Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Western-Blot-Analyse des Mikrotubuli-assoziierten Proteins Light Chain 3 zur Überwachung der autophagosomalen Dynamik in pankreaskrebszellen aus Mäusen

130 Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/71604

⸱

3. September 2026

 ,  , 
1Traslational Medicine Research Unit, Center for Medical Education and Clinical Research (CEMIC), 2Programa de Estudios Pancreaticos, Hospital de Clinicas “Jose de San Martin”, Universidad de Buenos Aires, 3The Massachusetts General Hospital Cancer Center, Harvard Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die LC3-Immunoblot-Analyse ist eine weit verbreitete Methode zur Überwachung der Autophagie, erfordert jedoch eine sorgfältige Optimierung. Dieses Protokoll beschreibt einen robusten Ansatz zur Detektion und Quantifizierung von LC3-II in aus KPC-Zellen abgeleiteten Pankreaskrebszellen, einschließlich wesentlicher technischer Aspekte und eines standardisierten Workflows für die dichtometrische Analyse mithilfe von Fiji.

Zusammenfassung

Die Autophagie spielt eine komplexe Rolle beim Pankreas-ductalen Adenokarzinom (PDAC) und trägt zur Tumorprogression, Anpassung an zellulären Stress sowie zur Therapieresistenz bei. Eine genaue Beurteilung der Dynamik von Autophagosomen ist daher für die Erforschung der Krebsbiologie unerlässlich. Unter den verfügbaren Methoden wird die Immunoblot-Analyse des Mikrotubuli-assoziierten Proteins Light Chain 3 (LC3) häufig zur Überwachung der Autophagosom-Dynamik eingesetzt, indem zwischen der zytosolischen (LC3-I) und der lipidierten, an Autophagosomen gebundenen Form (LC3-II) unterschieden wird. Aufgrund des geringen Molekulargewichts von LC3 und des minimalen Unterschieds in der elektrophoretischen Mobilität dieser Isoformen ergeben sich jedoch technische Herausforderungen, die eine sorgfältige Optimierung erfordern. Hier wird ein reproduzierbares Protokoll zur semi-quantitativen Analyse der LC3-II-Spiegel mittels Western Blot in aus KPC-Mäusen stammenden pankreatischen Krebszellen vorgestellt. Die Methode beinhaltet optimierte Bedingungen für die Zelllyse, Elektrophorese, Proteintrennung und proteinvermittelte Detektion, um eine zuverlässige Trennung und Nachweisbarkeit der LC3-Isoformen sicherzustellen. Zusätzlich wird ein standardisierter Arbeitsablauf zur dichtemetrischen Analyse der LC3-II-Banden mittels Fiji (ImageJ) bereitgestellt. Die Empfindlichkeit der Methode wird durch den Nachweis erhöhter LC3-II-Spiegel unter Bedingungen der Autophagie-Induktion (Behandlung mit Gemcitabin) und eingeschränktem autophagischen Fluss (VMP1-Knockdown) demonstriert. Kritische technische Parameter, die die Dateninterpretation beeinflussen, wie die Zusammensetzung des Lysepuffers und die Spezifität der Antikörper, werden ebenso untersucht wie häufige experimentelle Fallstricke. Obwohl die LC3-Immunoblot-Analyse allein nicht ausreicht, um den autophagischen Fluss vollständig zu charakterisieren, stellt sie in Kombination mit ergänzenden Assays einen robusten und zugänglichen Ansatz zur Überwachung der autophagischen Aktivität dar. Das Protokoll kann an andere experimentelle Kontexte angepasst werden und erleichtert so mechanistische Untersuchungen der Autophagie in Krebsmodellen.

Einleitung

Die Makroautophagie (im Folgenden als Autophagie bezeichnet) ist ein regulierter degradativer Weg, über den Zellen zytoplasmatische Materialien, einschließlich Proteine und dysfunktionale Organellen, abbauen. Ein Kennzeichen der Autophagie ist die Bildung einer doppelmembranösen Struktur, die als Autophagosom bekannt ist und zelluläre Fracht einschließt, um sie anschließend zu Lysosomen zu transportieren, wo sie abgebaut wird1,2,3. In normalen Zellen trägt die Autophagie zum kontrollierten Umsatz von Proteinen und Organellen bei, wodurch oxidativer Stress begrenzt und das Risiko der Tumorentwicklung verringert wird. In Krebszellen hingegen kann dieser Prozess dafür genutzt werden, das Überleben unter Bedingungen hoher metabolischer Belastung, Nährstoffmangel und Hypoxie zu unterstützen. Indem die Autophagie die Anpassung an eine feindliche Mikroumgebung erleichtert, trägt sie auch zur Chemotherapieresistenz bei, teilweise indem sie therapieinduzierte zelluläre Schäden verringert4,5.

