Forschungsartikel

Zeitabhängige Verschlechterung der Spermienbeweglichkeit und DNA-Integrität während längerer Samenexposition

DOI:

10.3791/71515

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7. August 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University Hospitals Fertility Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Fragmentierung der Spermien-DNA nahm zu und die Beweglichkeit nahm bei längerer Samenexposition nach der Ejakulation deutlich ab. In 14 normalen Proben nahm die DNA-Fragmentierung um 5,5 %, 11,5 % und 16,1 % nach 1 Uhr, 2 Stunde und 4 Stunden zu, während die Beweglichkeit abnahm. Diese Ergebnisse unterstützen die Minimierung von Verzögerungen bei der Samenentnahme und -bearbeitung außerhalb des Standorts.

Zusammenfassung

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Die Fragmentierung der Spermien-DNA ist dafür bekannt, die Spermienqualität zu beeinträchtigen, was sich negativ auf die Zyklen der assistierten Fortpflanzungstechnologie (ART) auswirken kann. Die Untersuchung der Spermien-DNA-Fragmentierung (SDF) in Samenflüssigkeit über die Zeit kann Einblicke in die Auswirkungen einer verlängerten Samenexposition auf die Integrität der Spermien-DNA geben. In dieser vorläufigen Studie wurde zu verschiedenen Zeitpunkten ein SDF-Test durchgeführt, um außerortige Samenaufnahmebedingungen mit dem Spermienchromatin-Dispersionstest an 14 normalen Samenproben zu simulieren. Die statistische Analyse der DNA-Fragmentierungsprozente während des gesamten Tests zeigte, dass die anhaltende Stagnation der Samenflüssigkeit von der Ejakulation bis zur Samenanalyse die DNA-Fragmentierung signifikant erhöhte. Die durchschnittliche Spermienbeweglichkeit war signifikant um 7,4 % nach 1 Uhr, 14,5 % um 2 Uhr und um 18,7 % nach 4 Stunden reduziert, und die durchschnittliche SDF stieg signifikant um 5,5 % nach 1 Uhr, 11,5 % nach 2 Stunden und 16,1 % nach 4 Stunden nach der Samenentnahme. Dieser Rückgang der Spermienqualität im Laufe der Zeit kann die Protokolle der Fruchtbarkeitskliniken bei der Vorbereitung auf ART-Zyklen beeinflussen, insbesondere wenn die Samenentnahme außerhalb des Andrologielabors erfolgt. Labore könnten erwägen, eine akzeptable Zeitgrenze für den Empfang von Sperma aus einer externen Entnahme festzulegen.

Einleitung

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Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) identifiziert, dass jeder sechste Mensch oder 17,5 % der Weltbevölkerung irgendwann im Laufe seines Lebens Unfruchtbarkeit erlebthat 1. Ungefähr 20 % der Unfruchtbarkeitsfälle haben ausschließlich die Diagnose männlicher Faktor Unfruchtbarkeit, zusätzlich 30–40 % der Fälle mit männlichem Faktor als Sekundärdiagnose2. Selbst bei gesunden Männern können die Samenparameter von Person zu Person stark variieren, einschließlich Schwankungen in Konzentration, Motilität, Morphologie und Vitalität3. Daher ist es wichtig, die spezifischen Faktoren zu verstehen, die die männliche Fruchtbarkeit beeinträchtigen, um eine angemessene Behandlung in einer klinischen Umgebung gewährleisten zu können.

Ein sich entwickelndes Forschungsgebiet ist die Wirkung der Integrität der Spermien-DNA auf Zyklen der assistierten Fortpflanzungstechnologie (ART) 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Das WHO-Laborhandbuch zur Untersuchung und Verarbeitung menschlichen Samens, 5. Auflage, besagt, dass die Fragmentierung der Spermien-DNA (SDF) (entweder durch Einzel- oder Doppelsträngbrüche) die Embryonalentwicklung, Implantation und Schwangerschaftsergebnisse beeinflussenkann 14. Muriel et al. führten eine Analyse von SDF durch und stellten fest, dass eine erhöhte SDF in den ART-Zyklen10 zu beeinträchtigten Befruchtungsraten, Embryoqualität und Einnistungsraten führte. Es ist jedoch ein besseres Verständnis der Ursachen der DNA-Fragmentierung erforderlich.

