäure herzustellen. Essigsäurelösungen als gefährliche chemische Abfälle entsorgen.
      ACHTUNG: Essigsäure ist korrosiv und kann Haut, Augen und Atemwege reizen. Im chemischen Abzug arbeiten und Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille tragen.
    12. Petrolatum: Etwa 100 g Petrolatum bei 60 °C in einem Ofen schmelzen. Das flüssige Petrolatum in 10 mL-Spritzen aufziehen und erkalten und erstarren lassen. Mit Petrolatum gefüllte Spritzen können mehrere Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.
    13. Petri-Schale: Für die Herstellung von Diffusionsgefäßen unbehandelte Petri-Schalen mit den Maßen 60 × 15 mm verwenden.
    14. Mit einer erhitzten 18-G-Spritzenkanüle ein kleines Loch in den Deckel einer Petri-Schale schmelzen.
    15. Den Innensrand des Deckels mit einem durchgehenden Petrolatum-Dichtungsstrang mit einer 10 mL-Spritze, die mit einer stumpfen 14 G-Kanüle ausgestattet ist, beschichten. Alle verwendeten Kanülen im genehmigten institutionellen Spitzabfallbehälter entsorgen.
      ACHTUNG: Spritzenkanülen sind scharf und können Stichverletzungen verursachen. Vorsichtig handhaben und in genehmigten Kanülenbehältern entsorgen. Beim Erhitzen von Kanülen hitzebeständige Handschuhe und Augenschutz tragen, um Verbrennungen zu vermeiden.
    16. NaF-Stammlösungen für Kalibrations-Diffusionsgefäße. 4,19 g NaF in 1 L ultrareinem Wasser lösen, um eine 100 mM-Stammlösung herzustellen. Durch serielle 1:10-Verdünnungen der 100 mM-Lösung 10 mM-, 100 µM- und 10 µM-Stammlösungen herstellen.
      HINWEIS: Ein Mol NaF liefert 19 g F⁻; daher enthält 1 µL 10 µM NaF 0,19 ng F⁻ und 1 µL 10 mM NaF enthält 190 ng F⁻.
      ​HINWEIS: Kalibrations-Diffusionsgefäße: Diffusionsgefäße, die speziell zur Kalibrierung mit einer bekannten Masse an Fluoridionen (F¯) verwendet werden.
  2. Probenspezifische Herstellung von Diffusionsgefäßen
    1. Serum-Diffusionsgefäß: 3 mL ultrareines Wasser in den Boden der Petri-Schale pipettieren und 75 µL Serum hinzufügen. Serumkontaminierte Materialien im institutionellen biologischen Abfallstrom entsorgen. Mit Schritt 3.4 fortfahren.
    2. Knochen-Diffusionsgefäß
      1. Pulverisierung der Knochenasche: Die veraschten Knochen mit einem Mikrospatel in den 1,5 mL-Mikrozentrifugenröhrchen zu einem feinen Pulver zermahlen. Die Verarbeitung der pulverisierten Knochenasche unmittelbar fortsetzen. Verbrauchsmaterialien, die mit Knochenasche kontaminiert sind, im institutionellen chemischen Abfallstrom entsorgen.
      2. Wiegen und Hydrieren der Knochenasche
        1. Den leeren Boden der Petri-Schale auf die Wägeplatte einer Analysenwaage mit einer Ablesbarkeit von mindestens 0,1 mg stellen.
        2. Die gemahlene Knochenasche aus dem 2 mL-Mikrozentrifugenröhrchen in eine kleine Porzellanschale überführen, um statische Aufladung zu minimieren und Pulververteilung zu verhindern.
        3. Mit einem Mikrospatel etwa 5 mg Knochenasche zur Schale hinzufügen und das Pulver sofort mit 3 mL ultrareinem Wasser bedecken, bevor die Schale von der Analysenwaage entfernt wird, um eine Ascheverteilung zu vermeiden.
        4. Das exakte Gewicht jeder Knochenascheprobe notieren. Mit Schritt 3.4 fortfahren.
    3. Zahn-Diffusionsgefäß
      1. Vermahlung der veraschten Zähne
