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Forschungsartikel

Specnuezhenid Ameliorates diabetische Nephropathie bei db/db-Mäusen mittels Nrf2, A20/NF-κB und der Regulation der Darmmikrobiota

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DOI:

10.3791/71530

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28. Juli 2026

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1College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, 2Shanxi Key Laboratory of Integrative Systemic Regulation for Qi-Blood Dynamic Homeostasis, Shanxi University of Chinese Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Specnuezhenid lindert die diabetische Nephropathie bei db/db-Mäusen, was mit verbesserter Nierenfunktion, Darmbarrierestabilität sowie reduzierter Entzündung und oxidativem Stress assoziiert ist.

Zusammenfassung

Die Pathogenese der diabetischen Nephropathie (DN) ist multifaktoriell und umfasst Entzündungen, oxidativen Stress und die Darm-Nieren-Achse. Specnuezhenid ist der Hauptwirkstoff von Ligustri Lucidi Fructus und zeigt antineoplastische, antioxidative und entzündungshemmende Wirkungen. Die molekularen Mechanismen, die seinen Auswirkungen auf DN zugrunde liegen, müssen jedoch weiter untersucht werden. Diese Studie zielt daher darauf ab, die molekularen Mechanismen von Specnuezhenid auf DN zu untersuchen. Ein DN-Mausmodell wurde mit db/db-Mäusen erstellt, und ihnen wurde 8 Wochen lang Specnuezhenid verabreicht. Die Wirkung von Specnuezhenid auf diese Mäuse wurde durch Serumglukose- und Nierenfunktionstests bewertet. Histopathologische Veränderungen wurden mittels Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen untersucht. Ein enzymgekoppelter Immunsorbent-Test wurde eingesetzt, um die Konzentration von entzündlichen Zytokinen zu quantifizieren. Der Nrf2-Weg und die A20/NF-κB-Wege wurden mittels Western Blotting (WB) analysiert, während die Expression der Proteine der Intestinal-Tight-Junction mittels WB und Immunfluoreszenz bewertet wurde. Veränderungen im Darmmikrobiota wurden mittels Hochdurchsatz-16S-rRNA-Sequenzierung untersucht. Im Vergleich zur Modellkontrolle verbesserte Specnuezhenid die Nierenfunktion bei db/db-Mäusen, indem es den Blutzucker (von 37,13 mmol/L auf 28,96 mmol/L), den Blut-Harnstoff-Stickstoff (von 18,27 mmol/L auf 15,15 mmol/L) und das Harnprotein (von 28,5 mg auf 20,41 mg) in der Hochdosisgruppe senkte. Unterdessen zeigte die Analyse der Darmmikrobiota eine erhöhte mikrobielle Häufigkeit und einen verringerten Lipopolysaccharidspiegel nach der Verabreichung von Specnuezhenid. Specnuezhenid kann unterdessen die Expression von Proteinen der Intestinal-Tight-Junction hochregulieren und so die Integrität der Darmschranke verbessern. Specnuezhenid kann die Expression von Nrf2 und A20 hochregulieren und die Expression von NF-κB herunterregulieren. Darüber hinaus kann Specnuezhenid Nierenfunktionsschäden lindern und gleichzeitig die Nrf2- und A20/NF-κB-Bahnen regulieren.

Einleitung

Diabetes ist eine Hauptursache für Nierenerkrankungen; mit dem Anstieg der Zahl der Diabetespatienten steigt seine Prävalenz1. Traditionelle Behandlungen der diabetischen Nephropathie (DN) haben gezeigt, dass sie das Fortschreiten der chronischen Nierenerkrankungverzögern 2. Es besteht jedoch weiterhin die Notwendigkeit, wirksamere Medikamente zur Prävention und Behandlung von DN zu identifizieren. Die Pathogenese von DN ist vielschichtig und umfasst Entzündungen, oxidativen Stress und die Darm-Niere-Achse1. Mit ihrem Multi-Target-Ansatz hat die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) eine bemerkenswerte Wirksamkeit bei der Behandlung chronischer Stoffwechselerkrankungen gezeigt. Darüber hinaus hat die wachsende Forschung zur TCM bei der Prävention und Behandlung von DN vielversprechende Ergebnisse gezeigt3.