Pankreaskrebs ist in den Vereinigten Staaten die dritthäufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle. Etwa 90 % aller Pankreaskrebsfälle werden als duktales Pankreasadenokarzinom (PDAC) klassifiziert. Im Gegensatz zu mehreren anderen Malignitäten, bei denen eine Früherkennung und therapeutische Fortschritte die Überlebensrate der Patienten verbessert haben, wird PDAC in über 80 % der Fälle erst im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert. Diese späte Diagnosestellung, verbunden mit einer aggressiven Tumorbiologie und einer deutlichen Therapieresistenz, führt zu einer Fünf-Jahres-Überlebensrate von etwa 11 %6.

Das KPC-Mausmodell, das auf der pancreasspezifischen Aktivierung von onkogenem Kras und der bedingten Deletion von Trp53 basiert, die durch Cre-Rekombinase vermittelt wird, ist eines der am häufigsten verwendeten genetisch veränderten Modelle des Pankreas-ductalen Adenokarzinoms. Diese Mäuse entwickeln spontan Tumore, die der menschlichen Erkrankung stark ähneln und sich von intraepithelialen Pankreasneoplasien (PanIN) bis zum invasiven Karzinom fortentwickeln. Bedeutend ist, dass dieses Modell zentrale Merkmale des Pankreaskarzinoms nachbildet, darunter ein dichtes desmoplastisches Stromagewebe und eine immunsuppressive Tumormikroumgebung. Aus KPC-Mäusen isolierte Tumorzellen (KPC-abgeleitete Zellen) stellen ein ergänzendes in vitro-System dar, das viele der genetischen und phänotypischen Eigenschaften der ursprünglichen Tumore beibehält und somit mechanistische Untersuchungen sowie eine kontrollierte Evaluierung therapeutischer Ansprechen ermöglicht7,8.

VMP1 ist ein essentielles, autophagieassoziiertes Protein, das die Autophagie durch seine Interaktion mit Beclin-1 und die Rekrutierung des PI3KC3-Komplexes initiiert9,10. Über die Initiation hinaus ist VMP1 an mehreren Stadien der Autophagie beteiligt, einschließlich der Bildung10, Schließung11 von Autophagosomen sowie selektiver Prozesse wie der Mitophagie12 und Zymophagie13. VMP1 bleibt während des gesamten autophagischen Flusses aktiv beteiligt und könnte zusätzliche Funktionen als Phospholipid-Scramblase ausüben14. Im Pankreas ist die Expression von VMP1 normalerweise gering, wird jedoch unter Stressbedingungen wie Pankreatitis und onkogener Transformation stark induziert, wobei es die Autophagie downstream der Signalgebung durch mutiertes KRAS fördert15,16. VMP1 ist im Pankreaskarzinom überexprimiert17, und experimentelle Mausmodelle haben gezeigt, dass VMP1-abhängige Autophagie gemeinsam mit KRAS die Tumorbildung und die Entstehung von PanIN-Läsionen unterstützt18. Darüber hinaus trägt VMP1 zur Chemotherapieresistenz bei, da seine Hochregulierung durch Wirkstoffe wie Gemcitabin19 die Autophagie stimuliert19 und das Überleben von Tumorzellen unterstützt17, was seine protumorigene Rolle unterstreicht15.

Autophagosomen zeichnen sich durch das Vorhandensein des Autophagie-assoziierten Proteins Mikrotubuli-assoziiertes Protein Light Chain 3 (LC3) aus20. Unter Basalbedingungen liegt LC3 hauptsächlich in einer löslichen Form (LC3-I) vor, die im gesamten Zytoplasma und Kern verteilt ist. Nach Aktivierung der Autophagie wird LC3 lipidiiert, indem es an Phosphatidylethanolamin konjugiert wird, wodurch die membranassoziierte Form LC3-II entsteht1,21. Obwohl LC3-II aufgrund dieser Modifikation ein höheres Molekulargewicht als LC3-I aufweist, wandert es während der SDS-PAGE schneller, wahrscheinlich aufgrund seiner erhöhten Hydrophobizität. Folglich spiegelt die Umwandlung von LC3-I in LC3-II eine Lipidierung und nicht eine proteolytische Verarbeitung wider, wobei LC3-I typischerweise bei etwa 16 kDa und LC3-II bei etwa 14 kDa detektiert wird. Da die Konzentrationen von LC3-II mit der Anzahl der Autophagosomen korrelieren, wird die LC3-Immunoblotanalyse häufig zur Überwachung der autophagischen Aktivität verwendet22. Eine genaue Beurteilung der LC3-Dynamik ist daher entscheidend für die Interpretation experimenteller Ergebnisse im Zusammenhang mit der Autophagie.

