Transmitochondriale Cybrid-Erzeugung aus mtDNA-Patientenplättchen: Ein effizientes Protokoll zur Optimierung der Kolonieauswahl und funktionellen Validierung

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein optimiertes transmitochondriales Cybrid-Generierungsprotokoll aus mtDNA-Patientenplättchen, wobei wir Wachstumsparameter und Kolonieisolation betonen. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung mitochondrialer DNA-Varianten auf variablen Heteroplasmie-Niveaus in einem gemeinsamen nuklearen Hintergrund, um deren funktionelle Bedeutung für die enzymatischen Aktivitäten der Elektronentransportkette und die integrierte Atemkapazität zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Die Erzeugung der transmitochondrialen Cybridzelllinien stellt die Goldstandardmethode zur Bestimmung der Pathogenität dar, indem biochemische Analysen einer spezifischen mitochondrialen DNA-(mtDNA)-Variante von Interesse bei hohen und niedrigen Prozentsätzen (Heteroplasmatwert) innerhalb eines ansonsten identischen mtDNA- und Kerngenom-Hintergrunds ermöglicht werden. Historisch gesehen war der Cybrid-Generierungsprozess mühsam und schlecht effizient. Hier beschreiben wir ein äußerst effizientes und wirksames Protokoll zur Erzeugung transmitochondrialer Cybridzelllinien, indem menschliche Blutplättchen mit einer Standard-Osteosarkom-143B-Zelllinie fusioniert werden, um einen isogenen Kernhintergrund ohne mtDNA (Rho^0-Zellen ) zu erzeugen. Zellisolate erfassen ein bestimmtes mtDNA-Genom von Interesse, um stabile Zelllinien mit unterschiedlichen Heteroplasmiegraden zu etablieren oder divergente Effekte unterschiedlicher mitochondrialer Haplogruppen zu vergleichen. Da Cybriden von mitochondrialen Patienten mit Standardprotokollen schwerer zu bestimmen sein können, konzentriert sich diese aktuelle Methodik darauf, mtDNA-Varianten zu isolieren, bei denen die Aktivität der Elektronentransportkette beeinflusst ist. Wir zeigen hier, dass Kolonie-Selektionstechniken die Zeit reduzieren und die Ausbeute bei der Erzeugung hoch-heteroplasmieller mtDNA-mutanten-Cybrid-Linien verbessern. Eine Fallstudie zur Cybrid-Generierung für eine Variante unbekannter Bedeutung in MT-ND1, m.3985G>A (s.E227K), wird bereitgestellt. Wir analysieren die Effizienz des Cybrid-Erzeugungsprozesses mit diesem Protokoll und führen funktionelle Studien mit hochauflösender Respirometrie durch. Von diesem Protokoll erzeugte Cybrid-Mutanten von hochstufiger Heteroplasmie MT-ND1 m.3985G>A weisen eine beeinträchtigte komplexe I-abhängige mitochondriale Atmung im Vergleich zur Wildtyp-Kontrolle auf, was darauf hindeutet, dass m.3985G>A wahrscheinlich pathogen ist.

Einleitung

Die Feststellung der Pathogenität mitochondrialer DNA-Mutationen (mtDNA) ist aufgrund ihrer Seltenheit, der Heteroplasmatik mit unterschiedlichen Niveaus mutierter und wilder mtDNA-Genome in verschiedenen Geweben, unterschiedlicher pathophysiologischer Mechanismen und komplexer Wechselwirkungen mit nukleären Genom-Hintergründen^schwierig 1,2,3,4 . Aus diesen Gründen bleiben transmitochondriale Cybrid-Zelllinien die Goldstandardmethode, um die Pathogenität von mtDNA-Varianten zu etablieren, wobei "Cybriden" die Verschmelzung des Zellkerns mit den Mitochondrien^einer anderen Zelle darstellen (^5,6,7,8,9,10 (Abbildung 1). Cybrid-Zelllinien enthalten einen isogenen Kernhintergrund und Mitochondrien mit einem festgelegten Heteroplasmatieanteil für die mtDNA-Variante, die untersucht^{wird 11,12}. Auf diese Weise können funktionelle Assays wie Respirometrie (mittels Polarographie) oder Elektronentransportenzym-Aktivität (mittels Spektrophotometrie) in Cybridlinien mit Heteroplasmiewerten von 0 % bis 100 % durchgeführt werden, um die potenziellen pathogenen Effekte einer bestimmten mtDNA-Variante sowie den relativen Einfluss mitochondrialer Haplogruppen, die zwischen Cybridlinien variieren können,^{zu bestimmen 1}. Andere Zelltypen können zur Untersuchung der Pathogenität verwendet werden und eignen sich am besten als Ergänzung zur Cybrid-Generierung und Funktionsanalyse, da jeder Zelltyp seine eigenen Vor- und Nachteile hat. Patientenfibroblasten stammen direkt vom Patienten, sind aber in der vererbten Heteroplasmie begrenzt und haben keine isogene Kernkontrolle, um Kerngeneffekte zu eliminieren. mtDNA-Bearbeitung wird immer beliebter, leidet aber unter Off-Target-Bearbeitung und begrenzten editierbaren Seiten in mtDNA¹³. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) können differenziert werden, um die Wirkung einer Mutation auf verschiedene Zelltypen wie Neuronen und retinale Ganglienzellen zu untersuchen, aber die Induktion der Pluripotenz kann zum Verlust der interessanten mtDNA-Variante führen oder zu zusätzlichen de-novo-Varianten ^führen. Die Cybrid-Studie umfasst die Erzeugung eines künstlicheren Systems, das auf einer Krebszelllinie (klassisch 143B-Osteosarkom) basiert, aber klassisch gut wächst, was es für den Einsatz in Hochdurchsatz-Screening-Studien für Kandidateninterventionen geeignet macht. Einschränkungen bei der Cybrid-Generierung auf hohem Heteroplasmieniveau umfassen die Qualität der Blutplättchen, die beginnende Heteroplasmie und die selektiven Nachteile der mutierten Mitochondrien, die in diesem Protokoll ausführlich behandelt werden.

