Mapping Microglial Parameters Software (MMPS): Ein Open-Source-, benutzerfreundliches Werkzeug zur quantitativen Analyse der Mikrogliamorphologie

Zusammenfassung

Die Mapping Microglial Parameters Software (MMPS) ist eine benutzerfreundliche Analysepipeline, die keine Programmierkenntnisse erfordert und die Analyse der einzelnen Mikroglialmorphologie aus Immunfluoreszenzbildern halbautomatisiert. Validiert in einem von Nagetieren induzierten Lipopolysaccharid-induzierten Neuroinflammationsmodell, erkennt MMPS reproduzierbar aktivierungsassoziierte morphologische Veränderungen und ermöglicht eine standardisierte, skalierbare mikrogliale Phänotypisierung.

Zusammenfassung

Mikroglia sind myeloid-abgeleitete Immunzellen des zentralen Nervensystems, die Gewebeabbau und -umbildung nach neurologischer Verletzung vermitteln und sich als vielversprechende therapeutische Ziele bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen erwiesen haben. Eine quantitative Analyse der Mikroglialmorphologie kann subtile Unterschiede zwischen mikroglialen Subpopulationen aufdecken und dabei wichtige Informationen vor Ort erhalten. Viele derzeit verfügbare Plattformen zur Analyse von Mikroglialmorphologie sind jedoch entweder nicht öffentlich zugänglich oder erfordern spezialisierte rechnerische Expertise, was ihre breite Verbreitung einschränkt. Um diese Einschränkungen zu beheben, wurde eine Open-Source-Plattform zur Analyse der Mikroglialmorphologie entwickelt, genannt Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), die Python 3.11 verwendet. MMPS ist mit Workflows auf Basis von Immunfluoreszenz kompatibel und erfordert keine Codierungsexpertise für Installation oder Betrieb. Die Software automatisiert die Analyse einzelzelliger Mikroglialmorphologie teilweise über eine barrierefreie grafische Benutzeroberfläche und integriert anpassbare Bildverarbeitungs- und Maskengenerierungs-Workflows. Die Studie beinhaltet die Validierung von MMPS mittels eines von Nager-Lipopolysaccharid (LPS)-induzierten Neuroinflammationsmodells. Quantitative Tieranalysen zeigten, dass Mikroglia von LPS-behandelten Tieren im Vergleich zu vehikelbehandelten Kontrollgruppen signifikant eine größere Somafläche (p < 0,01) und einen reduzierten Zellumfang (p < 0,05) aufwiesen, was mit morphologischen Merkmalen in Verbindung mit Mikroglialaktivierung und Neuroinflammation übereinstimmt. Insgesamt bietet MMPS eine standardisierte, reproduzierbare Plattform für die quantitative Analyse der Mikroglialmorphologie in verschiedenen Laboren.

Einleitung

Mikroglia sind angeborene Immunzellen des zentralen Nervensystems (ZNS), die ihre Umgebung kontinuierlich auf Krankheitserreger und^{Gewebeschäden untersuchen}. Nach der Aktivierung ziehen Mikroglia ihre Fortsätze zurück und wechseln von einer homöostatischen, verzweigten Morphologie zu einem amöbooiden Phänotyp ^2,3. Bei neurodegenerativen Erkrankungen wie ischämischem Schlaganfall ^4,5 und Alzheimer ^6,7. Mikroglia perpetuieren Neuroentzündungen oft durch anhaltende Zytokinproduktion, umfangreichen Gewebeabbau und Phagozytose². Diese Prozesse tragen zur Störung der neurovaskulären Einheit bei, verschärfen die Mikroglialaktivierung und CNS-Verletzung⁸ weiter, wodurch Mikroglia zu vielversprechenden therapeutischen Zielen ^9,10 wird.

Ein Ansatz zur Identifizierung subtiler Unterschiede zwischen mikroglialen Subpopulationen bei neurodegenerativen Erkrankungen ist die morphologische Analyse. Dies wird üblicherweise mit Cx3CR1-GFP-Tieren mit einer in vivo Zweiphotonenmikroskopie¹¹ oder durch Immunfluoreszenz-(IF)-Markierung etablierter Mikroglialmarker wie dem ionisierten calciumbindenden Adaptormolekül-1 (Iba1) oder dem P2Y-Purinozeptorrezeptor¹² durchgeführt. Obwohl Mikroglia nach einer Verletzung häufig zwischen homöostatischen und amöboiden Morphologien wechseln, haben frühere Studien gezeigt, dass Mikroglia auch zusätzliche Phänotypen annehmen können, darunter hyperverzweigte Mikroglia ^3,13, Waben-Mikroglia ^3,14, reaktive Mikroglia¹⁵ und Stab-Mikroglia ^3,16. Mikrogliale Morphologiestudien basieren jedoch oft auf der manuellen Kategorisierung homöostatischer und amöboider Phänotypen. Diese Ansätze erfordern spezialisierte Analysepipelines, die häufig keine Standardisierung zwischen Laboren aufweisen und die Unterscheidung ähnlicher Morphologien, wie homöostatischen versus hyperverzweigten Phänotypen, selbst für ausgebildetes Personal erschweren¹⁷. Darüber hinaus erfordert die IF-basierte Analyse subtiler morphologischer Veränderungen hochauflösende Bildgebung, was zusätzliche technische Herausforderungen darstellen kann.

Um diese Einschränkungen zu beheben, wurden mehrere analytische Plattformen entwickelt, die semi-automatisch¹¹ oder¹⁸ Mikroglia erkennen und mehrere binäre Darstellungen der Zellen, sogenannte "Masken", über benutzerdefinierte Zielbereiche (z. B. 200–800 μm²) erzeugen. Diese Ansätze verringern Nutzerbias, verbessern die Reproduzierbarkeit und erhöhen die analytische Effizienz. Trotz dieser Fortschritte haben viele derzeit verfügbare Softwareplattformen Einschränkungen, die die breite Verbreitung einschränken, darunter fehlende Open-Source-Zugänglichkeit¹⁷, Anforderungen an Programmierkenntnisse 11,19,20, Abhängigkeit von In-vivo-Zweiphotonenmikroskopiesystemen ^11,19, Fehlen intuitiver grafischer Benutzeroberflächen 11,21,22, langsam Verarbeitungsgeschwindigkeiten¹¹ oder Abhängigkeit von kommerziellen Softwareplattformen^{12, 19, 21}. Obwohl neuere Studien begonnen haben, einige dieser Probleme zu adressieren, sind viele bestehende Plattformen weiterhin schlecht für IF-basierte Arbeitsläufe geeignet, die weiterhin weit verbreitet zur Untersuchung der Mikroglialmorphologie verwendet werden.