Diese Studie beschreibt die Standardisierung und technische Optimierung eines klassischen LC3-Immunblot-Protokolls in einer aus KPC-Zellen stammenden Pankreaskarzinom-Zelllinie. Die Optimierung ist besonders wichtig, da LC3 ein Protein mit geringer Molmasse ist, die Formen LC3-I und LC3-II sich in ihrer elektrophoretischen Mobilität nur um etwa 2 kDa unterscheiden und LC3-II eine lipidierte Spezies darstellt21,22. Daher können bereits geringfügige methodische Abweichungen die Detektion von LC3 beeinträchtigen und zu suboptimalen Ergebnissen führen. Zudem ist die artliche Herkunft der Proben eine wichtige Überlegung, um eine optimale Immunreaktivität zu erreichen. Das optimierte Protokoll ist empfindlich genug, um erhöhte LC3-II-Spiegel nach Behandlung mit dem chemotherapeutischen Wirkstoff Gemcitabin sowie nach Herunterregulation von VMP1 nachzuweisen, Bedingungen, die bekanntermaßen die Autophagie stimulieren bzw. den autophagosomalen Fluss beeinträchtigen. Schließlich werden zwei mögliche technische Fallstricke hervorgehoben, um deren Auswirkung auf die Datenqualität und die Interpretation der Ergebnisse zu verdeutlichen. Ein Überblick über diesen experimentellen Arbeitsablauf ist in Abbildung 1 dargestellt.

figure-introduction-1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des LC3-Immunoblot-Protokolls in KPC-abgeleiteten Zellen. Schematische Übersicht des Protokolls zur Detektion und Quantifizierung von LC3-II mittels Immunoblot. KPC-abgeleitete Pankreaskrebszellen werden kultiviert und experimentellen Behandlungen unterzogen, gefolgt von Zelllyse, Proteinquantifizierung, SDS-PAGE, Membranübertragung, Antikörper-basierter Detektion von LC3, Erfassung des chemilumineszenten Signals und dichtemetrischer Analyse der LC3-II-Banden, normiert auf eine Ladekontrolle. Der Arbeitsablauf verdeutlicht die wichtigsten Verfahrensschritte und kritischen Phasen, die für eine zuverlässige Beurteilung der LC3-Dynamik erforderlich sind. Erstellt mit BioRender.com. Klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß den institutionellen Richtlinien durchgeführt und von dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Massachusetts General Hospital unter dem Protokoll #2019N000111 genehmigt. Die in dieser Studie verwendete aus KPC-Zellen stammende Pankreaskrebszelllinie wurde zuvor im Mostoslavsky-Labor unter diesem genehmigten Protokoll etabliert. Die Liste der Reagenzien, Chemikalien und Geräteinformationen ist in der Tabelle der Materialien enthalten.

1. Zellpräparation

  1. Säen Sie KPC (KrasG12D; Trp53f/+; p48-Cre)-abgeleitete Pankreastumorzellen mit niedriger Passage in eine 6-Loch-Platte in Roswell Park Memorial Institute-Medium (RPMI 1640), das 10 % fetalen Kälberserum, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin enthält. Stellen Sie die Ansiededichte so ein, dass am Tag der Lyse eine Konfluenz von 70 %–90 % erreicht wird.
    HINWEIS: Eine Ansiededichte von 3,5 × 105 Zellen pro Loch führte nach 72 h zu einer Konfluenz von etwa 80 %. Da das Wachstum zwischen verschiedenen Laboren und KPC-Modellen variieren kann, sollte die optimale Ansiededichte vor dem eigentlichen Experiment empirisch bestimmt werden.
    HINWEIS: Um stabile VMP1-Knockdown-Zelllinien zu erzeugen, produzieren Sie Lentivirus-Partikel durch Cotransfektion von HEK293T-Zellen mit Verpackungsplasmiden und dem jeweiligen lentiviralen Vektor unter Verwendung von Polyethylenimin (PEI). Sammeln Sie die lentiviralen Überstände 72 h nach der Transfektion, zentrifugieren Sie bei 300 × g für 10 min bei 4 °C, um zelluläre Trümmer zu entfernen, und filtrieren Sie durch einen Spritzenfilter mit 0,45 µm Porengröße. Führen Sie eine einzige Transduktionsrunde der KPC-Zellen mit den gesammelten viralen Überständen durch. Selektieren Sie stabil transduzierte Zellen durch Behandlung mit 2,5 µg/mL Puromycin (1:4.000 Verdünnung aus einer 10 mg/mL Stammlösung) über 72 h.
  2. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid (CO₂).
  3. Ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium und setzen Sie die Inkubation unter denselben Bedingungen fort.

2. Behandlung mit 20 µM Gemcitabin

  1. Stellen Sie einen 10 mM Gemcitabin-Lösung in RPMI-Medium einen Tag vor der Lyse her. Behandeln Sie jede Vertiefung mit 4 µL der 10 mM-Lösung, um eine Endkonzentration von 20 µM zu erreichen.
  2. Inkubieren Sie die Zellen 24 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid (CO₂).

