Dieses Protokoll beschreibt eine vollständig integrierte, chipbasierte Mikrofluidik-Methode unter Verwendung der LAMP-Technik, die den Nachweis von 15 Krankheitserregern, die bei auf der Intensivstation behandelten Patienten Infektionen der unteren Atemwege verursachen, innerhalb einer Stunde am Point-of-Care ermöglicht.
Methodenartikel
Schnelle Point-of-Care-Detektion von Pathogenen für Infektionen der unteren Atemwege bei Intensivpatienten
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Untere Atemwegsinfektionen (LRTIs) gehören zu den häufigsten Ursachen für eine klinische Verschlechterung und den Tod bei schwerkranken Patienten. Auf der Intensivstation (ICU) ist die zeitnahe Identifizierung des verursachenden Erregers für eine angemessene antimikrobielle Therapie entscheidend; herkömmliche Kulturmethoden benötigen jedoch 3 bis 5 Tage und weisen insbesondere bei Pilzen suboptimale Nachweisraten auf. Molekulare Ansätze wie die PCR verkürzen die Durchlaufzeit, sind aber weiterhin auf manuelle Nukleinsäure-Extraktion und Thermocycling angewiesen, was ihre Eignung für den Einsatz am Bett reduziert. Dieses Protokoll beschreibt einen Point-of-Care-Arbeitsablauf, der auf einem vollständig integrierten, scheibenförmigen mikrofluidischen Chip (CD-Chip) basiert und die magnetkugelbasierte Nukleinsäure-Reinigung mit der LAMP-Technik (loop-mediated isothermal amplification) kombiniert. Nach einem vereinfachten manuellen Verflüssigungs- und Lysisschritt wird die aufbereitete Probe gemeinsam mit zwei vorgepackten Reagenzgefäßen auf den Chip aufgebracht. Das Gerät führt anschließend automatisch die Extraktion, die Amplifikation bei 65 °C und die Echtzeit-Fluoreszenzauswertung durch und liefert innerhalb von 45 Minuten qualitativen Nachweis für 15 Zielstrukturen, nämlich 11 Bakterien, 3 Pilze und einen atypischen Erreger (ca. 1 Stunde für den gesamten sample-to-answer-Arbeitsablauf einschließlich des manuellen Vorverarbeitungsschritts). Wir präsentieren Nachweisdaten aus 10 ICU-Proben, darunter Sputum, bronchiale Aspirate und Bronchoalveolärlavageflüssigkeit, mit sowohl Einzel- als auch polymikrobiellen Ko-Infektionen, bei denen bis zu 7 Organismen auf einem einzigen Chip nachgewiesen wurden. Das geschlossene Kartuschendesign minimiert das Risiko einer Aerosolkontamination, und der einstufige Ladevorgang erfordert keine spezielle Schulung, wodurch dieses System sich als praktisches diagnostisches Werkzeug am Bett für ICU-Teams eignet.
Einleitung
Bei kritisch kranken Patienten auf der Intensivstation sind Infektionen der unteren Atemwege, wobei die beatmungsassoziierte Pneumonie (VAP) die häufigste Form darstellt, nach wie vor eine anhaltende Ursache für Morbidität, verlängerte mechanische Beatmung und erhöhte Letalität1,4. Das mikrobiologische Spektrum von auf der Intensivstation erworbenen Infektionen der unteren Atemwege (LRTIs) unterscheidet sich deutlich von dem bei ambulant erworbenen Erkrankungen. Multiresistente gramnegative Erreger (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii) dominieren, oft in polymikrobiellen Konstellationen, die eine empirische Therapie erschweren3,4. Opportunistische Pilze tragen eine zusätzliche Komplexitätsebene bei. Die invasive pulmonale Aspergillose, die einst als Kennzeichen starker Immunsuppression galt, wird heute zunehmend auch bei nicht-neutropenischen Intensivpatienten diagnostiziert, insbesondere nach schwerer Influenza und COVID-195. Bestehende diagnostische Algorithmen zur Aspergillose kombinieren kulturabhängige Verfahren mit geringer Ausbeute und die Antigentestung auf Galaktomannan (GM). Der GM-Assay ist jedoch durch gut dokumentierte diagnostische Zeitfenster und variable Sensitivität bei nicht-neutropenischen Wirtsorganismen eingeschränkt6. Jede Stunde Verzögerung bei der Einleitung einer geeigneten antimikrobiellen Therapie bei Sepsis ist mit einer messbaren Erhöhung der Sterblichkeit verbunden7. Insgesamt erfordern die Geschwindigkeit und Komplexität von Intensivstationeninfektionen diagnostische Werkzeuge, die der klinischen Dringlichkeit gerecht werden.
Die klassische mikrobiologische Kultur ist zwar für die Empfindlichkeitstestung unverzichtbar, jedoch grundsätzlich zeitlich limitiert: Die Durchlaufzeit beträgt 3 bis 5 Tage, anspruchsvolle Organismen werden übersehen, und die Positivrate bei Pilzkulturen bleibt niedrig8. Die metagenomische Next-Generation-Sequenzierung (mNGS) bietet eine unvoreingenommene Alternative, doch ihre klinische Anwendung wird durch hohe Kosten, eine Bearbeitungsdauer von 24 bis 48 Stunden, die Abhängigkeit von Bioinformatik-Pipelines und die begrenzte Eignung für die Point-of-Care-Diagnostik eingeschränkt9. PCR-basierte Testpanels haben die Zeitspanne verkürzt, erfordern jedoch weiterhin mehrstufige Nukleinsäure-Extraktion, thermocyclerbasierte Geräte und – bei herkömmlichen Verfahren – eine elektrophoretische Analyse nach der Amplifikation10. Keine dieser Plattformen erfüllt vollständig die zusammenlaufenden Anforderungen auf der Intensivstation: eine Dauer von weniger als einer Stunde, minimale manuelle Bearbeitungszeit, multiplexfähige Abdeckung von Pathogenen einschließlich Pilzen und ausreichende Bedienbarkeit für nicht-laborerfahrene Personal.
Die LAMP-Methode (loop-vermittelte isothermale Amplifikation) behebt mehrere dieser Einschränkungen. Erstmals von Notomi et al. beschrieben, amplifiziert die Methode Ziel-DNA bei konstanten 65 °C unter Verwendung eines Satzes von vier bis sechs Primern, die sechs unterschiedliche Regionen erkennen, wobei eine Strangverdrängungs-Polymerase zum Einsatz kommt11. Die Reaktion erzeugt charakteristische Stamm-Schleifen- und blumenkohlartige Amplikonstrukturen, die mittels Echtzeit-Fluoreszenz nachweisbar sind und S-förmige Kurven ergeben, sobald die Schwelle überschritten wird, was innerhalb weniger Minuten geschieht. Die Empfindlichkeit bei niedrigen Matrizenkonzentrationen ist hoch, und das Mehrfachprimer-Design verleiht eine Selektivität, die falsch-positive Ergebnisse begrenzt12,13. In Kombination mit mikrofluidischen Chip-Plattformen kann LAMP parallelisiert werden, sodass mehrere Zielstrukturen aus einer einzigen Probenaufgabe analysiert werden14. Frühere Arbeiten zeigten, dass LAMP-Chip-Systeme Atemwegserreger mit einer Durchlaufzeit deutlich unter drei Stunden nachweisen können15. Eine wesentliche Einschränkung dieser Systeme ist jedoch ihre Abhängigkeit von einer separaten, manuellen DNA-Extraktion, die zusätzliche Zeit, betriebliche Komplexität und Kontaminationsrisiken mit sich bringt.
