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Forschungsartikel

Identifizierung mitochondrienbezogener Kandidaten-Biomarker von Ligustri Lucidi Fructus bei diabetischer Nephropathie

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DOI:

10.3791/71592

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15. September 2026

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1Institute of Pharmaceutical and Food Engineering, Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Shanxi Key Laboratory of Integrative Systemic Regulation for Qi-Blood Homeostasis, 2College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die diabetische Nephropathie (DN) beinhaltet eine mitochondriale Dysfunktion. Mithilfe von Transkriptomik, Netzwerkpharmakologie und maschinellem Lernen identifizierten wir CAT, FABP1, MAOA und MAOB als potenzielle mitochondrienbezogene Biomarker für Ligustri Lucidi Fructus. Bei db/db-Mäusen erhöhte LLF die Expression von CAT und MAOA, was weitere mechanistische Untersuchungen unterstützt.

Zusammenfassung

Mitochondriale Dysfunktion und übermäßiger oxidativer Stress in den Mitochondrien sind zentrale pathologische Faktoren, die die tubuläre Nierenschädigung bei diabetischer Nephropathie (DN) vorantreiben. Obwohl Ligustri Lucidi Fructus (LLF) traditionell zur Behandlung der DN eingesetzt wird, sind die daran beteiligten Mechanismen, insbesondere jene, die mitochondrienassoziierte Gene und Signalwege betreffen, bisher nur unzureichend verstanden. In dieser Studie wurde eine Analyse der differentiellen Expression des GSE142025-Datensatzes durchgeführt, um differentiell exprimierte Gene (DEGs) im Zusammenhang mit DN zu identifizieren. Merkmalsgene wurden durch Abgleich der Ergebnisse aus vier maschinellen Lernmodellen ausgewählt. Gene, die eine signifikante differentielle Expression und konsistente Expressionsmuster in beiden Datensätzen aufwiesen, wurden anschließend mittels ROC-Kurvenanalyse (Receiver Operating Characteristic) bewertet. Solche Gene mit einer Fläche unter der Kurve (AUC) > 0,7 in beiden Datensätzen wurden als Kandidaten für Biomarker definiert. Es wurden funktionelle Anreicherungsanalysen, Untersuchungen zur Immuninfiltration, Netzwerkkonstruktion sowie molekulare Docking-Analysen durchgeführt. Ein DN-Mausmodell wurde verwendet, um Blutglukose, mikroalbuminurische Ausscheidung, histopathologische Veränderungen sowie die RT-qPCR-Expression der Kandidaten-Biomarker zu bewerten. CAT und MAOA waren in vivo signifikant hochreguliert. Die Kandidaten-Biomarker waren in Signalwegen angereichert, die mit Ribosomenfunktion, Valin-, Leucin- und Isoleucin-Abbau, Zytokin-Zytokinrezeptor-Interaktionen sowie Peroxisomen assoziiert sind. Sie zeigten eine negative Korrelation mit CD8+-T-Zellen und aktivierten Mastzellen sowie eine positive Korrelation mit aktivierten NK-Zellen und naiven B-Zellen. Taxifolin, Beta-Sitosterol und Eriodictyol wiesen Bindungsenergien unter -5 kcal/mol mit den Kandidaten-Biomarkern auf. CAT und MAOA stellen aussichtsreiche Kandidaten dar, die weitere mechanistische Untersuchungen rechtfertigen.

Einleitung

Die diabetische Nephropathie (DN), die weltweit führende Ursache für Niereninsuffizienz im Endstadium, ist eine der häufigsten Komplikationen des Diabetes mellitus. Pathologisch zeichnet sie sich durch eine übermäßige Ansammlung der extrazellulären Matrix in den glomerulären und tubulären Kompartimenten sowie durch Verdickung und Sklerose der intrarenalen Blutgefäße aus2. Die DN ist häufig mit Proteinurie und Hypertonie assoziiert3. Ihre Entstehung steht in engem Zusammenhang mit Schädigungen der vaskulären Endothelzellen, einer verstärkten Entzündungsreaktion und erhöhtem oxidativem Stress infolge anhaltender Hyperglykämie4. Die Inzidenz der DN nimmt weltweit zu, insbesondere bei mittelalten und älteren Diabetikern. Im Fortschreiten der Erkrankung kann es zur Niereninsuffizienz im Endstadium und sogar zu kardiovaskulären Komplikationen kommen, was die Lebensqualität und Prognose der Patienten erheblich beeinträchtigt5. Trotz Fortschritten in Diagnostik und Therapie der DN bleiben frühe und zuverlässige Biomarker für die Diagnosestellung weiterhin unentdeckt, und effektive Behandlungsstrategien zur Umkehrung der pathologischen Prozesse fehlen nach wie vor. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung neuartiger, gezielter Anti-DN-Wirkstoffe.

