Quantifizierung der embryonalen Letalitätsrate bei Caenorhabditis elegans

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet ein einfaches, kostengünstiges Verfahren zur Quantifizierung der embryonalen Lethalität bei Caenorhabditis elegans. Es ermöglicht eine einfache Erkennung embryonaler Anomalien in verschiedenen Populationen ohne spezielle Geräte oder Wurmpflücken-Expertise. Das Protokoll kann verwendet werden, um die Auswirkungen genetischer Mutationen, RNA-Interferenz-vermittelter Gen-Knockdowns und der Ernährung zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Embryonale Lethalität ist ein Grundphänotyp, der in der Forschung von Caenorhabditis elegans verwendet wird, um Entwicklungsdefekte zu charakterisieren, die durch Faktoren wie toxische Expositionen und genetische Mutationen entstehen. Daher ist es entscheidend, die Durchdringung der embryonalen Lethalität genau zu quantifizieren, um die Mechanismen und die Auswirkungen dieser Störungen auf die Tierentwicklung zu verstehen. Obwohl automatisierte Bewertungsplattformen existieren, erfordern diese Ansätze oft erhebliche finanzielle Investitionen sowie spezialisierte Hardware oder Software. Dieser Artikel beschreibt einen Low-Tech, kostengünstigen Test, der embryonale Lethalität quantifiziert, indem er den Prozentsatz der Embryonen misst, die erfolgreich nicht schlüpfen. Bemerkenswert ist, dass diese Version des Tests die Notwendigkeit eines Wurmpickels überflüssig macht, was ihn für Anfänger besonders geeignet macht. Ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass jede technische Replikation von Nachkommen mehrerer Tiere erzeugt und so die potenziellen Verzerrungen von Einzelwurm-Tests vermeidet. Dieses Protokoll beinhaltet eine Diskussion kritischer Parameter, wie etwa die Mindestanzahl der Nachkommen, die erforderlich ist, um die Phänotypdurchdringung genau zu erfassen, sowie die Begründung für die Methodik. Abschließend geben wir Anleitungen zur Anpassung des Tests, um die Auswirkungen von Gen-Knockdown mittels RNA-Interferenz, pharmakologischen Behandlungen oder Nahrungsergänzung zu bewerten und fügen dem Toolkit der C. elegans-Forscher ein vielseitiges und zugängliches Werkzeug hinzu.

Einleitung

Die embryonale Lethalität ist ein entscheidender Phänotyp zur Bewertung der Rolle von Genen und Umweltfaktoren in der frühen Entwicklung. C. elegans ist ein leistungsstarkes Modell zur Untersuchung von Entwicklungsprozessen aufgrund seiner invarianten Zelllinie, seines transparenten Körpers und seines schnellen^{Lebenszyklus 1}. Die embryonale Lethalität von C. elegans kann verwendet werden, um die Entwicklungsintegrität unter chemischen, pharmakologischen, ernährungsphysiologischen und genetischen Störungen^{zu bewerten 2,3,4,5}. Daher würden zugängliche und vielseitige Methoden zur genauen Quantifizierung der embryonalen Letalitätsrate der Forschungsgemeinschaft zugutekommen.

Fortschrittliche Hochdurchsatz- und Gehaltsmethoden, die die Embryogenese untersuchen, basieren auf spezialisierten Bildgebungssystemen und Software, die oft erhebliche finanzielle Investitionen^{erfordern 4,6,7}, während einfachere High-Throughput-Ansätze hauptsächlich qualitative Anzeigen^{liefern 8,9}. Klassische Methoden hingegen verwenden einen manuellen, kostengünstigen Ansatz, der typischerweise wiederholte Übertragungen einzelner Hermaphroditen mit einem Wurmpickel vorsieht, um die embryonale Lethalität des gesamten Bruts^zu beurteilen^. Allerdings kann diese Methode für Anfänger technisch anspruchsvoll sein und ist nur begrenzt skalierbar. Darüber hinaus quantifizieren klassische Brutgrößen-Assays die embryonale Lebensfähigkeit bei den Nachkommen einer alleinerziehenden Mutter, was unbeabsichtigte Verzerrungen einführen kann.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, einen alternativen, einfachen, kosteneffizienten und vielseitigen Ansatz zur Quantifizierung der embryonalen Lebensfähigkeit bei mittlerem Durchsatz bereitzustellen. Diese Methode misst die embryonalen Tödlichkeitsraten bei Nachkommen mehrerer Tiere pro Replikat, erfordert keinen Wurmpickel und vermeidet spezielle oder kostspielige Ausrüstung. Die Studie zeigt auch, wie die Methode auf häufige Störungen wie RNA-Interferenzen und Medikamenten- oder Nährstofftests angewendet werden kann.