Das hier beschriebene System beseitigt diesen Engpass. Aufbauend auf einem Einweg-Mikrofluidik-Chip in Scheibenform (86 mm Durchmesser) integriert es Probenzugabe, die nukleinsäurebasierte Reinigung mittels magnetischer Beads und die 16-plex LAMP-Amplifikation in einer einzigen geschlossenen Kartusche (Abbildung 1). Der Bediener führt lediglich einen kurzen manuellen Liquefaktions-Lyse-Schritt mit einem speziell konzipierten Probengefäß durch und gibt anschließend das Lysat sowie zwei Reagenzienfläschchen auf den Chip (Abbildung 2). Ab diesem Zeitpunkt übernimmt das Gerät vollständig automatisch die Nukleinsäure-Extraktion, die isothermale Amplifikation bei 65 °C und die Fluoreszenzdetektion und liefert innerhalb von 45 Minuten qualitative Ergebnisse für 15 klinisch relevante Zielstrukturen, nämlich 11 Bakterien, 3 Pilze (Aspergillus spp., Candida albicans, Pneumocystis jirovecii) und einen atypischen Erreger (Mycoplasma pneumoniae). Ein Gen der Neuroblastom-Breakpoint-Familie (NBPF), das als interne Kontrolle dient, überprüft in jedem Test die Probenqualität und die Reaktionsintegrität. Dieses Protokoll enthält Schritt-für-Schritt-Anleitungen für den gesamten Arbeitsablauf – von der Probenentnahme auf der Intensivstation über die Vorbehandlung, die Beladung des Chips, die automatisierte Detektion bis hin zur Ergebnisinterpretation – und richtet sich sowohl an Personal im klinischen Labor als auch an Teams an der Intensivbettseite.
Protokoll
Alle Proben wurden im Rahmen eines Protokolls erhoben, das vom Ethikprüfungsausschuss des Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, genehmigt wurde (Genehmigungsnummer I-24PJ1778). Von jedem Teilnehmer oder dessen gesetzlich bevollmächtigten Vertreter wurde vor der Probensammlung eine schriftliche informierte Einwilligung eingeholt. Die Zielpathogen-Panel- und Reaktionsmulden-Zuordnungen sind in Tabelle 1 aufgeführt, und die Verbrauchsmaterialien, die während der Probenvorverarbeitung verwendet wurden, sind in Tabelle 2 aufgelistet.
1. Sammlung klinischer Proben aus dem unteren Respirationstrakt auf der Intensivstation
- Sputum-Sammlung
- Spülen Sie die Mundhöhle dreimal mit sauberem Wasser oder steriler physiologischer Kochsalzlösung aus, um Speisereste und muköse orale Flora zu entfernen.
- Weisen Sie den Patienten an, zwei bis drei tiefe Atemzüge zu nehmen und anschließend kräftig zu husten, um tiefen Atemwegs-Sputum direkt in einen sterilen Sammelbehälter auszuhusten.
HINWEIS: Ein geeignetes Probenmaterial besteht aus zähflüssigem, eitrigem oder blutverschmiertem Material aus unterhalb der Trachea; klarer Speichel oder postnasaler Abfluss sind unzureichend und können die nachfolgende Detektion beeinträchtigen.
- Brachialaspirat (BAS)-Sammlung
- Bei nicht intubierten Patienten wird ein steriler Absaugkatheter (ein 10–12 Fr-Katheter, angeschlossen an eine Absaugquelle mit einem Druck von −0,0267 MPa, äquivalent zu −200 mmHg) über nasalen oder oralen Zugang bis zu einer Tiefe von etwa 30 cm eingeführt.
- Während der Katheter langsam zurückgezogen wird, Absaugung unter gleichzeitigem Drehen des Katheters durchführen. Die aspirierten Sekrete in einer sterilen Sammelfalle sammeln.
HINWEIS: Falls nur geringe Sekretmengen vorhanden sind, vor der Absaugung etwa 5 mL sterile Kochsalzlösung über den Katheter zugeben. - Bei mechanisch beatmeten Patienten wählen Sie den Absaugkatheter entsprechend der Größe des endotrachealen Tubus: Verwenden Sie einen 10 Fr-Katheter für einen 7,0–7,5 mm Tubus und einen 12 Fr-Katheter für einen 8,0 mm Tubus.
- Bevor Sie absaugen, hyperoxygenieren Sie den Patienten 30–60 Sekunden lang mit 100 % Sauerstoff. Trennen Sie den Beatmungsschlauchkreislauf und führen Sie den ausgewählten Katheter über die künstliche Atemwegsöffnung ein, bis ein Widerstand spürbar ist.
- Wenden Sie einen Unterdruck von −0,0267 MPa (äquivalent zu −200 mmHg) an und begrenzen Sie jeden Absaugvorgang – und damit die Dauer der Beatmungspause – auf maximal 15 Sekunden, um eine Derekrutierung und Hypoxämie zu minimieren. Hyperoxygenieren Sie den Patienten anschließend erneut 30–60 Sekunden lang mit 100 % Sauerstoff.
- Geben Sie 1–2 mL sterile Kochsalzlösung über den Katheter zu und warten Sie 3 Sekunden.
- Führen Sie die Absaugung durch und ziehen Sie den Katheter zurück. Sammeln Sie die aspirierten Sekrete in einer sterilen Sammelfalle. Schließen Sie den Beatmungsschlauchkreislauf unmittelbar nach der Probengewinnung wieder an.
HINWEIS: Es ist unbedingt erforderlich, während des gesamten Vorgangs eine strenge aseptische Technik anzuwenden, um nosokomiale Kontamination der Probe zu vermeiden.
- Sammlung von Bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF)
- Identifizieren Sie das Zielsegment anhand der Thoraxbildgebung. Führen Sie das Bronchoskop vor und blockieren Sie es im entsprechenden segmentalen oder subsegmentalen Bronchus.
- Geben Sie rasch Portionen von 20–50 mL steriler Kochsalzlösung zu, insgesamt 3–5 Portionen (60–120 mL insgesamt). Führen Sie nach jeder Portion eine sanfte Absaugung durch und sammeln Sie die zurückgewonnene Flüssigkeit in einem sterilen, verschlossenen Behälter.
WARNHINWEIS: Während der BAL muss bei Intensivpatienten eine kontinuierliche hämodynamische und ventilatorische Überwachung erfolgen. Passen Sie die Beatmungseinstellungen bei mechanisch beatmeten Patienten entsprechend an.
