Untersuchung von Zielen für Herzinsuffizienz mittels Mendelscher Randomisierung, Kolokalisierung, zusammenfassender datenbasierter Mendelscher Randomisierung und Arzneimittelvorhersage

Zusammenfassung

Diese Studie identifizierte durch genetische Analysen acht potenzielle Medikamentenziele für Herzinsuffizienz und untersuchte potenzielle therapeutische Verbindungen, die mit diesen Zielen assoziiert sind.

Zusammenfassung

Herzinsufficienz (HF) ist eine weit verbreitete Herz-Kreislauf-Erkrankung, die die Lebensqualität in fortgeschrittenen Stadien erheblich beeinträchtigt. Trotz verschiedener aktueller Behandlungsstrategien bleibt die Krankheitslast durch HF erheblich. Daher ist dringend die Erforschung neuer therapeutischer Ziele erforderlich. Diese Studie nutzte Mendelsche Randomisierung (MR), um die kausalen Zusammenhänge zwischen medikamentenfähigen Genen und HF zu bewerten. Kolokalisationsanalyse und zusammenfassende, datenbasierte Mendelsche Randomisierung (SMR) wurden durchgeführt, um die Beziehung zwischen ihnen weiter zu validieren. Schließlich wurden 8 potenzielle therapeutische Ziele für HF identifiziert, darunter 4 Risikofaktoren (CYP11A1, GALT, KCNH2 und METRN) und 4 Schutzfaktoren (APOM, CHD4, IL11RA und LPAR5). Die Analyse des GO-Anreicherungs, der KEGG-Anreicherung und des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks (PPI) zeigten, dass diese Gene hauptsächlich an der Stoffwechselregulation und an den elektrophysiologischen Verfahren des Herzens beteiligt sind. Darüber hinaus wurden potenzielle Medikamente, die auf diese Ziele abzielen, mittels Arzneimittelvorhersage und molekularer Andockung identifiziert, darunter Mitotan, Adehl, Benzofurane, 1,3-Di-o-Tolylguanidin, 96-69-5 und Bromoenol-Lacton. Darüber hinaus zeigten PCR-Ergebnisse auch, dass Mitotan mit CYP11A1 und KCNH2 assoziiert sein könnte. Medikamente, die auf diesen potenziellen therapeutischen Zielen basieren, können höhere Erfolgsraten bieten und klinische Ergebnisse verbessern.

Einleitung

Herzinsuffizienz (HF) ist ein verbreitetes kardiovaskuläres Syndrom, das durch eine beeinträchtigte ventrikuläre Füllung oder Myokardkontraktilität gekennzeichnet ist, was zu einer unzureichenden Herzzeit führt, um den Stoffwechselbedarf^zu decken ^1,2,3. Klinisch ist HF durch pulmonale und systemische Verstopfung, Gewebeunterspülung sowie Symptome wie Dyspnoe, Müdigkeit und peripheres Ödem ^1,4,5 gekennzeichnet. Trotz therapeutischer Fortschritte bleibt HF weltweit eine führende Ursache für Morbidität und Mortalität und betrifft laut der Global Burden of Disease (GBD)-Studie ^6,7,8 über 64 Millionen Menschen. Die erhebliche Krankheitslast unterstreicht den dringenden Bedarf an neuartigen therapeutischen Strategien.

Aktuelle pharmakologische und gerätebasierte Interventionen bei HF sind durch suboptimale Wirksamkeit und Nebenwirkungen begrenzt, was zu anhaltend hohen Rehospitalisierungsraten und einer beeinträchtigten Lebensqualität beiträgt ^9,10,11,12. Die Identifizierung neuer molekularer Ziele mit kausalen Verbindungen zur HF-Pathogenese ist daher entscheidend für die Verbesserung der klinischen Ergebnisse. Die Integration von Genomik in die Arzneimittelforschung stellt eine äußerst effektive Strategie zur Effizienzsteigerung dar, da genetisch validierte Therapien in klinischen Studien eine signifikant höhere Erfolgsquote zeigen (13,14,15). Darüber hinaus dienen von diesen aktiven Genen codierten Proteine als primäre therapeutische Ziele sowohl für kleine Moleküle als auch für monoklonale Antikörper^16,17.