3. Zelllysate

  1. Stellen Sie die Platte auf Eis und waschen Sie sie dreimal mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na₂HPO₄ und 2 mM KH₂PO₄).
  2. Geben Sie 80 µL Puffer zur Zelllyse (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 % Triton X-100 und 0,1 % SDS) unter Zusatz von Proteaseinhibitoren hinzu.
    HINWEIS: Wenn zwischen den Vertiefungen unterschiedliche Konfluenzniveaus beobachtet werden, passen Sie das Volumen des Lysepuffers an, um vergleichbare Protein-Konzentrationen zu erhalten. Als Richtwert verwenden Sie etwa 10 µL Lysepuffer pro 10 % Konfluenz (z. B. 70 µL bei 70 % Konfluenz und 90 µL bei 90 % Konfluenz).
  3. Verwenden Sie das breite (proximale) Ende einer P200-Pipettenspitze, um die gesamte Oberfläche jeder Vertiefung gründlich abzukratzen, um die Zellen vom Untergrund zu lösen und im Lysepuffer zu sammeln.
  4. Sammeln Sie das Lysat in einem Mikrozentrifugenröhrchen und bewahren Sie es 15 Minuten auf Eis auf.
  5. Zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 16.900 × g und 4 °C.
  6. Überführen Sie das Überstand in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen.
  7. Entnehmen Sie eine Aliquotprobe zur Proteinquantifizierung und bewahren Sie sie bis zur Analyse auf Eis auf.
    HINWEIS: Zur Proteinquantifizierung verdünnen Sie 2,5 µL Lysat in 7,5 µL Lysepuffer und mischen Sie dies mit 200 µL Bicinchoninsäure-Reagenz. Alternativen Methoden zur Proteinquantifizierung können ebenfalls verwendet werden.
  8. Geben Sie 4× Laemmli-Probenpuffer (250 mM Tris-HCl, pH 6,8, 8 % SDS, 40 % Glycerin, 0,04 % Bromphenolblau und 20 % β-Mercaptoethanol) zu den Lysaten hinzu und mischen Sie gründlich. Für 77,5 µL Lysat fügen Sie 25,8 µL Laemmli-Probenpuffer hinzu.
  9. Bewahren Sie die Proben bei −80 °C auf.
    HINWEIS: Der Protokollschritt kann an dieser Stelle unterbrochen werden. Die Proben können bis zu zwei Wochen lang vor der SDS-PAGE bei −80 °C gelagert werden.

4. SDS–PAGE und Western Blot

  1. Erhitzen Sie die Proben 5 min bei 96 °C.
  2. Geben Sie 70 µg jeder Probe auf ein 15%iges SDS-PAGE-Gel (1,5 mm Dicke) und führen Sie die Elektrophorese bei 90 V durch, bis die Farbstofffront in das Trenngel eindringt. Verwenden Sie ein selbst gegossenes 15%iges Polyacrylamid-Trenngel, das 15% Acrylamid/Bis-Acrylamid, 375 mM Tris-HCl (pH 8,8) und 0,1% SDS enthält.
  3. Erhöhen Sie die Spannung auf 120 V und setzen Sie die Elektrophorese fort, bis die Farbstofffront das untere Ende des Gels erreicht oder verlässt. Beenden Sie den Lauf, bevor der 10-kDa-Marker der Molekulargewichtsleiter das Gel verlässt.
  4. Schneiden Sie das Gel bei etwa 25 kDa durch, um den oberen und unteren Teil zu trennen.
  5. Übertragen Sie die Proteine auf eine 0,2 µm PVDF-Membran, die zuvor mit Methanol in Übertragungspuffer (25 mM Tris-Basis, 192 mM Glycin und 20% [v/v] Methanol) voraktiviert wurde, bei 200 mA für 1 h für den unteren Geltteil (<25 kDa) und 2,5 h für den oberen Geltteil (>25 kDa).
  6. Blockieren Sie die Membran 1 h in Blockpuffer unter leichtem Schütteln.
  7. Bereiten Sie eine 1:1.000-Verdünnung des primären Anti-LC3-Antikörpers in Blockpuffer, der 0,1% Tween-20 enthält.
    HINWEIS: Der primäre Anti-LC3-Antikörper wurde 1:1.000 verdünnt verwendet, der primäre Anti-Aktin-Ladungskontrollantikörper wurde 1:4.000 verdünnt verwendet.
  8. Incubieren Sie die Membran über Nacht bei 4 °C mit dem primären Anti-LC3-Antikörper unter leichtem Schütteln.
  9. Waschen Sie die Membran viermal je 5 min mit TBS-T (0,1% Tween-20 in TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, und 150 mM NaCl).
  10. Bereiten Sie eine 1:2.000-Verdünnung des mit Peroxidase konjugierten sekundären Antikörpers gegen Kaninchen in Blockpuffer vor.
  11. Incubieren Sie die Membran 1 h bei Raumtemperatur mit dem sekundären Antikörper unter leichtem Schütteln.
  12. Waschen Sie die Membran viermal je 5 min mit TBS-T.
  13. Waschen Sie die Membran zweimal mit TBS.