HINWEIS: Die typische Rückgewinnungsrate beträgt 40–60 % des applizierten Volumens. Eine geringe Rückflussmenge kann eine Neupositionierung der Bronchoskopt Spitze erforderlich machen.
2. Verflüssigung und Lyse von Krankheitserregern
- Aspirieren Sie mit der Einwegpipette #2 die Probe bis zur Markierungslinie (ca. 1 mL) und geben Sie sie in das Verflüssigungsgefäß. Drücken Sie den Pipettenbalg mehrmals, um sämtliches viskoses Material zu überführen, und verschließen Sie anschließend das Gefäß.
ANMERKUNG: Bei BALF oder wässrigem Sputum zwei Pipettenvolumina aufnehmen, um eine ausreichende Pathogenmenge sicherzustellen. - Schütteln Sie das Verflüssigungsgefäß kräftig von Hand für 1 Minute. Prüfen Sie die Probe visuell und setzen Sie das Schütteln fort, bis keine sichtbaren Schleimklumpen mehr vorhanden sind und die Probe ungehindert durch die Einwegpipette #1 fließt (einheitliche, wasserähnliche Konsistenz). Schütteln Sie mindestens 1 Minute lang, und verlängern Sie die Zeit bei stark viskosen Proben nach Bedarf, bis diese Kriterien erfüllt sind.
- Öffnen Sie die Verschlusskappe des Lysegefäßes.
- Aspirieren Sie mit der Einwegpipette #1 etwa 0,5 mL der homogenisierten Probe und geben Sie diese in das Lysegefäß.
- Schließen Sie die Verschlusskappe und vergewissern Sie sich, dass die Spitzenkappe fest angezogen ist.
- Setzen Sie das Lysegefäß in das Probenvorverarbeitungsgerät (SP-Gerät) ein, indem Sie es nach unten drücken, bis es sicher sitzt. Drücken Sie auf Start.
- Lassen Sie das SP-Gerät den automatisierten Verflüssigungs-Lyse-Zyklus (Parameter in Tabelle 3) abschließen, der etwa 15 Minuten dauert.
ANMERKUNG: Öffnen oder entfernen Sie das Gefäß während der Bearbeitung nicht.
3. Chip-Beladung und automatische Detektion
- Reagenz- und Probenzugabe
- Nehmen Sie den CD-Chip aus der Lagerung bei 4 °C und lassen Sie ihn 10 min bei Raumtemperatur (ca. 25 °C) akklimatisieren.
HINWEIS: Die Reagenzgefäße O und B sowie das vorverarbeitete Lysat werden bei Raumtemperatur verwendet; die LAMP-Amplifikation auf dem Chip erfolgt bei 65 °C (siehe Schritt 3.2.3 und Tabelle 3). - Öffnen Sie die Folienverpackung und legen Sie den Chip auf eine ebene Fläche.
- Drehen Sie die Kappe gegen den Uhrzeigersinn, um den Chip zu öffnen.
- Klopfen Sie leicht gegen das Gefäß O, um die Flüssigkeit am Boden des Gefäßes zu sammeln.
- Entfernen Sie die Kappe von Gefäß O, führen Sie die Düse in die O-Öffnung ein und geben Sie den gesamten Inhalt in die Öffnung ab.
- Entsorgen Sie Gefäß O. Wiederholen Sie den Vorgang mit Gefäß B und der B-Öffnung.
- Entnehmen Sie das aufgearbeitete Lysegefäß aus dem SP-Gerät und entfernen Sie die Spitzenkappe.
- Richten Sie die Gefäßspitze an der S-Öffnung aus und geben Sie das gesamte Volumen des Lysats in den Chip ab.
- Entsorgen Sie das verwendete Lysegefäß.
- Drehen Sie die Chipkappe im Uhrzeigersinn, bis zwei hörbare Klicks eine vollständige Versiegelung bestätigen.
HINWEIS: Eine unvollständige Befüllung einer beliebigen Öffnung kann zu Ausfällen einzelner Kanäle führen. Stellen Sie vor dem Versiegeln sicher, dass die Abgabe vollständig erfolgt ist. Um unvollständige Versiegelung und Kontaminationsrisiken zu vermeiden, tragen Sie beim Verschließen der Kappe keine PE-Handschuhe; Latex- oder Nitrilhandschuhe werden stattdessen empfohlen.
- Nehmen Sie den CD-Chip aus der Lagerung bei 4 °C und lassen Sie ihn 10 min bei Raumtemperatur (ca. 25 °C) akklimatisieren.
- Betrieb des Geräts
- Schalten Sie den automatisierten Nukleinsäureanalysator ein. Tippen Sie auf Erkennen, scannen Sie den Barcode auf der Chip-Folienverpackung und geben Sie die Patientendaten und die Proben-ID ein.
- Setzen Sie den Chip auf die Drehspindel und drücken Sie nach unten, bis ein Klicken die Verriegelung bestätigt.
- Tippen Sie auf Start. Das Gerät führt autonom die zentrifugale Reagenzverteilung, die magnetische Bead-Extraktion, die LAMP-Amplifikation bei 65 °C und die Fluoreszenzdetektion durch. Die Laufzeit beträgt ca. 45 min (die Reagenz-/Probenzugabe und der instrumentelle Arbeitsablauf sind in Abbildung 3 zusammengefasst).
HINWEIS: Öffnen Sie den Deckel während des Laufs nicht.
- Auswertung der Ergebnisse
- Die Software ermittelt den Wendepunkt jeder s-förmigen Amplifikationskurve durch Analyse des Maximums der zweiten Ableitung und gibt den entsprechenden TP-Wert (Zeit bis zur Positivität) an.
- Vergleichen Sie jeden TP-Wert mit dem entsprechenden Schwellenwert in Tabelle 4. Stufen Sie Kanäle mit TP-Werten unterhalb oder gleich dem Schwellenwert als positiv ein und Kanäle mit TP-Werten oberhalb des Schwellenwerts als negativ.
- Stellen Sie sicher, dass der interne Kontrollkanal (Wanne 16) eine s-förmige Amplifikationskurve mit einem TP-Wert unter 12 min aufweist.
- Verwerfen Sie den Lauf, wenn die interne Kontrolle fehlschlägt. Wiederholen Sie den Test mit einem neuen Chip oder entnehmen Sie die Probe erneut.
Ergebnisse
Nach Abschluss eines gültigen Durchlaufs zeigte das Gerät Echtzeit-Fluoreszenzverläufe für alle 16 Kanäle an. Positive Kanäle wiesen die erwarteten s-förmigen Verstärkungskinetiken mit automatisch annotierten TP-Werten auf, während negative Kanäle auf dem Grundniveau verblieben. Der IC-Kanal (Vertiefung 16) ergab in allen gültigen Durchläufen eine s-förmige Kurve mit einem TP < 12 min.