        1. Die veraschten Schneidezähne in 2 mL-rundbodige Mikrozentrifugenröhrchen überführen und in jedes Röhrchen eine 5 mm große Edelstahlkugel geben. Die Röhrchen verschließen und die Deckel mit Parafilm sichern.
        2. Die veraschten Schneidezähne in einem Bead-Beater bei 2.500 U/min für 10 s pulverisieren. Die Verarbeitung der gemahlenen Zähne unmittelbar fortsetzen.
      2. Wiegen und Hydrieren der veraschten Zähne
        1. Den gesamten Inhalt des Röhrchens, einschließlich der Edelstahlkugel, in den Boden des Diffusionsgefäßes geben, das auf der Wägeplatte einer Analysenwaage positioniert ist. Kontaminierte Verbrauchsmaterialien, die Zahnasche enthalten, im institutionellen chemischen Abfallstrom entsorgen.
        2. Die Edelstahlkugel aus der Schale entfernen und das exakte Gewicht der Zahnasche notieren (typischerweise 3–4 mg pro Unterkiefer-Schneidezahn).
        3. Unmittelbar 3 mL ultrareines Wasser hinzufügen, um die Zahnasche zu bedecken, bevor die Schale von der Waage entfernt wird, um eine Ascheverteilung durch statische Entladung zu verhindern. Mit Schritt 3.4 fortfahren.
  3. Kalibrations- und Qualitätskontroll-Diffusionsgefäße
    1. Parallel zu den Probendiffusionsgefäßen zwei Sätze von Kalibrations-Diffusionsgefäßen für eine 5–6-Punkte-Kalibrierung sowie einen identischen Satz von Qualitätskontroll-Diffusionsgefäßen, einschließlich einer Blindprobe, herstellen.
      HINWEIS: Qualitätskontroll-Diffusionsgefäße: Werden identisch zu den Kalibrations-Diffusionsgefäßen hergestellt, dienen aber periodisch zur Überprüfung der Elektrodenstabilität und zur Sicherstellung einer konsistenten Messleistung.
    2. 3 mL ultrareines Wasser in jeweils 11 oder 13 Petri-Schalen pipettieren und NaF-Stammlösung hinzufügen, um den erwarteten F¯-Massenbereich der Proben abzudecken. Mit Schritt 3.4 fortfahren, um die Montage der Diffusionsgefäße abzuschließen37.
  4. Vervollständigung der Diffusionsgefäß-Montage
    1. Zur Herstellung einer Fluoridfalle werden 50 µl 0,05 N NaOH in drei Tropfen auf die Innenseite des Petri-Schalen-Deckels aufgetragen, weit entfernt vom Rand des Deckels.
      HINWEIS: Fluoridfalle (F¯-Falle): Ein Bestandteil von Diffusionsgefäßen, der F¯ einfängt, speziell Natriumhydroxid (NaOH).
    2. Den Deckel umdrehen, ohne die NaOH-Tropfen zu stören, und ihn fest mit dem Boden des Gefäßes mittels Petrolatum verschließen.
    3. Zur Herstellung einer 3 N HMDS-gesättigten Schwefelsäurelösung gleiche Volumina 6 N HMDS-gesättigter Schwefelsäure und ultrareinen Wassers mischen. Unmittelbar vor Gebrauch frisch herstellen, da sie nicht gelagert werden kann.
    4. 3 mL der hergestellten 3 N HMDS-gesättigten Schwefelsäure mit einer 10 mL-Spritze, die mit einer 20 G-Kanüle ausgestattet ist, durch das Loch im Deckel in das Wasser am Boden des Diffusionsgefäßes injizieren. Beim Einführen und Herausziehen der Spritzenkanüle darauf achten, dass keine Säure auf die Innenseite des Deckels spritzt.
    5. HMDS-unterstützte Fluorid-Diffusion: Das Injektionsloch unmittelbar mit einem Petrolatum-Tropfen, der die Öffnung vollständig abdeckt, versiegeln und die Diffusionsgefäße auf einen verstellbaren Schüttler mit langsamer Geschwindigkeit stellen. Über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren (Abbildung 1).

