Die erzwungene Überexpression von miR-486-3p unterdrückt proliferationsassoziierte Aktivität, klonogene Zellvermehrung, Wundverschluss und Migration durch Matrigel in A549- und H358-Lungenadenokarzinomzellen. Diese Effekte gehen mit einer verminderten Expression von WNT5B, DVL1, β-Catenin und BCL-2 einher und deuten auf eine in vitro-Assoziation mit Wnt-vermittelten Veränderungen hin, ohne jedoch eine direkte Targeting oder kausale Beteiligung des Signalwegs nachzuweisen.
Forschungsartikel
miR-486-3p unterdrückt maligne Phänotypen und ist mit einer verminderten Expression von WNT5B, DVL1 und β-Catenin in Lungenadenokarzinomzellen assoziiert
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Lungenadenokarzinom (LUAD) ist der vorherrschende histologische Subtyp des nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms und bleibt mit erheblicher Morbidität und Mortalität assoziiert. Frühere Studien haben tumorunterdrückende Funktionen von miR-486-3p im LUAD identifiziert, doch seine Beziehung zu WNT5B-, DVL1- und β-Catenin-vermittelten Expressionsänderungen war bisher nicht eindeutig definiert. Hier wurde die Ausgangsabundanz von miR-486-3p in A549- und H358-LUAD-Zellen untersucht und mit der in Beas-2b-Bronchialepithelzellen verglichen, die unter ihren jeweiligen Routinebedingungen kultiviert wurden. Stabile Modelle mit Überexpression von miR-486-3p wurden mittels lentiviraler Transduktion erzeugt. Zellwachstumsassoziierte Aktivität, klonogene Proliferation, Wundverschluss und Migration durch Matrigel-beschichtete Membranen wurden mittels Cell-Counting-Kit-8-, Koloniebildungs-, Wundheilungs- und Transwell-Assays bewertet. Die Proteinabundanz von WNT5B, DVL1, β-Catenin und BCL-2 wurde durch Western-Blot-Analyse bestimmt, und die mRNA-Spiegel von WNT5B, DVL1, CTNNB1 und BCL2 wurden zusätzlich mittels RT-qPCR analysiert. Unter den verwendeten Kulturbedingungen war die Abundanz von miR-486-3p in A549- und H358-Zellen niedriger als in Beas-2b-Zellen, und die lentivirale Transduktion führte zu einer stabilen Überexpression in beiden LUAD-Zelllinien. Die erzwungene Überexpression von miR-486-3p verringerte das CCK-8-Signal, die Koloniebildung, den Wundverschluss und die Migration durch Matrigel-beschichtete Membranen und ging mit einer reduzierten Proteinabundanz von WNT5B, DVL1, gesamt-β-Catenin und BCL-2 einher. Die RT-qPCR zeigte zudem eine geringere Transkriptabundanz von WNT5B, DVL1, CTNNB1 und BCL2 in beiden LUAD-Zelllinien nach Überexpression von miR-486-3p. Diese Ergebnisse stützen eine in vitro-Assoziation zwischen erzwungener miR-486-3p-Expression, Abschwächung mehrerer maligner Zellparameter und veränderter Wnt-assoziierten Expression; sie belegen jedoch keine direkte Bindung des miRNA-Ziels, keine Pfadaktivität oder einen kausalen linearen Signalmechanismus.
Einleitung
Lungenadenokarzinom (LUAD) ist die häufigste histologische Unterform des nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms (NSCLC) und trägt weltweit erheblich zur Lungenkrebs-bedingten Morbidität und Mortalität bei1,2,3,4,5. Durch die molekulare Klassifizierung und gezielte Therapien haben sich die Behandlungsergebnisse für bestimmte Patientengruppen verbessert, fortgeschrittenes LUAD bleibt jedoch schwer behandelbar und ist biologisch heterogen1,2,3,4,5. Die Erforschung regulatorischer Prozesse, die zum malignen Zellverhalten beitragen, ist daher weiterhin von Bedeutung für die Entwicklung überprüfbarer therapeutischer Hypothesen.
Die Wnt-Signalübertragung umfasst β-Catenin-abhängige und β-Catenin-unabhängige Zweige, die Proliferation, Überleben, Polarität und Motilität regulieren6,7,8,9. WNT5B ist am häufigsten mit der nichtkanonischen Signalübertragung assoziiert, obwohl seine biologischen Effekte je nach Rezeptor und zellulärem Kontext variieren10,11. DVL1 ist ein zytoplasmatisches Signaltransduktionsprotein, das von mehreren Wnt-Zweigen gemeinsam genutzt wird, und wurde mit β-Catenin-vermittelten Vorgängen im Lungenkrebs in Verbindung gebracht12. Daher sollten gleichzeitige Veränderungen von WNT5B, DVL1 und β-Catenin allein nicht als Hinweis auf einen einzigen linearen Signalweg interpretiert werden.
Mikro-RNAs (miRNAs) sind kurze, nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression durch sequenzabhängige Wechselwirkungen mit Zieltranskripten regulieren13,14,15. Da eine einzelne miRNA mehrere RNAs beeinflussen kann, kann eine veränderte miRNA-Menge vielfältige, tumorassoziierte Phänotypen beeinflussen13,14,15,16,17,18. Mehrere miRNAs wurden mit dem Wachstum, der Motilität und Signalübertragung von Lungenkrebs in Verbindung gebracht, und eine Interaktion zwischen miRNAs und Wnt-assoziierten Netzwerken wurde in verschiedenen Krebskontexten beschrieben16,17,18,19,20.
Das MIR486-Lokus führt zur Bildung der reifen Stränge miR-486-3p und miR-486-5p. miR-486-3p hat tumorunterdrückende Aktivität beim Mundkrebs und beim Glioblastom gezeigt, während bei kutanem Plattenepithelkarzinom eine tumorfördernde Wirkung berichtet wurde21,22,23,24,25. miR-486-3p wurde für die vorliegende Studie anhand einer hypothesengetriebenen Strategie ausgewählt, die auf seinem verminderten Vorkommen in öffentlich zugänglichen LUAD-Daten, seiner zuvor berichteten tumorunterdrückenden Aktivität in LUAD sowie bioinformatischen Vorhersagen basiert, die ihn mit WNT-assoziierten Kandidatentranskripten verknüpfen. Tomioka et al. demonstrierten tumorunterdrückende Effekte beider miR-486-Stränge in LUAD und identifizierten GINS4 mittels genomweiter Target-Screening-Analyse26. Die vorliegende Studie erhebt daher nicht den Anspruch, den antitumoralen Phänotyp erstmals nachzuweisen. Stattdessen wird überprüft, ob eine erzwungene Expression von miR-486-3p mit Veränderungen in der Menge von WNT5B, DVL1 und β-Catenin sowie mit reproduzierbaren phänotypischen Veränderungen in zwei LUAD-Zelllinien einhergeht. Diese Analysen bewerten Assoziationen und stellen keine direkte Targeting-Wirkung, keine Aktivität eines Signalwegs oder einen linearen WNT5B/DVL1/β-Catenin-Mechanismus sicher.