Hier wird eine benutzerorientierte Plattform zur Analyse der Mikroglialmorphologie namens Mapping Microglial Parameters Software (MMPS) vorgestellt. MMPS erfordert keine Programmierkenntnisse, integriert sich in etablierte ImageJ-basierte Workflows und ist speziell für den Einsatz mit IF-Images konzipiert. Die Software wurde in Python 3.11 entwickelt und integriert Konzepte aus zuvor veröffentlichten Open-Source-Morphologieplattformen¹¹. MMPS verfügt über eine intuitive grafische Benutzeroberfläche, die es den Nutzern ermöglicht, große Mengen von IF-Bildern mit mehreren anpassbaren Bildverarbeitungsoptionen zu importieren und zu verarbeiten. Die Plattform integriert außerdem manuelle Zellauswahl, um Überprobenartefakte während der IF-Bildgebung zu minimieren, sowie manuelle Soma-Umrisse, um die Einbeziehung zellulärer Prozesse in Soma-Messungen zu verhindern. Darüber hinaus enthält MMPS anpassbare Maskengenerierungsparameter und mehrere Qualitätssicherungsfunktionen zur Verbesserung der Maskengenauigkeit. Die Software berechnet mehrere häufig verwendete morphologische Parameter, darunter Umfang, durchschnittliche Schwerpunktentfernung, Maskenfläche, Exzentrizität, Rundung und Soma-Fläche. Für fortgeschrittenere Studien sind MMPS-generierte Ausgaben mit mehreren ImageJ-Plugins kompatibel und können mit begleitenden Plugins für Fraktal-, Skelett- und Hüllenanalysen weiter analysiert werden.

MMPS wurde mit einem von Nagern induzierten Lipopolysaccharid (LPS)-induzierten Neuroinflammationsmodell validiert, indem mikrogliale Veränderungen in der kortikalen Schicht IV untersucht wurden. Quantitative Analysen zeigten, dass die LPS-Verabreichung die mikrogliale Somafläche signifikant vergrößerte und gleichzeitig den Zellumfang verringerte im Vergleich zu vehikelbehandelten Kontrollen, was darauf hindeutet, dass MMPS subtile morphologische Veränderungen im Zusammenhang mit der mikroglialen Aktivierung genau erkennt.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden gemäß dem West Virginia University Institutional Animal Care and Use Committee (Protokoll #2109047180) und dem Leitfaden für die Pflege und Nutzung von Labortieren, unterstützt von den National Institutes of Health, durchgeführt. Die bei dieser Methode verwendete Ausrüstung, Reagenzien und Software sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Versuchstiere

1. Beschaffen Sie 10 männliche Sprague-Dawley-Ratten (2-3 Monate alt). Sobald die Ratten in der Tiereinrichtung ankommen, sollten sie in einem 12-Stunden-Licht/Dunkel-Zyklus mit Ad-Libitum-Zugang zu Futter und Wasser untergebracht werden. Nach der Ankunft werden die Ratten drei Tage lang akklimatisiert, bevor sie sie einsetzen.
2. Zuweisen Sie Ratten zufällig Fahrzeug- oder LPS-behandelten Gruppen (n = 5 Ratten/Gruppe).
   HINWEIS: Aufgrund der geringen Anzahl der zu verwendenden Ratten kann eine einfache Randomisierungsstrategie angewandt werden, bei der computergenerierte Zufallszahlen verwendet werden, um die Ratten einer Behandlungsgruppe zuzuordnen.
3. Überwachen Sie Ratten nach einer Behandlung von "Krankheitsverhalten": Gewichtsverlust (>15 %), Porphyrinsekretion, Atemwegsanomalien oder verminderte Aktivität.
   HINWEIS: Symptome des Krankheitsverhaltens treten oft innerhalb der ersten 12 Stunden nach der Verabreichung auf, daher sollten Sie frühmorgens (6-8 Uhr) Mittel injizieren, das Verhalten tagsüber überwachen und die Ratten spät am Tag (17-19 Uhr) in die Einrichtung zurückbringen.

2. Neuroinflammationsmodell

1. Bereiten Sie LPS-(O111:B4)-Lagerlösung (10 mg/mL) vor, indem Sie 50 mg LPS in 5 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung auflösen.
   HINWEIS: LPS ist ein Endotoxin. Forscher sollten die SOP ihrer Institution für den Umgang und die Entsorgung befolgen.
2. Wiegen Sie die Ratten und injizieren Sie dann intraperitoneal mit LPS (10 mg/kg) oder PBS (Vehikel).
3. Basierend auf dem Gewicht der Ratten wird ein Einspritzvolumen zwischen 150–300 μL erwartet.
4. Ratten 24 Stunden nach der Injektion durch Herzperfusion und Enthauptung werden Ratten eingeschläfert.
5. Betäuben Sie Ratten mit inhaliertem Isofluran (5 % in_O2) für 5–10 Minuten. Bestätigen Sie die Anästhesie durch das Fehlen des Pedalrückzugsreflexes.
6. Während der Betäubung machen Sie einen mittleren Thoraxschnitt, um das Zwerchfell und das Brustbein freizulegen. Klemmen Sie den Xiphoideusprozess mit Hämostaten ab, um die Brusthöhle freizulegen.
7. Schneiden Sie das Zwerchfell und den Brustkorb in Richtung der Vordergliedmaßen, um das Herz freizulegen.
8. Klemme die absteigende Aorta und die untere Vena cava mit Hämostaten ab. Führe eine 25-Gauge-Flügelnadel in den linken Ventrikel ein.
9. Perfusere Ratten mit eiskaltem PBS (25 mL bei 30 mL/min) mit einer Peristaltikpumpe. Schneide den linken Vorhof innerhalb weniger Sekunden nach Beginn der Perfusion ein, um den Durchfluss zu ermöglichen.
10. Perfuserratten mit 4 % Paraformaldehyd (25 mL bei 30 mL/min).
    VORSICHT: Behandeln Sie Paraformaldehyd mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung in einer gut belüfteten Umgebung. Entsorgen Sie Paraformaldehydabfälle gemäß institutionellen und lokalen Vorschriften.
11. Ratten mit einer Guillotine enthaupten, nach der Perfusion.
    HINWEIS: Befolgen Sie die Richtlinien Ihrer Institution bezüglich der Erfassung von Enthauptungen und dem Schärfen der Klingen.
12. Legen Sie den Schädel frei, indem Sie die Kopfhaut zur Ohrmuschel zurückziehen.
13. Brechen Sie das Stirnbein mit Hämostaten oder Rongeuren, die in die Augenhöhlen eingeführt werden.
14. Führe die Pinzette in das Foramen magnum ein und ziehe die Parietalknochen ab.
15. Entfernen Sie das Gehirn mit feinen Pinzetten und inkubieren Sie über Nacht in 4% Paraformaldehyd.
16. Übertrage die Gehirne nacheinander in 20 % Saccharose und 30 % Saccharose über Nacht zur Kryoschutz.