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Abbildung 1: Schematische Darstellung einer Knochen-Diffusionszelle zur Fluorid-Extraktion und -Abscheidung. Abbildung 1 veranschaulicht den Aufbau einer in einer 60 × 15 mm großen unbehandelten Petrischale zusammengestellten Knochen-Diffusionszelle. Der Deckel weist ein kleines Injektionsloch auf, das mit einer Petrolatumperle verschlossen ist. Auf der Innenseite des Deckels befinden sich drei Tropfen NaOH als Fallen für Fluoridionen (F⁻), die während der Diffusion vom Deckel hängend angeordnet sind. Der Deckel wird mit Petrolatum luftdicht mit dem Schalenboden verschlossen. Der Boden der Petrischale enthält ultrareines Wasser, mit Hexamethyldisiloxan (HMDS) gesättigte Schwefelsäure und Knochenasche, die gemeinsam das Reaktionsmilieu für die Freisetzung und anschließende Abscheidung von Fluorid bilden. Diese Abbildung wurde von den Autoren mit Biorender erstellt und steht unter der CC-BY-Lizenz. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

4. Fluorid-Messung mit einer ISE

  1. Einrichten der ISE
    1. Füllen Sie die doppelkanalige fluoridselektive Elektrode mit der geeigneten Fülllösung, schließen Sie sie an das Potentiometer an und befestigen Sie die Elektrode in einem Elektrodenhalter.
    2. Platzieren Sie eine unbehandelte Petrischale auf einem Scherenhubtisch unterhalb der sensorischen Oberfläche der Elektrode, wobei sichergestellt werden muss, dass die sensorische Oberfläche parallel zum Boden der Petrischale liegt. Heben Sie den Tisch des Scherenhubtischs so an, dass die Petrischale fast die Elektrode berührt (Abbildung 2).
  2. Vorbereitung der Proben zur Messung
    ANMERKUNG: Proben: Im Protokoll werden ausschließlich die Endprodukte als Proben bezeichnet, die mit einer ionenselektiven Elektrode (ISE) gemessen werden und aus der F¯-Falle nach der Diffusion bestehen, die anschließend mit Essigsäure und Wasser versetzt wurde. 
    1. Um den pH-Wert der Probe auf 5 einzustellen, nehmen Sie die Diffusionsschale vom Schüttler und heben Sie vorsichtig den Deckel ab, indem Sie die Vaseline-Dichtung nach der Inkubationszeit durchbrechen. Stellen Sie den Deckel auf eine ebene Fläche, wobei sichergestellt werden muss, dass die drei Tropfen der F¯-Falle ungestört bleiben.
    2. Fügen Sie mit einer P20-Pipette 15–20 µL 0,2 N Essigsäure zu einem Tropfen hinzu und verschmelzen Sie anschließend alle drei Tropfen zu einem einzigen Tropfen, ohne die Pipettenspitze zu wechseln.
      ANMERKUNG: Proben mit hohen F¯-Konzentrationen weisen tendenziell einen niedrigeren Ausgangs-pH-Wert auf und benötigen daher weniger 0,2 N Essigsäure, um den pH-Wert auf 5 einzustellen, im Vergleich zu Proben mit geringerem F¯-Gehalt. Da das verbleibende Probenvolumen nach der Aufzeichnung des Elektrodenpotentials (Schritt 5.3) minimal ist, verwenden Sie die verfügbare Restprobe, um den pH-Wert mit Indikatorpapier zu überprüfen.
    3. Um das Probenvolumen anzupassen, stellen Sie eine P100-Pipette auf 75 µL ein, aspirieren Sie das gesamte Volumen der F¯-Falle, ohne Luft einzuziehen, und stellen Sie die Probe mithilfe von ultra-reinem Wasser exakt auf 75 µL ein.
    4. Führen Sie diesen Schritt sorgfältig durch, um ein genaues Volumen für die Fluoridkonzentrationsberechnung sicherzustellen. Behalten Sie die Probe in der Pipettenspitze bei und fahren Sie unmittelbar mit Schritt 4.3 fort.
  3. Messung von Proben, Kalibrier- und Qualitätskontrollproben
    1. Um das Elektrodenpotential der Probe zu messen, geben Sie diese zwischen die sensorische Oberfläche der fluoridselektiven Elektrode und die Petrischale. Stellen Sie sicher, dass die gesamte sensorische Oberfläche der Elektrode vollständig in Flüssigkeit eingetaucht ist, ohne die Petrischale direkt zu berühren. Lassen Sie das Potentiometer stabilisieren und notieren Sie das vom ISE angezeigte Potential (mV).
    2. Bestimmen Sie die Kalibrierstandardkurve, indem Sie die erste Serie von Kalibrierstandards nacheinander messen, beginnend mit der niedrigsten F¯-Konzentration und fortschreitend zur höchsten.
      1. Tragen Sie das Elektrodenpotential (mV) gegen den Logarithmus von F¯ (ng) auf, um die Kalibrierkurve zu erstellen (Abbildung 3). Wenden Sie eine exponentielle Regression an, um die Gleichung der Standardkurve und den Bestimmtheitskoeffizienten (R2) zu erhalten. Akzeptieren Sie Kalibrierkurven nur, wenn R2 ≥ 0,99 beträgt.
    3. Messen Sie jede Probenprobe und notieren Sie das Elektrodenpotential (mV).
    4. Um die Elektrodenstabilität zu überwachen und mögliche Assay-Drifts zu erkennen, messen Sie Qualitätskontrollproben intermittierend während jedes analytischen Durchlaufs.
      1. Vergleichen Sie die Werte der Qualitätskontrollproben direkt mit den entsprechenden Kalibrierproben und bestätigen Sie eine Übereinstimmung innerhalb von etwa 5 %, um eine stabile Elektrodenleistung über die Zeit zu verifizieren.
      2. Messen Sie regelmäßig eine leere Diffusionsschale, um die Abwesenheit von Fluoridkontamination während der Probenhandhabung und Diffusion zu bestätigen.
  4. Zur Berechnung der Masse von F¯ (ng) in jeder Probenprobe verwenden Sie die Gleichung der Standardkurve. Teilen Sie anschließend diese Masse durch das Volumen (µL) des hinzugefügten Serums oder durch die Masse (mg) der Knochen- oder Zahnschwere, die der Diffusionsschale zugegeben wurde.
    1. Beispielrechnung der F¯-Konzentration in Knochenschwere (ng/mg)
      1. Zur Diffusionsschale hinzugefügte Masse an Knochenschwere: 5,1 mg; Elektrodenpotential der 75 µL-Probenprobe: –31,6 mV
      2. Schritt 1: Berechnung der Fluoridmasse mithilfe der Kalibriergleichung
        1. F⁻-Masse (ng) = 3505,4 x e(-0,043x-31,6)
        2. F⁻-Masse (ng) = 13.641 ng
      3. Schritt 2: Berechnung der Fluoridkonzentration in Knochenschwere
        1. F⁻-Konzentration =  13.641 ng  /  5,1  mg
        2. F⁻-Konzentration =  2.675 ng / mg (ppm)