Diabetes mellitus ist eine komplexe Stoffwechselerkrankung, bei der der Darm eine zentrale Rolle in seiner Pathophysiologie durchWechselwirkungen mit Stoffwechselorganen spielt. Das Zusammenspiel zwischen Wirt und Darmmikrobiota ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase des Wirts. Eine Störung einer gesunden Mikrobiota-Struktur kann Toxine erzeugen, die die Nieren schädigen2, während eine beeinträchtigte Nierenreinigung den mikrobiellen Stoffwechsel und die Zusammensetzung verändernkann 5,6. Die Darmbarriere fungiert sowohl als chemische als auch physikalische Abwehr und wird durch epitheliale enge Verbindungen und eine Schleimschicht aus Mucin5 aufrechterhalten. Hinweise deuten auf eine Korrelation zwischen DN und einer beeinträchtigten Darmbarriere7 hin, die die Translokation von Toxinen und bakteriellen Nebenprodukten wie Lipopolysaccharid (LPS) in den Blutkreislaufermöglicht. LPS-Translokation über die kompromittierte Barriere kann eine Dysregulation adaptiver und angeborener Immunantworten auslösen und die Produktion proinflammatorischer Zytokineanregen, was letztlich zu einem chronisch entzündlichen Zustand führt, der für DN11,12 charakteristisch ist.

Ligustri Lucidi Fructus wird klinisch zur Behandlung der diabetischen Nephropathie (DN)13 eingesetzt, wobei Specnuezhenid als wichtiger Wirkstoff14 identifiziert wurde. Specnuezhenid, ein einzigartiges Secoiridoid-Glycosid15, zeigt entzündungshemmende, antioxidative und immunmodulatorische Eigenschaften 16,17,18,19. Die db/db-Maus ist ein gut etabliertes spontanes Typ-2-DN-Modell, das wichtige menschliche DN-Merkmale repapituliert, darunter persistierende Hyperglykämie, Albuminurie und die Expansion der Mesangialmatrix20. Eine frühere Studie berichtete, dass Specnuezhenid renoprotektive Effekte bei DN-Ratten hatte21; die molekularen Mechanismen sind jedoch weitgehend unerforscht. Bemerkenswert ist, dass Specnuezhenid eine niedrige orale Bioverfügbarkeit (etwa 1,93 %)22 aufweist, was es erschwert, seine pharmakologischen Effekte ausschließlich durch direkte Aufnahme zu erklären. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Specnuezhenid schnell vom Darmmikrobiota metabolisiert werden kann und seine pharmakologische Aktivität durch darm-mikrobiota-abhängige Wege vermittelt werdenkann 19. Basierend auf diesen Überlegungen wurde die Hypothese aufgestellt, dass Specnuezhenid DN lindert, indem es die Darmmikrobiota sowie nachfolgende entzündliche und oxidative Stresswege moduliert. Um diese Hypothese zu testen, bewerteten wir die dosisabhängigen Effekte von Specnuezhenid bei db/db-Mäusen und wählten die Dosen auf Grundlage von vorläufigen Experimenten und vorherigen pharmakologischen Studien aus.

Daher zielte diese Studie darauf ab, die potenzielle Wirkung und den Mechanismus von Specnuezhenid im Zusammenhang mit DN zu bewerten, mit Fokus auf seine Fähigkeit, Nierenentzündungen und oxidativen Stress über die Darm-Nieren-Achse zu mildern. Diese Studie trägt dazu bei, die Mechanismen aufzuklären, durch die Specnuezhenid zur Prävention und Behandlung von DN beiträgt.

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Protokoll

Das Ethikkomitee der Shanxi University of Chinese Medicine genehmigte diese Studie (2022DW167). Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Tierversuche

Männliche db/db-Mäuse im Alter von 8–9 Wochen wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen. Die Mäuse wurden im Tierzimmer auf SPF-Ebene des Experimental Management Center der Shanxi University of Chinese Medicine untergebracht und bei einer stabilen Luftfeuchtigkeit von 55 % ± 5 % sowie einer komfortablen Umgebung von 25 °C ± 1 °C mit einem 12/12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus und ad-libitum-Zugang zu Nahrung und Wasser gehalten. Vor dem Experiment wurden alle Mäuse sieben Tage lang akklimatisiert. Humane Endpunkte: Mäuse, die einen Gewichtsverlust von >20 %, einen ersterbenden Zustand oder die Unfähigkeit, Nahrung/Wasser zu erreichen, zeigten, wurden vor dem geplanten Endpunkt human eingeschläfert. Euthanasie: Alle Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbitalnatrium eingeschläfert, gefolgt von einer zervikalen Verrenkung nach institutionell genehmigten Protokollen.