Frühere Studien berichten, dass oxidativer Stress zu einer verminderten Spermienbeweglichkeit, einer beeinträchtigten enzymatischen Produktion und Funktion und vor allem zuDNA-Schäden führen kann. Solche DNA-Schäden können unter anderem Gendeletionen, Fehltranslationen und SDF umfassen. SDF-Assays werden derzeit verwendet, um die Integrität der Spermien-DNA zu bewerten. Obwohl Studien Kryokonservierung, Umgang mit Medien und oxidativem Stress mit SDF in Verbindung gebracht haben, ist über SDF im Zeitraum von der Ejakulation bis zur Analyse 4,5 wenig bekannt. Dies ist eine kritische Zeit für die Lebensspanne von Spermien, da die Häufigkeit von Heim-Spermiensammlungen zur Spermienpräparation in ART-Zyklen15 erhöht ist. Hausabholungen sind während der COVID-19-Pandemie immer beliebter geworden, da sie den direkten Kontakt mit dem Patienten einschränken und den Komfort und Komfort erhöhen. Es gibt jedoch keine spezifischen Richtlinien, die einen optimalen Zeitpunkt von der Ejakulation bis zur Analyse für Häussammlungen vorschlagen. Das Hauptziel unserer Studie war daher zu verstehen, ob sich SDF im Laufe der Zeit in stehender Samenflüssigkeit verändert und ob solche Veränderungen für die Handhabung von ART-Proben relevant sein könnten.

Protokoll

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Die Studie wurde gemäß der Erklärung von Helsinki durchgeführt und vom Institutional Review Board of University Hospitals (STUDY20201371) genehmigt. Von allen an der Studie beteiligten Probanden wurde eine informierte Zustimmung eingeholt. Vierzehn Samenproben wurden von Patienten in einem einzigen akademischen Fruchtbarkeitszentrum in Nordost-Ohio ausgewählt. Alle in diesem Experiment analysierten Proben wurden vor Ort in unserer Einrichtung entnommen. Die Spermienchromatin-Dispersionstests wurden an Samenproben von einem vollständig ausgebildeten Andrologen gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, um zwischenmenschliche Unterschiede zu minimieren. Mit diesem Set wurden intakte, nicht fixierte, frische Spermien in ein inertes Agarose-Mikrogel auf einem vorbehandelten Objektträger eingetaucht und dann bei 4 °C für 5 Minuten abgekühlt, um das Mikrogel zu verfestigen. Eine erste Säurebehandlung wurde verwendet, um DNA in Spermienzellen mit fragmentierter DNA zu denaturieren, und eine Lysepufferlösung wurde zur Entfernung von Kernproteinen angewendet. Nach dem Waschen mit destilliertem Wasser wurden die Folien in gradierten Ethanollösungen dehydriert und an der Luft getrocknet. Bei der Visualisierung unter Lichtmikroskopie nach der Färbung mit den vom Set bereitgestellten Färbelösungen zeigten Spermien ohne Fragmentierung Nukleoide mit einem großen Dispersionshalo (größer als ein Drittel des Kerndurchmessers), während Spermien mit Fragmentierung einen kleinen Halo (weniger als ein Drittel des Kerndurchmessers) oder das Fehlen eines Halos zeigten. Der Prozentsatz der Spermien mit DNA-Fragmentierung wurde als Anzahl fragmentierter und degradierter Spermien berechnet und als Prozentsatz ausgedrückt. Insgesamt wurden 300 Spermien auf einem Objektträger gezählt und entweder als mit einem großen oder mittleren Dispersionshalo oder als das Fehlen eines Dispersionshalos kategorisiert. Diese Zählung wurde zweimal repliziert, um die technische Variabilität zu bewerten, und die beiden Zählungen wurden gemittelt. Die diagnostische Sensitivität und Spezifität des Kits beträgt 93 %, und sowohl positive als auch negative Kontrollen wurden in jedes Experiment einbezogen. Die Samenproben wurden bei 0, 1, 2 und 4 Stunden bewertet (0 h war definiert als 15 Minuten nach der Verflüssigungsphase bei 37 °C) und bei Raumtemperatur (22–25 °C) gehalten.