Mitochondrien sind entscheidend für die zelluläre Bioenergetik, die Synthese von Stoffwechselvorläufern, die Kalziumhomöostase, die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), die Immunsignalübertragung und die Apoptose, alles Prozesse, die für die Aufrechterhaltung der zellulären und organismischen Stabilität unerlässlich sind6. Als Kraftwerke der Zelle spielen Mitochondrien eine zentrale Rolle in grundlegenden Prozessen wie der Glykolyse, dem Tricarbonsäurezyklus und der oxidativen Phosphorylierung7. Adipositas stört den Krebszyklus und die mitochondriale Atmungskette, was zu mitochondrialer Dysfunktion und erhöhter ROS-Produktion führt. Erhöhte ROS-Spiegel in der mitochondrialen Atmungskette können oxidativen Stress auslösen, der die mit Adipositas assoziierte Entzündungsreaktion verschärft und die Apoptose fördert8. Neuere Forschungsergebnisse haben die bedeutende Rolle mitochondrialer Dysfunktion bei der Pathogenese und Progression der diabetischen Nephropathie (DN) hervorgehoben, einschließlich Störungen des Energiestoffwechsels, übermäßiger ROS-Produktion und verstärkter Apoptosesignalgebung9. Chronische mitochondriale Dysfunktion beschleunigt den Fortschritt der Nierenerkrankung10. Daher könnte die Verbesserung der mitochondrialen Funktion eine entscheidende Schutzstrategie gegen die DN darstellen.

Ligustri Lucidi Fructus (LLF) ist eine getrocknete, reife Frucht aus der Familie der Luteaceae, die für ihre leber- und nierenstärkenden Eigenschaften bekannt ist, außerdem für ihre Fähigkeit, das Haar zu verdunkeln und das Sehvermögen zu verbessern. Ein natürlich vorkommendes Heteropolysaccharid, das aus LLF gewonnen wurde, konnte identifiziert werden und zeigt ein Potenzial zum Schutz der Nieren vor Fibrose11. In den letzten Jahren hat die Anwendung von LLF bei der Behandlung von diabetischer Nephropathie (DN) zunehmend Beachtung gefunden, wobei bemerkenswerte nephroprotektive Effekte nachgewiesen wurden11,12,13. Darüber hinaus wurde der komplexe Zusammenhang zwischen LLF und den Mitochondrien umfassend erforscht und bestätigt. Insbesondere zeigte eine Studie, dass LLF seine vorteilhaften Wirkungen durch die Modulation der mitochondrialen Funktion über die Aktivierung des AMPK-Signalwegs entfaltet14. Dieser Mechanismus schützt die Mitochondrien wirksam vor Schäden durch oxidativen Stress. Diese Erkenntnisse unterstreichen weiterhin die entscheidende Rolle von LLF bei der Aufrechterhaltung des zellulären Energiestoffwechsels und der Verbesserung der Widerstandsfähigkeit der Zellen gegenüber oxidativem Stress. Der genaue therapeutische Wirkmechanismus, insbesondere im Hinblick auf die Wiederherstellung der mitochondrialen Funktion, ist jedoch noch weitgehend unverstanden.

Das Ziel dieser Studie war es, die biologischen Mechanismen aufzuklären, die der therapeutischen Wirkung von LLF auf die mitochondriale Funktion bei diabetischer Nephropathie (DN) zugrunde liegen. Öffentliche Datenbanken wurden mithilfe bioinformatischer Werkzeuge durchsucht, um Kandidaten-Biomarker zu identifizieren, die mit den nierenprotektiven Effekten von LLF assoziiert sind, wobei transkriptomische Daten und Informationen zu wirksamen Inhaltsstoffen integriert wurden. Weitere Analysen, einschließlich Immuninfiltration, Assoziation mit klinischen Merkmalen, m6A-RNA-Modifikation, funktionelle Anreicherung, Konstruktion regulatorischer Netzwerke und molekulares Docking, legten nahe, dass diese Kandidaten-Biomarker eine zentrale Rolle bei der Regulation der mitochondrialen Funktion während der DN-Behandlung spielen. Eine in vivo-Validierung bestätigte ihre Bedeutung weiter. Diese umfassende Analyse vertieft unser Verständnis der Mechanismen, durch die LLF die DN behandelt, und schafft eine solide Grundlage für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Zielstrukturen basierend auf mitochondrialer Dysfunktion.