Die db/db-Maus ist ein genetisch spontanes diabetisches Modell (kein induziertes Modell). Der Modellerfolg wurde im Alter von 9 Wochen bestätigt, indem Nüchternblutzucker (≥16 mmol/L) und Urin-Mikroalbumin (positiv) gemessen wurden. Alle db/db-Mäuse erfüllten die Kriterien, und keine Tiere wurden ausgeschlossen. Sobald das DN-Modell bei db/db-Mäusen erfolgreich etabliert war, wurden die Mäuse zufällig in Gruppen unter Verwendung einer computergenerierten Zufallssequenz zugeteilt. Der Prüfer, der die Experimente durchführte, war blind gegenüber der Gruppenzuweisung. Jeder Käfig beherbergte nur eine Behandlungsgruppe, um Kreuzkontamination zu vermeiden. Die Mäuse wurden zufällig in vier Gruppen eingeteilt (n = 10 pro Gruppe): die Modellkontrollgruppe (MC), die Irbesartan-Gruppe (Irb), die niedrig-dosierte Specnuezhenid-Gruppe (Spe-L) und die hochdosierte Specnuezhenid-Gruppe (Spe-H), wobei die db/m-Mäuse (n = 10) als normale Kontrollgruppe (NC) verwendet wurden. Die NC- und MC-Gruppen erhielten destilliertes Wasser. Im Gegensatz dazu erhielten die Gruppen Irb, Spe-L und Spe-H täglich 43,75 mg/kg Irbesartan, 57 mg/kg Specnuezhenid bzw. 114 mg/kg Specnuezhenid für 8 Wochen. Die Gavage-Dosierung wurde proportional zur Körpergewichtszunahme erhöht. Nach 8 Wochen der Verabreichung wurden alle Mäuse über Nacht (12 Stunden) mit freiem Zugang zu Wasser vor der Euthanasie gefastet, und das Serum (zentrifugiert bei ~1500 x g für 15 Minuten und das Supernatant wurde gesammelt), Urin (24-Stunden-Urin im Stoffwechselkäfig entnommen), Kot sowie Darm- und Nierengewebe wurden unmittelbar nach der Euthanasie gesammelt und in flüssigem Stickstoff gefroren, und bis zur Analyse bei -80 °C gelagert. Nach der Datenerhebung wurde die Blindierung gebrochen, um statistische Analysen durchzuführen.

Blut- und Urinindikatoren

Die Serumwerte von LPS, SCr und BUN wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Die 24-Stunden-Urin-Albuminkonzentration wurde gemäß der Kit-Anleitung nachgewiesen. Die Serumglukosewerte wurden mit einem automatischen biochemischen Analysator gemessen.

ELISA-Detektion

Die Konzentrationen von TNF-α, IL-6 und IL-1β im Mausserum wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem 352-Modell-Mikroplattenleser gemessen.

Pathologische Beobachtung der Nierengewebe der Maus

Das Darm- und Nierengewebe wurde 48 Stunden lang in 4%iger Paraformaldehydlösung fixiert, bevor es gewaschen, dehydriert und Paraffin eingebettet wurde. Schnitte (4 μm dick) wurden mit einem Paraffinmikrotom gewonnen. Nach der Deparaffinisierung wurden die Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbt und mit einem digitalen Pathologie-Objektträger gescannt.

16S rRNA-Sequenzierung

Bakterielle genomische DNA wurde aus den Inhalten des Müslings mit einem magnetischen Perlen-basierten Boden-DNA-Extraktionsset nach dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Die DNA-Konzentration wurde mit einem Fluorometer gemessen.

Die V3–V4 hypervariable Region des 16S rRNA-Gens wurde mit den Primern 338F (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′) und 806R (5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′) amplifiziert. Die Verstärkung erfolgte mit einem PCR Master Mix unter folgenden Zyklusbedingungen: eine anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten; 5 Zyklen mit 95 °C für 30 Sekunden, 45 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 30 Sekunden; gefolgt von 20 Zyklen mit 95 °C für 30 Sekunden, 55 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 30 Sekunden; und eine letzte Verlängerung bei 72 °C für 5 Minuten. Die PCR-Amplikone wurden anschließend mit magnetischer Perlen-basierter DNA-Reinigung und Größenauswahl gereinigt.

