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Mikroinjektion von Interleukin-6 in den Blutkreislauf der TSC-Zebrafischlarven zur Untersuchung neuropsychiatrischer störungsähnlicher Verhaltensweisen

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DOI:

10.3791/71524

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26. Juni 2026

 , 
1Laboratory of Developmental Neurobiology, International Institute of Molecular Mechanisms and Machines, IMol, Polish Academy of Sciences, 2Warsaw-4-PhD doctoral school, International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Um zu modellieren, wie entzündliche Signale die Neuroentwicklung bei genetisch anfälligen Organismen beeinflussen, präsentieren wir ein Protokoll zur Mikroinjektion von IL-6 in den Gang des Cuvier (kardinalisten) von Zebrafischlarven, was eine kontrollierte Entzündungsinduktion und die Bewertung ihrer Entwicklungsauswirkungen im Kontext des tuberösen Sklerosekomplexes (TSC) ermöglicht.

Zusammenfassung

Patienten mit tuberöser Sklerose-Komplex (TSC1/TSC2-Mutationen) zeigen eine variable Expressivität der Autismus-Spektrum-Störung (ASS), und die Immunaktivierung der Mutter ist dafür bekannt, das ASS-Risiko zu erhöhen. Interleukin-6 (IL-6) ist ein pleiotropes Zytokin mit gut etablierten Rollen bei der Immunregulation, Entzündung und neuroinflammatorischen Prozessen. Sie wird von mehreren Immunzelltypen als Reaktion auf Infektionen oder Gewebeschäden produziert und wird häufig als proinflammatorischer Mediator charakterisiert. Bemerkenswert ist, dass IL-6 die Blut-Hirn-Schranke überwinden kann und mit Neuroentzündungen sowie entzündungsassoziierten neuropsychiatrischen Erkrankungen in Verbindung gebracht wird, darunter Autismus-Spektrum-Störung (ASS) und geistige Behinderung (ID). Hier beschreiben wir ein Protokoll, um systemische Entzündungssignale bei Zebrafischen zu induzieren, indem IL-6 durch Injektion in den Cuvier-Gang in den Blutkreislauf abgegeben wird. Dieser Ansatz ermöglicht kontrollierte und reproduzierbare Entzündungsreaktionen, um entzündungsbedingte Veränderungen in der frühen Entwicklung zu untersuchen. Das Protokoll beschreibt die wesentlichen Schritte zur IL-6-Präparation, Mikroinjektion und nachgelagerten experimentellen Anwendungen in Zebrafischmodellen von Krankheit und Neuroinflammation, einschließlich Studien zur Untersuchung von Gen-Umwelt-Interaktionen. Durch die kontrollierte Induktion systemischer Entzündungssignale bietet dieser Ansatz eine vielseitige Plattform, um zu untersuchen, wie genetische Anfälligkeit und entzündliche Expositionen zusammenwirken und Entwicklungsergebnisse prägen.

Einleitung

Das Verständnis, wie entzündliche Signale die frühe Neuroentwicklung prägen, ist entscheidend, um Mechanismen der neuroentwicklungsbedingten Störungen zu analysieren, insbesondere in genetisch anfälligen Kontexten. Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, einen präzisen, reproduzierbaren Ansatz bereitzustellen, um systemische entzündliche Signale bei Zebrafischlarven durch direkte Mikroinjektion von Interleukin-6 (IL-6) in den Gang von Cuvier (der kardinalinken) Gang zu induzieren.

Der tuberöse Sklerosekomplex (TSC) ist ein Beispiel für solche Gen-Umwelt-Interaktionen. TSC ist eine seltene genetische Erkrankung, die durch Mutationen in TSC1 oder TSC2 verursacht wird, die jeweils Hamartin und Tuberin codieren, Proteine, die einen Komplex bilden, der normalerweise die mTORC1-Signalübertragung unterdrückt. Der Verlust dieser Hemmung führt zu einer Hyperaktivierung des mTORC1-Weges, was zu abnormalem Zellwachstum und einem breiten Spektrum klinischer Manifestationen führt, einschließlich der Autismus-Spektrum-Störung (ASD)1,2. Es wird geschätzt, dass ASS ~1,5 % der Personen mit einem durchschnittlichen Diagnosealter von ~3 Jahren in entwickelten Ländern betrifft3. ASS gekennzeichnet durch repetitive Verhaltensweisen, eingeschränkte soziale Interaktionen und verminderte kognitive Flexibilität4, und Patienten zeigen häufig zusätzliche neurobehaviorale Herausforderungen wie Angstzustände, Depressionen oder geistige Behinderung3. Bemerkenswert ist, dass 40 % bis 60 % der Personen mit TSC ASS-bezogene Merkmale2 aufweisen, wobei die Symptomschwere stark variiert – selbst bei Patienten mit ähnlichen Mutationen – was darauf hindeutet, dass Umweltfaktoren genetisch bedingte Risiken beeinflussen.

Ein solcher Faktor ist die Entzündung. Obwohl die Ätiologie von ASD weitgehend unbekannt ist, wird Neuroinflammation in mehreren Hirnregionen schon lange in Verbindung gebracht5. Zunehmende präklinische und klinische Evidenz deutet darauf hin, dass fetale Neuroentzündungen, ausgelöst durch die Immunaktivierung der Mutter (MIA) und die daraus resultierende Erhöhung der Zytokin-Signalübertragung, wesentlich zur Pathogenese von ASD6 beitragen können. Daher bietet die Modellierung der entzündlichen Zytokinexposition in genetisch anfälligen Systemen wie TSC einen leistungsstarken Rahmen, um zu untersuchen, wie Immunsignale mit gestörter mTORC1-Regulation zusammenwirken, um die frühe Gehirnentwicklung zu beeinflussen.