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Protokoll

Datenerhebung
Die Genexpressionsmatrix und die entsprechenden klinischen Daten für die mit diabetischer Nephropathie (DN) assoziierten Datensätze GSE142025 und GSE96804 wurden aus der Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) abgerufen15. Der Trainingsdatensatz (GSE142025) enthielt Nierengewebeproben von 27 Patienten mit DN und neun Kontrollpersonen, die mittels der GPL20301-Plattform sequenziert wurden. Der Validierungsdatensatz (GSE96804) umfasste Sequenzierungsdaten von 41 DN-Patienten und 20 Kontrollen, die mit der GPL17586-Plattform verarbeitet wurden. Beide Datensätze konzentrieren sich auf Nierengewebe; der Datensatz GSE96804 untersucht speziell das Glomerulum, die primäre Filtrationseinheit der Niere (Abbildung 1). Der GSE142025-Datensatz (Trainingsset) besteht aus Proben des gesamten Nierengewebes und bietet einen umfassenden Überblick über die transkriptomische Landschaft der DN. Der GSE96804-Datensatz (Validierungsset) hingegen konzentriert sich gezielt auf glomeruläres Gewebe, dem primären Ort der glomerulären Filtrationsschädigung. Da diese beiden Datensätze aufgrund von Unterschieden in Plattform und Gewebetyp nicht direkt zusammengeführt wurden, wurde keine Korrektur von Batch-Effekten vorgenommen. Stattdessen erfolgte die Validierung unabhängig zwischen den Datensätzen. Gene mit konsistenten, gleichgerichteten Veränderungen und einer Fläche unter der Kurve (AUC) größer als 0,7 in beiden Datensätzen wurden als robuste Kandidaten ausgewählt, was die Generalisierbarkeit über verschiedene Nierenkompartimente hinweg unterstützt.

Insgesamt 1.136 mitochondrienbezogene Gene (MRGs) wurden aus der MitoCarta3.0-Datenbank (https://www.broadinstitute.org/mitocarta) extrahiert. Die Wirkstoffe von LLF wurden anhand der Datenbank Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology (TCMSP) (http://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php) vorhergesagt, unter Verwendung einer oralen Bioverfügbarkeit (OB) von ≥30 % und einer Arzneistoffähnlichkeit (DL) von ≥0,18. Anschließend wurden potenzielle Zielgene für die Wirkstoffe mittels der Swiss Target Prediction-Datenbank (http://www.swisstargetprediction.ch/) vorhergesagt.

Analyse der differentiellen Expression
Die Analyse der differentiellen Expression von GSE142025 (DN vs. Kontrolle) wurde mit dem limma-Paket (v3.54.1) durchgeführt, wobei die Signifikanzkriterien bei P.adj < 0,05 und |log2FoldChange| > 0.516 . Vulkanodiagramme und Heatmaps wurden mit den Paketen ggplot2 (v 3.3.6) und ComplexHeatmap (v 2.14.0) erstellt17,18bzw. DEGs, MRGs und potenzielle Zielgene der Wirkstoffe wurden überschnitten, und die gemeinsamen Gene wurden als Kandidatengene definiert. Das Netzwerk, das die Wirkstoffe mit den Kandidatengenen verbindet, wurde mithilfe der Cytoscape-Software (v 3.9.0) erstellt.19.

Funktionelle Anreicherungsanalyse und Konstruktion des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks (PPI)
Genontologie (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) wurden mittels des clusterProfiler-Pakets (v 4.6.2) zur Untersuchung der biologischen Funktionen und assoziierten Signalwege analysiert (P.adjust < 0.05). Die Kandidatengene wurden anschließend in die STRING-Datenbank (https://cn.string-db.org/) eingegeben, um PPI-Beziehungen abzurufen (Vertrauenswert ≥ 0.4), gefolgt von der Erstellung eines PPI-Netzwerks mithilfe von Cytoscape (v 3.9.0)20.

Maschinelles Lernen
Vier Algorithmen des maschinellen Lernens, darunter Random Forest (RF), k-nächste Nachbarn (KNN), partielle kleinste Quadrate (PLS) und Support-Vektor-Maschine mit radiale Basisfunktion als Kern (SVM), wurden mithilfe des caret-Pakets (v6.0-93) basierend auf dem Datensatz GSE142025 implementiert. Die in der vorangegangenen Analyse identifizierten Kandidatengene dienten als Prädiktorvariablen, der Krankheitsstatus (DN oder Kontrolle) wurde als Zielvariable verwendet. Für das KNN-Modell wurde eine 10-fache Kreuzvalidierung mithilfe der Funktion trainControl durchgeführt, mit tuneLength = 10. Das RF-Modell wurde mit 20 Bäumen (ntree = 20) angepasst; die PLS- und SVM-Modelle wurden unter Verwendung der Einstellungen angepasst, die im ursprünglichen caret-Workflow implementiert waren.