Die Bibliotheken wurden mit Illumina-Adaptern und -Indizes aufgebaut, und die Sequenzierung erfolgte auf einer Next-Generation-Sequencing-(NGS)-Plattform (2 × 250 bp Paired-End). Rohlesungen wurden mit gepaarter Endsequenzierung und Lesezusammenführungssoftware zusammengesetzt, qualitätsgefiltert und zu operativen taxonomischen Einheiten (OTUs) mit 97 % Ähnlichkeit unter Verwendung von Amplicon-Sequenzanalyse-Software gruppiert. Chimäre Sequenzen und Singleton-OTUs wurden entfernt. Die Taxonomie wurde von BLAST anhand der RDP-Datenbank (für Bakterien) und UNITE (für Pilze) zugewiesen.

Die Alpha-Diversität wurde mit Mothur v3.8.31 berechnet. Die Beta-Diversität wurde mittels Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) auf Basis von Bray-Curtis-Distanzen mit dem R-veganen Paket bewertet. Die Analyse der differentiellen Häufigkeit wurde mit STAMP v2.1.3 und LEfSe v1.1.0 durchgeführt. Die funktionale Vorhersage wurde mit PICRUSt v1.1.4 durchgeführt.

Immunfluoreszenzfärbung

Nach dem Entwachsen wurden die Proben mit Natriumcitrat bei hohen Temperaturen 15 Minuten entnommen, gefolgt von einem 60-minütigen Block mit 5 % BSA. Primäre Antikörper für Occludin und Claudin-1 (1:500) wurden dann auf Ileal- und Darmgewebe aufgetragen und über Nacht inkubiert. Anschließend wurde eine sekundäre Antikörperfärbung für 60 Minuten durchgeführt. Nach einer 10-minütigen DAPI-Färbung wurden die Proben mit einem Antifluoreszenz-Abschreckungsreagenz konserviert, und Immunfluoreszenzbilder wurden mit einem automatisierten Fluoreszenzbildgebungssystem aufgenommen.

Westliche Blotting

Das Gesamtprotein wurde mit einem RIPA-Puffer extrahiert und mit einem BCA-Protein-Assay-Kit quantifiziert. Proben (15 μL/Bohrloch) wurden für etwa 2 Stunden Elektrophorese auf ein 8–12%-Trenngel geladen. Die Proteine wurden dann unter Kühlbedingungen bei 100 V für 2 Stunden mit einem Nasstransfersystem auf eine PVDF-Membran übertragen. Nach dem Blockieren mit 5 % Magermilch wurde die Membran über Nacht mit dem primären Antikörper bei 4 °C inkubiert. Nach den Waschen wurde ein geeigneter sekundärer Antikörper aufgetragen, und die Membran wurde 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Schließlich wurden Membranen in einer Dunkelkammer mit ECL-Chemilumineszenz entwickelt und mit der ImageJ-Software analysiert. Für die Normalisierung wurde der Mittelwert der NC-Gruppe als Referenz festgelegt. Die Rohdaten jeder einzelnen Stichprobe aller experimentellen Gruppen wurden dann durch diesen Mittelwert geteilt, sodass der Durchschnitt der NC-Gruppe 1 wurde und alle anderen Werte als Faltänderung relativ zum NC ausgedrückt wurden.

Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit SPSS 26.0-Software durchgeführt, und die experimentellen Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. Biologische Replikate (n) repräsentieren einzelne Mäuse pro Gruppe (n = 10 für physiologische Parameter; n = 3 für Western Blot und n = 6 für 16S-Sequenzierung). Keine Tiere oder Proben wurden von der Analyse ausgeschlossen. Wenn die Stichprobe die Annahmen einer Normalverteilung und der Varianzhomogenität erfüllte, wurde eine Einweganalyse der Varianz verwendet, um mehrere Gruppen zu vergleichen. Wenn die Varianzhomogenität bestätigt wurde, wurde der Test für den geringsten signifikanten Unterschied (LSD) für paarweise Vergleiche angewendet; ansonsten wurde Dunnetts T3-Test verwendet. Aufgrund des explorativen Charakters der Studie wurde keine zusätzliche Korrektur für mehrere Vergleiche über verschiedene Endpunkte hinweg vorgenommen. Ein statistisch signifikanter Unterschied wurde angezeigt, als P < 0,05 betrug.

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Ergebnisse

Die Verabreichung von Specnuezhenid senkte den Blutzuckerspiegel, verbesserte die Nierenfunktion und linderte Nierenschäden bei Mäusen mit DN

DN-Modellmäuse wurden nach erfolgreicher Modellierung 8 Wochen lang mit Specnuezhenid behandelt. Die Mäuse der MC-Gruppe zeigten deutliche Zuwächse des Serumglukosespiegels, während die Mäuse in der Specnuezhenid-Gruppe signifikant reduziert waren (Abbildung 1B). Die MC-Grup...