Eine zusätzliche Motilitätsanalyse wurde an jeder Probe bei 0, 1, 2 und 4 Stunden durchgeführt. Die Motilitätsbewertung wurde von einem erfahrenen Andrologen mittels eines Zählprotokolls mit einer Einweg-Zählkammer durchgeführt. Dreihundert bewegliche Spermien wurden pro Gitter gezählt, und die Zählung wurde zweimal wiederholt. Eine durchschnittliche Konzentration beweglicher Spermien wurde auf Basis der beiden replizierten Zählungen berechnet.

Statistische Analysen wurden mit wiederholten ANOVA durchgeführt, um jede Zeitgruppe zu vergleichen. Wenn ein signifikanter Gesamteffekt nachgewiesen wurde, wurde der Tukey-Honestly Significant Difference (HSD)-Test für post-hoc-paarweise Vergleiche angewendet. Ein p-Wert < 0,05 galt als statistisch signifikant. Detaillierte Informationen zu Materialien sind in der Materialtabelle zusammengefasst.

Ergebnisse

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Um die Auswirkungen einer längeren Samenexposition auf die Spermienbeweglichkeit und DNA-Fragmentierung zu bewerten, wurden insgesamt 14 normozoospermische Patientenproben an vier Zeitpunkten der Entnahme analysiert. Die analysierten Proben wurden laut WHO 5. Ausgabe14 in den Samenanalyseparametern als "normal" eingestuft. Alle Proben wurden vor Ort in unserem Fertility Center entnommen, um die Genauigkeit der Analyseparameter zu jedem Zeitpunkt zu optimieren. Das Durchschnittsalter der Patienten betrug 35,4 Jahre (24–45 Jahre). Die anfänglichen Ergebnisse des Samenparameters der Gruppe ergaben ein durchschnittliches Samenvolumen von 3,7 mL, eine durchschnittliche Konzentration von 42,2 Millionen pro ml, eine durchschnittliche Beweglichkeit von 46,9 %, eine durchschnittliche normale Morphologie von 4 % und negative weiße Blutkörperchen für alle Proben nach qualitativem Test (Tabelle 1).

Im Laufe der Zeit wurde ein fortschreitender Rückgang der Spermienbeweglichkeit beobachtet. Im Vergleich zum Ausgangswert (0 Stunden) nahm die durchschnittliche Spermienbeweglichkeit um 7,4 % ab 1 Stunde (Bereich 3–16 %), um 1 Stunde um 14,5 % (Bereich 4–31 %) und um 18,7 % (Bereich 8–37 %) nach 4 Stunden. Die Spermienbeweglichkeit nahm im Laufe der Zeit schrittweise ab, von 58,6 % zu Beginn auf 42,5 % nach 4 Stunden Exposition (Abbildung 1). Insgesamt war die Verringerung der Beweglichkeit über Zeitpunkte statistisch signifikant (p = 0,0001585). Gleichzeitig nahm SDF signifikant mit längerer Inkubation im Samenplasma zu. Der mittlere SDF stieg von 15,6 % zum Ausgangspunkt auf 21,1 % um 1 Uhr, 27,1 % um 2 Uhr und 31,7 % um 4 Uhr. Im Vergleich zum Ausgangsniveau stieg SDF um 5,5 Prozentpunkte (Bereich 4–8 Prozentpunkte) um 1 Uhr, um 11,5 Prozentpunkte (Bereich 8–16 Prozentpunkte) um 14 Uhr und um 16,1 Prozentpunkte (Bereich 13–22 Prozentpunkte) um 4 Uhr. Statistisch signifikante Zunahmen der SDF wurden zu allen folgenden Zeitpunkten im Vergleich zum Ausgangspunkt nachgewiesen, darunter 1 Stunde (p = 0,021129), 2 Stunden (p < 0,00001) und 4 Stunden (p = 0,000018) (Tabelle 2).