Die Bewertung der Modell-Residualverteilungen erfolgte mithilfe des DALEX-Pakets (v2.4.3). Anschließend wurde eine permutationsbasierte Variablenbewertung unter Verwendung der Funktion variable_importance aus DALEX durchgeführt, wobei der Root-Mean-Square-Error (RMSE) als Verlustfunktion festgelegt wurde. Der resultierende dropout_loss stellt den RMSE dar, der nach Permutation der entsprechenden Variable erzielt wurde21,22. Im ursprünglichen analytischen Workflow wurden Variablen mit einem dropout loss < 0,281 über alle Modelle hinweg beibehalten, und Gene, die in allen vier Modellen gemeinsam vorkamen, wurden als konsensuelle Merkmal-Gene für die anschließende Validierung definiert.

Die vier maschinellen Lernmodelle wurden hauptsächlich zur Merkmalspriorisierung und nicht zum Aufbau eines endgültigen klinischen Klassifizierers verwendet. Entsprechend wurde die diagnostische Unterscheidungsfähigkeit anschließend auf Ebene einzelner Gene mittels ROC-Analyse sowohl in den Entdeckungs- als auch in den Validierungsdatensätzen bewertet.

Identifizierung von Biomarker-Kandidaten
In GSE142025 und GSE96804 wurden Expressionsunterschiede von Merkmalgenen zwischen DN- und Kontrollproben mittels des Wilcoxon-Tests bewertet. Nur Gene mit signifikant differenzieller Expression (P < 0,05) und übereinstimmenden Expressionsmustern in beiden Datensätzen wurden für die Analyse der Receiver-Operating-Characteristic-(ROC)-Kurve ausgewählt. Mithilfe des pROC-Pakets (v1.18.0) wurden ROC-Kurven erstellt und die Fläche unter der Kurve (AUC) berechnet; Gene mit einer AUC > 0,7 in beiden Datensätzen wurden als Biomarker-Kandidaten klassifiziert23.

Analyse der Gen-Set-Verdichtung (GSEA)
Die biologischen Funktionen und Signalwege, die mit den Kandidaten-Biomarkern assoziiert sind, wurden weitergehend mittels GSEA anhand des GSE142025-Datensatzes untersucht. Zunächst wurde eine Spearman-Korrelationsanalyse der Kandidaten-Biomarker mit allen anderen Genen unter Verwendung des psych-Pakets (v2.2.9) durchgeführt.24. Korrelationskoeffizienten wurden berechnet und (von hoch nach niedrig) geordnet. Als Referenz-Gen-Set diente c2.cp.kegg.v2023.1.Hs.symbols.gmt aus der Molecular Signatures Database (MSigDB, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/). Anschließend wurde eine GSEA-Analyse (Gene Set Enrichment Analysis) mithilfe des clusterProfiler-Pakets (v4.6.2) durchgeführt, um die Anreicherung der sortierten Gene im Hintergrund-Gen-Set zu bewerten. Es wurde eine Korrektur für Mehrfachvergleiche angewandt. über die FDR-Methode und angepasst P-Werte (bezeichnet als P.adjust) wurden als signifikant betrachtet, wenn < 0.05.