figure-protocol-2
Abbildung 2: Schematische Darstellung des ISE-Messaufbaus. Abbildung 2 veranschaulicht die Konfiguration, die für die Fluoridionen-Messungen mit einer doppelkanaligen ionenselektiven Elektrode (ISE) verwendet wird. Eine Petrischale ist auf einem Scherenständer positioniert, um eine präzise Einstellung ihrer Höhe relativ zur Elektrode zu ermöglichen. Die ISE ist mit einem Potentiometer verbunden und so ausgerichtet, dass ihre sensorische Oberfläche parallel zur Ebene der Petrischale liegt und einen Abstand von etwa 1–2 mm beibehält. Nachdem der Abstand eingestellt ist, wird eine kleine Menge der Probe (75 µL) in den Spalt zwischen der sensorischen Oberfläche und der Petrischale pipettiert, wobei sichergestellt wird, dass die Probe während der Messung die sensorische Fläche der Elektrode vollständig bedeckt. Diese Abbildung wurde von den Autoren mit Biorender erstellt und steht unter der CC-BY-Lizenz zur Verfügung. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-protocol-3
Abbildung 3: Kalibrierungskurve und zugehörige Kalibrierungstabelle zur Quantifizierung der Fluoridionenmasse in Zahnlaborproben. Oberes Feld: Beispielhafte Kalibrierungskurve zur Bestimmung der Fluoridionenmasse in Zahnlaborproben. Die x-Achse zeigt das Elektrodenpotential (mV, linearer Maßstab), und die y-Achse zeigt die entsprechende Fluoridionenmasse (ng F⁻, logarithmischer Maßstab). Gemessene Kalibrierpunkte sind als durchgezogene Linie dargestellt, und die angepasste exponentielle Regressionskurve ist als gestrichelte Linie gezeigt. Ein eingezeichnetes Kästchen zeigt die Gleichung der Standardkurve und das Bestimmtheitsmaß (R2 = 0.99). Unteres Feld: Tabelle mit den numerischen Werten, die zur Erstellung der Kalibrierungskurve verwendet wurden. Die erste Zeile enthält die fünf Elektrodenpotentiale (mV), die für die Kalibrierproben aufgezeichnet wurden. Die zweite Zeile gibt die entsprechenden Fluoridionenmassen (ng F⁻) für jede Kalibrierprobe an. Die dritte Zeile listet die Volumina (µL) der 10 mM NaF-Stammlösung auf, die den Kalibrierdiffusionsgefäßen hinzugefügt wurden; diese zugegebene Fluoridionenmasse entspricht der Masse, die in jeder Kalibrierprobe nach der Diffusion eingefangen wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergebnisse

Um die Anwendung dieses Protokolls zur Bestimmung von Fluoridkonzentrationen (F-) in biologischen Materialien zu demonstrieren, wurden Proben aus Serum, Knochen und Unterkiefer-Schneidezähnen von Mäusen gewonnen, die kontrollierten Fluoridbehandlungen ausgesetzt waren. Männliche C57BL/6J-Mäuse wurden zwei Altersgruppen zugeordnet, jugendlich (6 Wochen) und ausgewachsen (18 Wochen), und erhielten entweder fluoridfreies deionisiertes Wasser (0 ppm F⁻) oder mit Natriumfluorid angereichertes Trinkwasser (125 ppm F⁻) über einen Zeitraum von 6 Wochen. Jede Alters- und Behandlungsgruppe umfasste fünf Tiere. Am Ende der Expositionsphase wurden Serum, Femora und Unterkiefer-Schneidezähne entnommen, die Proben vorbereitet und gemäß dem Protokoll analysiert. Die repräsentativen, in Serum, Knochen und Zähnen gemessenen Fluoridkonzentrationen sind unten zusammengefasst.

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Abbildung 4: Fluoridkonzentrationen in Serum, Femurknochen und Unterkiefer-Schneidezähnen gemessen. Männliche C57BL/6J-Mäuse wurden zwei Altersgruppen zugewiesen, jugendlich (6 Wochen, offener Balken) und ausgewachsen (18 Wochen, gefüllter Balken), und erhielten entweder fluoridfreies deionisiertes Wasser (0 ppm F⁻) oder mit Natriumfluorid angereichertes Trinkwasser (125 ppm F⁻) über einen Zeitraum von 6 Wochen. Am Ende der Expositionszeit wurden die Fluoridgehalte in (A) Serum, (B) Femurknochen und (C) Unterkiefer-Schneidezähnen derselben Behandlungsgruppen bestimmt. Serumwerte unterhalb der Nachweisgrenze (<0,02 ppm) wurden zur Veranschaulichung eingetragen, aber von der statistischen Analyse ausgeschlossen. Die Daten sind als Mittelwerte ± SD angegeben. Vergleiche zwischen den jugendlichen und ausgewachsenen Gruppen wurden mittels eines Mann-Whitney-U-Tests mit Bonferroni-Dunn-Korrektur für multiple Vergleiche durchgeführt. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Fluoridkonzentrationen im Serum
In beiden Gruppen von Jugendlichen und Erwachsenen, die mit 0 ppm Fluorid behandelt wurden, lagen die Fluoridkonzentrationen im Serum unterhalb der Nachweisgrenze der ionenselektiven Elektrode (<0,02 ppm). In den Behandlungsgruppen mit 125 ppm stieg die Fluoridkonzentration im Serum auf 0,3 ± 0,2 ppm in der Gruppe der Jugendlichen und auf 0,7 ± 0,2 ppm in der Gruppe der Erwachsenen an (p = 0,06). Der Vergleich zwischen der Gruppe der mit 125 ppm behandelten Jugendlichen und der Gruppe der Erwachsenen erfolgte mittels eines Mann-Whitney-U-Tests mit Bonferroni-Dunn-Korrektur für multiple Vergleiche. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/Gruppe). Die Gruppen mit 0 ppm-Behandlung wurden von der statistischen Analyse ausgeschlossen. (Abbildung 4A, Tabelle 1).