5. Chemilumineszenznachweis

  1. Stellen Sie das zweikomponentige, verstärkte Chemilumineszenz-Substrat her, indem Sie unmittelbar vor der Verwendung gleiche Volumina von Reagenz A (Luminol/Verstärker-Lösung) und Reagenz B (Peroxid-Lösung) mischen.
  2. Entfernen Sie vorsichtig überschüssige Flüssigkeit von der Membran mit einem Laborabwischpapier.
  3. Legen Sie die Membran in eine lichtundurchlässige Box.
  4. Geben Sie die verstärkte Chemilumineszenz-Lösung auf die Membran, schließen Sie die Box und inkubieren Sie 5 min.
  5. Lassen Sie überschüssige Lösung von der Membran ablaufen und legen Sie die Membran in das Bildgebungssystem zur Signaldetektion.
  6. Nehmen Sie die Bilder gemäß den Herstelleranweisungen für das Bildgebungssystem auf.

6. Dichtometrische Analyse mit Fiji

  1. Ziehen Sie die Bilddatei per Drag & Drop in das Fiji-Fenster, um sie zu öffnen.
  2. Konvertieren Sie das Bild in 8-Bit-Graustufen (Image → Type → 8-bit).
  3. Falls erforderlich, drehen Sie das Bild, um die Bänder horizontal auszurichten (Image → Transform → Rotate).
    1. Aktivieren Sie die Vorschau und stellen Sie das Raster auf eine geeignete Anzahl von Linien ein (z. B. 20).
    2. Passen Sie den Drehwinkel an, bis die Bänder korrekt ausgerichtet sind.
  4. Verwenden Sie das rechteckige Auswahlwerkzeug, um einen interessierenden Bereich (ROI) um die erste Spur zu definieren, wobei nur das Band, das LC3-II entspricht, eingeschlossen wird.
    HINWEIS: Die Auswahl sollte nicht mehr als doppelt so breit wie hoch sein. Verwenden Sie für alle in die Analyse einbezogenen Bänder dieselben ROI-Abmessungen.
  5. Wählen Sie Analyze → Gels → Select First Lane.
  6. Verschieben Sie denselben ROI zur nächsten Spur und positionieren Sie ihn um das entsprechende Band.
  7. Wählen Sie Analyze → Gels → Select Next Lane.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 6.6 und 6.7, bis die letzte Spur ausgewählt ist.
  9. Erzeugen Sie Intensitätsprofile (Analyze → Gels → Plot Lanes).
  10. Verwenden Sie das Geradenwerkzeug, um die Basislinie jedes Peaks zu definieren, und quantifizieren Sie die Bandintensität mithilfe des Zauberstabwerkzeugs.
  11. Normalisieren Sie die Werte auf eine Loading-Control.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt die Western-Blot-Analyse zur Untersuchung der LC3-Dynamik in einer aus KPC-Zellen stammenden Pankreaskarzinom-Zelllinie unter verschiedenen experimentellen Bedingungen. Das Protokoll erzeugt chemilumineszente Bilder von LC3 und einer Ladekontrolle. In dieser Studie wurde Actin als Ladekontrolle verwendet.

Zwei repräsentative Anwendungen des Protokolls werden gezeigt. Zunächst wurden Kontroll-KPC-Zellen mit mit Gemcitabin behandelten KPC-Zellen verglichen. Gemcitabin...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt die technische Optimierung und Standardisierung eines klassischen LC3-Immunblottings in aus KPC-Zellen abgeleiteten Pankreaskrebszellen. Angesichts der zunehmend anerkannten Rolle der Autophagie und autophagiebezogener Proteine bei der Entstehung und Progression von Pankreaskrebs23 bietet dieser standardisierte Arbeitsablauf eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der LC3-Dynamik. Das Protokoll kann angewendet werden, um den autophagosomalen Pool unter verschiedenen ex...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

This work was supported by grants from the Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) [PIP 2021–2023 GI-11220200101549CO], the Agencia Nacional de Promoción de la Investigación, el Desarrollo Tecnológico y la Innovación (Agencia I+D+i) [PICT-2021-I-A-00328], the Universidad de Buenos Aires [UBACyT 2023–2025, 20020220300232BA], and the Fundación Norberto Quirno, Ciudad de Buenos Aires.