Jüngste Fortschritte in der Humangenetik haben die Priorisierung von Arzneimittelzielen durch integrative Analyse von genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) und Expression Quantitative Trait Loci (eQTL)-Daten erleichtert. Mendelsche Randomisierung (MR) nutzt genetische Varianten als instrumentelle Variablen, um kausale Effekte zu schätzen und minimiert so die in Beobachtungsstudien innewohnende Stör- und Umgekehrungskausalität^13,14. In Kombination mit Kolokalisierung und summary-based MR (SMR) ermöglicht dieser Ansatz eine robuste Priorisierung von Genen, deren Modulation das Krankheitsrisiko beeinflussen könnte, und bietet eine genetisch verankerte Strategie zur Zielentdeckung 18,19,20. Im Vergleich zu konventionellen Assoziationsstudien überwindet die Integration von MR, SMR und Kolokalisation Stör- und Umkehrkausalität, um robuste kausale Inferenzen zu etablieren. Darüber hinaus filtert dieses Rahmenwerk falsch-positive Signale aus dem Verknüpfungsdisgleichgewicht heraus, indem sichergestellt wird, dass Genexpression und Herzinsuffizienzrisiko dieselbe zugrundeliegende kausale Variante teilen, wodurch die Zielpriorisierung optimiert wird. Es ist erwähnenswert, dass kardiovaskuläre Gewebe zwar eine hohe Spezifität aufweisen, diese Studie jedoch hauptsächlich großflächige Blut-cis-eQTL-Daten verwendet, um die statistische Stärke zu maximieren. Obwohl dieser Ansatz die gewebespezifischen Mechanismen, die der HF innewohnen, möglicherweise nicht vollständig erfasst, dienen blutabgeleitete Varianten als zugängliche Biomarker und liefern robuste Einblicke in systemische genetische Treiber der Krankheit.

In dieser Studie wurden groß angelegte GWAS- und eQTL-Datensätze verwendet, um die kausalen Effekte medikamentöser Gene auf das HF-Risiko zu bewerten. Signifikante Assoziationen wurden durch Kolokalisation und SMR-Analysen weiter validiert. Um die biologischen Funktionen priorisierter Ziele zu erläutern, wurden Gene Ontology (GO) und die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Anreicherungsanalysen sowie Protein-Protein-Interaktionsnetzwerkanalysen (PPI) durchgeführt. Das therapeutische Potenzial wurde anschließend durch Arzneimittelvorhersage und molekulare Andockung bewertet. Schließlich wurden die Assoziationen zwischen ausgewählten medikamentösen Genen und Kandidaten durch In-vitro-Experimente validiert.

Abschließend liefert diese Studie wichtige Erkenntnisse für die Entdeckung neuer therapeutischer Ziele für HF. Durch den Einsatz von MR, SMR, Kolokalisationsanalyse, Genanreicherungsanalyse, PPI-Netzwerkaufbau, Arzneimittelvorhersage, molekularem Andocken und In-vitro-Experimenten können diese Ergebnisse zur Entwicklung wirksamerer therapeutischer Strategien für HF beitragen.

Protokoll

Alle in dieser Studie verwendeten Datensätze stammen aus zuvor veröffentlichten Studien mit ethischer Genehmigung. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Studiendesign

Der Arbeitsablauf dieser Studie ist in Abbildung 1 dargestellt. Zunächst wurden Expositionsdaten aus den cis-eQTLs von medikamentösen Genen gewonnen. Zweitens wurde eine MR-Analyse durchgeführt, um die kausale Beziehung zwischen medikamentösen Genen und HF zu untersuchen. Kandidatentherapeutische Ziele für HF wurden anschließend durch Kolokalisations- und SMR-Analysen identifiziert. Anschließend wurden Genanreicherungsanalysen und der Aufbau eines PPI-Netzwerks durchgeführt. Schließlich wurden Arzneimittelvorhersage und molekulares Andocken durchgeführt, um die Affinität von Medikamenten für Gene zu erforschen.

2. Datenquelle

Insgesamt wurden 6.888 drogenfähige Gene aus zwei Quellen identifiziert. Ein Datensatz enthielt 4.463 Gene aus einer zuvor veröffentlichten Studie, die mehrere^Datenquellen integrierte. Der andere Datensatz enthielt 5.012 Gene aus der Drug-Gene Interaction Database (DGIdb)²¹. Detaillierte Informationen wurden auf der Website illustriert (https://www.dgidb.org/). Nach dem Zusammenführen und Entfernen der Duplikate wurden 6.888 eindeutige, medikamentierbare Gene für die Analyse erhalten.