Die Begründung für die Entwicklung dieses Protokolls beruht auf der zunehmenden Erkenntnis, dass zytokinvermittelte Entzündungen, einschließlich der IL-6-Signalübertragung, mit genetischen Schwachstellen interagieren und so neuroentwicklungsbedingte Entwicklungspfade beeinflussen können. Zytokine sind niedrigmolekulare Glykoproteine, die die Kommunikation innerhalb des Immunsystems koordinieren. Bei ASS haben mehrere Studien durchweg erhöhte Werte proinflammatorischer Zytokine berichtet, darunter IL-6 im peripheren Blut 7,8,9,10, was die Hypothese stützt, dass dysregulierte IL-6-Signale zu den neuroentwicklungsbedingten und verhaltensweisenden Merkmalen der Störung beitragen könnten. IL-6 ist ein wichtiger Mediator der Immunaktivierung, die von verschiedenen Immunzelltypen als Reaktion auf Infektionen oder Gewebeschäden produziert wird. Da IL-6 die Blut-Hirn-Schranke überwinden und direkt Neuronen, Astrozyten und Mikroglia beeinflussen kann, wird eine anhaltende Erhöhung dieses Zytokins an Veränderungen der neuroentwicklungsbedingten Wege, synaptischen Plastizität und neuroimmunen Homöostase beteiligt – Mechanismen, die in der ASD-Pathophysiologiezunehmend erforscht werden. Diese Zusammenhänge werden durch MIA-Studien weiter verstärkt, bei denen ein erhöhtes mütterliches IL-6 während der Schwangerschaft die fetale Gehirnentwicklung stört und das ASS-bezogene Risikoerhöht. Die bestehenden Wirbeltiermodelle basieren jedoch oft auf systemischer Immunstimulation durch pathogenassoziierte Moleküle oder mütterliche Expositionsparadigmen, die Variabilität einführen, mehrere Immunwege gleichzeitig aktivieren und die Fähigkeit einschränken können, den spezifischen Beitrag von IL-6 zu isolieren. Die direkte IL-6-Mikroinjektion bei Zebrafischen überwindet diese Einschränkungen, indem sie gezielte Manipulation eines einzelnen Zytokins innerhalb eines transparenten, genetisch beherrschbaren Organismus ermöglicht.

Zebrafische bieten mehrere Vorteile bei der Untersuchung zytokingesteuerter Entwicklungseffekte. Ihre optische Transparenz ermöglicht eine Echtzeitvisualisierung von Immun- und neuronalen Antworten; ihre schnelle Entwicklung ermöglicht Hochdurchsatz-Experimente; und ihre konservierten Zytokin-Signalwege machen sie zu einem leistungsstarken Wirbeltiermodell zur Analyse von Entzündungsmechanismen 14,15,16,17,18. In experimentellen Studien ist es notwendig, exogene Materialien (Bakterien, Krebszellen, DNA, Nanopartikel usw.) in Zebrafischlarven einzuführen. Ein Ansatz besteht darin, die Larven einer Lösung auszusetzen, die das interessante Material enthält, wodurch eine passive Aufnahme über Haut, Kiemen oder den Magen-Darm-Trakt möglich ist. Die zweite und direktere Methode ist die Mikroinjektion, bei der externe Materialien mit feinen Glasnadeln in bestimmte embryonale oder larvale Kompartimente 19,20,21 eingebracht werden. Wichtig ist, dass die Mikroinjektion in den Cuvier-Kanal einen zuverlässigen Weg für die systemische Verabreichung bietet und eine schnelle Verteilung von IL-6 im gesamten Kreislauf gewährleistet, ohne die störenden Effekte einer Immunstimulation des gesamten Organismus.

In diesem Protokoll präsentieren wir ein Schritt-für-Schritt-Verfahren von der Herstellung von Injektionsspritzen bis hin zur Injektion von IL-6 in den Blutkreislauf über den Cuvier-Gang der Zebrafischlarven 2 und 3 Tage nach der Befruchtung (DPF). Diese Methode ist besonders nützlich für Forscher, die untersuchen, wie spezifische entzündliche Signale frühe Entwicklungsprozesse, Gen-Umwelt-Interaktionen in Modellen neuroentwicklungsbedingter oder immunbezogener Erkrankungen, die zellulären und molekularen Folgen einer Zytokinexposition in vivo oder das Zusammenspiel genetischer Mutationen und entzündlicher Signalwege beeinflussen. Durch die Bereitstellung eines kontrollierten, zytokinspezifischen und entwicklungsspezifischen Ansatzes bietet dieses Protokoll eine vielseitige Plattform, um die Mechanismen zu erforschen, durch die IL-6 und verwandte Immunsignale frühe Immun-, neuronale und Verhaltensergebnisse prägen.

Protokoll

Für das hier beschriebene Verfahren wurde die tsc2vu242/+ Zebrafischlinie22,23 verwendet. Alle durchgeführten Experimente wurden gemäß allen relevanten Gesetzen durchgeführt, und es ist keine zusätzliche Genehmigung des Ethikausschusses erforderlich, da die verwendete Entwicklungsstufe (<5 DPF) außerhalb des Geltungsbereichs der verpflichtenden ethischen Überprüfung fällt. Abbildung 1 zeigt einen Schaltplan des Protokolls.