3. Immunfluoreszenz

1. Frosten Sie kryogeschützte Gehirne in Tissue Tek O.C.T.-Compound auf Trockeneis ein.
2. Schnitt der Gehirne bei 30 μm mit einem Kryostat.
3. Sammeln Sie Abschnitte in PBS und übertragen Sie sie in Netzbrunnen, die in eine 12-Brunnen-Platte eingefügt werden.
4. Wählen Sie mindestens zwei Abschnitte pro Ratte aus, die den vorderen dorsalen Hippocampus enthalten.
5. Wasche Abschnitte zweimal während des Schaukelns für 5 Minuten in PBS.
6. Permeabilisiere Abschnitte mit 0,3 % Triton X-100/PBS für 45 Minuten beim Schaukeln.
   HINWEIS: Verwenden Sie 3 ml Lösung pro Wasch- oder Inkubationsschritt, sofern nicht anders angegeben.
7. Wasche Abschnitte zweimal für 5 Minuten in PBS.
8. Verdünne die Antigenentnahmelösung auf 1x in PBS und gib pro Bohrloch 2 ml zu.
9. Teile 20 Minuten lang bei 80°C in einem Wasserbad inkubieren.
10. Lassen Sie Abschnitte auf Zimmertemperatur abkühlen, bevor Sie fortfahren.
11. Wasche Abschnitte zweimal für 5 Minuten in PBS.
12. Blockiere Abschnitte mit 10 % Donkey Serum/0,05 % Triton X-100/PBS für 2 Stunden bei 37 °C beim Schütteln bei 75 U/min.
13. Wasche Abschnitte dreimal mit 1 % Eselserum/0,05 % Triton X-100/PBS 5 Minuten lang.
14. Transferiere Sektionen in eine neue 12-Well-Platte ohne die Nettobohrungen, die 500 μL primäre Anti-Iba1-Antikörperlösung enthalten, die in 1 % Eselserum/0,05 % Triton X-100/PBS hergestellt wird.
15. Stellen Sie negative Kontrollen vor, indem Sie den primären Antikörper aus der Inkubationslösung weglassen.
16. Inkubieren Sie alle Abschnitte über Nacht bei 4°C auf einem orbitalen Rocker
17. Teile zurück in Netzbrunnen.
18. Wasche Abschnitte dreimal mit 1 % Eselserum/0,05 % Triton X-100/PBS 10 Minuten lang.
19. Inkubiere Schnitte mit Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:1000 Verdünnung) in 1 % Eselserum/0,05 % Triton X-100/PBS für 1,5 Stunden bei Zimmertemperatur.
    HINWEIS: Minimieren Sie die Lichtbelastung bei allen weiteren Eingriffen und wickeln Sie die Platten in Alufolie, um den Verfall der Fluorophore zu verhindern.
20. Wasche Abschnitte zweimal für 5 Minuten in PBS.
21. Teile auf Objektträger montieren.
22. Lufttrocknungsrutschen im Dunkeln für >2 H.
23. Überdeckungsabschnitte verwenden wasserlösliche Verbindungen.
24. Bereiten Sie Negativkontroll-Objektträger mit einem Montagemedium vor.
25. Bewahre die Objektträger in einer Folienbox bei Raumtemperatur in einer dunklen Umgebung auf.

4. Bildgebung

1. Identifizieren Sie die Pixelgröße eines Bildgebungssystems bei 40-facher Vergrößerung. Wenn die Skala nicht gefunden wird, fügen Sie jedem Bild eine Skalaleiste hinzu.
2. Verwenden Sie DAPI-Färbung, um ein dichtes Band von kortikalen Kernen mit geringer Vergrößerung zu identifizieren, das der kortikalen Schicht IV entspricht.
3. Fokussieren Sie das Bild auf die identifizierte kortikale Region.
4. Wechsle auf die 40-fache Vergrößerung.
5. Passen Sie die Kanalbelichtungseinstellungen an, um die Trennung von DAPI- und Iba1-Signalen von der Hintergrundfluoreszenz zu maximieren.
6. Erwache Z-Stack-Bilder (> 30 Schritte), die die gesamte Tiefe der Mikroglia abdecken.
7. Erzeugen und speichern Sie ein zusammengesetztes Maximalintensitätsprojektionsbild aus dem aufgenommenen Z-Stack beider Flecken.
   HINWEIS: Optimieren Sie die Belichtungs- und Z-Stack-Einstellungen für jedes Bild, um die Signaltrennung zwischen DAPI/IBA1 und Hintergrundfluoreszenz zu maximieren. Schlechte Signaltrennung verringert die Genauigkeit der Maskengenerierung.