Analyse der m6A-Modifikation
Um RNA-Methylierungsmodifikationen von Kandidaten-Biomarkern zu untersuchen, wurde die SRAMP-Datenbank (http://www.cuilab.cn/sramp/) verwendet, um m6Modifikationsstellen an Kandidat-Biomarkern unter Berücksichtigung hochgradig verlässlicher Positionen innerhalb ihrer sekundären Strukturen. Anschließend wurde die ENCORI-Datenbank (https://starbase.sysu.edu.cn/) verwendet, um m6A-modifizierte Proteine zu identifizieren, die mit den Kandidat-Biomarkern interagieren, unter Verwendung der |HepG2 (shRNA)| > 1 Parameter zur Untersuchung zentraler Proteine. Die RPISeq-Datenbank (http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/) wurde anschließend verwendet, um die Wahrscheinlichkeit von Wechselwirkungen zwischen zentralen Proteinen und Kandidaten-Biomarkern vorherzusagen. RNA-Sequenzen für beide wurden im reinen Textformat hochgeladen, um Vorhersage-Scores mittels RF- und SVM-Klassifizierer zu generieren. Eine Wechselwirkung galt als signifikant, wenn der Score 0,5 überstieg.25Die SRAMP-Analyse wurde mit der „hohen“ Schwelle für die Vorhersage von m6A-Stellen unter Verwendung des „Transkript“-Modus und der Standardparameter durchgeführt. Für die ENCORI-Analyse wurde die Funktion zur „miRNA-mRNA“-Interaktion mit dem Parameter „HepG2 (shRNA)“ verwendet. > 1. Die RPISeq-Analyse verwendete den RF-Klassifikator mit Standardparametern; die Werte > 0,5 deutete auf eine positive Interaktion hin. Dies sind computergestützte Vorhersagen, keine experimentellen Belege für m6A-Modifikationen oder RNA-Protein-Interaktionen im Nierengewebe. Das HepG2 shRNA-Kriterium wurde aus vorkonfektionierten Datensätzen von ENCORI abgeleitet und spiegelt möglicherweise keine nieren-spezifische Regulation wider.

Analysen zur Immunzellinfiltration
Der CIBERSORT-Algorithmus wurde angewandt, um die Anteile von 22 Immunzelltypen sowohl in Kontroll- als auch in DN-Proben aus GSE142025 abzuschätzen, wobei eine Visualisierung über eine mit dem ggplot2-Paket (v3.3.6)26 erstellte Heatmap erfolgte. CIBERSORT wurde mit der LM22-Signaturmatrix, 1.000 Permutationen und deaktivierter Quantilnormalisierung durchgeführt (wie für Microarray-Daten empfohlen). Proben mit einem CIBERSORT-p-Wert < 0,05 wurden für weitere Analysen berücksichtigt. CIBERSORT schätzt die Anteile von Immunzellen anhand der Expression in gesamtem Nierengewebe, was jedoch keine Aussage über kompartimentsspezifische Infiltration (z. B. glomerulär vs. tubulointerstitiell) erlaubt und nicht zwischen infiltrierenden Leukozyten und residenten Immunzellen unterscheiden kann. Daher liegen die angegebenen Korrelationen auf Gewebeebene vor und sollten mittels räumlicher Methoden validiert werden. Zur Durchführung der Spearman-Korrelationsanalyse zwischen unterschiedlich gehäuften Immunzellen und Kandidaten-Biomarkern wurde das psych-Paket verwendet.

Aufbau von Netzwerken und molekulares Docking
Mikro-RNAs (miRNAs), die mit den Kandidaten-Biomarkern interagieren, wurden mithilfe der miRNet-Datenbank (https://www.mirnet.ca) vorhergesagt. Anschließend wurden langkettige nichtcodierende RNAs (lncRNAs), die die identifizierten miRNAs gezielt beeinflussen, über die Datenbanken TarBase (http://www.diana.pcbi.upenn.edu/tarbase) und starbase (http://starbase.sysu.edu.cn/) vorhergesagt. Für den Netzwerkaufbau wurden lncRNAs ausgewählt, die in beiden Datenbanken gemeinsam vorkamen. Mithilfe der Software Cytoscape wurde anschließend ein lncRNA-miRNA-mRNA-Regulationsnetzwerk erstellt. Potenzielle Wirkstoffe, die die Kandidaten-Biomarker gezielt ansprechen, wurden zur Erstellung eines Wirkstoff-Biomarker-Netzwerks ausgewählt. Zusätzlich wurden Wirkstoffe, Kandidaten-Biomarker und in der GSEA identifizierte Signalwege in Cytoscape integriert, um ein Wirkstoff-Biomarker-Signalweg-Netzwerk zu erstellen.

Die molekulare Docking-Analyse wurde durchgeführt, um die Bindungsaffinität zwischen potenziellen Wirkstoffen und Kandidaten-Biomarkern zu bewerten. Die 3D-Strukturen der Biomarker-Proteine wurden im PDB-Dateiformat aus der Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB, https://www.rscb.org/pdb) bezogen. Die 2D-Strukturen der potenziellen Wirkstoffe wurden im SDF-Format aus der PubChem-Datenbank (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) abgerufen. Das molekulare Docking wurde mit der CB-Dock-Plattform (http://clab.labshare.cn/cb-dock/php/blinddock.php) durchgeführt. Eine Bindungsenergie von weniger als -5 kcal/mol deutete auf eine starke Bindungsaffinität hin27.