1. Ziehen von Mikropipetten

  1. Bereiten Sie Mikroinjektionsnadeln aus Borosilikatglas-Kapillaren mit einem Mikropipettenzieher vor, und befolgen Sie die festgelegten Verfahren24.
  2. Verwenden Sie 10 cm lange Borosilikatglaskapillaren (1,0 mm Außendurchmesser, dünnwandig) und laden Sie sie in einen Mikropipettenzieher.
  3. Positionieren Sie die Kapillare sorgfältig im Zugwagen, sorgen Sie für eine präzise Ausrichtung in der vorgesehenen Nut, und sichern Sie sie fest mit den Instrumentenklemmen, um Bewegungen beim Ziehen zu verhindern.
  4. Stellen Sie die Kapillare so ein, dass sie im Heizfaden zentriert ist, um eine gleichmäßige Erwärmung entlang des zu ziehenden Bereichs für eine gleichmäßige Nadelbildung sicherzustellen.
  5. Starten Sie das Zugprogramm mit optimierten Parametern (z. B. für Sutter-Instrumente Hitze: 533, Zug: 50, Geschwindigkeit: 60, Verzögerung: 90 und Druck: 200) zur Erzeugung feiner Mikroinjektionsnadeln.
    VORSICHT: Mikronadeln, die aus Glaskapillaren gezogen werden, sind empfindlich und können leicht reißen, verstopfen oder unregelmäßige Spitzenformen entwickeln, die das Injektionsvolumen verändern. Untersuchen Sie jede Nadel vor der Anwendung unter einem Stereomikroskop, vermeiden Sie es, die Spitze auf harte Oberflächen zu berühren, und ersetzen Sie die Nadeln sofort, wenn Widerstand, Leckage oder eine uneinheitliche Tropfengröße festgestellt wird.
    HINWEIS: Nach dem Ziehen werden an beiden Enden der Kapillare konische Nadelspitzen gebildet. Vor der Verwendung sollte die Spitze vorsichtig geöffnet werden, indem sie mit feinen Pinzetten unter einem Stereomikroskop sanft gebrochen wird, um die gewünschte Blendengröße für die Mikroinjektion zu erreichen.

2. Herstellung von Puffern und Lagerlösung

  1. Bereiten Sie eine 60× Brühelösung aus E3-Embryomedium vor (siehe Tabelle 1). Sterilisieren Sie die Lösung durch Autoklavierung und lagern Sie sie bei 4 °C. Zur Verwendung wird die Grundlösung in ultrareinem Wasser verdünnt, um eine 1× E3-Arbeitslösung zu erhalten.
    HINWEIS: 60 × Lagerlösung des E3-Embryomediums kann bei 4 °C für eine Langzeitlagerung gelagert werden.
  2. Bereiten Sie eine 20-fache Tricainlösung (MS-222) wie in Tabelle 1 beschrieben vor. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C im Dunkeln, um einen Abbau zu verhindern. Vor der Anwendung auf 1× Arbeitskonzentration in E3-Medium verdünnen.
    HINWEIS: Stellen Sie den pH-Wert der Tricain-Haftlösung auf 7,5 an, wobei 1 M Tris pH 9,0 verwendet wird. Diese Lösung kann aliquotiert und bei -20 °C (gefroren) für die Langzeitlagerung oder bei 4 °C gelagert werden. Tricain baut sich bei RT und bei Licht zu einer giftigen Verbindung ab.
    VORSICHT: Bei der Anwendung von Tricain (MS-222) zur Anästhesie ist besondere Vorsicht geboten, da sowohl Unter- als auch Überexposition die Larvenphysiologie und das Verhalten negativ beeinflussen können. Übermäßige Exposition kann die Herzfunktion beeinträchtigen und späteres Verhalten verändern, während unzureichende Anästhesie das Verletzungsrisiko beim Aufsetzen erhöht. Verwenden Sie nur die minimale effektive Konzentration und Dauer und ermöglichen Sie eine vollständige Erholung im frischen Embryo-Medium vor Verhaltensanalysen.
  3. Bereiten Sie eine 1%ige (mit W/V) Agaroselösung in E3-Medium vor, indem Sie sie erhitzen, bis sie vollständig gelöst ist.
    HINWEIS: Wenn die Lösung im Voraus zubereitet wird, kann sie bei 4 °C gelagert und vor der Verwendung wieder erhitzt werden. Am Tag des Experiments wird die Agarose flüssig bei 55–60 °C gelagert, um eine vorzeitige Erstarrung zu verhindern.
  4. Bereiten Sie eine 0,9%ige (w/v) NaCl-Lösung vor und lagern Sie sie bis zu einer Woche bei Raumtemperatur oder bei 4 °C für längere Lagerung. Vor der Anwendung wird die Lösung auf Raumtemperatur ausgewogen oder bei 28,5 °C inkubiert, um den physiologischen Bedingungen der Embryonen gerecht zu werden.
  5. Bereite eine 2 pg/nL IL-6-Lösung mit 0,9 % NaCl vor. Aliquot die Lösung, um wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden und bei -20 °C zu lagern. Vor der Anwendung tauen Sie den Aliquot auf Zimmertemperatur auf.
  6. Bereiten Sie eine 0,5 mg/mL Arbeitslösung von Pronase in E3-Medium aus einer 20 mg/mL Fondlösung, die in ultrareinem Wasser hergestellt wird, vor.