Fluoridgehalte im Femur
In den 0-ppm-Behandlungsgruppen waren die Fluoridgehalte im Femur bei Adoleszenten (292 ± 39 ppm) signifikant niedriger als bei ausgewachsenen Tieren (896 ± 55 ppm) (p < 0,01). Im Gegensatz dazu waren in den 125-ppm-Gruppen die Fluoridgehalte bei Adoleszenten (4.108 ± 482 ppm) signifikant höher als bei ausgewachsenen Tieren (2.966 ± 612 ppm) (p = 0,04). Vergleiche zwischen adolescenten und ausgewachsenen Gruppen wurden mittels eines Mann-Whitney-U-Tests mit Bonferroni-Dunn-Korrektur für multiple Vergleiche durchgeführt. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/Gruppe). (Abbildung 4B, Tabelle 1). Abbildung 5A zeigt die Veränderung der Fluoridgehalte im Femur zwischen den 0-ppm- und 125-ppm-Behandlungen für jede Altersgruppe. Adoleszente zeigten bei 125 ppm einen 14-fachen Anstieg der Fluoridgehalte, während ausgewachsene Mäuse einen 3-fachen Anstieg aufwiesen.

Fluoridgehalte in den Unterkieferincisiven
In den 0-ppm-Gruppen waren die Fluoridgehalte in den Unterkieferincisiven bei Adoleszenten (35 ± 4 ppm) im Vergleich zu ausgewachsenen Tieren (123 ± 23 ppm) signifikant niedriger (p = 0,03). In den Behandlungsgruppen mit 125 ppm stiegen die Fluoridgehalte in den Incisiven auf 5641 ± 955 ppm bei Adoleszenten und auf 4392 ± 1694 ppm bei ausgewachsenen Tieren an. Der Vergleich zwischen adolescenten und ausgewachsenen Gruppen erfolgte mittels eines Mann-Whitney-U-Tests mit Bonferroni-Dunn-Korrektur für multiple Vergleiche. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/Gruppe). (Abbildung 4C, Tabelle 1). Obwohl die absoluten Fluoridgehalte bei 125 ppm zwischen den Altersgruppen nicht signifikant unterschiedlich waren, war die Zunahme von 0 ppm auf 125 ppm bei adolescenten Mäusen (161-fache Erhöhung) signifikant größer als bei ausgewachsenen Mäusen (36-fache Erhöhung) (Abbildung 5B).

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Abbildung 5: Jugendliche Mäuse weisen einen stärkeren Anstieg der Fluoridakkumulation in Knochen und Schneidezähnen auf als ausgewachsene Mäuse. Veränderung der Fluoridkonzentrationen bei der Behandlung mit 0 ppm im Vergleich zu 125 ppm Fluorid bei jugendlichen (weißer Balken) und ausgewachsenen (gefüllter Balken) Mäusen. (A) Femurknochen und (B) Unterkieferschneidezahn derselben Behandlungsgruppen. Die Daten sind als Mittelwert ± SD angegeben. Der Vergleich zwischen den Gruppen der Jugendlichen und Ausgewachsenen erfolgte mittels eines ungepaarten t-Tests. * p < 0,05, (N = 5/Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

ProbeSerumFemurMandibulärer Schneidezahn
AltersgruppeAdoleszentReifAdoleszentReifAdoleszentReif
Behandlungsgruppe0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm
< 0,020,2< 0,020,8324457693330813748241613229
< 0,020,1< 0,020,8229377892433263954511272654
< 0,020,7< 0,021,0300468387737133155441126997
< 0,020,4< 0,020,5323383280725193551141034169
< 0,020,3< 0,020,528336699372192N/V72711114909
Mittelwert< 0,020,3< 0,020,7292410889629663556411234392
SDN/V0,2N/V0,239482556123955231694

Tabelle 1: Individuelle Fluoridmessungen in Serum, Femurknochen und Unterkiefer-Schneidezähnen. Tabelle 1 enthält die individuellen Fluoridkonzentrationen (ppm F⁻), die in Proben von Serum, Femurknochen und Unterkiefer-Schneidezähnen von jugendlichen und ausgewachsenen Mäusen gemessen wurden, die entweder 0 ppm oder 125 ppm Fluorid ausgesetzt waren. Für jeden Gewebetyp sind die Daten in Spalten dargestellt, die den vier Behandlungsgruppen entsprechen: jugendlich 0 ppm, jugendlich 125 ppm, ausgewachsen 0 ppm und ausgewachsen 125 ppm. Jede Spalte enthält die fünf individuell erfassten Werte (N = 5), gefolgt vom berechneten Mittelwert und der Standardabweichung (SD). In der Gruppe der jugendlichen Mäuse mit 0 ppm im Serum lagen alle gemessenen Werte unterhalb der Nachweisgrenze der ionenselektiven Elektrode (<0,02 ppm). Die Tabelle liefert die rohen Zahlenwerte, die den zusammenfassenden Angaben und statistischen Vergleichen in Abbildung 4 zugrunde liegen.