Herstellung und Authentifizierung von Ligustri Lucidi Fructus
Hier bezeichnet Ligustri Lucidi Fructus (LLF) die getrocknete reife Frucht von Ligustrum lucidum W. T. Aiton (Oleaceae). Das botanische Material wurde gemäß dem Chinesischen Arzneibuch authentifiziert, und eine Belegprobe mit der Nummer 20240506,20240911,20241103 wurde an der Shanxi University of Traditional Chinese Medicine hinterlegt.

Zur Zubereitung des Dekokts wurden 200 g qualifizierter LLF-Scheiben für 30 min bei Raumtemperatur in 1.000 mL destilliertem Wasser eingeweicht. Die Mischung wurde zunächst kräftig gekocht und anschließend 60 min lang sanft geköchelt. Der Filtrat wurde gesammelt, und das verbleibende pflanzliche Material wurde erneut mit weiteren 1.000 mL destilliertem Wasser 60 min lang dekocht. Beide Filtrate wurden vereinigt, filtriert, zentrifugiert und unter vermindertem Druck eingeengt, um eine endgültige Stammlösung mit einer Konzentration von 1 g Rohdroge/mL (Gesamtvolumen 100 mL) zu erhalten. Das hergestellte Dekokt wurde bei 4 °C für den kurzfristigen Gebrauch oder bei −20 °C für die Langzeitlagerung aufbewahrt. Die Qualität von LLF und dessen Dekokt wurde streng gemäß den Vorgaben der Chinesischen Arzneibuchnorm identifiziert und verifiziert, um die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Experimente sicherzustellen.

Zur qualitativen Identifizierung wurde eine Dünnschichtchromatographie durchgeführt. Kurz gesagt, wurde ein geeignetes Volumen der hergestellten Dekoktion zentrifugiert und der Überstand mit Methanol extrahiert. Nach der Filtration wurden die Probelösung und die Referenzstandardsolution von Specnuezhenid auf dieselbe Silicagel-G-Platte aufgetragen. Nach der Laufmittelentwicklung, dem Trocknen und der Prüfung unter ultraviolettem Licht zeigte der Fleck der Probelösung eine übereinstimmende Farbe und Position mit der Referenzverbindung, wodurch das Vorhandensein der charakteristischen bioaktiven Komponente von LLF bestätigt wurde.

Zur quantitativen Qualitätskontrolle wurde eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Detektion durchgeführt. Die Analyse erfolgte unter Verwendung einer C18-Säule mit Methanol–Wasser als mobiler Phase. Die Detektionswellenlänge wurde auf 224 nm eingestellt. Der Gehalt an Specnuezhenid im Dekokt wurde anhand der Standardkurve bestimmt. Die Ergebnisse zeigten eine stabile und gleichmäßige chemische Zusammensetzung des hergestellten Dekokts, wodurch eine konsistente Arzneimittelqualität während des gesamten Tierversuchs gewährleistet war.

Tierexperimente
Zwölf SPF-qualitative männliche db/db-Mäuse (8–9 Wochen alt) und sechs altersentsprechende db/m-Mäuse wurden in der SPF-Tierhaltung der Shanxi University of Traditional Chinese Medicine gehalten. Vor den Experimenten wurden die Tiere 7 Tage lang bei einem 12-Stunden-Licht-/12-Stunden-Dunkel-Wechsel akklimatisiert und hatten ad libitum Zugang zu Futter und Wasser. Die Studie wurde vom Ethikkomitee der Shanxi University of Traditional Chinese Medicine genehmigt (Genehmigungsnummer: 2022DW167). Tiere mit einem Körpergewichtsverlust von >20 %, einem sterbenden Zustand oder der Unfähigkeit, Futter oder Wasser zu erreichen, wurden vor dem geplanten Studienende human getötet. Am Ende der Studie wurden alle verbliebenen Mäuse gemäß den institutionellen Protokollen durch intraperitoneale Injektion von Natriumpentobarbital und anschließende Halswirbeldislokation euthanasiert.