5. Software zur Kartierung von Mikroglialparametern (MMPS)

1. Speichere alle zusammengesetzten Bilder in einem einzigen Bildverzeichnis.
2. Erstelle ein separates Ausgabeverzeichnis für MMPS-generierte Ergebnisse.
3. Laden Sie das MMPS-Standalone-Paket oder MMPS.py Skript aus dem GitHub-Repository herunter.
4. Installiere alle in der requirements.txt Datei aufgeführten Abhängigkeiten, wenn du MMPS über MMPS.py startest.
5. Öffne das MMPS-Paket oder führe MMPS.py Skript aus.
6. Wählen Sie "Bilderordner auswählen" und wählen Sie das Bildverzeichnis.
7. Wählen Sie "Ausgabeordner auswählen" und wählen Sie das Ausgabeverzeichnis.
8. Erteile Ordnerzugriffsberechtigungen, wenn das Betriebssystem dazu auffordert.
   HINWEIS: Weitere Installationsanweisungen, Fehlersuchanleitungen und Anwendungsbeispiele finden sich in der ergänzenden Dokumentation und im GitHub-Repository.
9. Wählen Sie "Image Labeling" und weisen Sie jedem Bild Tierkennungen und Behandlungsgruppen zu.
   HINWEIS: Wenn die Bildkennzeichnung übersprungen wird, fordert MMPS vor dem Datenexport nach Behandlungsgruppen- und Tieridentifikatoren an.
10. Gib die Pixelgröße unter dem Reiter "Parameter" ein.
11. Wählen Sie "Kalibrieren aus der Skalaleiste" aus, wenn die Pixelgröße unbekannt ist. Wählen Sie bei Aufforderung den Anfangs- und Endpunkt der Tonleiterleiste aus. Geben Sie die bekannte Skala-Bar-Entfernung in Mikrometern ein.
12. Wählen Sie den Fluoreszenzkanal, der das Mikroglialsignal enthält.
13. Wählen Sie Bilder zur Verarbeitung aus, indem Sie das Kästchen neben jedem Bildnamen ankreuzen. Verarbeiten Sie Bilder einzeln, wenn sich die Hintergrundfluoreszenz zwischen den Bildern erheblich unterscheidet.
14. Überprüfen Sie die Reiter "Original", "Vorschau", "Verarbeitet" und "Masken", um Bildbearbeitungsphasen zu vergleichen.
15. Wählen Sie "Vorschau auf aktuelles Bild" aus, um die Bildverarbeitungseinstellungen auszuwerten.
16. Passen Sie die Rolling-Ball-Hintergrundsubtraktion, Denoising und Schärfungseinstellungen nach Bedarf an.
17. Verwenden Sie Rolling-Ball-Werte zwischen 5–150 Pixel für die Hintergrundsubtraktion.
18. Verwenden Sie Denoising-Werte zwischen 3–7 Pixeln, um ungleichmäßige Beleuchtungsartefakte zu reduzieren.
19. Verwenden Sie Schärfungswerte zwischen 1 und 2, um die Kantendefinition zu verbessern.
20. Wählen Sie nach der Optimierung der Bildverarbeitungseinstellungen "Ausgewählte Bilder verarbeiten".
    HINWEIS: Die Bildbearbeitungszeit variiert je nach Bildanzahl und ausgewählten Parametern.
21. Wählen Sie "Somas auswählen (Alle Bilder)".
22. Wählen Sie "Farbe anzeigen (C)", um RGB-Composite-Bilder anzuzeigen. Wähle "Channels..." und wählt ungenutzte Kanäle ab, wenn die Bildfarbung verzerrt erscheint.
23. Wähle mikrogliale Somas aus, die DAPI- und Iba1-Kolokalisation anzeigen. Vermeiden Sie es, Zellen auszuwählen, die Bildgrenzen berühren. Entfernen Sie falsch ausgewählte Soma-Marker mit der Taste "Backspace" oder "Delete".
24. Drücken Sie "Enter" oder "Return", um zum nächsten Bild zu gelangen.
25. Wähle nach Abschluss der Soma-Auswahl "Somas (Alle)" um.
26. Umrisse den Somumand jeder ausgewählten Mikroglialzelle. Zelluläre Prozesse aus der Soma-Umrisslinie ausschließen und mindestens acht Umrisspunkte pro Soma verwenden. Entfernen Sie falsch platzierte Umrisspunkte mit "Letzten Punkt rückgängig", "Löschen" oder "Rückstachen".
27. Presse "Enter", "Return", Doppelklick oder Rechtsklick, um jede Soma-Gliederung abzuschließen.
28. Wählen Sie "Letzte Gliederung neu machen", um die vorherige Soma-Gliederung bei Bedarf zu wiederholen.
29. Wählen Sie nach Abschluss der Soma-Gliederung "Alle Masken generieren".
30. Wenden Sie einen Mindestschwellenwert an, um die Einbindung von Hintergrundpixeln mit niedriger Intensität in Masken zu beschränken.
    HINWEIS: Höhere Werte bewahren die Soma-Genauigkeit auf Kosten der Verzweigung, während niedrigere Werte die Verzweigungsgenauigkeit auf Kosten von Soma erhalten. Schwellenwerte zwischen 10–30 % sorgen typischerweise für eine ausgewogene Hintergrundunterdrückung und Verzweigungserhaltung.
    HINWEIS: Die Erstellungszeit der Maske variiert je nach Anzahl der ausgewählten Zellen.
31. Wählen Sie "QA All Masks", um mit der Qualitätssicherung der Masken zu beginnen.
32. Übersichtsmasken präsentierten von der größten (800 μm²) bis zur kleinsten (200 μm²).
33. Vergleichen Sie jede Maske mit der entsprechenden Mikroglia mit den Reitern "Verarbeitet" und "Maske".
34. Akzeptieren Sie Masken mit der Tastenkombination "A". Masken mit der Tastenkombination "R" ablehnen. Drücke "B", um eine Annahme oder Ablehnung rückgängig zu machen. Navigiere mit den Pfeiltasten der Tastatur durch die Maskengrößen.
35. Wählen Sie die größte akzeptable Maske, die Mikroglialverzweigungen genau erfasst, ohne benachbarte Zellen, übermäßigen Hintergrund, Bildgrenzen oder Skalierungsbalken einzubeziehen.
    HINWEIS: Lehnen Sie Masken ab, wenn Unsicherheiten über ihre Genauigkeit bestehen.
    HINWEIS: Wählen Sie "Alle Masken löschen" und generieren Sie die Masken mit einem anderen Schwellenwert, falls die meisten ungenau sind.
36. Wählen Sie nach Abschluss der Maskenqualitätssicherung "Einfache Merkmale berechnen" aus, um
    Berechnen Sie durchschnittliche Schwerpunktentfernung, Maskenfläche, Umfang, Exzentrizität, Rundung und Soma-Größe anhand akzeptierter Masken und Soma-Umrisse.
37. Siehe Tabelle 1 für Parameterdefinitionen und mikrogliale Trends bei Neuroinflammation.
38. Download "Sholl.py", "FractalAnalysis_ImageJ.py" und "SkeletonAnalysisImageJ.py", um zusätzliche Analysen durchzuführen.
39. Öffnen Sie "FractalAnalysis_ImageJ.py" als Fiji-Plugin für Fraktal- und Hüllenanalysen.
40. Geben Sie bei Aufforderung den Standort des Ausgabeverzeichnisses und die Pixelgröße ein. Wählen Sie die Option "Nur größte Maske", wenn eine Analyse nur der größten akzeptierten Maske gewünscht ist.
41. Öffnen Sie "Sholl.py" als Fiji-Plugin für die Sholl-Analyse.
42. Geben Sie bei Aufforderung den Standort des Ausgabeverzeichnisses und die Pixelgröße ein.
43. Geben Sie die gewünschte Sholl-Analyse-Schrittgröße ein. Wählen Sie "Soma-Radius als Startradius verwenden", um MMPS-abgeleitete Soma-Radien als Startradius für die Sholl-Analyse zu verwenden. Geben Sie einen festen Soma-Radius ein, wenn keine MMPS-abgeleiteten Soma-Radien verwendet werden.
44. Öffnen Sie "SkeletonAnalysisImageJ.py" als Fiji-Plugin für die Skelettanalyse.
45. Geben Sie bei Aufforderung den Standort des Ausgabeverzeichnisses, die Pixelgröße und den Ordnerstandort des Maskenordners ein.
46. Exportiere alle von Plugins generierten Ergebnisse als CSV-Dateien in das Ausgabeverzeichnis, wenn du fertig bist.

6. Formeln, die in MMPS für Mikroglia-Morphologieberechnungen verwendet werden

HINWEIS: Alle Berechnungen werden automatisch von MMPS durchgeführt, wenn "Einfache Eigenschaften berechnen" gedrückt wird. Parameterberechnungen sind unten dargestellt.