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Diskussion

DN, eine anhaltende mikrovaskuläre Komplikation von Diabetes, ist gekennzeichnet durch erhöhte Albuminausscheidung im Urin und eine beeinträchtigte Nierenfunktion24. Albuminurie ist ein häufig verwendeter früher klinischer Indikator für das Fortschreitenvon DN 25. Patienten mit DN können eine abnormale Nierenfunktion zeigen, was sich durch signifikant erhöhte SCr- und BUN-Werte26 zeigt. In dieser Studie zeigte die Sp...

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Offenlegungen

Die Autoren geben an, dass sie keine bekannten konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.

Danksagungen

Diese Forschung wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81973486 und 82173974), den Forschungsprojekten der Shanxi-Provinz Administration für traditionelle chinesische Medizin (Nr. 2024ZYYA021) und dem Disziplinprojekt der Shanxi University of Chinese Medicine (Nr. 2026XK24) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AlbustixGuangzhou Huadu Gaoerbo Biotechnology Co., Ltd.20211203
Analytische WaageBeijing Sartorius Instrument System Co., Ltd.CPA
Antikörper A20Cell Signalling Technology5630s(1:1000)
Antikörper BaxCell Signalling Technology2772s(1:1000)
Antikörper Bcl-2Cell Signalling Technology3498s(1:1000)
Antikörper claudin 1AbcamEPR25359-48(1:1000)
Antikörper COX2Proteintech Group12375-1-AP(1:2000)
Antikörper GAPDHAbcamEPR16891(1:10000)
Antikörper GCLCProteintech Group12601-1-AP(1:10000)
Antikörper HO-1Proteintech Group10701-1-AP(1:10000)
Antikörper IκBαCell Signalling Technology4812s(1:1000)
Antikörper Myd88AbcamEPR21824(1:1000)
Antikörper NF-κB p65Cell Signalling Technology8242s(1:1000)
Antikörper NLRP3Proteintech Group68102-1-Ig(1:5000)
Antikörper NQO1Proteintech Group11451-1-AP(1:5000)
Antikörper Nrf2Proteintech Group16396-1-AP(1:5000)
Antikörper occludinCell Signalling Technology91131S(1:1000)
Antikörper p-IκBαCell Signalling Technology2859s(1:1000)
Antikörper p-NF-κB p65Cell Signalling Technology3033s(1:1000)
Antikörper TAX1BP1Proteintech Group14424-1-AP(1:2000)
Antikörper TLR4GeneTexGTX75742(1:1000)
Antikörper TRAF6Santa Cruz Biotechnologysc-8409(1:1000)
Antikörper ZO-1Proteintech Group21773-1-AP(1:10000)
Automatischer biochemischer Analysator zur BlutzuckermessungBiobase Biodusty (Shandong) Co., Ltd.BK-280
Blut Harnstoff StickstoffNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC03-2-1
ZentrifugenmaschineHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., LtdHI650
db/db Mäuse (8-9 Wochen alte Männchen)Changzhou Kavens Laboratory Animal Co., Ltd. SCXK (Su) 2021-0013
IL-1β ELISA-KitWuhan Fine Biotech Co., Ltd.EM0109
IL-6 ELISA-KitWuhan Fine Biotech Co., Ltd.EM1158
IrbesartanZhejiang Huahai Pharmaceutical Co., Ltd.0000019353
LPSJiangsu Meimian Industrial Co., Ltd.MM-0634M1
MikroskopOlympus CorporationBX53
MikrotomLeica Biosystems Nussloch GmbHRM 2016
Organisierte Pizza-SchneidemaschineWuhan Junjie Electronic Co., LtdJK-6
Paraffinn-SchneidemaschineRWD Life Science Co., Ltd.S710
Pathologischer Dia-ScannerNingbo Konfoong Bioinformation Tech Co., Ltd.KFBIO PRO-005
Serum KreatininNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC011-2-1
SpecnuezhenideNational Institutes for Food and Drug Control39011-92-2Reinheit >98%
SPSS-Statistik 26.0
Gewebe-Einbettungs-CenterWuhan Junjie Electronic Co., LtdJB-P5
Gewebe-ProzessorWuhan Junjie Electronic Co., LtdJT-12J
TNF-α ELISA-KitWuhan Fine Biotech Co., Ltd.ER1393
UrinproteinWuhan Fine Biotech Co., Ltd.EM0632

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