Nach der Eingewöhnungsphase wurde die Erstellung eines DN-Modells bei db/db-Mäusen durch einen Blutzuckerspiegel im Schwanzvenenblut von ≥ 16 mmol/L und eine Mikroalbuminurie bestätigt, die durch einen positiven Harn-Mikroalbumin-Teststreifen angezeigt wurde. Nach erfolgreicher Erstellung des DN-Modells wurden die db/db-Mäuse zufällig in zwei Gruppen (n = 6 pro Gruppe) eingeteilt: die DN-Modellgruppe (DN) und die LLF-Behandlungsgruppe (Behandlung). Außerdem dienten db/m-Mäuse (n = 6) als Kontrollgruppe (Kontrolle). Die Dosierung wurde basierend auf früheren pharmakodynamischen Studien zu LLF an diabetischen Ratten ausgewählt und mithilfe der Normalisierung der Körperoberfläche auf die menschliche Äquivalentdosis umgerechnet28. Den Kontroll- und DN-Gruppen wurde destilliertes Wasser verabreicht, während die Behandlungsgruppe 3,5 g/kg LLF über einen Zeitraum von 8 Wochen erhielt. Nach 8-wöchiger Gabe wurden alle Mäuse getötet, um Serum, Urin und Nierengewebe für nachfolgende Untersuchungen zu sammeln.

Blut- und Urinmarker
Die Glukosekonzentration im Serum wurde mithilfe eines vollautomatischen Blutbiochemie-Analysators bestimmt. Die Konzentration von mikroalbumin im Urin wurde gemäß den Anweisungen des Kits gemessen (Zusatzdatei 1).

Pathologische Untersuchung von Maus-Nierengeweben
Die Nierengewebe wurden für die histopathologische Untersuchung aufbereitet. Nach Fixierung in 4 % Paraformaldehyd wurden die Gewebe gewaschen, dehydriert, in Paraffin eingebettet und geschnitten. Anschließend erfolgte eine Hämatoxylin-Eosin-(HE)-Färbung, und die gefärbten Schnitte wurden unter dem Lichtmikroskop auf pathologische Veränderungen untersucht.

Quantitative Reverse-Transkriptase-Kettenreaktion (RT-qPCR)
Die RT-qPCR wurde verwendet, um die Expression der Kandidaten-Biomarker in Mausnieregewebe zu bestimmen. Gesamt-RNA wurde gemäß den Herstelleranweisungen extrahiert, anschließend wurden RNA-Konzentration und -Qualität bewertet (Tabelle 1). Die cDNA wurde aus der extrahierten RNA unter Verwendung des cDNA-Synthese-Kits synthetisiert. Die Amplifikation wurde mit den in Tabelle 1 aufgeführten Primerpaaren durchgeführt, wobei GAPDH als Referenzgen diente. Die relativen Expressionsniveaus wurden mit der 2−ΔΔCt-Methode13,26 berechnet.

Statistische Analyse
Alle statistischen Analysen wurden mit der R-Software (Version 4.2.2) sowie der für die entsprechenden experimentellen Verfahren erforderlichen Software durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, waren alle statistischen Tests zweiseitig, und Unterschiede wurden als statistisch signifikant betrachtet bei P < 0,05. Die differentielle Expressionsanalyse der Transkriptomik wurde mit dem limma-Paket durchgeführt. Gene mit einem adjustierten P < 0,05 und einer absoluten log2-Faltungsänderung größer als 0,5 wurden als differentiell exprimiert definiert.

Zum Vergleich der Expression von Kandidatengenen zwischen unabhängigen DN- und Kontrollproben wurden, wo im ursprünglichen analytischen Workflow angegeben, nichtparametrische Wilcoxon-Rangsummentests verwendet. Die Korrelationen zwischen Kandidaten-Biomarkern und Anteilen von Immunzellen wurden mittels Rangkorrelation nach Spearman bewertet.

Experimentelle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Vergleiche zwischen den drei unabhängigen Tiergruppen wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse durchgeführt, sofern die Voraussetzungen für eine parametrische Analyse erfüllt waren. Für post-hoc-Vergleiche wurde der Least-Significant-Difference-Test verwendet, wenn die Varianzen homogen waren, andernfalls der Dunnett's-T3-Test. Die pharmakodynamischen Messungen zum Basiswert und in der 8. Woche wurden getrennt analysiert und dargestellt; Rückschlüsse auf eine Wechselwirkung zwischen Gruppe und Zeit wurden nicht gezogen. Die für die Bioinformatik- und Machine-Learning-Analysen verwendeten R-Skripte und Rohdaten sind in Zusatzdatei 1 enthalten.

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Ergebnisse

To systematically investigate potential mitochondria-related candidate biomarkers for LLF in the treatment of DN, we designed a four-phase analytical workflow (Figure 1). In Phase I, we integrated transcriptomic data from the GSE142025 dataset (training set, whole kidney, n=36) and GSE96804 (validation set, glomerulus, n = 61) with 1,136 mitochondria-related genes from the MitoCarta 3.0 database and 517 predicted targets of 9 active ingredients from the TCMSP database. Overlapping these three gene sets y...