Protokoll
Die verwendeten Reagenzien und das verwendete Equipment sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.
Zellkultur
Es wurden die humanen Lungenadenokarzinom-(LUAD-)Zelllinien A549 und H358 sowie die immortalisierte bronchiale Epithelzelllinie Beas-2b verwendet. A549 (KRAS G12S) und H358 (KRAS G12C; STK11-defizient) wurden als häufig verwendete LUAD-Modelle mit unterschiedlichen KRAS-Mutationshintergründen ausgewählt, während Beas-2b als nicht maligner bronchialer Epithelvergleichsansatz diente. A549- und H358-Zellen wurden in RPMI-1640-Medium kultiviert, Beas-2b-Zellen in DMEM; jedes Medium enthielt 10 % fetalen Kälberserum und 1 % Penicillin-Streptomycin. Die Zellen wurden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ gezüchtet. Da die Tumor- und Epithelvergleichszelllinien in unterschiedlichen Standardmedien gehalten wurden, wurden vergleichende Expressionsanalysen zwischen den Zelllinien mit Vorsicht interpretiert.
Lentivirale Transduktion und stabile Zellselektion
Lentivirale Vektoren, die den Vorläufer von hsa-miR-486-3p (LV-miR-486-3p) oder eine zufällige Negativkontrollsequenz (LV-NC) tragen, wurden in einem stabilen Gain-of-Function-Ansatz verwendet. A549- und H358-Zellen wurden in 6-Well-Platten mit jeweils 5 × 104 Zellen/Well ausgesät und über Nacht kultiviert. Am folgenden Tag wurden die Zellen Lentivirus bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 in Gegenwart von 8 µg/mL Polybrene ausgesetzt. Nach 24 Stunden wurde das virale Inokulum durch frisches komplettes Medium ersetzt. Transduzierte Zellen wurden durch eine Selektion mit 2 µg/mL Puromycin über einen Zeitraum von 7 Tagen angereichert. Nach der Selektion durften die überlebenden Zellen regenerieren und wurden anschließend für molekulare und funktionelle Analysen vermehrt. Ein Ansatz mit einem miR-486-3p-Inhibitor wurde nicht durchgeführt, da die vorliegende Studie speziell darauf ausgelegt war, die Effekte einer stabilen, erzwungenen Überexpression zu untersuchen.
HINWEIS: Die MOI, die Polybrene-Expositionszeit und die Puromycin-Selektionsbedingungen müssen zwischen den Gruppen LV-NC und LV-miR-486-3p identisch gehalten werden, um behandlungsbedingte Unterschiede in der Zellviabilität zu minimieren.
Echtzeit-PCR
Die RT-qPCR wurde durchgeführt, um die Expressionslevel von miR-486-3p zu bestimmen und die Effizienz der lentiviralen Überexpression in A549- und H358-Zellen zu bestätigen. Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des TRIzol-Reagenz gemäß den Herstelleranweisungen isoliert. Die RNA-Konzentration und -Reinheit wurden spektrophotometrisch bewertet, wobei ein A260/A280-Verhältnis von 1,8–2,1 als akzeptabel galt. Für die mRNA-Analyse wurden 1 µg Gesamt-RNA mittels eines kommerziellen cDNA-Synthesekits gemäß Herstellervorschrift in cDNA umgeschrieben. Für die Analyse von Mikro-RNA erfolgte die cDNA-Synthese unter Verwendung eines miRNA-spezifischen Stamm-Schleifen-Rücktranskriptionsprimers. Die quantitative PCR wurde in einem Gesamtvolumen von 20 µL durchgeführt, das 10 µL 2× SYBR Green Master Mix, 0,4 µM jedes Primers und 2 µL cDNA-Vorlage enthielt. Das Amplifikationsprotokoll umfasste einen initialen Denaturierungsschritt bei 95 °C für 5 min, gefolgt von 40 Zyklen mit Denaturierung bei 95 °C für 10 s und Annealing/Extension bei 60 °C für 30 s. Anschließend wurde eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt, um die Spezifität der Amplifikation zu überprüfen. Die kleine nukleäre RNA U6 diente als interne Kontrolle für die miRNA-Quantifizierung, während GAPDH als Referenzgen für die mRNA-Normalisierung verwendet wurde. Die relativen Expressionslevel wurden nach der 2−ΔΔCq-Methode bestimmt.
Die miRNA-Primersequenzen waren wie folgt: Stem-Loop-Rücktranskriptionsprimer, 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′; miR-486-3p-Vorwärtsprimer, 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′; universeller Rückwärtsprimer, 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′; U6-Vorwärtsprimer, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′; und U6-Rückwärtsprimer, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. Primersequenzen für WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2 und GAPDH sowie Amplikonlängen und Amplifikationseffizienzen sind in Tabelle 1 angegeben. Die mRNA-Expression wurde auf GAPDH normalisiert, während die miR-486-3p-Expression auf U6 normalisiert wurde. Jedes Experiment umfasste drei unabhängige biologische Replikate mit jeweils drei technischen Replikaten pro biologischem Replikat.
Immunoblot
Nach Abschluss der siebentägigen Puromycin-Selektion und einer Erholungsphase wurden die Zellen in RIPA-Puffer mit Proteaseinhibitoren lysiert. Die Protein-Konzentrationen wurden mittels BCA-Protein-Assay bestimmt. Gleichmäßige Proteinmengen (20 µg pro Lane) wurden auf 10 %igen SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt und durch nasse Übertragung bei 300 mA für 120 min auf PVDF-Membranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % Magermilch in Tris-gepuffertem Salzlösung mit 0,1 % Tween-20 (TBST) für 1 h bei Raumtemperatur blockiert. Anschließend wurden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen WNT5B (1:1.000), DVL1 (1:1.000), β-Catenin (1:1.000), BCL-2 (0,5 µg/mL) oder β-Aktin (1:5.000) inkubiert. Die Hersteller und Katalognummern aller Antikörper sind in der Materialtabelle angegeben. Nach dreimaligem Waschen mit TBST je 10 min wurden die Membranen für 1 h bei Raumtemperatur mit einem HRP-konjugierten sekundären Antikörper (Ziege anti-Kanin-IgG), verdünnt 1:5.000, inkubiert. Danach wurden die Membranen dreimal mit TBST gewaschen, und die Proteinbanden wurden mithilfe eines chemilumineszenten Substrats sichtbar gemacht und mit einem Gel-Dokumentations- und Bildgebungssystem aufgezeichnet. Die Bandenintensitäten wurden mit ImageJ quantifiziert. Die Menge jedes Zielproteins wurde relativ zum entsprechenden β-Aktin-Signal derselben biologischen Probe normalisiert. Für die dichtemetrische Analyse wurden ausschließlich Belichtungen innerhalb des linearen, nicht gesättigten Nachweisbereichs verwendet. Es wurden drei unabhängige biologische Experimente durchgeführt.