Als Pilotstudie zur Machbarkeitsdemonstration des Protokolls wurden 10 repräsentative Proben ausgewählt, um die Bandbreite klinischer Szenarien in der Intensivmedizin zu veranschaulichen, darunter 6 Bronchialaspirate (BAS), 2 Bronchoalveolärlavageflüssigkeiten (BALF) und 2 tiefe Sputumproben (Spt). Diese Proben wurden gezielt so gewählt, dass sowohl monomikrobielle als auch komplexe polymikrobielle Fälle abgedeckt wurden, um nicht die Prävalenz von Erregern abzuschätzen; 8 der 10 Proben waren polymikrobiell (jeweils 2 bis 7 Erreger) und 2 monomikrobiell. Die vollständigen TP-Daten sind in Tabelle 5 dargestellt, und repräsentative Amplifikationskurven sind in Abbildung 4 gezeigt.
An einem Ende der Komplexitätsskala ergab Probe S1 (BAS) ein einziges positives Signal für Aspergillus spp. (TP = 8 min), während alle bakteriellen Kanäle negativ blieben. Dieses Muster entsprach einer isolierten invasiven Aspergillose, eine Diagnose, die mittels konventioneller Kultur häufig nicht rechtzeitig erkannt wird. Probe S10 (Spt) lieferte ebenfalls ein einziges positives Ergebnis für Streptococcus pneumoniae (TP = 5,5 min). Diese Befunde belegten die Fähigkeit des Assays, monomikrobielle Infektionen vor dem Hintergrund von 15 Pathogenzielen zu identifizieren.
Polymikrobielle Infektionen wurden in den verbleibenden Proben beobachtet, was mit der Epidemiologie von Atemwegsinfektionen bei auf der Intensivstation behandelten Patienten übereinstimmt. Die Proben S2–S5 enthielten jeweils Aspergillus spp. zusammen mit einem oder mehreren bakteriellen Erregern und in zwei Proben zusätzlich Candida albicans. Die komplexeste Probe, S5 (BALF), ergab sieben gleichzeitige positive Signale, darunter Aspergillus spp., Burkholderia cepacia, Corynebacterium striatum, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus und Stenotrophomonas maltophilia. Diese Ergebnisse belegten die Multiplex-Nachweisfähigkeit des 16-Kanal-Mikrofluidikchips unter klinischen Testbedingungen.
Die Proben S6–S9, die bakterielle Co-Infektionen ohne Beteiligung von Pilzen enthielten, reichten von der Detektion zweier Krankheitserreger (S6: B. cepacia und E. coli) bis hin zur Detektion von vier Krankheitserregern (S8: Acinetobacter baumannii, B. cepacia, Klebsiella pneumoniae und S. maltophilia). Bei allen 10 Proben lagen die TP-Werte für positive Kanäle zwischen 3,5 und 9 Minuten, und alle internen Kontrollkanäle erfüllten das vorab definierte Gültigkeitskriterium von TP < 12 min.
Für diesen Pilotversuch wurden die Ergebnisse des Chips mit zwei Referenzmethoden verglichen, die parallel an denselben 10 Proben durchgeführt wurden: zielgerichtete metagenomische Next-Generation-Sequenzierung (tNGS) und konventionelle Sputumkultur. Die übereinstimmung pro Ziel für die 15 Pathogenkanäle ist in Tabelle 6 zusammengefasst. Im Vergleich zu tNGS zeigte der Test eine positive prozentuale Übereinstimmung (PPA) von 100 % und eine negative prozentuale Übereinstimmung (NPA) von 100 % für alle Ziele in diesen Proben. Im Vergleich zur Sputumkultur betrug die PPA 100 % für jedes kulturpositive Ziel, während die NPA zwischen 44,4 % und 100 % lag; die niedrigeren NPA-Werte spiegelten Ziele wider, die mittels Chip (und tNGS) nachgewiesen wurden, aber in der Kultur nicht angezüchtet werden konnten, was mit der höheren analytischen Empfindlichkeit der Nukleinsäureamplifikation im Vergleich zur Kultur und nicht mit falsch-positiven Ergebnissen übereinstimmt. Aufgrund der kleinen, gezielt ausgewählten Stichprobe sind diese Werte beschreibende Übereinstimmungsschätzungen für die Pilotkohorte und nicht als formale Maße der diagnostischen Genauigkeit gedacht. Da tNGS selbst eine nukleinsäurebasierte Methode ist, bestätigt die Übereinstimmung mit tNGS die Kongruenz auf Ebene der Nukleinsäuren, ohne den klinischen Status jedes Erregers zu belegen; keines der beiden Verfahren kann allein eine echte Infektion von einer Besiedlung unterscheiden.
Abbildung 1: Architektur des mikrofluidischen Chips und zugehörige Verbrauchsmaterialien. (A) Übersicht über den 86 mm großen Scheibenchip mit drei konzentrischen Zonen: einem Ladebereich, einem mittleren Bereich zur magnetischen Bead-Reinigung und einem äußeren Bereich für Amplifikation und Detektion. (B) Äußerer Amplifikationsring mit den 16 Reaktionsgefäßen (Positionen 1, 4, 8, 12 und 16 gekennzeichnet). (C) Komponenten des Lyseröhrchens (Spitzenkappe, Verschlusskappe und Röhrchenkörper). (D) Einzeldosis-Reagenzienfläschchen „O“ und „B“. (E) Ladebereich mit Probenloch „S“ sowie Reagenzienlöchern „O“ und „B“. Abkürzungen: O = Reagenz O; B = Reagenz B; S = Probe. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 2: Vorbereitungskit und Workflow zur Proben-Vorbehandlung. (A) Die Probe wird in das Verflüssigungsgefäß überführt und durch manuelles Schütteln homogenisiert. (B) Die homogenisierte Probe wird aus dem Verflüssigungsgefäß in das Lysiergefäß überführt. (C) Das Lysiergefäß wird in die Vorbehandlungsvorrichtung (SP) für den automatisierten Verflüssigungs-Lyse-Zyklus eingesetzt. (D) Verbrauchsmaterialien für die Vorbehandlung: die Einweg-Pipetten #1 und #2 (rote Pfeile zeigen die Befüllmarkierungen), das Lysiergefäß und das Verflüssigungsgefäß. Abkürzung: SP = Proben-Vorbehandlung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 3: Chip-Beladung und automatisierter Nachweisablauf. (A) Die Reagenzfläschchen O und B sowie die aufgearbeitete Probe werden in die entsprechenden Chip-Anschlüsse (O, B und S) geladen. (B) Der Chip wird zusammengebaut und verschlossen. (C) Der Chip wird am automatisierten Nukleinsäureanalysator befestigt und der Barcode wird gescannt. (D) Der Lauf wird über den Touchscreen gestartet, woraufhin die Nukleinsäure-Extraktion, -Amplifikation und Fluoreszenzdetektion automatisch ablaufen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 4: Repräsentative Amplifikationskurven aus 10 Atemwegsproben von Intensivpatienten. Jedes Diagramm stellt eine einzelne Probe dar (S1–S10). S-förmige Amplifikationskurven