Cis-eQTL-Daten wurden vom eQTLGen-Konsortium (https://eqtlgen.org/cis-eqtls.html) gewonnen, das Expressionsprofile aus 31.684 Blutproben umfasst und 16.987 Gene^umfasst.

HF-Zusammenfassungsstatistiken wurden aus der R12-Veröffentlichung der FinnGen-Datenbank²³ gewonnen, die 37.653 Fälle und 462.695 Kontrollen umfasste. Die Diagnose von HF basierte auf der Internationalen Krankheitsklassifikation (ICD), darunter ICD-10—I11.0, I13.0, I13.2, I50, ICD-9—4029B|428 und ICD-8—42700|42710|428|7824. Alle Teilnehmer waren europäischer Abstammung. Detaillierte Informationen sind auf der FinnGen-Website und im Originalartikel (https://www.finngen.fi/en/access_results) verfügbar.

3. Mendelsche Randomisierungsanalyse

Instrumentale Variablen (IVs) wurden auf Grundlage von drei zentralen MR-Annahmen^{ausgewählt: 24}. Erstens sind IVs direkt mit Expositionsfaktoren verbunden. Zweitens sind IVs nicht mit Störfaktoren verbunden. Schließlich beeinflussen IVs das Ergebnis nur durch Exposition. Da proximale eQTLs eine unmittelbarere und robustere regulatorische Kontrolle über Zielgene ausüben, nutzte MR ausschließlich SNPs, die sich innerhalb von 100 kb-Regionen der Gene befinden, um die biologische Nähe zu maximieren. Für die Auswahl der SNP wurden strenge Kriterien angewandt. Alle ausgewählten SNPs befanden sich innerhalb von 100 kb oberhalb des Transkriptionsstarts und 100 kb stromabwärts des Transkriptionsendpunkts jedes medikamentierbaren Gens. Nur SNPs mit genomweiter Bedeutung (S. < 5×10-8) wurden²⁵ eingeschlossen. Um das Verknüpfungsungleichgewicht (LD) zu minimieren, wurde das LD-Klumpen mit einem^{r2-Schwellenwert} von 0,001 und einem Klumpabstand von 10.000 kb²⁶ durchgeführt. SNPs mit F-Statistik >10 wurden beibehalten und mit der Formel berechnet: F = [R²(N−k−1)]/[k(1−R²)]²⁷. SNP-Informationen finden Sie in ergänzender Tabelle 1.

Die primären analytischen Methoden waren das inverse Varianzgewichtete (IVW) und das Wald-Verhältnis. Ein p-Wert unter 0,05 galt als statistisch signifikant^28,29. Die False Discovery Rate (FDR) wurde angewandt, um den p-Wert so anzupassen, dass falsch-positive Ergebnisse³⁰ minimiert werden. Wenn nur ein SNP verfügbar war, wurde die Wald-Verhältnis-Methode verwendet; ansonsten wurde IVW angewendet. Die Analysen umfassten MR-Egger, gewichteten Median, gewichteten Modus und einfachen Modus, wenn genügend SNPs vorhanden waren.

Der Cochran-Q-Test und die MR-Egger-Intercept-Analyse wurden verwendet, um Heterogenität und Pleiotropie zu testen. Ein Q-p-Wert größer als 0,05 deutete auf das Fehlen von Heterogenität³¹ hin. Ein p-Wert für den MR-Egger-Intercept von weniger als 0,05 zeigte das Vorhandensein einer gerichteten Pleiotropie¹⁸ an. Schließlich wurde der Leave-One-Out-Test durchgeführt, um zu prüfen, ob die Ergebnisse durch eine einzelne SNP beeinflusst werden können. MR-Analysen wurden mit dem TwoSampleMR-Paket (Version 0.6.11) in R (Version 4.4.2) durchgeführt.