Protokoll

1. C. elegans-Wartung

HINWEIS: Detaillierte Anleitungen zur Haltung von C. elegans finden Sie in WormBook¹¹.

1. Bereiten Sie Erhaltungs-Nematode-Wachstumsmedium (NGM)-Platten vor.
   1. Um 1 L NGM herzustellen, kombinieren Sie 3 g NaCl, 2,5 g bakteriologisches Pepton und 17 g Agar in einer 2-Liter-Flasche. Gib 975 ml destilliertes Wasser und eine Rührstange dazu, dann eine Autoklav für 20 Minuten bei 121 °C.
   2. Lassen Sie das Medium in einem Wasserbad auf 55 °C abkühlen. Stellen Sie die Flasche auf eine Rührplatte und fügen Sie mit aseptischer Technik 25 ml 1 M Kaliumphosphatpuffer und jeweils 1 ml Folgende hinzu: 1 M MgSO₄, 1 M CaCl₂ und 5 mg/mL Cholesterin. Gießen Sie etwa 25 ml in jede 100-mm-Platte.
2. Bereite über Nacht E. coli OP50-Kulturen vor.
   1. Mit aseptischer Technik füllen Sie eine 1-Liter-Erlenmeyer-Flasche auf ein Fünftel ihres Volumens (200 ml) mit LB-Medium. Inokulieren Sie das Medium mit einer einzelnen Kolonie von E. coli OP50 mittels einer sterilen Impfschleife. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C auf einem Orbitalshaker bei 200 U/min.
3. Samen-NGM-Pflegeplatten mit E. coli OP50 (Abbildung 1A).
   1. Die E.-coli-OP50-Kultur wird in autoklavierte Zentrifugenflaschen übertragen und 30 Minuten bei 3.500 x g bei Raumtemperatur gezentrifugiert. Die bakterielle Pellet in ein Zwanzigstel des ursprünglichen Volumens wieder aufhängen. Verwenden Sie 1–1,5 ml konzentrierte Kultur, um jede 100-mm-NGM-Platte auszusäen.
   2. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei Zimmertemperatur, damit die Bakterien wachsen können.
      HINWEIS: Diese Wartungsplatten haben eine hohe Bakteriendichte, um bis zu 4.000 Würmer pro Platte zu unterstützen, was bei einer großen Anzahl von Assays oder bei der Arbeit mit einem langsam wachsenden C. elegans-Stamm wünschenswert ist. Besätete Pflegeplatten können bis zu einem Monat im Kühlschrank bei 4 °C gelagert werden.
4. Etablierung einer primären C. elegans-Kultur (Abbildung 1A).
   1. Verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze, um ein kleines Stück Agar mit ~1.000 Würmern von einer ausgehungerten Wartungsplatte auszuschneiden. Legen Sie das Agar-Stück auf eine entkernte NGM-Platte.
   2. Stellen Sie den neuen Teller in einen Plastikbehälter und bebrüten Sie ihn 3 Tage lang bei 20 °C, bis die Würmer trächtig sind und Eier legen. Stellen Sie sicher, dass der bakterielle Rasen ausreichend ist und die Wurmpopulation nicht verhungert. An diesem Punkt ist die Wurmpopulation bereit für das Experiment.

2. Herstellung von Versuchsmedien und Bakterienkulturen

HINWEIS: In diesem Schritt fahren Sie entweder mit Methode 1 fort, um die Wirkung des RNAi-vermittelten Gen-Knockdowns zu testen, oder Methode 2 zur Untersuchung von Nahrungsergänzungsmitteln.