1. Perimeter
   1. Berechnen Sie den Umfang mit folgender Gleichung:
      
   2. Definiere als Perimeter, als Anzahl der Kantenpixel und als Pixelgröße in μm.
2. Durchschnittliche Schwerpunktentfernung
   HINWEIS: Die durchschnittliche Schwerpunktentfernung wird auch als Zellverteilung¹¹ bezeichnet.
   1. Identifizieren Sie vier Verzweigungsendpunkte anhand der Zellkoordinaten:
      Oberer Zweig: Minimum y-Koordinate,
      Unterer Ast: maximale y-Koordinate,
      Linker Ast: minimale x-Koordinate,
      Rechter Ast: maximale X-Koordinate.
   2. Berechnen Sie die Schwerpunktkoordinaten mit den folgenden Gleichungen:
      
      
   3. Definiere c_x und c_y als Schwerpunktkoordinaten, x_i und y_i als Pixelkoordinaten und als die Gesamtzahl der Pixel.
   4. Berechnen Sie den Abstand mit folgender Gleichung:
      
   5. Definiere d als Verzweigungsabstand, x_i und y_i als Koordinaten am Zweigenden, und c_x und c_y als Schwerpunktkoordinaten.
   6. Berechnen Sie die durchschnittliche Schwerpunktentfernung mit folgender Gleichung:
      
   7. Definieren Sie als mittlere Schwerpunktentfernung, als Verzweigungsabstand, d_i und als Pixelgröße in μm.
3. Maskenbereich
   1. Berechnen Sie die Maskenfläche mit folgender Gleichung:
      
   2. Definiere als Maskenfläche in μm², als die Anzahl der Pixel innerhalb der Maske und als Pixelgröße in μm.
4. Exzentrizität
   1. Berechnen Sie die zweiten zentralen Momente mit den folgenden Gleichungen:
      
      
      
   2. Definiere μ₂₀, μ₀₂ und μ₁₁ als zweite zentrale Momente, x_i und y_i als Pixelkoordinaten, c_x und c_y als Schwerpunktkoordinaten und N als Gesamtpixelanzahl.
   3. Berechnen Sie Kovarianzmatrix-Eigenwerte mit folgender Gleichung:
      
   4. Definiere λ₁ ≥ λ₂.
   5. Berechnen Sie Haupt- und Nebenachsenlängen mit den folgenden Gleichungen:
      
   6. Definiere a als Hauptachsenlänge und b als Nebenachsenlänge.
   7. Berechnen Sie die Exzentrizität mit folgender Gleichung:
      
   8. Definiere es als Exzentrizität.
5. Rundung
   1. Berechnen Sie die Rundheit mit folgender Gleichung:
      
   2. Definieren Sie als Rundheit, als Hauptachsenlänge und als Nebenachsenlänge.
6. Soma-Größe
   1. Berechnen Sie die Soma-Fläche mit folgender Gleichung:
      
   2. Definiere Sa als Somafläche in μm² als Anzahl der Pixel innerhalb der Soma-Maske und S als Pixelgröße in μm.

7. Statistische Analyse

1. Führen Sie alle statistischen Analysen mit R-Version 4.3.2 durch.
2. Filtere Datensätze mit der größten akzeptierten Maske für jede Zelle.
3. Durchschnittliche zelluläre Parameter auf Tierebene vor der statistischen Analyse.
4. Normalität und Varianz mit den Shapiro–Wilk- und Levene-Tests bewerten.
5. Führen Sie Student's t-Tests oder wiederholte Mittelwerte ANOVA mit post-hoc Holm-korrigierten gepaarten t-Tests durch, wenn Datensätze parametrische Annahmen erfüllen.
6. Führen Sie Wilcoxon-Rangsummen- oder Friedman-Tests mit Holm-korrigierten gepaarten Wilcoxon-Zeichenrangtests durch, wenn Datensätze parametrische Annahmen nicht erfüllen.
7. Definiere statistische Signifikanz als p < 0,05.

Ergebnisse

Eine Open-Source, eigenständige Plattform zur Analyse der Mikroglialmorphologie, genannt Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), wurde entwickelt, um einen zugänglichen, standardisierten Workflow für die IF-basierte Analyse der Mikroglialmorphologie bereitzustellen. Die Plattform baut auf früheren Methoden der Morphologieanalyse auf, erfordert keine Programmierkenntnisse und integriert eine zugängliche grafische Benutzeroberfläche. MMPS wurde entwickelt, um die Erkennung subtiler mikroglialer Verzweigungen zu verbessern und dabei mehrere Schutzmaßnahmen zu integrieren, um die Überschätzung von Mikroglialmasken zu minimieren.

MMPS wurde mit einem LPS-induzierten Nagetier-Neuroinflammationsmodell validiert. Nach Gewebeverarbeitung und Bildaufnahme (Abbildung 1) wurde die IF-Spezifität mit negativen Kontrollschnitten ohne primäre Antikörperfärbung bestätigt (ergänzende Abbildung 1). Die MMPS-Verarbeitung beginnt mit dem Import von IF-Bildern in die Softwareschnittstelle (Abbildung 2A). Die Software bietet mehrere Bildverarbeitungsoptionen zur Verbesserung der Mikroglialsignalerkennung und Hintergrundtrennung. Die obligatorische Hintergrundsubtraktion erfolgt mit dem Rolling-Ball-Algorithmus, der im Scikit-image-Paket implementiert ist, während optionale Dämpfungs- und Schärfungsfilter über SciPy-basierte Gaußsche Filterung verfügbar sind. Nach der Bildverarbeitung werden mikrogliale Somas manuell ausgewählt und durch rote Auswahlmarker identifiziert (Abbildung 2B). Soma-Grenzen werden anschließend manuell für morphologische Berechnungen nachgeschaltet (Abbildung 2C).

Abbildung 1: Grafischer Überblick über das Neuroinflammationsmodell und die Verarbeitung. Die Ratten wurden mit LPS oder PBS injiziert und 24 Stunden mit einer Herzperfusion und anschließend Enthauptung gesammelt. Die Gehirne wurden extrahiert und in 30-μm-Abschnitte geschnitten, um dann im IF-Verfahren für den Mikroglialmarker Iba1 verwendet zu werden, die anschließend mit MMPS verarbeitet wurden. Erstellt mit Biorender. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Überblick über die Nutzung von MMPS. (A) Beispiel für ein Bild der kortikalen Mikroglia (rot, Iba1) mit Zellkernen (blau, DAPI), das in MMPS referenziert werden soll (Skalenleiste = 75 μm, 40x). Nach der Bildverarbeitung mit MMPS wird der Hintergrund reduziert und die genauen Morphologien bewertet (B). Nach der Bildverarbeitung in MMPS werden Somas manuell mit einem roten Kreis ausgewählt, der in den folgenden in den Methoden beschriebenen Schritte verwendet wird (Maßstabsleiste = 75 μm, 40x). (C) Zwei repräsentative Mikroglia wurden manuell umrissen, und die gespeicherten Soma-Umrissbilder sind unten dargestellt. (D) Die Maskenerzeugung ausgewählter Zellen verfolgt automatisch Mikroglialzweige bis zu 800 μm², erfordert jedoch manuelle Qualitätssicherung. Hier zeigen wir die ungenaue 800-μm-2-Maske, gefolgt von der genaueren 700-μm-2-Maske. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Nach der Soma-Umrissung erzeugt MMPS iterativ Masken über einen Größenbereich von 200–800^{μm 2} unter Verwendung adaptiver Schwellenwerte, die durch benutzerdefinierte Mindestintensitätsschwellenwerte begrenzt sind. Kleinere Masken folgen der vom Nutzer definierten Schwelle näher, während größere Masken die Schwellenbeschränkungen schrittweise lockern, um die Einbindung von Zweigen zu maximieren. Generierte Masken werden manuell überprüft, um das Einschließen benachbarter Zellen, übermäßige Hintergrundaufnahme oder eine Verkürzung durch Bildränder oder Skalenbalken zu verhindern. Wie in Abbildung 2D gezeigt, verlängerte sich die 800-μm-2-Maske einer repräsentativen Mikroglialzelle in eine benachbarte Zelle. Die Ablehnung der 800-μm-2-Maske und die Auswahl der 700-μm-2-Maske korrigierten den Segmentierungsfehler, während die genaue Abgrenzung der Ziel-Mikroglia erhalten blieb.