3. Embryonen gewinnen und aufziehen bis 2 DPF

  1. Organisieren Sie das Laichen in der Gruppe, indem Sie mehrere tsc2vu242/vu242 erwachsene Zebrafische in ein Laichbecken setzen.
    HINWEIS: Männchen und Weibchen können über Nacht mit einem Trenner getrennt werden, um vorzeitiges Laichen zu verhindern, wobei der Trenner am nächsten Morgen entfernt wird, um eine synchrone Paarung zu ermöglichen. Alternativ können Fische ohne Trenner in einer lichtkontrollierten Umgebung gehalten werden, in der der Übergang von Dunkelheit (Nacht) zu Licht (Morgen) als Laichsignal dient.
  2. Am folgenden Tag entfernen Sie den Trenner (falls genutzt) und lassen Sie das Laichen etwa 1 Stunde fortschreiten.
  3. Sammeln Sie befruchtete Embryonen umgehend und übertragen Sie sie in 100 mm große Petrischalen mit 40 ml E3-Embryomedium, wobei eine Dichte von maximal ~60 Embryonen pro Schüssel erhalten bleibt, um eine optimale Entwicklung zu gewährleisten.
  4. Embryonen werden bei 28,5 °C unter einem kontrollierten täglichen Zyklus von 14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit inkubiert.
  5. Bei 1 DPF und 2 DPF untersuchen Sie die Embryonen unter einem Stereomikroskop und entfernen Sie tote Embryonen, unbefruchtete Eizellen und Ablagerungen, um die Kulturqualität zu erhalten.
  6. Ersetzen Sie das E3-Medium durch eine frische Lösung, um die Abfallansammlung zu minimieren und die normale embryonale Entwicklung zu unterstützen.

4. Vorbereitung von Agaroseplatten für Mikroinjektionen und Dechorionation

  1. Bereite eine 1%ige (w/v) Agaroselösung in E3-Medium vor und erhitze sie, bis die Agarose vollständig gelöst ist und die Lösung klar wird.
  2. Lassen Sie die Lösung kurz abkühlen und gießen Sie dann etwa 30 ml in eine 100 mm Petrischale, um eine gleichmäßige Schicht über die Oberfläche zu gewährleisten.
  3. Während die Agarose noch flüssig ist, aber zu erstarren beginnt, legen Sie vorsichtig eine Silikonform auf die Oberfläche, um gleichmäßige Rillen zu erzeugen.
    HINWEIS: Hier werden Silikonformen mit pyramidenförmigen Mustern (Abbildung 2) verwendet, um Bohrungen zu erzeugen, die während der Mikroinjektion überschüssiges E3 speichern können. Diese Brunnen sind so konzipiert, dass sie vorübergehend Stabilität während der Handhabung und Injektion gewährleisten, indem sie ausreichend Feuchtigkeit erhalten, um Austrocknung zu verhindern und die Lebensfähigkeit des Embryos für mehrere Minuten außerhalb der regulären Inkubationsbedingungen zu gewährleisten.
  4. Bereiten Sie mit Agarose beschichtete Petrischalen für die enzymatische Dechorionation (50 mm Durchmesser) vor, indem Sie etwa 5 ml flüssige 1% (w/v) Agaroselösung gießen und die Schale sanft wirbeln, um die Oberfläche gleichmäßig zu beschichten.
  5. Entferne überschüssige Agarose.
  6. Lassen Sie die Agarose 10–15 Minuten bei Raumtemperatur fest werden. Sobald sie fest sind, sind die Schalen bereit für die enzymatische Dechorion von Embryonen.

5. Enzymatische Dechorionation von 2-dpf-Fischen

  1. Transferiere etwa 100 Embryonen in Chorionen mit 2 dpf in eine kleine (50 mm) mit Agarose überzogene Petrischale.
  2. Entfernen Sie so viel E3-Medium wie möglich, um die Verdünnung der enzymatischen Lösung zu minimieren und eine effiziente Dechorionation sicherzustellen.
  3. Gib 4 ml frisch vorbereitete Pronaselösung (Lagerkonzentration: 20 mg/mL [in ultrareinem Wasser zubereitet], Arbeitskonzentration: 0,5 mg/mL [verdünnt in E3]) in die Schale, um sicherzustellen, dass die Embryonen vollständig untergetaucht sind.
    VORSICHT: Die Pronase-Behandlung muss sorgfältig kontrolliert werden, da eine Überverdauung das Larvengewebe schädigen kann, was zu einer erhöhten Empfindlichkeit beim Umgang führt und möglicherweise das Überleben oder Verhalten beeinträchtigt. Verwenden Sie nur die minimale effektive Expositionszeit und spülen Sie anschließend die Embryonen gründlich, um eine weitere enzymatische Aktivität zu verhindern.
  4. Inkubieren Sie 3–5 Minuten bei Raumtemperatur und überwachen Sie die Freisetzung von Chorionen unter einem Stereomikroskop.
  5. Bewegen Sie die Schale vorsichtig oder wirbeln Sie die Schüssel zwischendurch sanft, um die enzymatische Entfernung der Chorionen zu erleichtern. Machen Sie weiter, bis die Mehrheit der Embryonen aus ihren Chorionen befreit ist.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die nackten Embryonen immer in Lösung untergetaucht sind; andernfalls kann der Eigelbsack platzen, was zum Tod der Embryonen führt.
  6. Sobald die Dechorionation erreicht ist, werden die Embryonen gründlich durch 5–6 Wechsel des frischen E3-Mediums gewaschen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die nackten Embryonen immer in Lösung untergetaucht sind; andernfalls kann der Eigelbsack platzen, was zum Tod der Embryonen führt.
  7. Stellen Sie sicher, dass alle Chorionen und Pronase-Rückstände entfernt werden, um Schäden an den Larven zu verhindern und optimale Kulturbedingungen zu erhalten.
  8. Transferiere ~50 dechorionierte Larven in eine 100 mm große Petrischale mit 40 ml E3-Medium mittels einer Glas-Pasteur-Pipette.
  9. Halten Sie die Larven unter diesen Bedingungen, bis sie mikroinjiziert werden.