Diskussion

Fluoridkonzentrationen wurden mit einer fluoridselektiven ionenselektiven Elektrode (ISE) gemessen, die ein Lanthanfluorid (LaF₃)₃Kristallmembran38,39. Diese Membran bildet äußerst stabile La–F-Bindungen aus, was zu einer starken Präferenz für Fluoridionen gegenüber anderen Halogeniden führt. Gemäß etablierter elektrochemischer Literatur und den Herstellerangaben weist das LaF₃ Die Membran weist sehr niedrige Selektivitätskoeffizienten für Chlorid auf, was darauf hinweist, dass Chloridionen unter den in diesem Protokoll verwendeten Bedingungen keine messbare Interferenz verursachen. Obwohl Chlorid natürlich in Zähnen und Knochen vorkommt, beeinflusst seine Aktivität das Elektrodenpotential nicht, und das aufgezeichnete Signal spiegelt spezifisch die Fluoridaktivität wider. Die Nachweisgrenze von 0,02 ppm entspricht der vom Hersteller validierten minimalen quantifizierbaren Konzentration für die Orion-Fluorid-selektive Elektrode. Diese Grenze entspricht der niedrigsten Fluoridkonzentration, bei der die Elektrode eine stabile Nernstsche Antwort und einen linearen Zusammenhang mit der Kalibrierkurve aufrechterhält. Da die Nachweisgrenze durch die membranbedingten Eigenschaften der Elektrode definiert und vom Hersteller validiert ist, war für dieses Protokoll keine zusätzliche experimentelle Bestimmung erforderlich; hinsichtlich des oberen Nachweisbereichs stellten die Autoren jedoch fest, dass Fluoridmengen, die etwa 38.000 übersteigen ng in einem 50 µL Die NaOH-Falle führte zu einer nichtlinearen Elektrodenantwort, was darauf hinweist, dass die Kalibrierkurve bei sehr hohen Fluoridkonzentrationen nicht mehr zuverlässig ist. Diese Nichtlinearität ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass unter den gegebenen experimentellen Bedingungen die optimale Ionenstärke und Aktivitätsrange für die Elektrode überschritten wurde, und spiegelt nicht eine inhärente obere Grenze der ISE selbst wider. Für Proben, bei denen Fluoridmengen oberhalb dieser Schwelle erwartet werden, empfiehlt es sich, das Volumen der NaOH-Falle zu vergrößern, um die Messungen im linearen dynamischen Bereich der Elektrode zu halten.

Diese Überlegung sollte berücksichtigt werden, wenn das Protokoll auf Proben mit ungewöhnlich hohem Fluoridgehalt angewendet wird. Da der Diffusionsschritt das gesamte Probenvolumen verbraucht, konnten Duplikatmessungen und Spike-and-Recovey-Experimente an den biologischen Proben nicht durchgeführt werden. Um die analytische Genauigkeit und Präzision sicherzustellen, wurden in jeder Messreihe Qualitätskontrollstandards (QC-Standards) mit bekannten Fluoridkonzentrationen mitgeführt. Diese QC-Standards wurden identisch zu den Versuchsproben verarbeitet und gemessen. In allen Durchläufen lagen die gemessenen Fluoridkonzentrationen der QC-Standards durchgängig innerhalb von 5 % der erwarteten Werte. Für jede Serie von 10–20 Proben wurden parallel zu den Proben zwei unabhängige Sätze von 5–6 Kalibrierproben hergestellt, und vor jeder Messung wurde eine Kalibrierkurve aufgezeichnet. Der Kalibrierbereich wurde für jeden Durchlauf angepasst, um den erwarteten Fluoridmengen der Proben annähernd zu entsprechen, die von der Probensorte, der Masse des in die Diffusionschale gegebenen Materials sowie der Behandlungsgruppe und dem Alter des Versuchstiers abhingen. Bei der Bestimmung von Serum entsprachen die Kalibrierstandards Fluoridkonzentrationen von etwa 0,06–1,20 ppm in der Probe. Bei der Bestimmung von Knochen und Zähnen entsprachen die Kalibrierstandards Fluoridkonzentrationen von etwa 19–7.600 ppm in der Probe.

Dieses Protokoll beschreibt eine empfindliche und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der Fluoridionenmasse in Serum, Knochen und Zähnen mittels hexamethyldisiloxanvermittelter Diffusion gefolgt von ISE-Analyse. Die Methode erfasst zuverlässig Fluorid, das aus verschiedenen biologischen Matrizen freigesetzt wird, und ermöglicht die quantitative Beurteilung der Fluoridakkumulation nach kontrollierter Exposition. Repräsentative Ergebnisse von jugendlichen und ausgewachsenen Mäusen zeigen deutliche alters- und dosisabhängige Unterschiede in der Fluoridablagerung in verschiedenen Geweben auf und unterstreichen damit die Nützlichkeit dieses Ansatzes für die Untersuchung des Fluoridstoffwechsels und der toxikokinetischen Eigenschaften in vivo.