Nach der MMPS-Verarbeitung wurde die Mikroglialaktivierung mit der größten akzeptierten Maske pro Zelle bewertet, da diese Masken die distale Verzweigung am genauesten erfassten und gleichzeitig die Hintergrundeinbindung minimierten. Die berechneten morphologischen Parameter sind in Tabelle 1 zusammengefasst und in Abbildung 3 dargestellt. LPS-Verabreichung verringerte signifikant den durchschnittlichen Schwerpunktabstand und den Zellumfang im Vergleich zu fahrzeugbehandelten Kontrollen (S. < 0,05; Abbildung 3A,B), im Einklang mit dem Rückzug der Mikroglialprozesse während der Aktivierung. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in Maskenfläche, Rundheit oder Exzentrizität zwischen den Behandlungsgruppen beobachtet (Abbildung 3C–E), obwohl frühere Berichte diese Parameter mit aktivierten mikroglialen Phänotypen ^3,23 in Verbindung brachten. Die vorliegende Studie war statistisch nicht befähigt, subtile Unterschiede in der Somaform oder Maskenfläche zu erkennen, und mikrogliale Subpopulationen können heterogene entzündliche Morphologien annehmen, die diesen Trends nicht einheitlich folgen³. Im Gegensatz dazu war das Soma-Gebiet bei LPS-behandelten Tieren im Vergleich zu Kontrollfahrzeugen signifikant erhöht (p < 0,01; Abbildung 3F), unterstützt zudem die aktivationsassoziierte morphologische Umgestaltung²².

Abbildung 3: Vergleich der morphologischen Mikroglialparameter. Für alle Panels wurden Tests zur Normalität durchgeführt (Shapiro-Wilk und Levene), wobei in allen Fällen nichtsignifikante Werte gefunden wurden (S>0,05), was zur Anwendung von Student t-Tests führte. Die Punkte repräsentieren einzelne Tiere (n=5 pro Behandlung) (A) Der durchschnittliche Schwerpunktabstand war in der Vehikelgruppe signifikant größer als in der LPS-Behandlungsgruppe. (B) Der Umfang der Mikrogliazellen war in der Vehikelgruppe signifikant größer als in der LPS-Behandlungsgruppe. (C) Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Maskenfläche zwischen den Behandlungsgruppen. (D) Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Soma-Exzentrizität zwischen den Gruppen. (E) Es gibt keinen signifikanten Unterschied in der Soma-Rundheit zwischen den Behandlungsgruppen. (F) Es gab einen signifikanten Anstieg der Soma-Fläche in der LPS-Gruppe * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Parameter	Definition	Beziehung zur Mikroglialaktivierung
Durchschnittliche Schwerpunktentfernung	Durchschnittliche Entfernung des entferntesten Ast in den oberen, rechtsen, unteren und linken Positionen	Abnahmen
Perimeter	Messung des Zellumfangs	Abnahmen
Maskenbereich	Der eigentliche Bereich der Zelle, nicht der Bereich der Zielmaske	Abnahmen
Exzentrizität	Eine Messung der ungefähren Verlängerung des Zellsomas (0: kreisförmig, 1: stark verlängert)	Abnahmen
Rundung	Eine Messung der ungefähren Zirkularität des Zellsoms (0: verlängert, 1: kreisförmig)	Erhöhungen
Soma-Größe	Die Fläche der Zellsoma	Erhöhungen

Tabelle 1: Berechnete Parameter aus MMPS und vorhergesagte Veränderung als Reaktion auf Mikroglia-Aktivierung. Die Tabelle fasst morphologische Parameter zusammen, die von der Mapping Microglial Parameters Software (MMPS) berechnet wurden, darunter Umfang, durchschnittliche Schwerpunktentfernung, Maskenfläche, Exzentrizität, Rundung und Soma-Fläche.

Die Inter-User-Reproduzierbarkeit wurde anschließend bewertet, indem dasselbe Bildset für verblindete, zuvor untrainierte Nutzer zur unabhängigen Analyse bereitgestellt wurde (ergänzende Abbildung 2). Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Nutzern festgestellt, und alle Nutzer reproduzierten morphologische Trends, die mit der mikroglialen Aktivierung bei LPS-behandelten Tieren übereinstimmten.

MMPS unterstützt zusätzlich fortgeschrittene morphologische Analysen nachgelagert. Korrelative Analyse der aus Abbildung 3 generierten Parameter zeigte Beziehungen zwischen unterschiedlichen morphologischen Merkmalen. Vehikelbehandelte Ratten zeigten nur eine schwache Korrelation zwischen Mikroglia-Rundheit und Umfang (R² = 0,17), während LPS-behandelte Ratten eine stärkere Korrelation (R² = 0,64) aufwiesen, was darauf hindeutet, dass eine erhöhte Mikroglialaktivierung mit gleichzeitigen Verringerungen von Rundheit und Umfang assoziiert war (Abbildung 4A). Darüber hinaus zeigte der Maskenbereich starke positive Korrelationen mit dem durchschnittlichen Schwerpunktabstand sowohl in den Gruppen mit Vehicle- als auch in LPS-behandelten Gruppen (R² = 0,71 bzw. 0,88), was mit Veränderungen der Verzweigungskomplexität im Zusammenhang mit dem mikroglialen Aktivierungsstatus übereinstimmt (Abbildung 4B).