6. Injektion von Zebrafisch-Embryonen

  1. Unter einem Stereomikroskop (≥150× Vergrößerung) verwenden Sie feine Pinzette, um die Spitze der gezogenen Glaskapillare (Abschnitt 1) vorsichtig zu durchbrechen und so eine Mikropipette mit einer Öffnung von etwa 3 μm Durchmesser zu erzeugen.
    HINWEIS: Eine geeignete Mikropipette kann erkannt werden, indem man darauf achtet, dass die Spitze fein geöffnet ist, ohne sichtbare Abflachung oder eine große offene Fläche an der Spitze. Wenn die Spitze zu weit abgebrochen wird, dringt sie nicht effektiv in die Fischhaut ein und kann zu schlechten oder unregelmäßigen Injektionen führen. Daher sollte das Öffnen der Spitze unter einem Stereomikroskop bei hoher Vergrößerung vorsichtig erfolgen, um einen minimalen, kontrollierten Bruch am äußersten Ende der Kapillare sicherzustellen.
  2. Bereite Injektionslösungen mit 0,9 % (w/v) NaCl (Kontrolle) oder IL-6 (2 pg/nL) in 0,9 % NaCl vor und gib 1 μL 0,1 % Trypanblau zu jedem 10 μL Lösung hinzu, um die Sichtbarkeit während der Injektion zu erleichtern.
  3. Füllen Sie die vorbereitete Mikropipette mit ~3 μL der Injektionslösung mit einer Mikrolader-Spitze nach, sodass keine Luftblasen entstehen.
  4. Sichern Sie die geladene Mikropipette in den Kapillarhalter (Abbildung 2), der mit dem Mikroinjektionssystem verbunden ist.
  5. Legen Sie einen kleinen Tropfen Mineralöl auf eine Kalibrierungsfolie.
  6. Kalibrieren Sie das Einspritzvolumen, indem Tröpfchen in das Mineralöl gestoßen und deren Durchmesser mit einem Kalibrierungsträger (Abbildung 2) mit einer Skala von 0,01 mm gemessen werden. Der Einspritzdruck (zwischen 300–500 hPa) wird eingestellt, um ein Tröpfchenvolumen von ~1 nL zu erreichen.
  7. Tricain (MS-222) geben Sie dem E3-Medium, das Larven enthält, zu einer Endkonzentration von 1× zur Anästhesie. Um Stress zu minimieren und eine gleichmäßige Sedierung zu gewährleisten, verwenden Sie die Larven in kleinen Mengen.
  8. Einzelne 2-DPF-Larven auf eine verfestigte Agarose-Injektionsplatte übertragen. Mehrere Larven (z. B. bis zu 10) können je nach Handhabungskapazität pro Schüssel positioniert werden.
  9. Stell die Schüssel unter das Stereomikroskop. Mit einer Glaspipette wird jede Larve vorsichtig so ausgerichtet, dass der Cuvier-Kanal klar sichtbar und zugänglich ist.
    HINWEIS: Bei der Arbeit mit mehreren Larven sollten Sie darauf achten, dass die Agaroseoberfläche hydratisiert bleibt, indem Sie regelmäßig Tropfen E3-Medium mit Tricain (1×) hinzufügen, um Austrocknung zu verhindern.
  10. Positioniere die Mikropipettenspitze am Eintrittspunkt des Cuvier-Kanals (wie in Abbildung 3 dargestellt), wobei man die Blutzellen, die sich unter dem Stereomikroskop zum Herzen bewegen, identifizieren kann.
  11. Injizieren Sie zwei aufeinanderfolgende Tröpfchen (jeweils ~1 nL) der vorbereiteten Lösung in den Cuvier-Kanal, mit einem Abstand von etwa 20 s zwischen den Injektionen, um eine korrekte Verteilung zu gewährleisten.
  12. Nach der Injektion werden die Larven vorsichtig von der Agaroseplatte in eine frische 100 mm große Petrischale mit 40 ml E3-Medium übertragen. Minimieren Sie die mechanische Belastung während des Transfers.
  13. Bringen Sie die Larven bei 28,5 °C zurück in den Inkubator zur Rettung.
  14. Am folgenden Tag (3 DPF) wiederholen Sie das Mikroinjektionsverfahren wie in den Schritten 6.8–6.13 beschrieben.
    HINWEIS: Eine einzelne Injektion erzeugt nur kurzlebige Signalübertragung und keine konsistente Verhaltensreaktion, während die zweite Injektion eine anhaltende Aktivierung der Entzündungswege über das für die Neuroentwicklung relevante frühe Larvalentwicklungsfenster gewährleistet und Verhaltensänderungen wie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse beschrieben hervorruft.
  15. Bei 5 DPF werden die Larven für nachgelagerte Anwendungen eingesetzt, einschließlich Verhaltenstests, Hirnbildgebung oder Immunfluoreszenzanalyse.

Ergebnisse

Um die Auswirkungen der IL-6-Mikroinjektion auf die Larvenphysiologie und das Verhalten zu bewerten, verglichen wir IL-6-injizierte Larven mit NaCl-injizierten Kontrollen hinsichtlich des Überlebens sowie zwei Verhaltensmessen, die häufig zur Bewertung angstähnlicher und repetitiver Verhaltensweisen bei Zebrafischen verwendet werden. Die IL-6-Mikroinjektion beeinträchtigte die Larvenlebensfähigkeit im Vergleich zu NaCl-Injektionen nicht (Abbildung 4A). Die Überlebensraten bei 5 dpf waren zwischen IL-6-injizierten und NaCl-injizierten Gruppen nicht zu unterscheiden, was darauf hindeutet, dass das Dosierungsregime gut verträglich ist und keine unspezifische Toxizität einführt. Mikroinjektionen selbst verringerten die Lebensfähigkeit im Vergleich zu nicht injizierten Geschwistern leicht, was auf eine moderate handhabungsbezogene Wirkung unabhängig von der IL-6-Exposition hinweist. Dies bestätigt, dass das Protokoll für nachgelagerte Verhaltensanalysen geeignet ist.