zeigen positive Zielstrukturen mit angegebenen TP-Werten an, während flache Kurvenverläufe negative Zielstrukturen anzeigen. Probe S1 enthielt ausschließlich Aspergillus spp.; die Proben S2–S5 enthielten Aspergillus spp. zusammen mit bakteriellen Erregern und/oder Candida albicans; die Proben S6–S9 wiesen polymikrobielle bakterielle Infektionen auf; und Probe S10 enthielt ausschließlich Streptococcus pneumoniae. Die entsprechenden TP-Werte sind in Tabelle 5 angegeben. Abkürzungen: Aba = Acinetobacter baumannii; Asp = Aspergillus spp.; Bcc = Burkholderia cepacia; Cal = Candida albicans; Cst = Corynebacterium striatum; Eco = Escherichia coli; Hin = Haemophilus influenzae; IC = interne Kontrolle; Kpn = Klebsiella pneumoniae; Lpn = Legionella pneumophila; Mpn = Mycoplasma pneumoniae; Pae = Pseudomonas aeruginosa; Pji = Pneumocystis jirovecii; Sau = Staphylococcus aureus; Sma = Stenotrophomonas maltophilia; Spn = Streptococcus pneumoniae. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
| Vertiefung | Ziel | Abkürzung | Kategorie | Typ |
| 1 | Acinetobacter baumannii | Aba | Bakterien | Bakterium |
| 2 | Aspergillus spp. | Asp | Pilze | Pilz |
| 3 | Burkholderia cepacia | Bcc | Bakterien | Bakterium |
| 4 | Candida albicans | Cal | Pilze | Pilz |
| 5 | Corynebacterium striatum | Cst | Bakterien | Bakterium |
| 6 | Escherichia coli | Eco | Bakterien | Bakterium |
| 7 | Haemophilus influenzae | Hin | Bakterien | Bakterium |
| 8 | Klebsiella pneumoniae | Kpn | Bakterien | Bakterium |
| 9 | Legionella pneumophila | Lpn | Bakterien | Bakterium |
| 10 | Mycoplasma pneumoniae | Mpn | Atypisch | Atypisches Bakterium |
| 11 | Pseudomonas aeruginosa | Pae | Bakterien | Bakterium |
| 12 | Pneumocystis jirovecii | Pji | Pilze | Pilz |
| 13 | Staphylococcus aureus | Sau | Bakterien | Bakterium |
| 14 | Stenotrophomonas maltophilia | Sma | Bakterien | Bakterium |
| 15 | Streptococcus pneumoniae | Spn | Bakterien | Bakterium |
| 16 | NBPF (interner Kontrollpunkt) | IC | interner Kontrollpunkt | Interne Kontrolle |
Tabelle 1: Zielpathogen-Panel und Zuteilung der Reaktionsgefäße.
| Verbrauchsmaterial | Spezifikation / Volumen | Funktion |
| Liquefaktionsröhrchen | 2 mL/Röhrchen | Empfängt Probe; manuelle Homogenisierung |
| Lysieröhrchen | 0,5 mL/Röhrchen | Druckverformbarer Silikonkörper mit 200 µm Filtermembran; vorbeladen mit Lysereagenzien |
| #1 Einwegpipette | 0,5 mL | Überträgt homogenisierte Probe in das Lysieröhrchen |
| #2 Einwegpipette | 2 mL | Aspiriert Probe bis zur Markierungslinie in das Liquefaktionsröhrchen |
Tabelle 2: Spezifikationen der Verbrauchsmaterialien, die während der Probenvorverarbeitung verwendet wurden.
| Schritt | Temperatur | Dauer |
| Verflüssigung | 50 °C | 10 min |
| Pathogenlyse | 95 °C | 5 min |
| Gesamtzyklus | — | ~15 min |
Tabelle 3: Betriebsparameter des Proben-Vorverarbeitungs-(SP-)Gerätezyklus.
| Ziel | TP-Schwellenwert (min) | Klassifizierungsregel |
| Acinetobacter baumannii | 13 | TP ≤ Schwellenwert = positiv |
| Aspergillus spp. | 15,5 | TP ≤ Schwellenwert = positiv |
| Burkholderia cepacia | 12,5 | TP ≤ Schwellenwert = positiv |
| Candida albicans | 13,5 | TP ≤ Schwellenwert = positiv |
| Corynebacterium striatum | 13 | TP ≤ Schwellenwert = positiv |
| Escherichia coli | 12 | TP ≤ Schwellenwert = positiv |
| Haemophilus influenzae | 13,5 | TP ≤ Schwellenwert = positiv |
| Klebsiella pneumoniae | 15,5 | TP ≤ Schwellenwert = positiv |
| Legionella pneumophila | 14,5 | TP ≤ Schwellenwert = positiv |
| Mycoplasma pneumoniae | 14 | TP ≤ Schwellenwert = positiv |
| Pseudomonas aeruginosa | 12 | TP ≤ Schwellenwert = positiv |
| Pneumocystis jirovecii | 14,5 | TP ≤ Schwellenwert = positiv |
| Staphylococcus aureus | 15,5 | TP ≤ Schwellenwert = positiv |
| Stenotrophomonas maltophilia | 12 | TP ≤ Schwellenwert = positiv |
| Streptococcus pneumoniae | 14,5 | TP ≤ Schwellenwert = positiv |
| NBPF (interner Kontrollpunkt) | 12 | Lauf gültig, wenn TP < 12 min |
Tabelle 4: TP-Schwellenwerte, die für die Zielklassifizierung verwendet wurden.
| Probe | Typ | Nachgewiesenes Target | TP (min) | Kultur / tNGS (Reads) |
| S1 | BAS | Aspergillus spp. | 8 | + / 1,253 |
| S2 | BAS | Aspergillus spp. | 7,5 | – / 3,877 |
| Pseudomonas aeruginosa | 4 | + / 55,039 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 6,5 | – / 3,087 | ||
| S3 | BAS | Aspergillus spp. | 5,5 | + / 6,145 |
| Burkholderia cepacia | 6 | – / 3,221 | ||
| Candida albicans | 7,5 | – / 3,280 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 6 | + / 13,189 | ||
| S4 | BALF | Acinetobacter baumannii | 6,5 | + / 10,485 |
| Aspergillus spp. | 7,5 | – / 4,432 | ||
| Burkholderia cepacia | 5,5 | – / 1,676 | ||
| Candida albicans | 8,5 | – / 576 | ||
| S5 | BALF | Aspergillus spp. | 7,5 | + / 2,869 |
| Burkholderia cepacia | 4 | – / 6,532 | ||
| Corynebacterium striatum | 5,5 | – / 71,839 | ||
| Escherichia coli | 7 | – / 1,891 | ||
| Pseudomonas aeruginosa | 4 | + / 31,386 | ||
| Staphylococcus aureus | 6,5 | – / 26,683 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 4 | + / 21,467 | ||
| S6 | BAS | Burkholderia cepacia | 5,5 | – / 1,984 |
| Escherichia coli | 5,5 | + / 8,005 | ||
| S7 | BAS | Acinetobacter baumannii | 5,5 | + / 28,007 |
| Burkholderia cepacia | 4 | + / 3,585 | ||
| Haemophilus influenzae | 6,5 | – / 8,912 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 6 | – / 8,865 | ||
| S8 | BAS | Acinetobacter baumannii | 5,5 | – / 43,721 |
| Burkholderia cepacia | 4 | – / 53,796 | ||
| Klebsiella pneumoniae | 3,5 | + / 23,757 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 4 | – / 26,898 | ||
| S9 | Spt | Haemophilus influenzae | 9 | – / 3,636 |
| Staphylococcus aureus | 8,5 | + / 1,918 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 8,5 | – / 872 | ||
| S10 | Spt | Streptococcus pneumoniae | 5,5 | – / 29,893 |
Tabelle 5: Nachweisergebnisse und TP-Werte für 10 repräsentative Atemwegsproben aus den unteren Atemwegen, die von auf der Intensivstation behandelten Patienten gesammelt wurden.