1. Methode 1: Vorbereitung von experimentellen NGM-Platten für RNAi durch Füttern.
   1. Bereiten Sie 1 L NGM wie in Schritt 1.1 beschrieben vor und fügen dann mit aseptischer Technik 1 ml 1 M IPTG und 1 ml 50 mg/mL Ampicillin hinzu. Gießen Sie etwa 5 ml in jede 35-mm-Platte.
   2. Inokulieren Sie die gewünschte Anzahl von E. coli HT115 RNAi-Fütterungsklonen mit L4440-Plasmiden, die auf C . elegans-Gene von Interesse abzielen, zusammen mit der leeren Vektorkontrolle. Wählen Sie eine einzelne Kolonie mit einer Inokulationsschleife und übertragen Sie sie in 1,5 mL LB mit 50 μg/mL Ampicillin. Inkubieren Sie 18 Stunden bei 37 °C auf einem Orbitalshaker bei 200 U/min.
   3. Seed 35 mm NGM-Platten mit Ampicillin und IPTG sowie 100 μL E. coli HT115-Kultur über Nacht und Vorbereitung von zwei technischen Replikaten pro Bedingung. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur, um das Bakterienwachstum zu ermöglichen und die Produktion von doppelsträngiger RNA zu induzieren. Lagern Sie eine gleiche Anzahl unentkernter Teller bei 4 °C für spätere Verwendung beim Eiertransfer.
2. Methode 2: Bereite experimentelle NGM-Platten mit einem Nährstoff- oder Arzneimittelpräparat vor.
   1. Bereiten Sie 1,5x konzentriertes NGM vor, indem Sie den Anweisungen aus Schritt 1.1 folgen, fügen Sie jedoch 642 ml destilliertes Wasser statt 975 ml hinzu. Bewahren Sie das zubereitete Medium in einem 55 °C Wasserbad.
   2. Bereiten Sie einen wasserbasierten Fond des gewünschten Ergänzungsmittels mit dem 3-fachen der Zielkonzentration vor (zum Beispiel stellen Sie Platten mit 40 mM Natriumformat eine 120 mM Fond her). Berechnen Sie das erforderliche Lagervolumen, indem Sie die Anzahl der Versuchsplatten mit 1,666 mL (ein Drittel des Plattenvolumens) multiplizieren. Verwenden Sie einen Spritzenfilter, um die Brühe zu filtern, und erwärmen Sie sie dann in einem Wasserbad auf 55 °C.
   3. In einem 50-mL konischen Rohr mischen Sie 2 Teile 1,5x NGM mit 1 Teil Ersatz. Um keine Nahrungsergänzungsmittel zu kontrollieren, mische 2 Teile 1,5x NGM mit 1 Teil heißem, sterilem Wasser. Vorsichtig mischen, indem Sie das Rohr 10 Mal umkehren, und gießen Sie dann mit aseptischer Technik schnell etwa 5 ml Medium auf jede 35-mm-Platte.
      HINWEIS: 1,5x NGM wird verwendet, um eine mittlere Verdünnung auszugleichen, wenn große Mengen Nahrungsergänzungsmittel hinzugefügt werden. Wenn jedoch der Wirkstoff- oder Metabolitbestand auf 100× oder mehr der Endkonzentration konzentriert ist, kann normales NGM anstelle von 1,5× NGM verwendet werden. Bei der Ergänzung mit einer organischen Säure hilft die Verwendung von Natriumsalz, einen Abfall des mittleren pH-Werts zu verhindern.
   4. Mit aseptischer Technik wird eine 50-ml-Erlenmeyer-Flasche auf ein Fünftel ihres Volumens (10 ml) mit LB-Medium gefüllt. Inokulieren Sie mit einer Kolonie von E. coli OP50 und inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C auf einem Orbitalshaker bei 200 U/min.
   5. Samen 35-mm-NGM-Platten mit 100 μL E . coli OP50-Kultur über Nacht, wobei pro Bedingung zwei technische Replikate vorbereitet werden. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei Zimmertemperatur. Lagern Sie eine gleiche Anzahl unentkernter Teller bei 4 °C für spätere Verwendung beim Eiertransfer.