Obwohl die Cybridenerzeugung der Goldstandard für die funktionelle Bestimmung der mtDNA-Variantenpathogenität ist, erstellen nur wenige Labore Cybride für die Untersuchung mitochondrialer Erkrankungen 9,10,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26,27}. Stattdessen werden mehr Cybriden erzeugt, um Krebs und Alter^{von 28,29} Jahren zu untersuchen. Hier verwenden wir eine Fallstudie eines vermuteten mitochondrialen Patienten, um Optimierungsstrategien zu demonstrieren, die entwickelt wurden, um die Cybrid-Generierung aus mtDNA-Patientenplättchen zu erleichtern, einschließlich Selektionsverfahren und Zellpräparaten, die notwendig sind, um Cybrid-Zelllinien mit hohen versus niedrigen Heteroplasmatwerten für die Ziel-mtDNA-Variante zu etablieren. Konkret demonstrieren wir die Methodik zur Erzeugung von Cybridenzelllinien für eine komplexe I (CI)-Untereinheit MT-ND1-Variante m.3985G>A, bei der wir biochemische Studien durchführen, die die pathogene Natur dieser Variante nachweisen. Abbildung 2 zeigt den Zeitrahmen für die Cybrid-Generierung, wobei die wichtigsten methodischen Schritte Fusion-, Selektions- und Isolationsmethoden umfassen, um unterschiedliche Kolonien zu erzeugen.

Protokoll

Blutplättchen wurden gemäß der IRB-Studie 08-6177 des Children's Hospital of Philadelphia (CHOP) entnommen.

1. Zubereitung von Thrombozyten

1. Tag 1: Blut in die Säure-Citrat-Dextrose-Röhren abnehmen, wenn sie entnommen wird.
   HINWEIS: Blut sollte sofort auf den Rotator gelegt werden. Thrombozyten werden idealerweise maximal 4 Stunden nach der Blutentnahme entnommen.
2. Zeichnen Sie das Blutvolumen auf. Ein Volumen von 5–6 ml Blut wird empfohlen.
3. Zentrifugiere Blut bei 200 × g für 20 Minuten bei 12 °C.
   HINWEIS: Zentrifugation bei 12 °C bewahrt die Integrität der Probe und verhindert die Aktivierung der Blutplättchen.
4. Übertragen Sie das Supernatant (Plasma) in ein neues Zentrifugenrohr.
5. Zeichnen Sie das Volumen des Plasmas auf.
6. Zentrifugiere das Plasma bei 1500 × g für 20 Minuten bei 12 °C.
7. Zeichnen Sie das geschätzte Volumen der Thrombozytenpellets auf.
   HINWEIS: Zu viele Blutplättchen können in diesem Protokoll umständlich sein. Nach der Fusion kann beim Plattieren der^Rho-0-Zellen und Thrombozyten ein Überschuss an Thrombozyten am Boden der Kolbe haften bleiben und die Haftung der Rho-0-Zellen verhindern. Es wird empfohlen, weniger als 50 μL des Pelletvolumens der Thrombozyten für die Fusion zu verwenden. Die überschüssigen Thrombozyten können durch das Aufteilen der Thrombozyten in den folgenden Schritten eingefroren werden.
8. Entferne das Überwasser.
   HINWEIS: Wenn das Pellet groß ist, kann die Entfernung durch Aspiration erfolgen. Die Anzahl der Blutplättchen von Patienten ist manchmal drastisch reduziert und nicht sehr klebrig. Wenn das der Fall ist, verwenden Sie eine Pipette, um das Plasma langsam zu entfernen.
9. Wenn Sie mit frischen Blutplättchen fortfahren, suspendieren Sie das Pellet in 1 ml Spinner-Modifikation des Minimum Essential Eagle's Medium (SMEM) und übertragen Sie es in ein Mikrozentrifugenrohr.
10. Beim Einfrieren wird das Pellet (die Blutplättchen) in 1,05 mL SMEM und 450 μL plättchengefrierender Lösung (350 μL fetales Rinderserum [FBS] + 100 μL Dimethylsulfoxid [DMSO]) erneut suspendiert.
    HINWEIS: Einige Blutplättchen der Patienten sind während des Einfrierverfahrens nicht stabil, und ein hochmutierter Cybrid kann nach dem Einfrieren nicht mehr erreicht werden. Es wird empfohlen, die frische Zubereitung zu verwenden.
11. Wenn die Rho^0-Zellen nicht rechtzeitig fertig sind, platzieren Sie die Blutplättchen bei 37 °C mit leichtem Erschüttern bei 60 U/min.
    HINWEIS: Letztlich ist es am besten, die Thrombozyten und die Rho-0-Zellen so zu timen, dass sie gleichzeitig bereit sind. Es wird nicht empfohlen, länger als 2 Stunden zu warten.