DATENVERFÜGBARKEIT
Die für die Analyse verwendeten Daten zur Patientenbeweglichkeit und SDF sind in der ergänzenden Tabelle S1 bereitgestellt.

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Abbildung 1. Veränderung der Spermienbeweglichkeit im Laufe der Zeit nach der Ejakulation. Die Spermienbeweglichkeit wurde zu Beginn und nach 1, 2 und 4 Stunden Samenexposition bewertet. Die Beweglichkeit nahm mit zunehmender Expositionszeit schrittweise ab. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

ParameterDurchschnittStandardabweichung
Patientenalter35,4 (Spanne, 24–45 Jahre)6.22
Samenvolumen3,7 mL2.18
Schwerpunkt42,2 Millionen/mL33.45
Beweglichkeit46.9%18.77
Weiße BlutkörperchenNegativ (alle)—
Morphologie4.0%0.77

Tabelle 1: Ausgangsmerkmale des Spermas der Studienproben. Die Samenparameter wurden nach der Verflüssigung und vor der zeitabhängigen Bewertung der DNA-Fragmentierung und -Beweglichkeit von Spermien erfasst.

Zeit0 h1 Stunde2 Stunden4 Stunden
Durchschnittliche Verringerung der Spermienbeweglichkeit ab 0 H*—-7.4%-14.5%-18.7%
Durchschnittliche SDF15.6%21.1%27.1%31.7%
Standardabweichung5.28%5.27%5.31%4.80%
P-Wert vs. 0 h—p = 0,021129p < 0,00001p = 0,000018
*Wiederholte Messungen ANOVA mit Tukey HSD Post-hoc-Vergleichen.

Tabelle 2: Zeitabhängige Veränderungen in der Fragmentierung und Beweglichkeit der Spermien-DNA. Die Fragmentierung und Beweglichkeit der Spermien-DNA wurden zu Beginn sowie nach 1 StH, 2 und 4 Stunden Samenexposition bewertet. Die Werte werden wie von den Autoren berichtet präsentiert, wobei statistische Vergleiche mit dem Ausgangswertstrang durchgeführt werden.

Ergänzende Tabelle S1. Patientenebene Spermienbeweglichkeitsunterschiede und Werte des DNA-Fragmentationsindex der Spermien. Werte werden als Proportionen angegeben; Multipliziere mit 100, um in Prozentsätze umzurechnen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

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In den in diesem Experiment enthaltenen Proben nahm SDF im Laufe der Zeit zu, während die Beweglichkeit im gleichen Zeitraum abnahm. Dies deutet darauf hin, dass die Integrität der Spermien-DNA abnehmen kann, wenn die Samenflüssigkeit zwischen Ejakulation und Analyse oder Verarbeitung länger stillsteht. Die Verlängerung der Zeit, in der die Proben vor der Analyse stagnierten, könnte die Exposition gegenüber Bedingungen im Zusammenhang mit oxidativem Stress erhöht haben. Wie bereits erwähnt, kann oxidativer Stress der DNA-Qualität der Spermien schaden und zu hohen DNA-Fragmentierungsraten führen. Die Ergebnisse dieser Studie könnten die Samenhandhabung in ART-Zyklen informieren.

Zunächst könnte es sich für Kliniken lohnen, diesen Test zu den traditionellen Samenanalyseparametern hinzuzufügen, um die Qualität der Spermien-DNA sicherzustellen, bevor die Spermien in ART-Zyklen verwendet werden. Die Optimierung der Spermienqualität kann mit verbesserten Ergebnissen verbunden sein, wie einer höheren Anzahl eingefrorener Embryonen, erhöhten Euploidieraten sowie höheren Raten positiver Schwangerschaften und Lebendgeburten, wie in früheren Studien16 berichtet wurde.