3. Erreichen einer synchronisierten Population von L1-Larven

1. Bereiten Sie alkalische Bleichlösung vor, indem Sie 7 ml steriles Wasser, 2 ml 5%ige Natriumhypochloritlösung und 1 ml 5 N NaOH kombinieren.
2. Bereiten Sie den M9-Puffer vor, indem Sie 3 g KH₂PO₄, 6 g Na₂HPO₄ und 5 g NaCl in 1 l destilliertes Wasser auflösen und dann den pH-Wert auf 6,5 anpassen. Autoklaven 20 Minuten bei 121 °C, die Lösung abkühlen lassen und dann aseptisch 1 ml 1 M MgSO4 hinzufügen.
3. Wasche trächtige erwachsene Würmer (Schritt 1.4.2) mit M9-Puffer von der Platte und übertrage sie in ein 15-mL konisches Rohr. Zentrifugiere mit 350 x g für 2 Minuten, sauge das Überstandsmittel ab und fülle das Rohr mit frischem M9-Puffer. Wiederhole die Wäsche zweimal.
4. Geben Sie 2 ml M9-Puffer und 2 ml alkalische Bleichlösung zum Wurmpellet. Wirbeln und schütteln kräftig, überprüfen Sie regelmäßig unter dem Mikroskop, bis fast alle Würmer aufgelöst sind.
5. Fülle das Rohr mit M9-Puffer und zentrifugiere bei 350 x g für 2 Minuten. Entferne das Überdachungsmittel durch Umkehren des Rohrs und wasche dann viermal mit M9-Puffer. Achten Sie darauf, dass die erste Reinigung unmittelbar nach der Lysierung der Würmer erfolgt, um Überbleichen zu verhindern. Nach der letzten Wäsche füllen Sie das Rohr mit 8 ml M9-Puffer und brüten Sie 18–20 Stunden auf einer Schaukel aus, bis die Eier schlüpfen.

4. Kultivierung mütterlicher Populationen

1. Setzen Sie fünf 3-μL-Tropfen Wurmsuspension auf einen Glasschlitten und zählen Sie unter dem Mikroskop die Anzahl der geschlüpften L1-Larven. Teilen Sie die Gesamtmenge durch 15, um die Konzentration pro Mikroliter zu erhalten.
2. Nehmen Sie 30 L1-Larven auf jede ausgezaimte 35-mm-Platte und inkubieren Sie bei 20 °C für 72 Stunden. Wenn die experimentellen Bedingungen eine Entwicklungsverzögerung hervorrufen, verlängern Sie die Brutzeit, bis die Würmer trächtig sind und mit dem Eilegen beginnen (Abbildung 1B).

5. Embryonen auf Schlüpfplatten übertragen

1. Nehmen Sie die unentkernten 35-mm-Teller aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie Zimmertemperatur erreichen.
2. Untersuchen Sie die Wurmplatten unter dem Mikroskop und bestätigen Sie, dass sie mehr als 100 Embryonen enthalten, ohne dass geschlüpfte L1-Larven vorhanden sind.
3. Fülle die Platte vorsichtig mit M9-Puffer. Verwenden Sie eine Vakuumleitung, um die Flüssigkeit abzusaugen, und entfernen Sie die mütterliche Population. Stellen Sie sicher, dass keine erwachsenen Würmer auf dem Teller zurückbleiben.
4. Füllen Sie eine Mikropipettenspitze mit 200 μL M9-Puffer und pipettieren Sie kräftig auf und ab, um Embryonen vom bakteriellen Rasen zu lösen. Führen Sie beim Betrachten durch das Mikroskop die Pipettenspitze zu embryodichten Bereichen.
5. Nimm eine ungesäte Platte und pipettiere einen Tropfen Embryosuspension in die Mitte. Untersuchen Sie den Tropfen unter dem Mikroskop. Enthält er nicht 100–300 Embryonen, wird mehr Embryosuspension hinzugefügt, bis dieser Bereich erreicht ist. Stellen Sie sicher, dass keine Würmer aus der elterlichen Population mit den Embryonen übertragen werden.
6. Lassen Sie die Flüssigkeit trocknen und inkubieren Sie die Transferplatten dann mindestens 24 Stunden bei 20 °C.
   HINWEIS: Wenn L1-Larven bereits auf der Versuchsplatte vorhanden sind, verwenden Sie eine Vakuumleitung anstelle einer M9-Spülung, um die gesamte mütterliche Population einzeln zu entfernen. Dies verhindert, dass L1-Jungtiere weggespült werden, die nicht wie Embryonen am bakteriellen Rasen haften. Fahren Sie mit dem Nachkommentransfer fort, der nun sowohl Embryonen als auch L1-Larven umfasst. Stellen Sie sicher, dass derselbe Ansatz auf alle Bedingungen angewendet wird.