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Diskussion

LLF ist ein häufig verwendetes traditionelles chinesisches Arzneimittel, das hauptsächlich zur Stärkung der Leber und Nieren sowie zur Behandlung von Diabetes und seinen Komplikationen eingesetzt wird. Derzeit gibt es keine spezifischen Arzneimittel oder Therapien für die diabetische Nephropathie (DN), sodass die Behandlung vorwiegend auf blutglukosesenkenden, lipidregulierenden und blutdrucksenkenden Maßnahmen beruht30,31,32. D...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Wir möchten allen Einzelpersonen und Organisationen, die uns während dieser Forschung unterstützt und geholfen haben, unseren aufrichtigen Dank aussprechen. Diese Studie wurde unterstützt durch die Nationale Naturwissenschaftliche Stiftung Chinas (Nr. 81973486 und 82173974), die Forschungsprojekte der Verwaltung für Traditionelle Chinesische Medizin der Provinz Shanxi (Nr. 2024ZYYA021), das Fachdisziplin-Projekt der Shanxi-Universität für Chinesische Medizin (Nr. 2026XK24) und das wissenschaftliche Forschungsförderungsprojekt der Shandong-Universität für Chinesische Medizin (Nr. KYZK2024Q13). Wir danken Qinqing Li, außerordentlicher Professor an der Shanxi-Universität für Chinesische Medizin, der das botanische Material authentifiziert hat.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4 % Paraformaldehyd-Gewebe-FixierungslösungSaiyin Biotechnology Co., Ltd.71033600
Absolute EthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10009218
BlutzuckermessgerätSinocare Inc.GA-3
Blut-Harnstoff-Stickstoff-(BUN-)TestkitNanjing Jianwei Bioengineering InstituteC03-2-1
C57BLKS/J db/db-MäuseChangzhou Cavens Experimental Animal Co., Ltd.SCXK (Su) 2021-0013
C57BLKS/J db/m-MäuseChangzhou Cavens Experimental Animal Co., Ltd.SCXK (Su) 2021-0013
ZentrifugeHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.HI650
ChloralhydratShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.302-17-0
Cytoscape (v3.9.0)https://cytoscape.org
Datenbank für m6A-Modifikationsvorhersagehttp://www.cuilab.cn/sramp/
Datenbank für Wirkstoffe in der traditionellen chinesischen Medizinhttp://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php
ENCORI / Starbasehttps://starbase.sysu.edu.cn/
Gene Expression Omnibus (GEO)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
HE-Färbekit (Hämatoxylin und Eosin)Servicebio C0105S
SchnellzentrifugeLabnet, USAC2500-R-230V
Werkzeug zur Analyse der Immuninfiltrationhttps://cibersort.stanford.edu/
Ligustri Lucidi FructusSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20240506
Magnet-RührerJintan Zhongtian Instrument Factory, JiangsuT8-1
MikroskopOlympusBX53
MikrotomLeica, GermanyRM 2016
Mikroliter-SpektrophotometerHangzhou Aosheng Instrument Co., Ltd.Nano-300
miRNethttps://www.mirnet.ca
MitoCarta 3.0https://www.broadinstitute.org/mitocarta
R-Paket zur Modellinterpretationhttps://cran.r-project.org/package=DALEX
Molekulares Docking-Portalhttp://clab.labshare.cn/cb-dock/
Maus-Mikroalbuminurie-ELISA-KitFine TestEM0632
Maus-Mikroalbuminurie-TeststreifenGuangzhou Huadu Gaoerbao Biotechnology Co., Ltd.20211203
Maus-Serum-Kreatinin-ELISA-KitAbmartAB5990A
MSigDBhttps://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/
PCR-ThermocyclerRocheRoche LightCycler 480
R-Software (v4.2.2) + R-Paketehttps://www.r-project.org / CRAN/Bioconductor
RCSB PDBhttps://www.rcsb.org
RNA-ExtraktionskitBeijing Jumei Biotech Co., Ltd.MF-036-01
RPISeqhttp://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/
RT-qPCR-KitBeijing Jumei Biotech Co., Ltd.MF949-T
SalidrosideSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20211009
Serum-Kreatinin-TestkitNanjing Jianwei Bioengineering InstituteC011-2-1
SPF-TierhaltungsanlageShanxi University of TCM
SRAMPhttp://www.cuilab.cn/sramp/
STRINGhttps://cn.string-db.org/
SwissTargetPredictionhttp://www.swisstargetprediction.ch/
TCMSPhttp://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php
Tezhi PiganSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20210602
GewebeschwimmbeckenWuhan JunjieJK-6

Referenzen

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