| Ziel | tNGS + | POCT + | tNGS − | POCT − | PPA | NPA | (SC) PPA/NPA |
| Acinetobacter baumannii | 3 | 3 | 7 | 7 | 100% | 100% | 100% / 87,5% |
| Aspergillus spp. | 5 | 5 | 5 | 5 | 100% | 100% | 100% / 71,4% |
| Burkholderia cepacia | 6 | 6 | 4 | 4 | 100% | 100% | 100% / 44,4% |
| Candida albicans | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | – / 80,0% |
| Corynebacterium striatum | 1 | 1 | 9 | 9 | 100% | 100% | 100% / 100% |
| Escherichia coli | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | 100% / 88,9% |
| Haemophilus influenzae | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | – / 80,0% |
| Klebsiella pneumoniae | 1 | 1 | 9 | 9 | 100% | 100% | 100% / 100% |
| Legionella pneumophila | 0 | 0 | 10 | 10 | – | 100% | – / 100% |
| Mycoplasma pneumoniae | 0 | 0 | 10 | 10 | – | 100% | – / 100% |
| Pseudomonas aeruginosa | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | 100% / 100% |
| Pneumocystis jirovecii | 0 | 0 | 10 | 10 | – | 100% | – / 100% |
| Staphylococcus aureus | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | 100% / 88,9% |
| Stenotrophomonas maltophilia | 6 | 6 | 4 | 4 | 100% | 100% | 100% / 50,0% |
| Streptococcus pneumoniae | 1 | 1 | 9 | 9 | 100% | 100% | – / 90,0% |
Tabelle 6: Übereinstimmung pro Zielorganismus zwischen dem Testverfahren und der gezielten metagenomischen Next-Generation-Sequenzierung (tNGS) sowie der konventionellen Sputumkultur für die 10 repräsentativen Proben. Für jedes der 15 pathogenen Zielorganismen sind die Anzahl der positiven und negativen Ergebnisse je Methode sowie die sich ergebende prozentuale Übereinstimmung bei positiven (PPA) und negativen (NPA) Ergebnissen angegeben. Abkürzungen: PPA = prozentuale Übereinstimmung bei positiven Ergebnissen; NPA = prozentuale Übereinstimmung bei negativen Ergebnissen; tNGS = gezielte metagenomische Next-Generation-Sequenzierung; PPA/NPA wird als „/“ angezeigt, wenn keine positiven (bzw. negativen) Referenzergebnisse verfügbar waren.
| Nr. | Pathogen | NA (Kopien/mL) |
| 1 | Acinetobacter baumannii | 1,000 |
| 2 | Aspergillus spp. | 2,000 |
| 3 | Burkholderia cepacia | 2,000 |
| 4 | Candida albicans | 1,000 |
| 5 | Corynebacterium striatum | 1,000 |
| 6 | Escherichia coli | 4,000 |
| 7 | Haemophilus influenzae | 2,000 |
| 8 | Klebsiella pneumoniae | 4,000 |
| 9 | Legionella pneumophila | 2,000 |
| 10 | Mycoplasma pneumoniae | 1,000 |
| 11 | Pseudomonas aeruginosa | 2,000 |
| 12 | Pneumocystis jirovecii | 1,000 |
| 13 | Staphylococcus aureus | 2,000 |
| 14 | Stenotrophomonas maltophilia | 2,000 |
| 15 | Streptococcus pneumoniae | 4,000 |
| 16 | Interner Kontrollstamm (NBPF) | Nicht zutreffend (interne Kontrolle) |
Tabelle 7: Analytische Nachweisgrenze (LoD) für jedes Panel-Ziel. Die LoD wurde mithilfe digital-PCR-quantifizierter genomischer Nukleinsäure ermittelt, die in eine negative Matrix aus Bronchoalveolärflüssigkeit eingearbeitet, seriell verdünnt und in dreifachen Ansätzen getestet wurde, und definiert als die niedrigste Konzentration, die in mindestens 95 % der Replikate nachgewiesen wurde. Die Werte sind in Kopien/mL angegeben. Abkürzung: LoD = Nachweisgrenze.
| Dimension | POCT (dieser Test) | Sputumkultur | Konventionelle PCR | mNGS |
| Durchlaufzeit | ~1 h | 2–5 Tage | 4–8 h | > 24 h |
| Erforderliche Fachkenntnisse des Bedieners | Niedrig | Hoch | Hoch | Hoch |
| Laboranforderung | Niedrig; am Bett | Hoch; bakteriologisches Labor | Hoch; PCR-Labor | Hoch; spezialisierte Einrichtung |
| Ausstattungsinvestition | Niedrig bis moderat | Niedrig | Moderat | Hoch |
| Kosten pro Test | Moderat | Niedrig | Moderat | Hoch |
| Analytische Empfindlichkeit | Hoch | Niedrig | Hoch | Hoch |
| Hauptsächlicher Vorteil | Vollständig integriert, Probeneingabe/Ergebnisausgabe, keine spezielle Bedienung erforderlich | Referenzstandard; liefert Empfindlichkeitsdaten | Hohe Empfindlichkeit; quantitativ | Unvoreingenommen; erfasst seltene oder unerwartete Erreger; klärt schwierige Fälle auf |
Tabelle 8: Qualitativer Vergleich des vorliegenden Point-of-Care-Assays mit Sputumkultur, konventioneller PCR und metagenomischer Sequenzierung. Die Methoden werden hinsichtlich Durchlaufzeit, erforderlichem Bedienerfachwissen, Laborinfrastruktur, Geräteinvestitionen, Kosten pro Test, analytischer Sensitivität und wesentlicher Vorteile verglichen. Abkürzungen: POCT = Point-of-Care-Testung; PCR = Polymerase-Kettenreaktion; mNGS = metagenomische Next-Generation-Sequenzierung.