Abbildung 1: Experimentelle Zeitleiste und Schematische der wichtigsten Schritte im embryonalen Lethalitätsassay. (A) Flussdiagramm-Zeitleiste, die die gesamte Dauer des experimentellen Protokolls darstellt, von der Vorbereitung des Wartungsmediums bis zur Bewertung der Schlüpfplatten. Schlüsselverfahren sind für die entsprechenden Tage des Experiments angegeben. (B) Schematisch des embryonalen Lethalitätstests (Schritte 4–6). Am 4. Tag werden synchronisierte L1-Larven zu den experimentellen RNAi- oder Supplementplatten hinzugefügt, um eine mütterliche Population zu etablieren. Nach 72 Stunden, am Tag 7, sobald die Würmer Eier gelegt haben, wird die mütterliche Population weggespült, während die Embryonen am bakteriellen Rasen befestigt bleiben. Die Embryonen werden dann mit einer Pipette vom Rasen gespült und auf eine Schlüpfplatte übertragen, mit mindestens 100 Embryonen pro Platte. Nach 24 Stunden Brut werden geschlüpfte Larven und ungeschlüpfte Embryonen gezählt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

6. Wertungsplatten

1. Verwenden Sie einen permanenten Marker, um ein etwa 4 mm × 4 mm großes Gitter auf den Deckel einer 35 mm Petrischale zu zeichnen, und legen Sie den Deckel dann unter die Platte. Verwenden Sie das Raster als Leitfaden und zählen Sie unter dem Mikroskop die Anzahl der L1-Larven und ungeschlüpften Embryonen mit einem Hand-Klickzähler.
2. Kombinieren Sie die Anzahl technischer Replikate, um eine angemessene Gewichtung jeder Replikat basierend auf ihrer Nachkommenzahl sicherzustellen. Konkret summiert man die Anzahl der ungeschlüpften Embryonen und geschlüpften Larven über technische Replikaten.
3. Berechnen Sie eine embryonale Letalitätsrate pro biologischer Replikation, indem Sie die Anzahl der Embryonen (ungeschlüpfte Würmer) durch die Gesamtzahl der Würmer und Embryonen teilen und dann mit 100 multiplizieren, um den Wert als Prozentsatz auszudrücken.
   HINWEIS: Wenn eine Platte nur geschlüpfte Larven oder nur Embryonen enthält, kann dieser Zählschritt übersprungen werden, da die embryonale Tödlichkeitsrate bei 0 (0 %) bzw. 1 (100 %) liegt.

7. Statistische Analyse

1. Wiederholen Sie das gesamte Experiment mindestens dreimal, um unabhängige biologische Replikationen zu erhalten. Für jede biologische Replikation verwenden Sie pro Bedingung zwei technische Replikationsplatten, mit mindestens 100 Embryonen pro technischer Replikat.
2. Bestimmen Sie, ob die embryonalen Lethalitätsraten zwischen Erkrankungen mit Einweg-ANOVA signifikant abweichen, gefolgt von post-hoc-paarweisen Student-t-Tests mit mehrfacher Testkorrektur, wie etwa der Benjamini-Hochberg-Methode.
   HINWEIS: Die Kombination zweier technischer Replikate ergibt mindestens 200 Embryonen pro biologischer Replikat. Dies erfüllt die Stichprobengrößenanforderung (~184 Embryonen/Bedingung), geschätzt durch die R-Basisfunktion power.prop.test, um einen Unterschied von 15 Prozent in der Letalität (z. B. 20 % vs. 35 %) mit 90 % Potenzstärke und einem Signifikanzniveau von α = 0,05 zu erkennen.