Eine zentrale Stärke dieses Protokolls liegt in der Verwendung von Diffusionsgefäßen, die die fluoridfreisetzende Reaktion räumlich von der Fluorid-abscheidenden Umgebung trennen. Die mit Petrolatum versiegelte Konstruktion minimiert den Austausch mit der Atmosphäre und gewährleistet eine effiziente Erfassung freigesetzter Fluoridionen durch Natronlauge-Tröpfchen auf dem Deckel. Schwefelsäure, gesättigt mit HMDS, liefert eine starke und konstante Triebkraft für die Freisetzung von Fluorid aus mineralisierten Geweben, einschließlich stark verkalkter Strukturen wie Knochen und Zähnen. Die anschließende ISE-Messung, kalibriert mit diffusionsabgeglichenen Standards, ermöglicht eine genaue Quantifizierung über einen weiten dynamischen Bereich. Ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes ist die Fähigkeit, Fluorid in äußerst kleinen biologischen Proben zu quantifizieren. Mineralisierte Gewebe von Mäusen, insbesondere die Unterkieferincisiven, liefern pro Zahn nur 3–5 mg Asche. Herkömmliche analytische Methoden erfordern oft größere Probemengen oder einen höheren Fluoridgehalt, um eine zuverlässige Detektion zu erreichen. Im Gegensatz dazu konzentriert die diffusionsbasierte Methode das gesamte aus der Probe freigesetzte Fluorid in einem kleinen, definierten Volumen und ermöglicht so eine präzise Quantifizierung selbst bei winzigen Proben mit geringer absoluter Fluoridmasse. Diese Eigenschaft ist besonders wertvoll für Studien an kleinen Tieren, bei begrenzter Gewebeverfügbarkeit oder an mikrodissezierten mineralisierten Strukturen.

Eine wesentliche Einschränkung dieser Methode ist die Nachweisgrenze der in dieser Studie verwendeten ISE (0,02 ppm). Serumproben von fluoridfreien Kontrolltieren lagen häufig unterhalb dieses Schwellenwerts, wodurch eine Quantifizierung äußerst niedriger Fluoridkonzentrationen verhindert wurde. Bei der Messung von Spurenkonzentrationen nahe oder unterhalb der Nachweisgrenze könnte eine größere Masse oder ein größeres Volumen der Probe, sofern verfügbar, in die Diffusionskammer gegeben werden müssen, oder es könnten alternative analytische Techniken erforderlich sein. Zudem erfordert die Methode eine Diffusion über Nacht sowie eine sorgfältige Handhabung ätzender Reagenzien, was die Probendurchsatzrate bei Studien mit hohem Probenvolumen einschränken kann. Obwohl die ISE eine empfindliche Quantifizierung des Gesamtfluorids ermöglicht, kann sie keine räumliche Verteilung innerhalb von Geweben erfassen. Ergänzende Ansätze wie die Rasterelektronenmikroskopie gekoppelt mit energiedispersiver Röntgenspektroskopie (SEM-EDX) oder die durch Teilchen induzierte Gammastrahlungsemission (PIGE) können integriert werden, um die Fluoridverteilung im Mikro- bis Makrobereich sichtbar zu machen und abzubilden. Diese bildgebenden Verfahren ermöglichen die Beurteilung lokaler Fluoridanreicherungen in mineralisierten oder weichen Geweben und ergänzen damit die ISE-Messungen, indem sie eine umfassendere Bewertung des Fluoridgehalts im Gewebe liefern.

Mehrere wiederkehrende technische Faktoren können die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Fluorid-Diffusion und -Messung in diesem Protokoll beeinflussen, und unsere Beobachtungen verdeutlichen, wie die Zubereitung der Kalibrierung, die Abdichtung der Diffusionschale, die pH-Kontrolle, die Leistung der Elektrode und das Probenumgehen gemeinsam die Datenqualität beeinflussen. Mögliche Ursachen für eine nichtlineare Kalibrierungskurve (R2 < 0,99) oder für Messwerte von Gewebeproben außerhalb des erwarteten Bereichs sind falsche Berechnungen des zur Diffusionschale hinzugefügten NaF-Stammlösungsvolumens oder Pipettierfehler während der Herstellung der Kalibrierstandards. Empfohlene Maßnahme: Bereiten Sie für jeden Durchlauf mindestens zwei unabhängige Sätze von Kalibrierproben vor, sodass ein Ersatzsatz verfügbar ist, falls eine Kalibrierungskurve außerhalb des erwarteten Bereichs liegt. Eine unvollständige Abdichtung der Diffusionschale kann ebenfalls zu einem Fluoridverlust während der Diffusion führen, was künstlich niedrige Messwerte verursacht. Dies tritt typischerweise auf, wenn ungenügend Petrolatum auf den Rand des Deckels der Diffusionschale aufgetragen wird. Empfohlene Maßnahme: Tragen Sie eine reichliche Menge Petrolatumsalbe rings um den Rand des Deckels der Diffusionschale auf und drücken Sie fest, um eine vollständige Abdichtung sicherzustellen. Pipettierfehler beim Hinzufügen der Essigsäurelösung zur NaOH-Falle können den Proben-pH-Wert außerhalb des optimalen Bereichs von pH 5,0 verschieben und zu ungenauer Fluorid-Rückgewinnung führen. Empfohlene Maßnahme: Überprüfen Sie den pH-Wert jeder Probe mit pH-Papier und verwerfen Sie alle Proben, deren pH-Wert außerhalb von pH 5 liegt. Kalibrierproben können auch außerhalb der gültigen Aufzeichnungsgrenzen der fluoridselektiven Elektrode liegen. Konzentrationen unter 0,02 ppm liegen unter der Nachweisgrenze der Elektrode. Empfohlene Maßnahme: Verwenden Sie keine Kalibrierproben mit einem Fluoridgehalt von weniger als 0,02 ppm. Umgekehrt können Kalibrierproben mit übermäßig hohen Fluoridkonzentrationen die Ionenstärke der Lösung verändern und nichtlineare Elektrodenantworten hervorrufen. Empfohlene Maßnahme: Bereiten Sie zu Beginn des Projekts Kalibrierlösungen über einen weiten Fluoridkonzentrationsbereich vor, um den linearen Arbeitsbereich der verwendeten spezifischen Elektrode zu bestimmen. Falls Gewebeproben diesen linearen Bereich überschreiten, reduzieren Sie die Gewebemasse oder erhöhen Sie das Volumen der NaOH-Falle und passen Sie das Volumen der Essigsäure entsprechend an, um pH 5 beizubehalten. Schwierigkeiten, lineare Kalibrierungskurven im Bereich von 0,02–1 ppm zu erhalten: Eine häufige Ursache ist die Alterung der Elektrode. Ältere fluoridselektive Elektroden verlieren bei sehr niedrigen Fluoridkonzentrationen an Empfindlichkeit. Empfohlene Maßnahme: Ersetzen Sie die fluoridselektive Elektrode. Instabile Potentiometerablesungen (Signaldrift oder Sprünge) treten typischerweise auf, wenn die sensorische Oberfläche der Elektrode nicht vollständig in die Probenlösung eingetaucht ist. Empfohlene Maßnahme: Senken Sie die Elektrode so weit ab, dass die sensorische Oberfläche vollständig von der flüssigen Probe bedeckt ist.