Abbildung 4: Fortgeschrittene Analyse der Mikroglialparameter. Alle Panels sind tierbezogene Linien mit der besten Passung, berechnet mit der gewöhnlichen Methode der kleinsten Quadrate, dargestellt mit ihrem Bestimmungskoeffizienten (R²) und schattiert mit ihrem 95%-Konfidenzintervall. (A) Die Rundung des Mikroglia-Somas und die gesamte Perimeterlänge tendieren bei Mikroglia in der Vehikelgruppe schwach (R² = 0,17), weisen jedoch nach der LPS-Exposition eine stärkere Korrelation auf (R² = 0,64). (B) Die durchschnittliche Schwerpunktentfernung korreliert mit der Fläche der Mikroglia in den Gruppen Vehikel (R² = 0,71) und LPS (R² = 0,88). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Abbildung 1: Validierung des IF-Protokolls durch negative Kontrolle. Ein Hirnschnitt desselben Bereichs für jede Ratte wurde dem IF-Protokoll ohne primäre Antikörperzugabe unterzogen, um das Fehlen der Autofluoreszenz zu bestätigen (Skalenleiste = 75 μm) (A) Repräsentatives Bild von vehuelfarbigem Gewebe für DAPI (blau). (B) Repräsentatives Bild von fahrzeuggefärbtem Gewebe für Iba1 (rot). (C) Repräsentatives Bild von fahrzeuggefärbtem Gewebe für DAPI (blau) und Iba1 (rot). (D) Repräsentatives Bild von LPS-gefärbtem Gewebe für DAPI (blau). (E) Repräsentatives Bild von LPS-gefärbtem Gewebe für Iba1 (rot). (F) Repräsentatives Bild von LPS-gefärbtem Gewebe für DAPI (blau) und Iba1 (rot). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Bewertung der MMPS-Inter-User-Variation. Mehrere verblindete Nutzer nutzten MMPS auf denselben Proben aus Abbildung 3 , und die Ergebnisse auf Tierebene wurden verglichen. Für alle waren die Normalitätstests (Shapiro-Wilk und Levene) nicht signifikant (S>0,05), was zur Anwendung einer wiederholten ANOVA mit einem post-hoc-korrigierten Holm-korrigierten gepaarten T-Test (S>0,05) führte. (A) Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Nutzern in jeder Gruppe hinsichtlich der durchschnittlichen Schwerpunktentfernung (p>0,05). (B) Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Nutzern zwischen den Nutzern für den Umfang (S>0,05). (C) Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Nutzern zwischen den Nutzern hinsichtlich des Maskenbereichs (S>0,05). (D) Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Nutzern zwischen den Nutzern hinsichtlich Exzentrizität (S>0,05). (E) Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Nutzern zwischen den Nutzern hinsichtlich der Rundheit (S>0,05). (F) Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Nutzern zwischen den Nutzern im Soma-Gebiet (S>0,05). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Das Hauptziel dieser Methodik ist es, die Zugänglichkeit für Mikroglialmorphologieanalysen zu erweitern, indem gängige technische Hürden reduziert und gleichzeitig die Stärken etablierter morphologischer Bewertungsansätze erhalten bleiben. MMPS ermöglicht die Erkennung subtiler morphologischer Veränderungen im Mikroglialbereich bei gleichzeitiger Kompatibilität mit fortgeschrittenen Analysen, einschließlich fraktaler, skelett-, rumpf- und Sholl-Analysen. Im Vergleich zu zuvor veröffentlichten Ansätzen bietet MMPS eine zugängliche grafische Benutzeroberfläche, integrierte Berechnungen für häufig verwendete morphologische Parameter und die Eliminierung von Codierungsanforderungen, während die Kompatibilität mit fortgeschritteneren Downstream-Analysen erhalten bleibt.

Mehrere entscheidende methodische Schritte beeinflussen die analytische Genauigkeit und Reproduzierbarkeit stark. Eine hochwertige Immunfluoreszenzbildgebung (IF) ist unerlässlich für eine zuverlässige Maskenerzeugung und Morphologieberechnungen. Die Antikörperspezifität stellt einen wesentlichen Faktor für die Bildqualität dar, da die unspezifische Markierung die Hintergrundfluoreszenz erhöht und die Signaltrennung zwischen Mikroglia und umgebendem Gewebe reduziert. Ebenso können suboptimale Antikörperkonzentrationen die Fluoreszenzintensität verringern und die Bildauflösung verringern. Die Erfassung von Z-Stack-Bildern ist ebenfalls entscheidend, da das Weglassen der Z-Stack-Bildgebung die scheinbare Mikroglia-Verzweigungskomplexität und Prozessverteilung künstlich verändern kann und somit morphologische Berechnungen verzerrt.

Mehrere zusätzliche Überlegungen sind während der MMPS-Verarbeitung wichtig. Obwohl MMPS Batch-Bildverarbeitung unterstützt, ist eine individuelle Bildoptimierung oft vorzuziehen, da Hintergrundeigenschaften und Färbungsqualität zwischen den Bildern erheblich variieren können. Die Bildqualität beeinflusst direkt die Genauigkeit der Maskengenerierung; daher verbessert die Optimierung während der Bildvorverarbeitung die Reproduzierbarkeit und Robustheit von nachgelagerten Analysen erheblich. Eine sorgfältige Auswahl von Mikroglialsomas ist ebenfalls wichtig, insbesondere die Vermeidung von Zellen, die Bildgrenzen berühren, da die Teilzellselektion die Soma-Messungen künstlich reduzieren und die Maskenbildung verzerren kann. Während der Qualitätssicherung der Masken sollten Masken mit benachbarten Zellen, übermäßigem Hintergrund oder Bildgrenzen abgelehnt werden. Umgekehrt sollten kleinere Masken nicht allein deshalb abgelehnt werden, weil sie nicht alle distalen Prozesse erfassen, da der iterative Maskengenerierungsalgorithmus absichtlich lokale Schwellenwerte entsprechend der Maskengröße und der regionalen Pixelintensität anpasst.

Diese Methodik ist hochgradig anpassungsfähig und kann an spezifische experimentelle Anforderungen angepasst werden. Da MMPS Open Source ist, kann die Plattform erweitert werden, um einzelne Z-Stack-Frames zu analysieren oder automatisierte Zellerkennungsalgorithmen zu integrieren, um eine vollständig automatisierte Morphologieanalyse-Pipeline zu erstellen. Darüber hinaus bleiben generierte Masken und Soma-Umrisse kompatibel mit ImageJ-basierten Workflows für fraktale, rumpf-, skelett- und Sholl-Analysen. Da MMPS in Python 3.11 entwickelt wurde, können zusätzliche Analysen auch direkt in die Software integriert werden, indem allgemein verfügbare wissenschaftliche Python-Pakete verwendet werden, ohne externe Softwareplattformen erforderlich zu sein.

Trotz dieser Vorteile sollten mehrere Einschränkungen berücksichtigt werden. MMPS wurde mit einem Neuroinflammationsmodell in einem bestimmten Hirnbereich männlicher Sprague-Dawley-Ratten validiert, wobei verschiedene Hirnregionen, Krankheitsmodelle, Arten oder biologisches Geschlecht morphologische Ergebnisse beeinflussen können. Die Anwendbarkeit von MMPS auf alternative experimentelle Paradigmen sollte daher durch Pilotstudien validiert oder durch frühere Literaturvergleiche unterstützt werden. Darüber hinaus erfasst die IF-basierte Bildgebung dreidimensionale Verzweigungsstrukturen unvollständig, da Prozesse, die sich direkt über oder unter der Brennebene erstrecken, in Maximalprojektionsbildern möglicherweise nicht erkannt werden. Eine Erhöhung der Anzahl der analysierten Zellen kann helfen, diese Einschränkung abzumildern. MMPS bleibt zudem von der Bildaufnahmequalität abhängig und erfordert daher eine Optimierung für einzelne Bildsysteme, Färbungsprotokolle und Antikörperpräparate. Bilder mit niedriger Auflösung können die Maskengröße künstlich vergrößern, da die Grenzen um Somas und dicht gepackte Äste verschwommen sind. Aus diesem Grund integriert das vorliegende Protokoll frei schwimmende IF-Methoden und mehrere Bildverarbeitungsoptionen, um die Bildqualität zu maximieren.