Diskussion
Die schnelle Identifizierung von Krankheitserregern ist entscheidend für das Infektionsmanagement auf Intensivstationen. Das hier beschriebene System verkürzt die Zeit bis zur Identifizierung des Erregers von den üblicherweise für Kulturen erforderlichen 3 bis 5 Tagen auf weniger als 1 Stunde, also auf einen Zeitraum, in dem häufig bereits Entscheidungen über antimikrobielle Erstlinientherapien getroffen werden7. Durch die Integration der Nukleinsäure-Extraktion, -Reinigung und der 16-fachen LAMP-Amplifikation auf einem einzigen geschlossenen Chip entfällt der manuelle DNA-Extraktionsschritt, der bisher das wesentliche betriebliche Engpass bei früheren LAMP-Chip-Plattformen darstellte15. Das Ergebnis ist ein einziger Ladevorgang, der von Personal ohne spezielle Schulung in Molekularbiologie durchgeführt werden kann.
Mehrere prozedurale Aspekte erfordern besondere Aufmerksamkeit. Die Probengüte ist entscheidend. Tiefe Atemwegsproben, wie Bronchialaspirat oder Bronchoalveolärlavageflüssigkeit, sind bei beatmeten Patienten dem ausgeworfenen Sputum vorzuziehen, da eine oropharyngeale Kontamination bei diesen das Signal des eigentlichen Erregers überlagern kann. Eine unvollständige Verflüssigung ist die häufigste Ursache für eine suboptimale Lyse; das manuelle Schütteln sollte daher so lange fortgesetzt werden, bis die Probe eindeutig eine wässrige Konsistenz erreicht hat. Während des Beladens des Chips kann das unvollständige Entleeren entweder des Reagenzglases oder des Lyserohrs bewirken, dass den nachgeschalteten Vertiefungen das erforderliche Ausgangsmaterial fehlt, was zu kanalspezifischen Fehlschlägen führen kann, die fälschlicherweise als negative Ergebnisse interpretiert werden. Zudem ist das zweistufige Schließen der Chipkappe nicht nur eine mechanische Funktion; es ist notwendig, um den geschlossenen Kopfraum aufrechtzuerhalten, der für die isotherme Amplifikation erforderlich ist, und um Verdunstungsverluste zu verhindern.
Die Fehlersuche ist relativ einfach. Stark viskoses ICU-Sputum erfordert möglicherweise ein manuelles Schütteln über einen längeren Zeitraum als die empfohlene Dauer von 1 Minute. Verdünnte Proben, insbesondere Bronchoalveoläres Lavagefluid, erfordern möglicherweise die doppelte standardmäßige Pipettiermenge, um eine geringere Pathogendichte auszugleichen. Das Versagen der internen Kontrolle, definiert als Fehlen einer S-förmigen Amplifikationskurve oder ein TP-Wert von mehr als 12 Minuten, weist entweder auf unzureichende Zellulärität der Probe oder auf eine Fluidikstörung innerhalb des Chips hin. In solchen Fällen ist die angemessene Maßnahme, eine neue Probe zu entnehmen oder die Untersuchung mit einem neuen Chip zu wiederholen, anstatt einzelne Kanäle neu zu interpretieren.
Diese Methode weist jedoch auch wichtige Einschränkungen auf. Das Panel ist auf 15 vordefinierte Zielstrukturen beschränkt, und Organismen außerhalb dieser Liste, einschließlich vieler antimikrobieller Resistenzdeterminanten, können nicht nachgewiesen werden. Jeder Primeransatz zielt auf einen konservierten, artenspezifischen Bereich des jeweiligen Organismus ab, mit Ausnahme des gattungsspezifischen Aspergillus-Assays; daher werden Arten oder Stämme, die im Panel nicht vertreten sind, nicht detektiert, und intraspezifische Variationen auf Stamm-Ebene werden vom Panel nicht erfasst. Da jede der 16 Vertiefungen einen spezifischen lyophilisierten Primeransatz enthält, ist das Panel modular aufgebaut und kann in zukünftigen Versionen umkonfiguriert werden, um zusätzliche Zielstrukturen aufzunehmen.
Das Testergebnis ist qualitativ. Obwohl die TP-Werte eine lose Beziehung zur Pathogenlast aufweisen können, können sie quantitative Kulturergebnisse oder auf Zyklusschwellenwerten basierende PCR-Schätzungen nicht ersetzen. Wie bei jedem Nukleinsäureamplifikationstest, der an Atemwegsproben durchgeführt wird, kann der Assay allein keine Unterscheidung zwischen Besiedlung und echter Infektion treffen. Die klinische Interpretation muss daher die Chip-Ergebnisse mit entzündungsmarker wie C-reaktivem Protein und Procalcitonin, bildgebenden Befunden, Pilz-Biomarkern wie Galaktomannan und (1,3)-β-D-Glucan sowie dem gesamten klinischen Verlauf kombinieren. Zudem liefert das System keine Daten zur antimikrobiellen Empfindlichkeit, und die konventionelle Kultur bleibt für diesen Zweck unverzichtbar.
Abschließend wurden alle in dieser Studie enthaltenen Proben aus einer einzigen Intensivstation der Tertiärversorgung gewonnen, und die Prävalenz von Krankheitserregern sowie Muster von Co-Infektionen können zwischen verschiedenen Einrichtungen und Patientenpopulationen variieren. Die vorliegende Arbeit sollte daher als Pilotstudie verstanden werden, die den Nachweis des Konzepts an einem kleinen, gezielt ausgewählten Satz repräsentativer Proben demonstriert; sie war nicht darauf ausgelegt, die diagnostische Genauigkeit zu ermitteln. Die klinische Sensitivität und Spezifität pro Ziel sowie die systematische Übereinstimmung mit der konventionellen Kultur und der metagenomischen Next-Generation-Sequenzierung (mNGS) werden in einer geplanten prospektiven, multizentrischen Studie mit konsekutiv rekrutierten Teilnehmern etabliert.
Als erste Maßnahme zur Beurteilung der analytischen Leistungsfähigkeit wurde die Nachweisgrenze (LoD) für jedes Ziel mittels digitaler PCR-quantifizierter genomischer Nukleinsäure bestimmt, die in eine negative Matrix aus Bronchoalveolärflüssigkeit eingefügt wurde. Die Proben wurden seriell verdünnt und in dreifacher Ausführung getestet. Die LoD wurde als die niedrigste Konzentration definiert, die in mindestens 95 % der Wiederholungen nachgewiesen wurde. Die ermittelten LoD-Werte lagen je nach Nachweis zwischen 1.000 und 4.000 Kopien/mL (Tabelle 7). Da in dieser Pilotstudie keine quantitativen Angaben auf Basis von Koloniezählungen für die einzelnen Organismen verfügbar waren, werden diese LoD-Schätzungen in zukünftigen Arbeiten mit formal aufgezählten Referenzstämmen präzisiert.
Der Vergleich mit bestehenden diagnostischen Ansätzen verdeutlicht weiter die Stellung dieser Plattform. Die konventionelle Kultur ist zwar langsam, bleibt aber der Referenzstandard und liefert Informationen zur Empfindlichkeit. Die metagenomische Sequenzierung der nächsten Generation bietet eine deutlich umfassendere Abdeckung von Organismen, ist jedoch mit erheblich höheren Kosten, längeren Durchlaufzeiten (typischerweise 24–48 h) und einem Bioinformatikaufwand verbunden, den viele Intensivstationen vor Ort nicht bewältigen können9. Standardisierte multiplex PCR-Panels verkürzen die Zeit bis zum Ergebnis, erfordern aber in der Regel weiterhin eine separate Nukleinsäure-Extraktion und je nach Plattform eine Batch-Verarbeitung, die zusätzliche Verzögerungen verursachen kann10.