Ergebnisse

Der embryonale Lethalitätstest wurde in zwei Stämmen durchgeführt: dem Wildtyp N2 und dem RNAi-hypersensitiven Stamm rrf-3(pk1426). Mit RNAi durch Fütterung haben wir Gene geschlagen, die zuvor als embryonale Letalität in Hochdurchsatz-Screens ^9,12 gemeldet wurden. Abbildung 2 zeigt eine repräsentative Demonstration der Assay-Leistung. Der T04G9.4-Knockdown führte bei sowohl rrf-3 (pk1426) als auch N2-Tieren zu nahe...

Diskussion

Mehrere Schritte sind entscheidend für die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit des Assays. Zunächst muss der Bleichschritt sorgfältig getimt werden, um erwachsene Würmer aufzulösen, ohne die Embryonen zu schädigen. Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Übertragung einer ausreichenden Anzahl von Embryonen zum Zählen: Zu wenige verringern die Genauigkeit, während zu viele das Zählen unnötig mühsam machen. Als Nächstes sollte der Embryotransfer erfolgen, bevor die Embryonen schlüpfen. Andernf...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ampicillin-Natriumsalz	Sigma-Aldrich	A9518
Bakteriologisches Pepton	Fischer Scientific	DF0118-17-0
C. elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Wildtyp
C. elegans NL2099	Caenorhabditis Genetics Center	NL2099	rrf-3(pk1426) II. RNAi-empfindlich
Kalziumchlorid, wasserfrei	Sigma-Aldrich	746495
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C3045
Konische Zentrifugengefäße, 15 mL	VWR	60818-725
Kulturröhrchen, 14 mL	VWR	470150-966
Membranpumpe	Amazon	TC-100
Dissektionsmikroskop	AmScope	SM-2
Escherichia coli HT115	Caenorhabditis Genetics Center		RNAse III-defizient, für RNAi-Fütterungsexperimente verwendet
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center
Granulierter Agar	Fischer Scientific	BP97445
Handzähler	LabDepot	HTCP01
IPTG, dioxanfrei (Isopropyl-b-D-thiogalactosid)	US Biological	I8500
LB-Bouillon (Miller)	US Biological	L1520	Um LB-Medium herzustellen, lösen Sie 25 g LB-Pulver in 1 L destilliertem Wasser. Autoklavieren Sie für 20 min bei 121,1 °C.
Einwegspritze mit Luer-Lok	BH Supplies	BH20LL
Magnesiumsulfat	Sigma-Aldrich	M2643
Objektträger	Sail Brand	7101
Petrischalen, 100 mm	Tritech Research	T3371
Petrischalen, 35 mm	Tritech Research	T3501
Kaliumphosphatpuffer (PPB)			Um Kaliumphosphatpuffer (1 M) herzustellen, lösen Sie 98 g Kaliumphosphatmonohydrat und 48 g Kaliumphosphatdihydrat in 1 L destilliertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 6 ein. Autoklavieren Sie für 20 min bei 121 °C.
Kaliumphosphatdihydrat	Sigma-Aldrich	795496
Kaliumphosphatmonohydrat	Sigma-Aldrich	529568
Schüttelinkubator (nutatierer Mischer)	Corning LSE	6720
Serologische Pipetten, 25 mL	Corning	4489
Serologische Pipetten, 5 mL	Celltreat	229235
Schüttelinkubator Infors Multitron	INFORS HT	NA
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S9888
Natriumhydroxidlösung, 5 N	Fisher Scientific	SS256-500
Natriumhypochlorit, 5%	LabDepot	LC246302
Natriumphosphatdihydrat	Sigma-Aldrich	S9763
Sorvall ST1 Plus Zentrifuge	Thermo Scientific	75016030
Rührplatte	ONilab	ONi28-S
Spritzfilter	Semmerfeld	JQP033022QE1
Wasserbad	FOUR E's Scientific	WB401