Cell-Counting-Kit-8-Assay
A549- und H358-Zellen, die stabil mit LV-NC oder LV-miR-486-3p transduziert wurden, wurden in 96-Well-Platten mit jeweils 1,5 × 104 Zellen/Well in 100 µL komplettem Medium ausgesät. Nach einer Übernacht-Haftung wurde das Medium erneuert, und die Absorption zum Zeitpunkt 0 h wurde unmittelbar nach Zugabe des Cell Counting Kit-8-Reagenzes gemessen. Zu den Zeitpunkten 0 h, 24 h, 48 h, 72 h und 96 h wurden je 10 µL Reagenz pro Well zugegeben und 1 h bei 37 °C inkubiert, bevor die Absorption bei 450 nm gemessen wurde. Für die überarbeitete zeitliche Analyse wurde jede Gruppe vor dem Erstellen des Diagramms auf ihren eigenen Wert zum Zeitpunkt 0 h normalisiert. Es wurden drei unabhängige biologische Experimente durchgeführt, und die technischen Ansätze innerhalb jedes Experiments wurden vor der statistischen Analyse gemittelt.
Koloniebildungsassay
Stabil selektierte A549- und H358-Zellen wurden als Einzelzell-Suspensionen mit 5 × 102 Zellen/mL hergestellt. Je ein Milliliter Zellsuspension wurde in jede Vertiefung einer 6-Loch-Platte gegeben und mit 3 mL komplettem Medium ergänzt. Die Zellen wurden 14 Tage lang kultiviert, wobei alle 5 Tage das Medium erneuert wurde. Kolonien wurden mit PBS gewaschen, 20 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, 20 Minuten lang mit Kristallviolett angefärbt, erneut gewaschen und luftgetrocknet. Kolonien mit mindestens 50 Zellen wurden in ImageJ gezählt. Es wurden drei unabhängige biologische Experimente durchgeführt.
HINWEIS: Eine homogene Einzelzell-Suspension und eine minimale Plattenstörung während der Koloniebildung sind erforderlich, um künstliche Zellaggregationen zu verhindern.
Test zur Zellmigration
Stabil transfizierte A549- und H358-Zellen wurden in 6-Well-Platten ausgesät und bis zur Ausbildung einer konfluenten Monoschicht kultiviert. Ein gerader Kratzer wurde mit einer sterilen 10-µL-Pipettenspitze erzeugt, abgelöste Zellen wurden entfernt, und dieselben markierten Felder wurden nach 0 h, 24 h, 48 h und 72 h abgebildet. Die Wundfläche wurde in ImageJ gemessen, und die Wundschlussrate wurde berechnet als (Fläche bei 0 h − Fläche zum angegebenen Zeitpunkt) / Fläche bei 0 h × 100 %. Es wurden drei unabhängige biologische Experimente durchgeführt. Es wurde kein pharmakologischer Proliferationshemmer verwendet; daher wurde dieser Assay als Messung des Wundverschlusses und nicht als migrationsspezifische Messung interpretiert.
HINWEIS: Kratzer sollten mit konstanter Breite und Druck erzeugt werden, und während des gesamten Zeitverlaufs sollten identische Felder beobachtet werden.
Test zum Zellinvasionsvermögen
Transwell-Invasionsassays wurden unter Verwendung von 24-Loch-Polycarbonatmembran-Einsätzen mit einer Porengröße von 8 µm durchgeführt. Die obere Oberfläche jedes Einsatzes wurde mit 100 µL Matrigel-Basalmembranmatrix beschichtet, die 1:8 in serumfreiem DMEM verdünnt war, um eine endgültige Proteinkonzentration von etwa 1 mg/mL zu erreichen, und für 4 h bei 37 °C inkubiert. A549- und H358-Zellen wurden in serumfreiem RPMI-1640-Medium in Dichten von 8 × 105 Zellen/mL bzw. 4 × 105 Zellen/mL resuspendiert. Ein 200 µL-Aliquot der Zellsuspension wurde in die obere Kammer gegeben, was 1,6 × 105 A549-Zellen oder 8 × 104 H358-Zellen pro Einsatz entspricht. Die untere Kammer wurde mit 500 µL RPMI-1640-Medium, das 20 % fetalen Rinderserum als Chemoattraktans enthielt, gefüllt. Nach einer Inkubation bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ über 48 h wurden nicht eingewanderte Zellen, die auf der oberen Oberfläche der Membran verblieben waren, vorsichtig mit einem Wattestäbchen entfernt. Die Zellen, die durch die Membran eingewandert waren, wurden 20 min mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und anschließend 20 min bei Raumtemperatur mit 0,1 % Kristallviolett angefärbt. Für jeden Einsatz wurden fünf zufällig ausgewählte mikroskopische Felder abgebildet, und die Anzahl der eingewanderten Zellen wurde mittels ImageJ quantifiziert. Die mittlere Zellanzahl aus den fünf Feldern galt als ein einzelner Wert pro Einsatz, wobei der Einsatz und nicht das einzelne mikroskopische Feld als experimentelle Einheit betrachtet wurde. Es wurden drei unabhängige biologische Experimente durchgeführt.
HINWEIS: Entfernen Sie die nicht eindringenden Zellen vorsichtig und gleichmäßig, um die Membran nicht zu beschädigen oder Zellen abzulösen, die auf ihre untere Oberfläche migriert sind.
Statistische Analyse
Die Daten werden als Mittelwert dargestellt ± SD und n bezeichnen unabhängige biologische Experimente, sofern nicht anders angegeben. Technische Replikate oder mehrere mikroskopische Felder derselben experimentellen Einheit wurden vor der inferenzstatistischen Auswertung gemittelt. Für den Vergleich der drei Zelllinien wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse mit anschließenden Tukey-korrigierten paarweisen Vergleichen verwendet. Für die Zeitreihen der CCK-8- und Wundverschlussversuche wurde eine zweifaktorielle Varianzanalyse mit Messwiederholungen verwendet, um die Effekte von Behandlung, Zeit sowie der Wechselwirkung zwischen Behandlung und Zeit zu evaluieren, gefolgt von Šídák-korrigierten Vergleichen zu einzelnen Zeitpunkten. Zweigruppenvergleiche wurden mittels zweiseitigem ungepaartem Student’s t-Tests. Die statistischen Analysen und die Datenvisualisierung wurden mit statistischer Analyse- und Grafiksoftware durchgeführt. Genau p-Werte sind in den Abbildungspanels oder den Quelldatentabellen angegeben. Statistische Signifikanz wurde definiert als p < 0.05; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001 und ****p < 0.0001.