The authors gratefully acknowledge The Company of Biologists for financial support through a Traveling Fellowship awarded by Disease Models & Mechanisms. This support contributed to the work arising from the funded visit. Further information about the charity is available at https://www.biologists.com/.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
C-DiGit-Blot-ScannerLI-COR BioScience3600Wird für die chemilumineszente Detektion im Schritt 5.6 verwendet
10x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Corning46-013-CMWird zur Herstellung steriler 1x PBS zur Zellwäsche vor dem Passagieren im Schritt 1.1 verwendet.
2-Mercaptoethanol (β-Mercaptoethanol)Sigma-Aldrich (Merck)M3148Wird zur Herstellung des 4×-Laemmli-Probelöseung für die SDS-PAGE-Probenpräparation im Schritt 3.8 verwendet.
3D-SchüttlerDLABSK-D1807-EWird zum Inkubieren der Membranen in Blockier-, Primär- und Sekundärantikörperlösungen sowie während der Waschschritte verwendet (Schritte 4.6, 4.8, 4.9, 4.11, 4.12 und 4.13).
6-Loch-ZellkulturplatteSORFASCP-11-006Wird zum Aussäen der Zellen im Schritt 1.1 verwendet.
AcrylamidSigma-Aldrich (Merck)A8887Wird zur Herstellung des 15%-igen SDS-PAGE-Gels benötigt, das für die Schritte 4.2–4.5 erforderlich ist.
Anti-Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, mausmonoklonal, Klon 6C5Merck MilliporeMAB374RRID:AB_2107445 Reaktivität:
Mensch, Katze, Schwein, Maus, Kaninchen, Fisch, Hund, Ratte. Wird als Ladekontrolle zur Beurteilung der Knockdown-Effizienz verwendet (Abbildungen 2C und 2D).
Anti-Maus-IgG, HRP-gekoppelter AntikörperCell Signaling Technology7076RRID: AB_330924. Wird zur Herstellung der Sekundärantikörperlösung im Schritt 4.10 verwendet.
Anti-Kaninchen-IgG, HRP-gekoppelter AntikörperCell Signaling Technology7074RRID: AB_2099233. Wird zur Herstellung der Sekundärantikörperlösung im Schritt 4.10 verwendet.
Anti-β-Actin (ACTB)-Antikörper, mausmonoklonal, AC-15Sigma-Aldrich (Merck)A1978RRID:AB_476744 Reaktivität: Schaf, Karpfen, Katze, Huhn, Ratte, Maus, Hirudo medicinalis, Kaninchen, Hund, Schwein, Mensch, Rind, Meerschweinchen. Wird als Ladekontrolle in den Abbildungen 2A, 2B, 2E, 2F, 2G und 2H verwendet.
BromphenolblauSigma-Aldrich (Merck)B0126Wird zur Herstellung des 4×-Laemmli-Probelöseung für die SDS-PAGE-Probenpräparation im Schritt 3.8 verwendet.
Ethylenediamintetraessigsäure (EDTA)Sigma-Aldrich (Merck)E9884Wird zur Herstellung des lysearmen Puffer (Abbildungen 2G und 2H) verwendet.
Fötales RinderserumNATOCOR Lintc-634Wird zur Herstellung des kompletten Kulturmediums für die Zellkultur verwendet (Schritte 1 und 2).
FijiOpen-Source-SoftwareN/VBildanalyse-Software
GlycerinSigma-Aldrich (Merck)G5516Wird zur Herstellung des 4×-Laemmli-Probelöseung für die SDS-PAGE-Probenpräparation im Schritt 3.8 verwendet.
GlycinSigma-Aldrich (Merck)G7126Wird zur Herstellung des Transferpuffers für Schritt 4.5 verwendet.
Immun-Blot PVDF-Membran, Rolle, 0,2 µm, 26 cm x 3,3 mBio-Rad1620177Wird für den Transfer im Schritt 4.5 verwendet.
Intercept (TBS) BlockierpufferLI-COR BioScience927-60001Wird zum Blockieren im Schritt 4.6 sowie zur Herstellung der Primär- und Sekundärantikörperlösungen in den Schritten 4.7 und 4.10 verwendet.
LC3 A/B (D3U4C) Kaninchen-monoklonaler Antikörper Cell Signaling Technology12741RRID: AB_2617131 Reaktivität:
Mensch, Maus, Kaninchen. Wird zur Herstellung der Primärantikörperlösung im Schritt 4.7 verwendet.
LC3B (D11) Kaninchen-monoklonaler AntikörperCell Signaling Technology3868SRRID: AB_2137707 Reaktivität: Mensch. Wird als LC3-Primärantikörper in Abbildung 2H verwendet.
MethanolAnedra6197Wird zur Aktivierung der PVDF-Membran und zur Herstellung des Transferpuffers im Schritt 4.5 verwendet.
Millex-HV-Spritzenfiltereinheit, 0,45 μm PVDF Merck MilliporeSLHV033RSWird zum Filtrieren des lentivirus-haltigen Mediums (Schritt 1.1) verwendet.