4. Kolokalisationsanalyse

Die Kolokalisationsanalyse wurde mit dem Coloc-R-Paket (Version 6.0.1) durchgeführt, um festzustellen, ob geteilte genetische Varianten sowohl die Genexpression als auch das HF-Risiko³² beeinflussen. Die vorherigen Wahrscheinlichkeiten, dass ein SNP mit einem der beiden Eigenschaften und beiden Eigenschaften assoziiert ist, wurden auf 1 × ^10-4 bzw. 1 × ^10-5 gesetzt. Die posterioren Wahrscheinlichkeiten der fünf Hypothesen können berechnet werden: (1) PPH0: SNPs sind nicht mit zwei Merkmalen verbunden. (2) PPH1/PPH2: SNPs sind mit der Genexpression oder HF assoziiert. (3) PPH3: SNPs sind mit HF und Genexpression verknüpft, werden jedoch durch unterschiedliche SNPs gesteuert. (4) PPH4: SNPs sind mit HF und Genexpression verbunden und werden durch die gemeinsamen SNPs gesteuert. Ein PPH4 > 0,8 wurde als Beleg für Kolokalisierung betrachtet.

5. SMR-Analyse

Die SMR-Analyse wurde durchgeführt, um die Beziehung zwischen dem Gen und HF mit der SMR-Software (Version 1.3.1)³³ zu untersuchen. Der Test der Heterogenität in abhängigen Instrumenten (HEIDI) wurde durchgeführt, um festzustellen, ob beobachtete Assoziationen auf eine Verknüpfung zurückzuführen sind. Ein signifikanter SMR-p-Wert (< 0,05) kombiniert mit einem HEIDI-p-Wert > 0,05 wurde als Beweis für eine echte kausale Beziehung und nicht als durch das Verknüpfungsszenario verursachte Assoziation interpretiert. Die detaillierten Betriebsprotokolle und Recheneinstellungen sind auf der offiziellen Website zugänglich.

6. Anreicherungsanalyse

GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen wurden verwendet, um die biologischen Funktionen und Wege der getesteten potenziellen therapeutischen Zielgene³⁴ zu charakterisieren. Die GO-Anreicherung umfasste biologische Prozesse (BP), molekulare Funktionen (MF) und zelluläre Komponenten (CC). Das R-Paket clusterProfiler (Version 4.14.6) und Pathview (Version 1.46.0) wurden zur Durchführung der Anreicherungsanalyse^35,36 verwendet.

7. Kandidat-Arzneimittelprognose

Um potenzielle therapeutische Verbindungen zu identifizieren, wurde eine Arzneimittelprognoseanalyse mit der Drug Signatures Database (DSigDB) (http://dsigdb.tanlab.org/DSigD Bv1.0/)³⁷ durchgeführt. Im DSigDB sind 22.527 Gensätze enthalten, darunter 17.389 einzigartige Verbindungen mit 19.531 Genen. Zusammenhänge zwischen Kandidatengenen und -verbindungen wurden analysiert, gefolgt von einer Anreicherungsanalyse, um potenziell relevante Medikamente zu identifizieren, die auf HF-assoziierte Gene abzielen.

8. Aufbau von Protein-Interaktionsnetzwerken

Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke (PPI) wurden mit GeneMANIA (https://genem ania.org/)³⁸ konstruiert. GeneMANIA könnte helfen, Genfunktionshypothesen zu erstellen, Genlisten zu analysieren und Gene für funktionelle Tests zu priorisieren.

9. Molekulares Andocken

Ein molekulares Andocken wurde durchgeführt, um die Medikamentenfähigkeit der Gene und deren Beziehung zu den Wirkstoffkandidaten zu validieren. Andocksimulationen helfen dabei, die Bindungsaffinität und die Interaktionsmuster zwischen Verbindungen und Zielproteinen zu bewerten und so die Priorisierung und Optimierung der Kandidaten zu unterstützen. Proteinstrukturen wurden aus der Protein Data Bank (PDB) (http://www.rcsb.org/) entnommen, und Verbindungsstrukturen wurden aus PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)³⁹ gewonnen. Das Andocken erfolgte mit CB-Dock2 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php), das mit Hohlraumerkennung das blinde Andocken^40,41 steuert. Detaillierte Betriebsverfahren und Informationen zu Berechnungseinstellungen sind auf der offiziellen Website erhältlich.

10. Zellkultur

Humane immortalisierte Kardiomyozytenzellen (AC16) wurden unter sterilen Bedingungen in einem zellspezifischen Kulturmedium von AC16 kultiviert. Die Zellen wurden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 gehalten. Das Kulturmedium wurde alle 2–3 Tage ersetzt, und die Zellen wurden bei etwa 70–80% Konfluenz durchführt, um optimale Wachstumsbedingungen zu gewährleisten. Zellmorphologie und Konfluenz wurden routinemäßig mittels Lichtmikroskopie vor jedem Experiment überwacht. Alle Zellkulturverfahren wurden in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt, um das Kontaminationsrisiko zu minimieren. Für Behandlungsexperimente wurden AC16-Zellen in 6-Well-Platten eingepflanzt und über Nacht vor der Behandlung haften lassen.