Um zu validieren, dass das IL-6-Mikroinjektionsparadigma eine messbare Entzündungsreaktion bei 5 dpf induziert, quantifizierten wir Prostaglandin E2 (PGE2), einen nachgelagerten Mediator der zytokingetriebenen entzündlichen Signale25. Die tsc2-/- homozygoten Mutanten zeigten erhöhte Ausgangswerte von PGE2 auch ohne IL-6-Injektion, deutlich höher als ihre Wildtyp-(WT) tsc2+/+ Geschwister (Abbildung 4B). Heterozygote tsc2+/- Mutanten zeigten einen moderaten, nicht signifikanten Anstieg des Ausgangs-PGE2 im Vergleich zu WT-Larven, aber wichtig ist, dass ihre PGE2-Werte nach der IL-6-Mikroinjektion stark anstiegen. Dieses Muster entspricht unserem Ziel, Gen- × Umweltinteraktionen zu modellieren: WT-Larven bleiben von milder, vorübergehender IL-6-Exposition weitgehend unbeeinträchtigt, während genetisch anfällige tsc2+/- Mutanten eine ausgeprägte Entzündungsreaktion zeigen.

Im Einklang mit diesen genotypabhängigen Unterschieden im entzündlichen Tonus untersuchten wir als Nächstes, ob IL-6-induzierte Signalübertragungen in messbare Verhaltensänderungen im offenen Feld-Test führten. Ein Open-Field-Test bei 5 DPF (wie zuvorbeschrieben 22) zeigte, dass tsc2-mutierte Larven im Vergleich zu WT-Geschwistern ein erhöhtes angstähnliches Verhalten zeigten (Abbildung 4C); Mikroinjektionen von IL6 beeinflussten dieses Verhalten jedoch nicht. Konkret verbrachten tsc2+/- und tsc2-/- Larven deutlich mehr Zeit in der äußeren Zone der Arena und zeigten eine reduzierte Zentrumserkundung im Vergleich zu tsc2+/+, was mit etablierten angstbedingten Phänotypen bei Zebrafischlarven übereinstimmt.

IL-6-Injektionen erhöhten wiederholende, stereotype Schwimmmuster, insbesondere bei tsc2+/- mutierten Larven (Abbildung 4D–E), ein Verhaltensmerkmal, das häufig als ASD-relevante Anzeige bei Zebrafischmodellen26 verwendet wird. Eine detaillierte Quantifizierung wiederholter Schleifen, definiert als drei oder mehr aufeinanderfolgende kreisförmige Schwimmbewegungen, zeigte einen signifikanten Anstieg des Anteils der IL-6-injizierten tsc2+/- Mutanten mit diesem Verhalten im Vergleich zu NaCl-injizierten Kontrollen. Diese selektive Verstärkung des repetitiven Schwimmens bei genetisch anfälligen Larven unterstützt zudem eine Gen-×-Umwelt-Interaktion, bei der milde Entzündungsstimulation ASD-ähnliche Verhaltensweisen speziell im tsc2+/- mutanten Hintergrund entlarvt oder verstärkt.

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Abbildung 1: Schaltplan des Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 2: Mikroinjektions-Arbeitsstation. Schaltplan der Mikroinjektionsarbeitsstelle, die für Larven-Zebrafisch-Injektionen verwendet wird. (1) Glasmikropipette, die am Einspritzbehälter montiert ist; (2) Agarose-überzogene Petrischüssel mit geformten Brunnen zur Larvenpositionierung; (3) Mineralöl zur Kalibrierung; (4) Trypan-blaue Lösung; (5) ausgezogene Glasnadeln; (6) Kalibrierungsfolie; (7) verlängerte Pipettenspitzen; (8) Pasteurpipette; (9) Silikonform. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Injektion in den Cuvier-Kanal. (A) Schematische Darstellung des Cuvier-Kanals (der gemeinsamen Kardinalvene) bei Larven-Zebrafischen und repräsentativen offenen Lokomotorbahnen bei 5 dpf. (B) Repräsentative Bilder der Kontrolle (uninjiziert) und Injektionen mit NaCl und IL-6. Maßstabsleiste: 250 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse der Gen-x-Umwelt-Interaktion mit der tsc2-mutantenlinie. (A) Überlebensraten (%) der tsc2-vu242-Larven während des Experiments in Kontrollgruppen (uninjizierte), NaCl-injizierte und IL-6-injizierte Gruppen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM bei 5 dpf präsentiert (n = 4 unabhängige experimentelle Replikate, wobei jeder Genotyp × Behandlungskombination 60–70 Fische enthält). Die statistische Analyse erfolgte mit ANOVA, gefolgt vom Tukey-Post-hoc-Test zum paarweisen Vergleich. Signifikante Unterschiede wurden zwischen Kontroll- und IL-6-injizierten Gruppen (p = 0,00150) sowie zwischen Kontroll- und NaCl-injizierten Gruppen (p = 0,00243) beobachtet. (B) Boxplots, die die PGE2-Werte in den tsc2-Mutanten und Geschwistern darstellen, gemessen bei 5 dpf mit einem enzymgekoppelten Immunsorbent-Assay (ELISA)-Kit gemäß dem Herstellerprotokoll (2-Wege-ANOVA für Genotyp: F = 7,4503; P = 0,01234). Jede Probe enthält 20 Köpfe (Zahl wurde für die Genotypisierung verwendet). Die Punkte in den Boxplots repräsentieren biologische Replika. (C) Boxplots der Ergebnisse des Open-Field-Tests für tsc2-mutierte Fische, die die relative Zeit zeigen, die für jeden Genotyp nach Injektionen mit NaCl und IL-6 sowie für uninjizierte Kontrollpersonen neben den Wänden verbracht wurde (2-Wege-ANOVA für Genotyp: F = 7,021; P = 0,00106). Der Open-Field-Test wurde mit einer automatisierten Analysekammer (Materialtabelle) gemäß dem zuvor berichtetenProtokoll 22 durchgeführt. (D) Beispielfigur, die zufälliges exploratives Verhalten nach der NaCl-Injektion und wiederholte Schleifen nach IL-6-Injektionen zeigt. (E) Boxplots, die die Anzahl der Tiere darstellen, die normales und wiederholtes Looping-Verhalten für jeden tsc2-Genotyp nach der Injektion mit NaCl oder IL-6 und für uninjizierte Kontrollfische zeigen (2-Wege-ANOVA für Genotyp: F = 5,7615; P = 0,005849). Dafür wurden drei unabhängige experimentelle Replikate verwendet, wobei jeder Genotyp × Behandlungskombination 60–70 Fische enthielt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