Ergebnisse
Die TCGA/starBase-Analyse zeigt eine verminderte Abundanz von miR-486-3p in LUAD, und TargetScan identifiziert mögliche Bindungsstellen
Über starBase v3.0 abgerufene expressionsdaten aus TCGA zeigten, dass die Menge an miR-486-3p in 512 Proben von Lungenadenokarzinomen (LUAD) signifikant niedriger war als in 20 nicht-tumoralen Lungenproben (Wilcoxon-Rangsummentest, p = 3,2 × 10⁻5; Abbildung 1). TargetScanHuman identifizierte eine schlecht konservierte, kandidatenhafte 7mer-m8-Bindungsstelle für miR-486-3p an den Positionen 468–474 der 3′-unübersetzten Region (3′ UTR) von DVL1 mit einem Context++-Score von −0,23 und einem Context++-Score-Perzentil von 80. Eine schlecht konservierte, kandidatenhafte 8mer-Bindungsstelle wurde an den Positionen 913–920 der 3′ UTR von WNT5B mit einem Context++-Score von −0,46 und einem Context++-Score-Perzentil von 97 identifiziert (Abbildung 2). Diese computergestützt vorhergesagten Bindungsstellen dienten der Erstellung der experimentellen Hypothese und wurden nicht als Hinweis auf eine direkte miRNA–Target-Bindung gewertet. Die Quell-URLs sind in Tabelle 2 angegeben.
Die Menge an miR-486-3p ist in LUAD-Zelllinien verringert und nach lentiviraler Transduktion deutlich erhöht
Unter ihren jeweiligen Routinekulturbedingungen zeigte die RT-qPCR-Analyse, dass die Menge an miR-486-3p in A549- und H358-Zellen niedriger war als in bronchialen Epithelzellen vom Typ Beas-2b. Tukey-angepasste Vergleiche nach einfaktorieller Varianzanalyse ergaben signifikante Unterschiede zwischen A549- und Beas-2b-Zellen (p < 0,01) sowie zwischen H358- und Beas-2b-Zellen (p < 0,001; Abbildung 3A).
Die stabile Transduktion mit LV-miR-486-3p erhöhte die Menge an miR-486-3p im Vergleich zu den entsprechenden LV-NC-Gruppen deutlich. Die Expression stieg in A549-Zellen um etwa das 1.470-Fache und in H358-Zellen um das 220-Fache an, wobei beide Vergleiche statistisch signifikant waren (p < 0,001; Abbildung 3B,C). Diese Ergebnisse bestätigten die erfolgreiche Erstellung stabiler Zellmodelle mit überexprimiertem miR-486-3p.
Die erzwungene Expression von miR-486-3p ist mit einer verminderten Expression von WNT5B, DVL1, β-catenin und BCL-2 assoziiert
Die Western-Blot-Analyse zeigte eine geringere Proteinmenge an WNT5B, DVL1, gesamt-β-Catenin und BCL-2 in LV-miR-486-3p-transduzierten Zellen im Vergleich zu den jeweiligen LV-NC-Kontrollen (Abbildung 4A–E). In A549-Zellen war eine künstlich herbeigeführte Expression von miR-486-3p mit einer verminderten Proteinmenge an β-Catenin (p = 0,022), WNT5B (p = 0,0008), DVL1 (p = 0,019) und BCL-2 (p = 0,0017) assoziiert. Entsprechende Abnahmen wurden ebenfalls in H358-Zellen für β-Catenin (p = 0,001), WNT5B (p = 0,0002), DVL1 (p = 0,0003) und BCL-2 (p = 0,0018) beobachtet.
Anschließend wurde eine RT-qPCR durchgeführt, um zu bestimmen, ob Transkriptänderungen die Proteinbefunde begleiteten (Abbildung 4F–I). In A549-Zellen verringerte die erzwungene Expression von miR-486-3p die CTNNB1-mRNA auf das 0,226-Fache im Vergleich zur LV-NC-Gruppe (p = 0,004), die WNT5B-mRNA auf das 0,180-Fache (p = 0,004), die DVL1-mRNA auf das 0,278-Fache (p = 0,006) und die BCL2-mRNA auf das 0,259-Fache (p = 0,003).
Ähnliche Transkriptmengenänderungen wurden in H358-Zellen nachgewiesen. Die CTNNB1-mRNA war im Vergleich zur LV-NC-Gruppe auf das 0,288-Fache reduziert (p = 0,028), die WNT5B-mRNA auf das 0,250-Fache (p = 0,019), die DVL1-mRNA auf das 0,271-Fache (p = 0,020) und die BCL2-mRNA auf das 0,534-Fache (p = 0,003). Somit war die Richtung der Transkriptmengenänderungen in beiden Zelllinien konsistent mit den entsprechenden Ergebnissen auf Proteinebene. Diese Ergebnisse zeigen koordinierte Expressionsänderungen auf, belegen jedoch nicht die direkte Targeting-Wirkung oder die Aktivität eines linearen WNT5B/DVL1/β-Catenin-Signalwegs.
Erzwungene miR-486-3p-Expression verringert das wachstumsassoziierte CCK-8-Signal
Die CCK-8-Messungen wurden auf den entsprechenden 0-h-Wert jeder experimentellen Gruppe normiert. Das normierte CCK-8-Signal stieg im Zeitverlauf sowohl in LV-NC- als auch in LV-miR-486-3p-transduzierten Zellen an, jedoch wurden nach induzierter miR-486-3p-Expression im Allgemeinen niedrigere Werte beobachtet (Abbildung 5).
In A549-Zellen zeigten nach einer zweifaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholung vorgenommene Šídák-angepasste Vergleiche signifikant niedrigere CCK-8-Signale in der LV-miR-486-3p-Gruppe nach 24, 48 und 96 h im Vergleich zur LV-NC-Gruppe (p < 0,05), während der Unterschied nach 72 h nicht statistisch signifikant war (Abbildung 5A). In H358-Zellen war das CCK-8-Signal in der LV-miR-486-3p-Gruppe nach 24, 48, 72 und 96 h signifikant niedriger (p < 0,05; Abbildung 5B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine erzwungene Expression von miR-486-3p die wachstumsassoziierte metabolische Aktivität verringerte, wobei über den gesamten Zeitverlauf in H358-Zellen ein konsistenterer Effekt beobachtet wurde.
Erzwungene miR-486-3p-Expression verringert das klonogene Wachstum
Koloniebildungsassays wurden durchgeführt, um das langfristige klonogene Wachstum zu bewerten. A549-Zellen, die mit LV-miR-486-3p transduziert worden waren, bildeten signifikant weniger Kolonien als die entsprechenden LV-NC-Zellen (p = 0.013; Abbildung 6A). Eine signifikante Verringerung der Kolonieanzahl wurde ebenfalls in H358-Zellen beobachtet (p = 0.006; Abbildung 6B). Die Verringerung war in H358-Zellen stärker ausgeprägt als in A549-Zellen, was darauf hinweist, dass das Ausmaß des klonogenen Effekts zwischen den beiden LUAD-Modellen unterschiedlich war.
Erzwungener miR-486-3p-Ausdruck verringert die Wundschließung
Die Wundschlussrate wurde 24 h, 48 h und 72 h nach dem Verkratzen quantifiziert (Abbildung 7). In A549-Kulturen wies die LV-miR-486-3p-Gruppe eine signifikant geringere Wundschlussrate als die LV-NC-Gruppe nach 24, 48 und 72 h auf (p < 0,05 für jeden Vergleich; Abbildung 7A,C).