Aus Kostensicht, obwohl eine formale Kosten-Nutzen-Analyse außerhalb des Rahmens dieser Pilotstudie lag, adressiert die Plattform die wichtigsten realen Kostenfaktoren auf der Intensivstation, einschließlich Kultur und konventioneller oder multiplexer PCR (ein qualitativer Vergleich der Methoden ist in Tabelle 8 dargestellt). Sie liefert Ergebnisse innerhalb von etwa 1 h, verglichen mit 2–5 Tagen bei Sputumkultur, 4–8 h bei konventioneller PCR (die in der Regel eine Batch-Verarbeitung erfordert) und >24 h bei metagenomischem Sequenzieren. Da der Workflow vollständig integriert ist („sample-in, result-out“), ist nur ein einziger manueller Ladeschritt erforderlich, es ist keine separate Nukleinsäure-Extraktion nötig, die Durchführung ist am Bettplatz ohne spezialisiertes bakteriologisches oder molekularbiologisches Labor sowie ohne Fachpersonal aus dem Bereich der Molekularbiologie möglich, und es wird eine geschlossene Einweg-Kassette verwendet, wodurch kontaminationsbedingte Wiederholungstests reduziert werden. Auch die Gerätekosten sind gering, da weder ein Echtzeit-PCR-Gerät noch eine Sequenzierplattform benötigt werden. Für schwer kranke Intensivpatienten könnte diese schnelle Durchlaufzeit die Dauer einer unangemessenen empirischen Therapie verkürzen und den Krankenhausaufenthalt verkürzen, was einen indirekten, aber möglicherweise erheblichen Kostenvorteil darstellt.
Das vorliegende System nimmt eine eindeutig abgegrenzte Nische ein, die durch schnelle Durchlaufzeiten, einfache Handhabung und die biosichere geschlossene Kartusche definiert ist, Eigenschaften, die gemeinsam eine Anwendung am Krankenbett ermöglichen. Die Einbeziehung von drei Pilzzielen ist eine besonders wichtige Eigenschaft. Aspergillus-Arten wurden in 5 der 10 Proben nachgewiesen (TP-Bereich: 5,5–8 min). Angesichts der bekannten Grenzen der Kultur und des engen diagnostischen Zeitfensters der Galaktomannan-Testung für Aspergillus5,6 könnte ein molekularer Nachweis innerhalb von 45 Minuten eine frühzeitige Einleitung einer gezielten antifungalen Therapie ermöglichen, obwohl der klinische Nutzen dieses früheren Nachweises in prospektiven Studien noch belegt werden muss.
Mehrere zukünftige Entwicklungen liegen auf der Hand. Die Erweiterung des Panels, um zumindest wichtige Resistenzdeterminanten wie Carbapenemase-Gene und mecA einzuschließen, würde dazu beitragen, die Lücke zwischen der Pathogenerkennung und der empirischen antimikrobiellen Therapiewahl zu schließen. Darüber hinaus könnten maschinelle Lernmodelle, die auf gepaarten Amplifikationsprofilen und klinischen Metadaten trainiert sind, mit wachsendem Umfang der TP-Datensätze langfristig helfen, eine Kolonisation von einer echten Infektion zu unterscheiden, obwohl solche Anwendungen eine sorgfältige prospektive Validierung erfordern werden. Allgemeiner formuliert wird eine multizentrische Evaluation über geografisch unterschiedliche Intensivpatientenpopulationen notwendig sein, bevor die diagnostische Leistungsfähigkeit dieser Plattform als verallgemeinerbar angesehen werden kann.
Offenlegungen
Die Autoren geben keine Wettbewerbsinteressen an.
Danksagungen
Nichtübertragbare chronische Krankheiten – Nationales Wissenschafts- und Technologiemajorprojekt (Nr. 2023ZD0516500), Finanzierung für klinische Forschung an Hochschulen auf höchstem Niveau (2026-PUMCH-A-103) und CMB-Programm für offene Wettbewerbe (24-561) sowie Programm zur Förderung des wissenschaftlichen Nachwuchses am Peking Union Medical College Hospital (Nr. UGG11571).
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Automatischer Nukleinsäure-Analysator | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-T80-01 | TurboFlow T; führt zentrifugale Reagenzverteilung, magnetische Bead-Extraktion, LAMP durch bei 65 °Cund Echtzeit-Fluoreszenznachweis (~45 min Laufzeit) |
| #1 Einweg-Pasteurpipette | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Maßgefertigt | Einwegverbrauchsmaterial; 0,5 mL; überträgt homogenisiertes Probenmaterial in Lysepipette |
| #2 Einweg-Pasteurpipette | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Maßgefertigt | Einwegverbrauchsmaterial; 2 mL; aspiriert Probe bis zur Markierungslinie in das Verflüssigungsrohr |
| CD-Chip | Beijing Hongyang Chensheng Technology Co., Ltd | Maßgefertigt | Einwegverbrauchsmaterial; 86-mm-Scheibe mit zentralem Ladebereich (Anschlüsse O, B, S), Bereich für die Magnetkügelchen-Reinigung und äußerem Ring mit 16 Reaktionsgefäßen (15 Pathogen-Ziele + NBPF-Interner Kontrollbereich) |
| LAMP-Reaktionsreagenzien | Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | 16730ES80 | LAMP-Reaktionsreagenzien als lyophilisierte Kügelchen in CD-Chip vorgelagert |
| Verflüssigungsgefäß | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Maßgefertigt | Einwegverbrauchsmaterial; 2 mL/Röhrchen; dient zum Aufnehmen der Probe zur manuellen Homogenisierung |
| Lyseröhrchen | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Maßgefertigt | Einwegverbrauchsmaterial; 0,5 mL/Röhrchen; komprimierbarer Silikonkörper mit 200 µm Filtermembran; vorbeladene Lysereagenzien |
| Primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | Maßgefertigt | Primergemisch in der Reaktionskammer des CD-Chips eingebettet |
| Vorverarbeitungseinrichtung für Proben | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-R10-02 | TS-2000; automatisierte Verflüssigung–Lysezyklus (~15 min) |
| Einmaldosisfläschchen “B” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Maßgefertigt | Einwegverbrauchsmaterial; vorverpacktes Reagenz auf Chip; je Test eines erforderlich; Lagerung bei 4 °C und auf Raumtemperatur (~25 °C) vor dem Beladen |
| Einmaldosisfläschchen “O” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Maßgefertigt | Einwegverbrauchsmaterial; vorverpacktes Reagenz auf Chip; je Test eines erforderlich; Lagerung bei 4 °C und auf Raumtemperatur (~25 °C) vor dem Beladen |
Referenzen
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