60 x E3 Serienlösung
ReagenzAbschließende SchwerpunkteBetrag
NaCl297 mM17,4 g
KCl10,7 mM0,8 g
CaCl219,6 mM2,18 g
MgCl2,6H 2O24 mM4,89 g
Ultrareines H2ON/AFüllen bis zu 1 L
GesamtN/A1 L
Trikain-Stocklösung
ReagenzAbschließende SchwerpunkteBetrag
Tricaine15,3 mM1 g
1 M Tris-HCl pH 921 mM5,25 mL
Ultrareines H2ON/A244,75 mL
GesamtN/A250 mL

Tabelle 1: Zusammensetzung von E3- und Tricain-Lösungen.

Diskussion

Wie erwartet zeigten tsc2-homozygote Mutanten hohe Ausgangswerte von angstähnlichem Verhalten, was mit zuvor berichteten Phänotypen 22,27 übereinstimmt. Da diese Larven bereits schwere Verhaltensauffälligkeiten aufweisen, hat die IL-6-Injektion ihren Phänotyp nicht weiter verschlimmert. Im Gegensatz dazu zeigten TSC2-Heterozygoten deutliche IL-6-induzierte Veränderungen. Diese Selektionssensitivität unterstreicht den Nutzen dieses Protokolls zur Untersuchung von Gen- × Umweltinteraktionen, bei denen milde, aber anhaltende entzündliche Signale mit der zugrundeliegenden genetischen Verwundbarkeit interagieren und neurobehaviorale Ergebnisse beeinflussen.

Die LPS-Exposition bleibt das am weitesten verbreitete entzündungseinlösende Paradigma bei Zebrafischen und erzeugt zuverlässig eine breite, robuste Immunantwort, die durch starke Induktion proinflammatorischer Zytokine, Rekrutierung angeborener Immunzellen und dosisabhängigeSterblichkeit gekennzeichnet ist. Obwohl leistungsstark, aktiviert LPS mehrere Toll-ähnliche Rezeptorwegegleichzeitig 28,29,30, was es erschwert, den Beitrag einzelner Zytokine zu den nachgelagerten neuroentwicklungsbedingten Effekten zu isolieren. Im Gegensatz dazu bietet das hier beschriebene IL-6-Mikroinjektionsprotokoll einen gezielten und kontrollierten Ansatz, indem ein einzelnes Zytokin erhöht wird, das als zentral für die Immunaktivierung der Mutter gilt. Wichtig ist, dass IL-6-Injektionen die Sterblichkeit im Vergleich zu NaCl-injizierten Kontrollgruppen nicht erhöhen, sodass Verhaltens- und molekulare Phänotypen untersucht werden können, ohne die Toxizität zu stören. Darüber hinaus erzeugt die IL-6-Mikroinjektion spezifische nachgeschaltete entzündliche Signale, wie durch erhöhte PGE2-Spiegel gezeigt wird, und induziert messbare Verhaltensänderungen – insbesondere verstärktes wiederholtes Schwimmen bei tsc2-heterozygoten Larven –, wobei genetische Anfälligkeit mit der Zytokinexposition interagiert. Zusammen unterstreichen diese Unterschiede, dass LPS zwar die globale Immunaktivierung modelliert, während die IL-6-Mikroinjektion eine präzise Analyse zytokinspezifischer Mechanismen ermöglicht, die für das neuroentwicklungsbedingte Risiko relevant sind.

Die hier präsentierten repräsentativen Ergebnisse veranschaulichen IL-6-Effekte im Hintergrund eines tsc2-mutanten, aber das Protokoll selbst ist breit anwendbar. Die Methode kann leicht in Wildtyp-Larven oder anderen genetischen Modellen implementiert werden, um zu untersuchen, wie definierte Entzündungssignale mit verschiedenen genetischen Kontexten während der frühen Neuroentwicklung zusammenwirken. Für Anwendungen jenseits des tsc2-Modells empfehlen wir, empirisch die optimale IL-6-Dosis zu bestimmen, da die Zytokinsensitivität und die entzündlichen Schwellenwerte je nach Genotyp und experimentellen Zielen variieren können.