Mini-Digital-TrockenbadLabnet International, Inc.D 5060075Wird zum Erhitzen der Proben im Schritt 4.1 verwendet.
Mini-PROTEAN Tetra-Elektrophorese-SystemBio-Rad1658025FCWird für SDS-PAGE und Transfer in den Schritten 4.2, 4.3 und 4.5 verwendet.
MISSION shRNA, die auf die murine Vmp1 (TRCN0000279038) abzieltSigma-Aldrich (Merck)SHCLND-NM_029478Wird zur Erzeugung stabiler VMP1-Knockdown-Zelllinien verwendet (Schritt 1.1).
N,N'-Methylenbisacrylamid (Bis-Acrylamid)Sigma-Aldrich (Merck)M7279Wird zur Herstellung des 15%-igen SDS-PAGE-Gels benötigt, das für die Schritte 4.2–4.5 erforderlich ist.
Nabigem 1g GemcitabinMicrosules ArgentinaM3060584-3Wird für die Gemcitabin-Behandlung im Schritt 2 verwendet.
Pen-Strep-LösungSartorius03-031-1BWird zur Herstellung des kompletten Kulturmediums für die Zellkultur verwendet (Schritte 1 und 2).
Pierce BCA-Protein-Assay-KitThermo Fisher Scientific23227Wird für die Proteinquantifizierung verwendet (Schritt 3.7).
Pierce Protease-Inhibitor-TablettenThermo Fisher Scientific A32953Wird zur Herstellung des Lysepuffers im Schritt 3.2 verwendet.
Polyethylenimin HCl MAX, linear (PEI MAX), MW 40.000Polysciences24765-1Wird für die Transfektion mit lentiviralen Plasmiden verwendet (Schritt 1.1).
Kaliumchlorid (KCl)Sigma-Aldrich (Merck)P9333Wird zur Herstellung von PBS im Schritt 3.1 verwendet.
Monobasisches Kaliumphosphat (KH2PO4)Sigma-Aldrich (Merck)P5655Wird zur Herstellung von PBS im Schritt 3.1 verwendet.
PowerPac Basic NetzteilBio-Rad1645050Wird für SDS-PAGE und Transfer in den Schritten 4.2, 4.3 und 4.5 verwendet.
Prestained ProteinladderGenbiotechPM201Wird für SDS-PAGE in den Schritten 4.2–4.4 verwendet.
Puromycin (10 mg/mL-Lösung) InvivoGenant-pr-1Wird für die Selektion stabil transduzierter Zellen verwendet (Schritt 1.1).
RPMI 1640GenbiotechMC2012LWird zur Herstellung des kompletten Kulturmediums für die Zellkultur verwendet (Schritte 1 und 2).
Natriumchlorid (NaCl)Sigma-Aldrich (Merck)S9888Wird zur Herstellung von PBS im Schritt 3.1, der Lysepuffer im Schritt 3.2 und von TBS im Schritt 4.9 verwendet.
Natriumlaurylsulfat (SDS)Sigma-Aldrich (Merck)L3771Wird zur Herstellung des Lysepuffers im Schritt 3.2 und des 15%-igen SDS-PAGE-Gels benötigt, das für die Schritte 4.2–4.5 erforderlich ist.
Natriumfluorid (NaF)Sigma-Aldrich (Merck)S7920Wird zur Herstellung des lysearmen Puffers verwendet (Abbildungen 2G und 2H).
Dibasisches Natriumphosphat (Na2HPO4)Sigma-Aldrich (Merck)S9763Wird zur Herstellung von PBS im Schritt 3.1 verwendet.
Sorval ST 16R ZentrifugeThermo Fisher Scientific75004380Wird zum Zentrifugieren der Zellen im Schritt 1.1 und der Lysate im Schritt 3.5 verwendet.
Chemilumineszenter Substrat SuperSignal West Pico PLUSThermo Fisher Scientific34577Wird für die chemilumineszente Detektion im Schritt 5.1 verwendet.
Thermo Scientific 1300 Series A2 Klasse II, Typ A2 SicherheitswerkbankThermo Fisher Scientific1386Wird für die sterile Zellkulturhandhabung in den Schritten 1.1, 1.3 und 2.1 verwendet.
Thermo Scientific BB 150 CO2-InkubatorThermo Fisher ScientificBB150-2TCS-LWird für die Zellkultur in den Schritten 1.2 und 2.2 verwendet.
TMEM49/VMP1 (D1Y3E) Kaninchen-monoklonaler Antikörper Cell Signaling Technology12929RRID: AB_2714018 Reaktivität: Mensch, Maus, Ratte. Wird als Primärantikörper zur Überprüfung der VMP1-Knockdown-Effizienz in den Abbildungen 2C und 2D verwendet.
Tris-BasisSigma-Aldrich (Merck)T1503Wird zur Herstellung des Transferpuffers für Schritt 4.5 verwendet.
Tris-Hydrochlorid (Tris-HCl)Sigma-Aldrich (Merck)T3253Wird zur Herstellung der Lysepuffer im Schritt 3.2, des 4×-Laemmli-Probelöseung im Schritt 3.8, des 15%-igen SDS-PAGE-Gels für die Schritte 4.2–4.5 sowie von TBS im Schritt 4.9 verwendet.
Triton X-100Sigma-Aldrich (Merck)T8787Wird zur Herstellung der Lysepuffer im Schritt 3.2 verwendet.
Trypsin EDTAGibco11570626Wird zum Passagieren der Zellen im Schritt 1.1 verwendet.