Ebenso war die Wundschließung in LV-miR-486-3p-transduzierten H358-Kulturen nach 24 h und 48 h (p < 0,05) sowie nach 72 h (p < 0,01; Abbildung 7B,D) vermindert. Da der Test ohne pharmakologischen Proliferationsinhibitor durchgeführt wurde, wurden diese Ergebnisse als verminderte Wundschließung und nicht als Hinweis auf einen ausschließlich migrationspezifischen Effekt interpretiert.
Erzwungene Expression von miR-486-3p verringert das Durchqueren von Matrigel-beschichteten Membranen
Die Fähigkeit der Zellen, Matrigel-beschichtete Transwell-Membranen zu durchqueren, wurde nach 48 h bewertet. Signifikant weniger mit Kristallviolett gefärbte Zellen wurden auf der unteren Membranoberfläche in der A549 LV-miR-486-3p-Gruppe im Vergleich zur A549 LV-NC-Gruppe detektiert (p = 0.0001; Abbildung 8A). Eine ähnliche Verringerung wurde bei H358-Zellen beobachtet (p = 0.0007; Abbildung 8B).
Für jeden Insert wurden fünf mikroskopische Felder gemittelt, und der Insert wurde als experimentelle Einheit betrachtet. Diese Ergebnisse zeigen eine verminderte Passage von Matrigel-beschichteten Membranen nach erzwungener miR-486-3p-Expression unter den in diesem Assay verwendeten Bedingungen.
VERFÜGBARKEIT VON DATEN:
Alle Quelldaten, die den Abbildungen zugrunde liegen, sind in Supplementary File 1 enthalten, einschließlich Datenbank-Quelldateien, RT-qPCR-Daten, nicht zugeschnittene Western Blots, Densitometrie-Werte, Mikroskopiebilder, Zähldaten, CCK-8-Messungen und Dateien zur statistischen Analyse.
Abbildung 1: Häufigkeit von miR-486-3p in LUAD- und normalen Lungengewebeproben aus TCGA/starBase. Die über TCGA abgerufenen Expressionsdaten wurden im Mai 2026 über starBase v3.0 bezogen und umfassten 512 Proben von Lungenadenokarzinomen (LUAD) sowie 20 Proben normalen Lungengewebes. Die Gruppen wurden mittels des Wilcoxon-Rangsummentests verglichen (p = 3,2 × 10⁻5). LUAD, Lungenadenokarzinom. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 2: Mit TargetScan vorhergesagte potenzielle Bindungsstellen für miR-486-3p in den 3′-UTRs von DVL1 und WNT5B. TargetScanHuman identifizierte eine potenzielle 7mer-m8-Bindungsstelle an den Positionen 468–474 der 3′-unübersetzten Region (3′ UTR) von DVL1 sowie eine potenzielle 8mer-Bindungsstelle an den Positionen 913–920 der 3′ UTR von WNT5B. Die entsprechenden Quell-URLs sind in Tabelle 2 angegeben. Diese bioinformatischen Vorhersagen dienten der Hypothesenbildung und stellen keine experimentellen Belege für eine direkte Bindung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 3: Grundlegende miR-486-3p-Expression und Nachweis der lentiviralen Überexpression. (A) RT-qPCR-Analyse der miR-486-3p-Menge in A549-, H358- und Beas-2b-Zellen, die in ihrem jeweiligen Routinekulturmedium gehalten wurden. (B,C) RT-qPCR-Überprüfung der miR-486-3p-Überexpression in A549 (B) und H358 (C) Zellen, die mit LV-NC oder LV-miR-486-3p transduziert wurden. Die Expression wurde auf U6 normalisiert. Die Daten werden als Mittelwert ± SD aus drei unabhängigen biologischen Experimenten dargestellt. (A) wurde mittels einfaktorieller ANOVA mit anschließenden Tukey-korrigierten Mehrfachvergleichen analysiert. (B,C) wurden mittels zweiseitiger ungepaarter Student’s t-Tests ausgewertet. *p < 0,01; **p < 0,001. LV-NC, negativer Kontrolllentivirus; RT-qPCR, einkettige quantitative PCR nach reverser Transkription; SD, Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 4: Erzwungener miR-486-3p-Ausdruck ist mit einer verminderten Expression von Kandidatengenen assoziiert. (A) Repräsentative Westernblots, die die Mengenverhältnisse von β-Catenin, WNT5B, DVL1, BCL-2 und β-Aktin in A549- und H358-Zellen zeigen, die mit LV-NC oder LV-miR-486-3p transduziert wurden. Die molekularen Massen sind in Kilodalton angegeben.B–EDensitometrische Quantifizierung von β-Catenin (B), WNT5B (C), DVL1 (D) und BCL-2 (E), normalisiert auf β-Aktin. (F–I) RT-qPCR-Analyse von CTNNB1 (F), WNT5B (G), DVL1 (H) und BCL2 (I) Transkriptmenge, normalisiert auf GAPDH. Die Daten werden als Mittelwert ± SD aus drei unabhängigen biologischen Experimenten dargestellt; einzelne Werte entsprechen unabhängigen biologischen Wiederholungen. Der Vergleich der Gruppen erfolgte mittels zweiseitigem ungepaartem Student’s t-Test. t-Tests. Genau p-Werte und Faltungsänderungen sind in den entsprechenden Darstellungen angegeben. kDa, Kilodalton; LV-NC, lentiviraler Negativkontroll-Virus; RT-qPCR, quantitative RT-PCR; SD, Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Die erzwungene Expression von miR-486-3p verringert zeitabhängig wachstumsassoziierte CCK-8-Signale. A549 (A) und H358 (B) Zellen, die mit LV-NC oder LV-miR-486-3p transduziert wurden, wurden nach 0 h, 24 h, 48 h, 72 h und 96 h analysiert. Die OD450-Werte wurden auf den entsprechenden Wert zum Zeitpunkt 0 h innerhalb jeder Gruppe normiert. Die Daten werden als Mittelwert ± SD aus drei unabhängigen biologischen Experimenten dargestellt. Die Effekte der Behandlung, der Zeit sowie der Wechselwirkung zwischen Behandlung und Zeit wurden mittels zweifaktorieller Varianzanalyse mit Messwiederholungen analysiert, gefolgt von Šídák-korrigierten Gruppenvergleichen zu jedem Zeitpunkt. *p < 0,05. CCK-8, Cell Counting Kit-8; LV-NC, negativkontrolliertes Lentivirus; OD450, optische Dichte bei 450 nm; SD, Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 6: Die erzwungene Expression von miR-486-3p verringert das klonogene Wachstum. Repräsentative Ganzfeldbilder und quantitative Koloniezahlen werden für A549 gezeigt (A) und H358 (B) Zellen, die mit LV-NC oder LV-miR-486-3p transduziert wurden. Die Kolonien wurden mittels ImageJ mit identischen Analyseeinstellungen für alle Gruppen quantifiziert. Die Daten werden als Mittelwert ± SD aus drei unabhängigen biologischen Experimenten dargestellt und mittels zweiseitigem ungepaartem Student’s t-Test analysiert. t-Tests. Genau p-Werte sind in den entsprechenden Darstellungen angegeben. LV-NC, negativer Kontroll-Lentivirus; SD, Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Erzwungene Expression von miR-486-3p verringert die Wundschließung. Dargestellt sind repräsentative Bilder und quantitative Messungen der Wundschließung für A549 (A,C) und H358 (B,D) Zellen nach 0 h, 24 h, 48 h und 72 h nach dem Anritzen. Die Wundschließung wurde wie folgt berechnet: (Wundfläche bei 0 h − Wundfläche zum angegebenen Zeitpunkt) / Wundfläche bei 0 h × 100 %. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen biologischen Experimenten dargestellt. Die Effekte der Behandlung, der Zeit sowie der Wechselwirkung zwischen Behandlung und Zeit wurden mittels zweifaktorieller Varianzanalyse mit wiederholten Messungen analysiert, gefolgt von nach Šídák adjustierten Gruppenvergleichen zu jedem Zeitpunkt. Maßstabsbalken, 200 µm. *p < 0,05; **p < 0,01. LV-NC, negativer Kontroll-Lentivirus; SD, Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 8: Erzwungener miR-486-3p-Ausdruck verringert das Durchwandern von Matrigel-beschichteten Transwell-Membranen. Repräsentative mikroskopische Felder nach Kristallviolett-Färbung und quantitative, auf Inserts basierende Zellzählungen werden für A549 gezeigt (A) und H358 (B) Zellen, die mit LV-NC oder LV-miR-486-3p transduziert wurden. Transwell-Einsätze mit einer 8-µm Porengröße verwendet wurden. Für jeden Insert wurden fünf mikroskopische Felder gemittelt, und jeder Insert wurde als eine experimentelle Einheit betrachtet. Die Daten werden als Mittelwert ± SD aus drei unabhängigen biologischen Experimenten angegeben und mittels zweiseitigem ungepaartem Student’s t-Test analysiert. t-Tests. Maßstabsbalken, 200 µm. Genau p-Werte sind in den entsprechenden Darstellungen angegeben. LV-NC, lentiviraler Negativkontrollvirus; SD, Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
| Gen | Primersequenzen | Amplikonlängen | Amplifikationseffizienzen | |
| WNT5B | Vorwärts: 5'-AAATGCCACGGCGTCTCG-3', | 118 bp | 101% | |
| Rückwärts: 5'-GGGTGAAGCGGCTGTTGA-3' | ||||
| DVL1 | Vorwärts: 5'-GAGGGTGCTCACTCGGATG-3', | 158 bp | 95,60% | |
| Rückwärts: 5'-GTGCCTGTCTCGTTGTCCA-3' | ||||
| CTNNB1 | Vorwärts: 5'- GCGCCATTTTAAGCCTCTCG -3', | 140 bp | 96,30% | |
| Rückwärts: 5'-AAATACCCTCAGGGGAACAGG-3' | ||||
| BCL2 | Vorwärts: 5'- GTCATGTGTGTGGAGAGCGT-3', | 139 bp | 97,20% | |
| Rückwärts: 5'-ATAGTTCCACAAAGGCATCC-3' | ||||
| GAPDH | Vorwärts: 5'-GACTTCAACAGCAACTCCCACTC-3', | 107 bp | 98,30% | |
| Rückwärts: 5'-TAGCCGTATTCATTGTCATACCAG-3' | ||||
Tabelle 1: Primersequenzen für die RT-qPCR.
| Ziel | Vorhersageinformationen | Quelle | ||
| DVL1 | 7mer-m8, Positionen 468–474 | TargetScan URL (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST00000397196.2&taxid=9606&members=miR-486-3p&showcnc=1& shownc=1&shownc_nc=1&showncf1=1&showncf2=1&subset=1) | ||
| WNT5B | 8mer, Positionen 913–920 | TargetScan URL (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST00000378891.5&taxid=9606&members=miR-486-3p&showcnc=1& shownc=1&shownc_nc=1&showncf1=1&showncf2=1&subset=1) | ||
Tabelle 2: TargetScan-Datenbank und entsprechende URL.
Zusatzdatei 1: Daten zur Unterstützung der Ergebnisse dieser Studie.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Diskussion
Die vorliegende Gain-of-Function-Studie untersuchte die Auswirkungen einer stabilen, erzwungenen Expression von miR-486-3p in A549- und H358-Lungenadenokarzinom-(LUAD-)Zellen. In beiden Modellen war die Überexpression von miR-486-3p mit verringerten wachstumsassoziierten CCK-8-Signalen, reduziertem klonogenem Wachstum, geringerer Wundschlussrate und weniger Zellen, die Matrigel-beschichtete Transwell-Membranen durchquerten, verbunden. Diese phänotypischen Veränderungen gingen einher mit einer verminderten Proteinausprägung von WNT5B, DVL1, gesamt-β-Catenin und BCL-2 sowie niedrigeren Transkriptmengen von WNT5B, DVL1, CTNNB1 und BCL2. Insgesamt stützen diese Befunde einen Zusammenhang zwischen erzwungener miR-486-3p-Expression, Abschwächung mehrerer maligner Zellphänotypen und koordinierten Veränderungen ausgewählter Wnt-assozierter Moleküle. Sie belegen jedoch nicht direkt die Bindung der miRNA an ihr Ziel, die Aktivität des Signalwegs oder eine kausale Signalkaskade.
Das in dieser Studie beobachtete allgemeine tumorsuppressive Phänotyp ist vereinbar mit früheren Berichten und sollte nicht als Hauptneufund interpretiert werden. Tomioka et al. zeigten zuvor, dass sowohl miR-486-3p als auch miR-486-5p maligne Phänotypen in LUAD-Zellen unterdrücken, und identifizierten GINS4 mittels einer unvoreingenommenen Target-Screening-Strategie26. Der Beitrag der vorliegenden Studie ist spezifischer: Die erzwungene Expression von miR-486-3p ging mit einer Verringerung der Mengen von WNT5B, DVL1 und β-Catenin in zwei LUAD-Zellmodellen einher. Zusätzlich liefert die Studie einen integrierten experimentellen Arbeitsablauf, der stabile lentivirale Transduktion, RT-qPCR, Western Blotting, CCK-8-Analyse, Koloniebildungs-, Wundverschluss- und Matrigel-beschichtete Transwell-Assays kombiniert. Diese Unterscheidung ist wichtig, da die vorliegende Arbeit die molekularen Beobachtungen im Zusammenhang mit der Überexpression von miR-486-3p erweitert, ohne den Erstnachweis ihrer antitumoralen Aktivität in LUAD zu beanspruchen.