Ein wichtiger technischer Aspekt bei diesem Protokoll ist die Konsistenz des Injektionsvolumens, da die biologischen Effekte von IL-6 von einer genauen Abgabe von etwa 1 nL pro Injektion abhängen. Die Variabilität der Tröpfchengröße entsteht oft durch Unterschiede in der Nadelöffnung oder im Injektionsdruck. Wenn Tröpfchen zu klein sind, stellt eine allmähliche Erhöhung des Drucks oder das leichte Verbreitern der Nadelspitze bei hoher Vergrößerung in der Regel den richtigen Durchfluss wieder. Umgekehrt zeigen Tröpfchen, die das vorgesehene Volumen überschreiten, meist darauf hin, dass die Nadelöffnung zu breit ist, in diesem Fall ist eine Druckminderung oder das Zubereiten einer neuen Nadel mit schmalerer Spitze notwendig. Die Aufrechterhaltung präziser Injektionsmengen ist unerlässlich, da Abweichungen die Entzündungslast verändern und die Reproduzierbarkeit beeinträchtigen können. Gelegentlich stoßen Nutzer auf Situationen, in denen keine Lösung aus der Nadel herausgeworfen wird. Dies ist meist auf Luftblasen, Ablagerungen oder Verstopfungen an der Nadelspitze zurückzuführen. Die Inspektion der Nadel unter einem Stereomikroskop und die Überprüfung des Einspritzsystems auf Lecks oder lose Verbindungen lösen das Problem in der Regel. Eine saubere, ungehinderte Nadelspitze ist entscheidend für eine gleichmäßige Verabreichung und um Druckaufbau zu verhindern, der die Larven schädigen könnte.

Ein weiterer wichtiger Faktor ist die physiologische Toleranz des injizierten Volumens. Larven vertragen im Allgemeinen ~1 nL gut, aber größere Mengen können die Sterblichkeit erhöhen, insbesondere wenn mehrere Injektionen an aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt werden. Bei Experimenten, die eine wiederholte Dosierung erfordern, ist es entscheidend, mechanische Belastung zu minimieren, ausreichend Erholungszeit zwischen den Injektionen einzuplanen und die IL-6-Konzentration statt des Volumens anzupassen, um die gewünschte Dosis zu erreichen. Diese Überlegungen helfen sicherzustellen, dass beobachtete Phänotypen die Zytokinexposition widerspiegeln und nicht die injektionsbedingte Verletzung.

Schließlich kann die injektionsbedingte Sterblichkeit je nach Nutzererfahrung stark variieren. Während qualifizierte Nutzer typischerweise eine Sterblichkeitsrate von etwa 5 % erreichen, können unerfahrene Nutzer Raten von bis zu 50 % beobachten. Die meisten Verluste resultieren aus mechanischen Schäden während der Montage, falscher Nadelplatzierung oder versehentlichem Einstich des Eigelbsacks oder des umliegenden Gewebes. Das Üben des Verfahrens an Wildtyplarven vor Beginn experimenteller Injektionen verbessert die Konsistenz erheblich und senkt die Sterblichkeit. Die richtige Positionierung der Larven, um den Cuvier-Kanal klar zu erkennen, kombiniert mit sanfter Handhabung während der Montage und Bergung, minimiert den prozeduralen Schaden zusätzlich.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Kevin Ess und Lilianna Solnica-Krezel (Vanderbilt University) für die tsc2vu242/+ Fische sowie dem IIMCB ZCF für die Unterstützung bei den erwachsenen Fischen. Diese Arbeit wurde durch das SONATA BIS-Stipendium Nr. 2023/50/E/NZ3/00252 unterstützt, ein Zuschuss für JZ vom Nationalen Wissenschaftszentrum Polen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Borosilikatglas Kapillaren (Außendurchmesser 1,0 mm/Innendurchmesser 0,75 mm)Sutter InstrumentBF150-75-10
CaCl2 (Calciumchlorid)Chempur118748703
Kalibrierschiebe (1/100 mm)Bresser5916710
Kapillarenhalter (Grip Head Set 4 Größe 0)Fertilart Sp. z o.o5196082001
Flaming/Brown MikropipettenzieherSutter InstrumentP-1000
HClChempur115752837
Human IL6Thermo Fischer Scientific200-06-20UGBestandskonzentration: 10 µg/mL, Arbeitskonzentration: 2 pg/nL (verdünnt in 0,9% NaCl)
Injektorpumpe FemtoJet 4iEppendorfE5252000021
KCl (Kaliumchlorid)Chempur117397402
MgCl2·6H2O (Magnesiumchlorid Hexahydrat)Chempur116120500
Femtotips Microloader Tips für Femtojet MikroinjektorEppendorfEPE 5242956003
Mikroskop Leica M165 FC 1983 VergrößerungLeica Microsystemshttps://www.leica-microsystems.com/products/
light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m165-fc/
MineralölSigma-AldrichM5904
NaCl (Natriumchlorid)Chempur117941206
PronaseSigma-AldrichP5147-1GBestandskonzentration: 20 mg/mL (hergestellt in ultrareinem Wasser), Arbeitskonzentration: 0,5 mg/mL (verdünnt in E3)
TricainSigma-Aldrich/MerckA-5040
Tris baseCarl Roth4855.3
TrypanblauThermo Fischer Scientific15250061
UltraPure Low Melting Point AgaroseThermo Fischer Scientific16520050
ZebraBox Erweiterung - Photo Motor Response EZBPMRAnimalabhttps://animalab.eu/zebrabox-high-throughput-monitoring-system
ZebraboxViewPointhttps://www.viewpoint.fr/product/zebrafish/fish-behavior-monitoring/zebraboxAutomatisierte Analysekammer

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