Zweitens geben diese Ergebnisse Einblicke in die Auswirkungen der häuslichen Samensammlung auf ART-Ergebnisse. Während der COVID-19-Pandemie begannen viele Kliniken, die Samenentnahme zu Hause als sicherere Option für Patienteneinzusetzen. Als die Praxen begannen, diese Umstellung zu vollziehen, hatten Patienten nicht nur die Möglichkeit, die COVID-Exposition zu reduzieren, sondern auch die Abholung in der Privatsphäre ihres eigenen Zuhauses durchzuführen. Unsere Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass diese Praxiswechsel Abwägungen in Bezug auf die Spermienqualität und möglicherweise ART-Ergebnisse mit sich bringen könnten.

Frühere Studien mit Entnahmekits zu Hause zeigten große Schwankungen der Spermaanalysen bei Männern mit unterschiedlichen männlichen Faktor-Diagnosen und bei Männern, die typischerweise "normale" Samenproben18 produzieren. Diese Schwankungen könnten auf das Stillstand der Spermien während des Transports von zu Hause in die Klinik zurückzuführen sein, insbesondere wenn Spermaproben in manchen Fällen über Nacht verschickt werden. Andere Studien bestätigen unser Ergebnis, dass SDF in den ersten 3–4 Stunden der Inkubation mit 5 % CO2 bei 37 °C nach der Spermienvorbereitung entweder bei gefrorenen/aufgetauten Spermien19 oder frischen Spermien20 schnell zunimmt, was darauf hindeutet, dass Spermien so schnell wie möglich nach der Spermienpräparierung für ART verwendet werden sollten.

Kerdtawee et al. führten eine Metaanalyse des Effekts der Spermiensammlungsposition auf Samenparameter und Fruchtbarkeitsergebnisse durch. Obwohl sie keine signifikanten Unterschiede zwischen Häus- und Klinikproben zeigten, stellten sie signifikante Heterogenität in den analysierten Studien fest, von denen die meisten Beobachtungsstudienwaren 16. Wichtig ist, dass diese Studien auch keinen kontrollierten Zeitplan hatten, wann die zu Hause entnommenen Proben an die Klinik zurückgegeben und analysiert werden sollten. Die in dieser Studie analysierten Daten ermöglichten jedoch eine kontrollierte Analyse der DNA-Fragmentierung über mehrere Zeitpunkte, was zu größerer Präzision und Konsistenz in den experimentellen Ergebnissen führte.

Obwohl eine Sammlung zu Hause für manche Patienten eine Option sein kann, kann das Verständnis der SDF-Rate helfen, Richtlinien zu entwickeln, um Patienten zu identifizieren, für die die Häussammlung für die ART-Ergebnisse nachteilig sein könnte. Eine systematische Übersichtsarbeit und Metaanalyse von Christoforaki et al. ergab, dass das oxidative Reduktionspotenzial in Samenflüssigkeit die männliche Unfruchtbarkeit negativ beeinflusst21. Analysierte Parameter umfassen Spermienkonzentration, Anzahl, Beweglichkeit und Morphologie, die alle durch ein höheres oxidatives Reduktionspotenzial negativ beeinflusst wurden, was zeigt, dass die Qualität der Spermien durch oxidativen Stress beeinflusst werden kann.

Zu den Stärken dieser Studie zählt ihre Neuart, da nur wenige Studien zeitabhängige SDF-Veränderungen bei längerer Exposition gegenüber Samenflüssigkeit untersucht haben. Diese Studie wurde auch in einer kontrollierten Umgebung mit einer relativ homogenen Gruppe von Männern ohne zugrundeliegende Samenpathologie durchgeführt. Diese Studie war jedoch auf eine kleine Stichprobe von 14 Patienten beschränkt. Weitere Experimente sollten durchgeführt werden, um das Vertrauen in die gesammelten Datenpunkte und abschließenden Bemerkungen zu maximieren.