MMPS behält zudem ein gewisses Potenzial für benutzerabhängige Variabilität, da Nutzer manuell Zellen auswählen und Somas umreißen. Die Verwendung von DAPI- und Iba1-Kolokalisation reduziert jedoch die Mehrdeutigkeit bei der Zellauswahl erheblich. Darüber hinaus zeigte die blinde Inter-User-Analyse minimale Variabilität zwischen zuvor untrainierten Nutzern, was die Reproduzierbarkeit des analytischen Workflows unterstützte.

Im Gegensatz zu mehreren zuvor veröffentlichten Mikroglialmorphologieplattformen ist MMPS nicht vollständig automatisiert. Dieses Design wurde jedoch gewählt, um die Segmentierungsgenauigkeit und die Qualitätssicherung der Masken zu priorisieren. Automatisierte Arbeitsabläufe könnten durch die Änderung des Python-Quellcodes integriert werden, um automatisierte DAPI/Iba1-Kolokalisierungserkennung, konturbasierte Soma-Gliederung und maschinell-lernen-basierte Maskenakzeptanz oder -ablehnung zu ermöglichen. Darüber hinaus benötigt MMPS eine erhebliche Festplattenspeicherkapazität, da generierte Masken und Soma-Umrisse automatisch als .tiff Dateien für nachgelagerte Analysen und Qualitätssicherung gespeichert werden. Der Speicherbedarf könnte reduziert werden, indem die Software so modifiziert wird, dass Masken nacheinander zellweise generiert werden, gefolgt von sofortiger Qualitätsbewertung und Parameterextraktion.

Zusammenfassend erweitert MMPS den Zugang zur quantitativen Analyse der Mikroglialmorphologie, indem es eine standardisierte, Open-Source-Plattform bereitstellt, die keine Codierungsexpertise oder In-vivo-Bildgebungsmöglichkeiten erfordert. Die Plattform ermöglicht eine reproduzierbare Analyse der IF-basierten Mikroglialmorphologie und bleibt dabei mit fortschrittlichen nachgelagerten analytischen Ansätzen kompatibel.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
12-well plate	Fisher Scientific	07-200-82	Platte zur Inkubation und zum Waschen von Gewebeschnitten.
Aluminiumfolie	Fisher Scientific	01-213-101	Zum Schutz fluoreszierender Proben vor Lichtexposition.
Antigen Retrieval Puffer (10×)	ThermoFisher Scientific	00-4955-58	Zur Verbesserung der Antigenzugänglichkeit bei der Immunfluoreszenzfärbung.
Anti-Iba1 Primärantikörper	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	019-19741	Primärantikörper für die immunfluoreszente Markierung von Mikroglia.
Kryostat	Fisher Scientific	95-710-0L	Instrument zur Herstellung von Gefrierschnitten aus Hirngewebe in definierten Dicken.
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21428	Fluoreszierende Sekundärantikörper zur Visualisierung von Kaninchen-Primärantikörpern.
Donkey Serum	Fisher Scientific	50-413-115	Blockierungsreagenz zur Reduzierung unspezifischer Antikörperbindungen.
EVOS FL Auto 2 Imaging System	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Fluoreszenzmikroskop zur Bilderfassung.
Fiji (ImageJ) 2.16.0	NIH	fiji.sc	Bildverarbeitungsplattform zur Analyse der Morphologie und für Plugins.
Fluoromount-G	ThermoFisher Scientific	00-4959-52	Einbettmedium zur Konservierung von Fluoreszenz und zur Sicherung von Objektträgern.
Isofluran	EntirelyPets Pharmacy	MWI502017	Inhalationsanästhetikum, das bei Tierversuchen verwendet wird.
Lipopolysaccharid	Millipore Sigma	L2630	Zur Induktion systemischer Neuroinflammation und mikroglialer Aktivierung bei Nagetieren.
Matplotlib	https://pypi.org/project/matplotlib/		Python-Plotting-Bibliothek zur Datenvisualisierung und Figurenerstellung.
MMPS (Mapping Microglial Parameters Software) v1.00	Diese Arbeit	https://github.com/NeurodegenerativePharmaceuticalLab/Mapping-Microglia-Parameters-Software/releases/tag/v1.00	Open-Source-Softwareplattform zur Analyse der Mikroglia-Morphologie.
Net wells	Millipore Sigma	CLS3477	Einsätze zur Aufnahme von frei schwimmenden Gewebeschnitten während der Färbeverfahren.
Numpy	https://pypi.org/project/numpy/		Python-Bibliothek für numerische Berechnungen innerhalb von MMPS.
Objektivlinse (4×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4922	Objektivlinse mit niedriger Vergrößerung zur anatomischen Orientierung und Regionsidentifikation.
Objektivlinse (40×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4625	Objektivlinse mit hoher Vergrößerung zur Mikroglia-Morphologie-Bildgebung.
opencv-python	https://pypi.org/project/opencv-python/		Computer-Vision-Bibliothek für Bildverarbeitungsfunktionen innerhalb von MMPS.
Paraformaldehyd	ThermoFisher Scientific	169650025	Fixiermittel zur Gewebeperfusion und -erhaltung vor der Schnittherstellung.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	Permanentes Einbettmedium zur Folienerhaltung.
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung	Fisher Scientific	BP3991	Pufferlösung zum Waschen von Gewebe und zur Reagenzzubereitung.
Pillow	https://pypi.org/project/Pillow/		Python-Bildverarbeitungsbibliothek für Bildverarbeitungsoperationen.
PyQt5	https://pypi.org/project/PyQt5/		Python GUI-Framework zur Generierung der MMPS-grafischen Benutzeroberfläche.
Python 3.11	Python Software Foundation	python.org	Programmierumgebung, die für die Entwicklung und Ausführung von MMPS verwendet wird.
R 4.3.2	R Foundation for Statistical Computing	r-project.org	Statistische Software zur Datenanalyse und Grafikerstellung.
Scikit-image	https://pypi.org/project/scikit-image/		Python-Bildanalysebibliothek zur Bildverarbeitung und Segmentierung.
Scipy	https://pypi.org/project/scipy/		Python-Wissenschaftspaket zur Filterung und Bildverarbeitungsoperationen.
Sprague-Dawley-Ratten	Evingo	002	Experimentelle Tiere zur Validierung des Neuroinflammationsmodells.
Saccharose	Fisher Scientific	S5-3	Kryoprotektor vor dem Einfrieren von Hirngewebe.
Tifffile	https://pypi.org/project/tifffile/		Python-Paket zum Lesen und Schreiben von TIFF-Bilddateien.
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	Einbettmedium für die Kryoschnittherstellung von gefrorenen Gewebeproben.
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Detersiens zur Membranpermeabilisierung während der Immunfluoreszenz.