Die Wnt-bezogenen Befunde erfordern eine vorsichtige Interpretation. WNT5B wird üblicherweise als nichtkanonischer Wnt-Ligand beschrieben und kann auf rezeptor- und kontextabhängige Weise die Planarzellpolarität oder die Wnt/Ca2⁺-Signalübertragung aktivieren. In bestimmten zellulären Umgebungen kann die nichtkanonische Wnt-Signalübertragung außerdem die β-Catenin-abhängige Signalübertragung hemmen10,11. DVL1 ist ein gemeinsamer intrazellulärer Mediator, der sowohl an der kanonischen als auch an der nichtkanonischen Wnt-Signalübertragung beteiligt sein kann und bereits mit β-Catenin-bezogenen Phänotypen beim nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom in Verbindung gebracht wurde12. Daher belegt die gleichzeitige Reduktion von WNT5B, DVL1 und gesamt-β-Catenin keinen linearen WNT5B→DVL1→β-Catenin-Signalweg. Die vorliegenden Daten deuten stattdessen auf parallele Abnahmen der WNT5B-Expression sowie der Mengen von DVL1 und β-Catenin nach erzwungener miR-486-3p-Expression hin.
Die Ergebnisse auf Transkriptebene waren in ihrer Richtung konsistent mit den Befunden der Western-Blot-Analyse. Die erzwungene Expression von miR-486-3p verringerte die Transkriptmenge von WNT5B, DVL1 und CTNNB1 in beiden Zelllinien, A549 und H358. Diese Übereinstimmung legt nahe, dass die beobachteten Proteinveränderungen möglicherweise von einer veränderten Transkriptmenge begleitet werden, anstatt ausschließlich auf Veränderungen der Proteinstabilität zurückzugehen. Dennoch belegen verringerte Transkript- und Proteinmengen nicht den direkten Bindungsnachweis von miR-486-3p an die vorhergesagten 3′-unübersetzten Regionen. Dualluciferase-Reporterassays unter Verwendung von Wildtyp- und Mutanten-Bindungsstellen sowie Rescue-Experimente wären erforderlich, um festzustellen, ob WNT5B oder DVL1 direkt durch miR-486-3p reguliert wird. Ebenso weist die Abnahme der BCL-2-Menge auf eine Veränderung eines mit dem Zellüberleben assoziierten Proteins hin, kann jedoch bei fehlenden validierten Zelltod-Assays nicht als Beleg für eine erhöhte Apoptose interpretiert werden.
Die funktionellen Assays weisen zudem assayspezifische Einschränkungen auf. Der CCK-8-Assay misst die zelluläre Stoffwechselaktivität, anstatt die Zellanzahl direkt zu bestimmen, und Änderungen der Absorption können Veränderungen der Proliferation, des Stoffwechsels oder der Vitalität widerspiegeln. Die Koloniebildungsanalyse liefert eine Langzeitmessung der klonogenen Kapazität, doch die Stärke des Effekts unterschied sich zwischen den beiden Zelllinien, wobei eine geringfügige Reduktion in A549-Zellen und eine stärkere Reduktion in H358-Zellen beobachtet wurde. Dieser Unterschied legt nahe, dass die Reaktion auf die erzwungene Expression von miR-486-3p vom molekularen und zellulären Kontext abhängen könnte.
Bei beiden Zelllinien wurde eine verminderte Wundheilung beobachtet, jedoch wurde während des Assays kein Proliferationsinhibitor verwendet. Da eine erzwungene Expression von miR-486-3p ebenfalls wachstumsassoziierte Messungen beeinflusste, könnte eine verminderte Proliferation zum Wundheilungsphänotyp beigetragen haben. Die Ergebnisse sollten daher als verminderte Wundheilung und nicht als migrationspezifischer Effekt interpretiert werden. Ebenso könnte der 48-Stunden-Matrigel-beschichtete Transwell-Assay durch Unterschiede in der Membranpassage, Proliferation, Überleben oder Adhäsion beeinflusst sein. Die beobachtete Verringerung der Zellen auf der unteren Membranfläche stützt somit eine beeinträchtigte Passage unter den getesteten Bedingungen, isoliert jedoch keinen spezifischen Invasionmechanismus.
Ein weiterer Aspekt betrifft das Ausmaß der Überexpression von miR-486-3p. Die lentivirale Transduktion erhöhte die Menge an miR-486-3p in A549-Zellen um etwa das 1.470-Fache und in H358-Zellen um das 220-Fache im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollgruppen. Eine derart supraphysiologische Expression könnte die seed-abhängige Off-Target-Repression verstärken, die Verfügbarkeit von Komponenten des RNA-vermittelten Stummschaltkomplexes beeinträchtigen oder unspezifischen zellulären Stress auslösen. Da keine Dosis-Wirkungs-Reihe durchgeführt wurde, konnte der Zusammenhang zwischen der Menge an miR-486-3p und den beobachteten Phänotypen nicht bestimmt werden. Zudem verhindert das Fehlen eines inhibitorbasierten Funktionsverlust-Experiments Aussagen über die endogene physiologische Rolle von miR-486-3p in LUAD-Zellen. Die vorliegenden Ergebnisse sollten daher ausschließlich als Folgen einer stabilen, erzwungenen Überexpression interpretiert werden.
Mehrere Einschränkungen sollten berücksichtigt werden. Es wurden nur zwei KRAS-mutierte LUAD-Zelllinien untersucht, und die Verwendung unterschiedlicher Standardmedien beschränkt die Interpretation der Vergleiche mit Beas-2b-Zellen. Die Authentifizierung der Zelllinien und die Mykoplasmen-Testung wurden während der Studie nicht durchgeführt, und U6 wurde als einzige Referenz für die Quantifizierung von miR-486-3p verwendet. Die Studie enthielt außerdem keine Funktionsverlust-, Dosis-Wirkungs-, Reporter-, Rescue- oder funktionelle Wnt-Signalweg-Analysen. Darüber hinaus könnten die Ergebnisse der Wundheilung und der Transwell-Analysen durch Unterschiede in der Proliferation, Vitalität oder Adhäsion beeinflusst worden sein. Schließlich wurden keine Tiermodelle, Patientenproben oder klinischen Validierungskohorten einbezogen. Die Ergebnisse beschränken sich daher auf dieses System mit erzwungener Expression in vitro und belegen weder eine direkte Targeting-Wirkung, noch Kausalität des Signalwegs oder klinische Relevanz.