Weitere Forschung sollte auch Variablen untersuchen, die die SDF-Raten beeinflussen könnten, insbesondere um die Faktoren besser zu verstehen, die zur Erhaltung der Spermienqualität beitragen. Zu berücksichtigende Faktoren gehören unter anderem, aber nicht beschränkt auf, das bei der Spermienpräparation verwendete Medien, die Temperatur der Transportbedingungen vom Zuhause in die Klinik, Kryokonservierungsmethoden und die zugrundeliegenden Erkrankungen männlicher Patienten. Umfassende Einblicke in die Faktoren, die zu SDF beitragen, ermöglichen es Kliniken letztlich, ihre Richtlinien zu optimieren und ihre Entscheidungen bei der Erstellung von Protokollen für die Behandlung von ART-Patienten besser zu informieren.

Die beobachtete Verschlechterung der Spermienqualität zeigte ein klares zeitabhängiges Muster, das durch eine abnehmende Beweglichkeit und zunehmende DNA-Fragmentierung bei längerer Exposition gegenüber Samenflüssigkeit gekennzeichnet ist. Bemerkenswert ist, dass die ausgeprägteste Verschlechterung nach 2–4 Stunden Lagerung auftrat, als die SDF 30 % überschritt und die Beweglichkeit um fast ein Fünftel gegenüber dem Ausgangsstand abnahm. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Verzögerungen zwischen Ejakulation und Samenverarbeitung die funktionelle Integrität der Spermien negativ beeinflussen können, und unterstreichen die Bedeutung der Minimierung von Transport- und Handhabungszeiten für Proben, die außerhalb des Standorts für assistierte Fortpflanzungsverfahren entnommen werden. Andrologielabore können erwägen, eine akzeptable Zeitgrenze für die Spermaaufnahme von Sperma aus externer Entnahme festzulegen und zu kommunizieren, insbesondere bei der Vorbereitung auf IUI oder IVF. Die Zeit von der Ejakulation bis zur Samenanalyse und/oder -vorbereitung sollte im Hinblick auf SDF berücksichtigt werden, insbesondere wenn die Entnahme außerhalb des Andrologielabors für ART erfolgt.

Aufgrund der Einschränkungen der kleinen Stichprobengröße dieser Studie sollten zukünftige Studien die Auswirkungen einer verlängerten Samenexposition auf SDF in einer breiteren Palette von Samenqualitätskategorien bewerten, einschließlich Proben von Männern mit abnormen Samenparametern. Darüber hinaus sind prospektive randomisierte kontrollierte Studien erforderlich, um festzustellen, ob zeitabhängige Zunahmen von SDF zu klinisch signifikanten Unterschieden bei ART-Ergebnissen führen, einschließlich Befruchtung, Embryonalentwicklung, Einnistung, Schwangerschaft, Fehlgeburt und Lebendgeburtenraten.

Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ANOVA-RechnerStatistik KönigreichStatistische Analyse
https://www.statskingdom.com/anova_manova.html
Halosperm G2HalotechHT-HSG2In-vitro-Diagnostik-Kit zur Messung der Sperma-DNA-Fragmentierung
https://halotechdna.com/de/producto/halosperm-g2/
MicrocellVitrolife15423Einweg-Zählkammer für die Spermaanalyse
https://www.vitrolife.com/products/sperm-processing/microcell--accessories/
Qualitätskontrolle für WBC/pH-TeststreifenMedizinische elektronische SystemeA-CA-01752-00Positive und negative Kontrolle für QwikCheck WBC-Teststreifen
https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/qwikcheck-wbc-ph-teststreifen-qualitaetskontrolle/
QwikCheck WBC/pH-Test ReagenzstreifenMedizinische elektronische Systeme0700Bestimmung von Leukozyten (WBCs) im Sperma
https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/

Referenzen

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