11. Quantitative Reverse-Transkription PCR (RT-PCR)

AC16-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 200 μM Palmitinsäure (PA) oder 20 μM Mitotan behandelt, nachdem sie etwa 60–70 % Konfluenz erreicht hatten. PA wurde im Rinderserumalbumin (BSA) gelöst, während Mitotan in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst war. Alle potenziell gefährlichen Reagenzien wurden gemäß den standardisierten Laborsicherheitsverfahren mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhen und Laborkitteln behandelt.

Nach der Behandlung wurde die gesamte RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers unter RNase-freien Bedingungen mit einem RNA-Extraktionskit extrahiert. RNA-Extraktionsverfahren wurden wann immer möglich auf Eis durchgeführt, um den RNA-Abbau zu minimieren. RNA-Konzentration und Reinheit wurden vor nachgelagerten Experimenten bewertet, und für spätere Analysen wurden nur Proben mit einem A260/A280-Verhältnis zwischen 1,8 und 2,0 verwendet.

Komplementäre DNA (cDNA) wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers mit einem Reverse-Transkriptionskit synthetisiert. Quantitative RT-PCR wurde anschließend mit SYBR Green Master Mix auf einem Echtzeit-PCR-Detektionssystem durchgeführt. Jede Reaktion wurde in einem Endvolumen von 10 μL vorbereitet, das 5 μL SYBR Green Master Mix, 0,4 μL Forward Primer, 0,4 μL Reverse Primer, 1 μL cDNA-Vorlage und 3,2 μL nukleasefreies Wasser enthielt. Die Amplifikation erfolgte unter folgenden Zyklusbedingungen: Anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 30 Sekunden, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 5 Sekunden und Glühung/Verlängerung bei 60 °C für 30 Sekunden. Jedes Experiment wurde mit drei biologischen Replikaten durchgeführt, und alle Reaktionen wurden dreifach durchgeführt.

GAPDH wurde als internes Referenzgen verwendet, und die relativen mRNA-Expressionsniveaus von CYP11A1 und KCNH2 wurden mit der 2^{−ΔΔCt-Methode} berechnet. Ein einzelner Peak in der Schmelzkurvenanalyse wurde als Hinweis auf eine spezifische Amplifikation angesehen. Die für RT-PCR verwendeten Primer-Sequenzen sind in Ergänzungstabelle 2 aufgeführt.

Ergebnisse

Mendelsche Randomisierung
Die MR-Ergebnisse zur Bewertung der kausalen Effekte zwischen medikamentöser Genexpression und HF wurden in ergänzender Tabelle 3 präsentiert. Ein FDR-bereinigter P-Wert unter 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Insgesamt wurden 11 Gene mit signifikanten kausalen Assoziationen mit HF identifiziert (Abbildung 2). Darunter waren sechs Gene mit einem erhöhten HF-Risiko assoziiert, daru...

Diskussion

Diese Forschung bewertete systematisch die kausalen Effekte medikamentöser Gene auf das HF-Risiko mittels MR und identifizierte acht potenzielle therapeutische Ziele. Dazu gehörten vier Schutzfaktoren (APOM, CHD4, IL11RA und LPAR5) sowie vier Risikofaktoren (CYP11A1, GALT, KCNH2 und METRN). Diese Assoziationen wurden zusätzlich durch Kolokalisationsanalyse und SMR unterstützt. Funktionelle Annotationen durch GO, KEGG-Anreicherung und PPI-Netzwerkanalysen deuteten darauf hin, dass diese G...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2× Universal SYBR Green Fast qPCR Mix	Abclonal	RK21203
AC16	HyCyte	TCH-C119
AC16-Zell-spezifisches Kulturmedium	HyCyte	TCH-G119
cDNA-Reverse-Kit	Abclonal	RK20400
CFX96™ Echtzeitsystem	Bio-Rad Laboratories
Mitotan	TargetMol	T1199
Palmitinsäure	TargetMol	T2908
RNA-Extraktions-Kit	Abclonal	RK30120