Zusammenfassend führte ein stabiler, erzwungener Ausdruck von miR-486-3p zu einer Verringerung mehrerer wachstums- und beweglichkeitsassoziiierter Parameter in A549- und H358-LUAD-Zellen und ging mit einer niedrigeren Expression von WNT5B, DVL1, gesamt-β-Catenin und BCL-2 einher. Diese Befunde liefern eine Grundlage für weitere mechanistische Untersuchungen, belegen jedoch weder WNT5B noch DVL1 als direkte Zielstrukturen, noch einen linearen WNT5B/DVL1/β-Catenin-Signalweg oder den klinischen Nutzen von miR-486-3p.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Danksagungen
Die Zhejiang Provincial Medical and Health Science and Technology Plan (2025KY349) und die Jiaxing City Key Supporting Discipline (2023-zc-014) leisteten finanzielle Unterstützung für diese Studie.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 6,8) | Solarbio | T1020 | Vorbereitung des SDS-PAGE-Stapelgels |
| 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) | Solarbio | T1010 | Vorbereitung des SDS-PAGE-Auflösegels |
| 20× TBS-Puffer | Solarbio | 71080 | Stammlösung für das Waschen bei Western Blots und zur Antikörpverdünnung |
| 30%ige Acrylamid/Bis-Acrylamid-Lösung (29:1) | Solarbio | A1010 | Vorbereitung von SDS-PAGE-Gelen |
| 4%ige Paraformaldehyd-Fixierlösung | Servicebio | G1101 | Fixierung für Koloniebildungs- und Transwell-Assays |
| 5× Protein-Lade-Puffer | Beyotime | P0015 | Probenpräparation für SDS-PAGE |
| Ammoniumpersulfat | Solarbio | 427A038 | Polymerisationsinitiator für SDS-PAGE-Gel |
| BCA-Protein-Assay-Kit | Beyotime | P0009-1 | Bestimmung der Protein-Konzentration |
| BCL-2-Antikörper | Boster Biological Technology | A00040-2 | Kaninchen-polyklonaler Antikörper; Western Blot im Verdünnungsverhältnis 1:5.000 |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | TargetMol | C0005 | Assay zur metabolischen Aktivität im Zusammenhang mit Zellwachstum; 10 μL pro 100 μL Kulturmedium |
| Chemilumineszenz-Bildgebungssystem | Bio-Rad | ChemiDoc MP | Bildgebung für Western Blot |
| Chloroform | Servicebio | G3005 | Phasentrennung während der TRIzol-basierten RNA-Extraktion |
| Crystal-Violett-Färbelösung | Servicebio | G1014 | Färbung von Kolonien und Transwell-Membranen |
| DMEM | Servicebio | G4511 | Routinemäßig verwendetes Kulturmedium für Beas-2b-Zellen |
| DVL1-Antikörper | Signalway Antibody | 53180 | Kaninchen-Primärantikörper; Western Blot im Verdünnungsverhältnis 1:5.000 |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Biosharp | BL203B | 10%ige (v/v) Supplementierung für die routinemäßige Zellkultur; 20%ig (v/v) in der unteren Kammer des Transwells |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | Version 8 | Erstellung von Grafiken und statistische Analyse |
| Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (ohne Rox) | Yeasen Biotechnology | 11201ES08 | SYBR Green-basierter quantitativer PCR-Assay |
| Hifair III 1st Strand cDNA Synthese SuperMix für qPCR (mit gDNA-Digester) | Yeasen Biotechnology | 11141ES60 | Reverse Transkription für mRNA RT-qPCR |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Version 22,0 | Statistische Analyse |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1,53 | Dichtometrie bei Western Blots, Messung der Wundfläche, Zählung von Kolonien und Transwell-Zellen |
| Invertiertes Mikroskop | Olympus | CKX53 | Bildgebung von Wundheilungs- und Transwell-Assays |
| Isopropanol | Servicebio | G3006 | RNA-Präzipitation während der TRIzol-basierten Extraktion |
| LV-miR-486-3p und LV-NC Lentiviren-Präparationen | GenePharma | Individuelle Synthese | Vektor für stabile Überexpression von miR-486-3p und scramblter negativer Kontrollvektor |
| Matrigel-Basalmembranmatrix | Corning | 354234 | 1:8 in serumfreiem DMEM verdünnt; endgültige Proteinkonzentration etwa 1 mg/mL |
| Methanol | Xilong Scientific | GB/T 683-2006 | Aktivierung der PVDF-Membran |
| Mikroplattenreader | BioTek | ELx800 | Messung der Absorption bei 450 nm |
| Mikrovolumen-UV-Vis-Spektrophotometer | Allsheng | Nano-600 | Bestimmung der RNA-Konzentration und Bewertung der Reinheit über A260/A280 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1%ige (v/v) Supplementierung für die routinemäßige Zellkultur |
| Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) | Servicebio | G0002 | Waschen von Zellen und Membranen |
| Protease-Inhibitor-Cocktail | APExBIO | K1007 | Zugabe zum RIPA-Lysepuffer |
| Proteinladder | Biosharp | BL712A | Molekulargewichtsreferenz für Western Blot |
| PVDF-Membran | Millipore | K2MA8350E | Proteintransfermembran für Western Blot |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | QuantStudio 5 | Aufnahme von RT-qPCR-Daten |
| RIPA-Lysepuffer | Beyotime | P0013B | Extraktion von gesamtem zellulärem Protein |
| RNA-Extraktionsreagenz (vom Typ TRIzol) | Servicebio | G3013 | Extraktion von Gesamt-RNA |
| RPMI 1640 Medium | Servicebio | G4510 | Routinemäßig verwendetes Kulturmedium für A549- und H358-Zellen sowie serumfreie Transwell-Zellsuspension |
| SDS | Solarbio | S8010 | Reagenz für SDS-PAGE |
| Magermilchpulver | BD | 2271470 | 5%ige Blockierungslösung für Western Blot |
| StarBase v3.0 | Sun Yat-sen University | https://rnasysu.com/encori/ | Analyse der miR-486-3p-Expression aus TCGA-Daten |
| TargetScanHuman | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://www.targetscan.org/vert_80/ | Vorhersage möglicher Bindungsstellen für miR-486-3p |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T8090 | Katalysator für die Polymerisation von SDS-PAGE-Gelen |
| Transwell-Einsätze, 24-Loch, 8 μm Porengröße | Corning | 3428 | Membrantraversierungs-Assay mit Matrigel-Beschichtung |
| Trypsin | Servicebio | G4000 | Zellablösung |
| Tween-20 | Solarbio | 815A043 | Vorbereitung des Waschpuffers für Western Blot |
| Vertikales Elektrophorese-System | Liuyi Biotechnology | DYCZ-24DN | Proteintrennung mittels SDS-PAGE |
| Western HRP-Substrat-Luminol-Reagenz | Affinity Biosciences | KF001 | Chemilumineszente Detektion bei Western Blot |
| Nassübertragungssystem | Bio-Rad | 1703930 | Proteinübertragung auf PVDF-Membran |
| WNT5B-Antikörper | Signalway Antibody | 56808 | Kaninchen-Primärantikörper; Western Blot im Verdünnungsverhältnis 1:5.000 |
| β-Aktin-Antikörper | Abcam | ab8227 | Ladekontrolle; Western Blot im Verdünnungsverhältnis 1:5.000 |
| β-Catenin-Antikörper | Signalway Antibody | 21725 | Kaninchen-Primärantikörper; Western Blot im Verdünnungsverhältnis 1:5.000 |
Referenzen
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