Referenzen

  1. Grasso D, Renna FJ, Vaccaro MI. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Front Cell Dev Biol. 2018;6:146.
  2. Galluzzi L, et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO J. 2017;36(13):1811–1836.
  3. Wang Q, Sun Y, Li TY, Auwerx J. Mitophagy in the pathogenesis and management of disease. Cell Res. 2026;36(1):11–37.
  4. Debnath J, Gammoh N, Ryan KM. Autophagy and autophagy-related pathways in cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24(8):560–575.
  5. Altalbawy FMA, et al. Deciphering autophagy signaling in cancer: A paradigm shift from molecular classifications to clinical innovations. Semin Oncol. 2025;52(5):152397.
  6. Stoffel EM, Brand RE, Goggins M. Pancreatic cancer: Changing epidemiology and new approaches to risk assessment, early detection, and prevention. Gastroenterology. 2023;164(5):752–765.
  7. Kugel S, et al. SIRT6 suppresses pancreatic cancer through control of Lin28b. Cell. 2016;165(6):1401–1415.
  8. Hingorani SR, et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 2005;7(5):469–483.
  9. Molejon MI, Ropolo A, Re AL, Boggio V, Vaccaro MI. The VMP1-Beclin 1 interaction regulates autophagy induction. Sci Rep. 2013;3:1055.
  10. Ropolo A, et al. The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells. J Biol Chem. 2007;282(51):37124–37133.
  11. Zhao YG, et al. The ER-localized transmembrane protein EPG-3/VMP1 regulates SERCA activity to control ER-isolation membrane contacts for autophagosome formation. Mol Cell. 2017;67(6):974–989.e6.
  12. Vanasco V, Ropolo A, Grasso D, Alvarez S, Vaccaro MI. VMP1-dependent selective mitophagy and mitochondrial fragmentation are protective cellular mechanisms in pancreatitis. Pancreatology. 2018;18(4 Suppl):S86–S87.
  13. Grasso D, et al. Zymophagy, a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death. J Biol Chem. 2011;286(10):8308–8324.
  14. Ghanbarpour A, Valverde DP, Melia TJ, Reinisch KM. A model for a partnership of lipid transfer proteins and scramblases in membrane expansion and organelle biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118(16):e2101562118.
  15. Renna FJ, Gonzalez CD, Vaccaro MI. Decoding the versatile landscape of autophagic protein VMP1 in cancer: A comprehensive review across tissue types and regulatory mechanisms. Int J Mol Sci. 2024;25(7):3758.
  16. Lo Ré AE, et al. Novel AKT1-GLI3-VMP1 pathway mediates KRAS oncogene-induced autophagy in cancer cells. J Biol Chem. 2012;287(30):25325–25334.
  17. Gilabert M, et al. Novel role of VMP1 as modifier of the pancreatic tumor cell response to chemotherapeutic drugs. J Cell Physiol. 2013;228(9):1834–1843.
  18. Loncle C, et al. The pancreatitis-associated protein VMP1, a key regulator of inducible autophagy, promotes Kras(G12D)-mediated pancreatic cancer initiation. Cell Death Dis. 2016;7(7):e2295.
  19. Ropolo A, et al. A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS. Front Endocrinol (Lausanne). 2020;11:411.
  20. Tanida I, Ueno T, Kominami E. LC3 and autophagy. Methods Mol Biol. 2008;445:77–88.
  21. Kabeya Y, et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 2000;19(21):5720–5728.
  22. Mizushima N, Yoshimori T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy. 2007;3(6):542–545.
  23. Li J, Chen X, Kang R, Zeh HJ, Klionsky DJ, Tang D. Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer. Autophagy. 2021;17(11):3275–3296.
  24. Moresco P, et al. Signal peptide-independent secretion of keratin-19 by pancreatic cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2025;122(27):e2426218122.
  25. Gonzalez CD, Resnik R, Vaccaro MI. Secretory autophagy and its relevance in metabolic and degenerative disease. Front Endocrinol (Lausanne). 2020;11:266.
  26. Klionsky DJ, et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 2021;17(1):1–382.
  27. Renna FJ, Herrera Lopez M, Manifava M, Ktistakis NT, Vaccaro MI. Evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using LC3 immunofluorescence. J Vis Exp. 2023;(194):e65005. doi:10.3791/65005.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Weitere Artikel entdecken

LC3-ImmunoblottingÜberwachung der AutophagieLC3-II-NachweisProteinelektrophoresedensitometrische AnalyseAntikörperspezifitätautophagischer Flux

Dieser Artikel wurde veröffentlicht

Video demnächst verfügbar

Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.