Insgesamt bietet dieses Protokoll einen robusten, kalibrierungsbasierten Ansatz zur Quantifizierung von Fluorid in verschiedenen biologischen Matrizes und eignet sich gut für Studien zur Untersuchung der Fluoridexposition, der Ablagerung im Gewebe und toxischer Wirkungen in murinen Modellen.

Offenlegungen

Die Autoren geben an, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Die in dieser Veröffentlichung beschriebene Forschung wurde von der Japan Society for the Promotion of Science; JSPS Overseas Research Fellowships 202560528 (S.Y.), der Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP); 2024/07452-9 (J.S.T.) sowie dem National Institute of Dental and Craniofacial Research der National Institutes of Health; R01DE027648 (M.S.) und K02DE029531 (M.S.) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Essigsäure, eisSigma-AldrichSupelco, GR ACSAX0073-6
Aluminiumoxid-TiegelAdvalue Technology12 mm Außendurchmesser × 25 mm Höhe, AL-6212AL-6212
Analytische WaageVWRVWR 124B2, d = 0,1 mg—
KugelmühleBenchmarkBeadBug 6—
Spritzenkanüle mit stumpfem EndeAmazonIndustrielle stumpfe Nadel, 14 G × 0,5 ZollX001TT8KX1
KohlenstoffdioxidAirGas——
Chemische AbzugshaubeMott ManufacturingModell 7421040—
D(+)-SaccharoseThermo Scientific99,7 % für Biochemie177142500
Elektrolytlösung für ElektrodenThermo ScientificOrion IonPlus Fülllösung900061
ÄthylalkohollösungKoptec140 Proof2401
Gefrierschrank, −80 °CThermo ScientificRevco RDE-Serie—
Hitzebeständige HandschuheFisher ScientificBel-Art Clavies Biohazard Autoklav-HandschuheH13201
Hexamethyldisiloxan (HMDS)Fisher ScientificTCI H0091, >98 %H0091
WasserstoffperoxidVWRJ.T. Baker, 30 %2204-01
Ionenselektive ElektrodeThermo ScientificOrion Fluorid-ISE, Doppelkanal9609BNWP
Magnetischer RührerVWR360 Stirrer—
MikrospatelAmazonWachskerbspatel #7A, Edelstahl—
MikrozentrifugeEppendorf5427R5404000131
MuffelofenThermo ScientificThermolyne kleiner Tisch-Muffelofen, 1,3 L, FB1315MFB1315M
OfenBoekel ScientificBoekel RapidFISH240200
Paraformaldehydlösung in PBSThermo Scientific4 % Paraformaldehyd in PBSJ19943-K2
Petri-SchaleVWR60 × 15 mm, unbehandelt25384-092
PetrolatumThermo ScientificPetrolatum, weiß, rein417090010
pH-IndikatorpapierFisher ScientificpH-Fix 4,5–10,092120.3
PorzellantiegelFisher ScientificFisherbrand-Tiegel, 5 mL, 20 mm Höhe, hohe FormFB-965-B
PotentiometerThermo ScientificOrion Dual Star pH/ISE-Messgerät2115102
Stativ mit KlemmeVWRRundklemme, 15 cm470104-526
LabortiernahrungBio-ServF1515, AIN-76A, ½ PelletsF1515
SchneckenheberAmazonLabor-Schneckenheber—
TrenntrichterFisher ScientificEisco, Borosilicatglas, 2 LS89285
NatriumchloridFisher ScientificACS-zertifiziert, kristallinS271-1
NatriumfluoridFisher ScientificACS-zertifiziert, PulverS299-100
NatriumhydroxidFisher Scientificweiße PelletsBP359-500
EdelstahlkugelnFisher ScientificScientific Industries, 5 mm, 100 StückSI-CS05
SchwefelsäureFisher ScientificACS-GradA300-500
TISAB IIThermo ScientificOrion IonPlus Applikationslösung940909
Vakuum-ExsikkatorFisher ScientificBel-Art Space Saver Vakuum-Exsikkator, 10 ZollF42010-0000
VakuumfilterFisher ScientificFlow Bottle-Top-Filter, PES, 90 mm, 0,2 µm597-4520
Verstellbarer SchüttlerMidSciLabDoctor / Benchmark Scientific—

Referenzen

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