2. Vorbereitung von Rho-0-Zellen

1. Verwenden Sie entweder frisch aufgetaute 143B-Osteosarkom-Rho-0-Zellen oder Rho-0-Zellen, die nahe an der Zusammenflussgrenze gewachsen sind.
   HINWEIS: Es wird empfohlen,^Rho-0-Zellen zu verwenden, die im Inkubator bis nahe der Zusammenfluss gewachsen sind. Frisch aufgetaute^Rho-0-Zellen können verwendet werden, und es wird empfohlen, ein gefrorenes Fläschchen mit Rho-0-Zellen mit hoher Zelldichte zu verwenden. Lassen Sie die Zellen zwei oder mehr Stunden vor der Fusion anheften.
2. Wasche die T75-Flasche mit 5 ml PBS.
3. Fügen Sie 1 ml Trypsin-EDTA 0,25 % hinzu, um die^Rho-0-Zellen abzudecken.
4. Inkubieren Sie 5 Minuten bei 37 °C.
5. Nach dem Schaukeln der Flasche waschen Sie den Boden mit 5 ml SMEM.
6. Sammeln Sie^Rho-0-Zellen in einem 15-mL konischen Rohr.
7. Zentrifugiere bei 200 × g für 5 Minuten, um die Zellzählung zu konzentrieren.
8. Entferne Supernatant und suspendiere es in 1 ml SMEM.
9. Zähle die Zellen.
   HINWEIS: Idealerweise sollten für jede Fusion 1,5 Millionen Zellen vorhanden sein; erfolgreiche Fusionen wurden jedoch bereits mit nur 30.000 Zellen durchgeführt.
10. Aliquot 1,5 Millionen Zellen in 1,5 Mikrozentrifugenröhren und das Volumen auf 1 ml erhöhen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie eine zusätzliche "Mock Fusion"-Sonde haben. Dieses Rohr enthält nur^Rho-0-Zellen und dient zur Steuerung des Auswahlprozesses.
11. Zentrifugieren Sie die Thrombozyten bei 1700 × g für 15 Minuten bei Zimmertemperatur.
    HINWEIS:^Rho-0-Zellen sind empfindlich gegenüber Kälte.
12. Entfernen Sie das Überdachungsmittel aus den Thrombozyten.
13. Gib 1 ml Rho^0-Zellen auf das Thrombozytenpellet.
14. Zentrifugiere die^Rho-0-Zellen und die Blutplättchen bei 200 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.

3. Fusion

1. Entferne das Supernatant aus den^Rho-0-Zellen und dem Thrombozytenpellet.
2. Fügen Sie 150 μL Fusionspuffer hinzu (50 % Polyethylenglykol [PEG]/10 % DMSO) und triturieren Sie 90 Sekunden, um es wieder zu suspendieren.
   HINWEIS: Manche Pellets sind ziemlich klebrig und müssen zusätzlich zum Hoch- und Reißen manuell umgerührt und zerbrochen werden. Registriere, ob das Pellet klebrig war.
3. Fügen Sie 12 ml Cybrid-Medium (DMEM) + 10 % FBS + 50 μg/mL Uridin zu einer T75-Flasche hinzu.
4. Gib die 1 ml fusionierte Blutplättchen und^Rho-0-Zellen in die Kolben.
5. Die Zellen werden bei 37 °C mit 5 % CO2_{bei hoher} Luftfeuchtigkeit inkubiert.
   HINWEIS: Alle Zellwachstumsschritte finden unter diesen Bedingungen statt.

4. Wachstum

1. Tag 2: Cybrid-Medium entfernen und frisches 12 ml Cybrid-Medium + 10 % FBS + 50 μg/mL Uridin hinzufügen.
   HINWEIS:^Rho-0-Zellen benötigen etwa eine Woche, um die mtDNA zu integrieren.
2. Tag 5: Cybrid-Medium entfernen und frisches 12 ml Cybrid-Medium + 10 % FBS + 50 μg/mL Uridin hinzufügen.
   HINWEIS: Wenn die^Rho-0-Zellen bei 80 % Zusammenfluss sind, teilen Sie die Zellen in zwei Kolben auf.

5. Auswahl

1. Tag 8: Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 5 ml PBS.
2. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 1 ml Trypsin hinzu.
3. Den Boden der Flasche mit Trypsin abdecken und 5 Minuten bei 37 °C inkubieren.
4. Füge 5 ml Cybrid-Medium + 10% FBS + 50 μg/mL Uridin hinzu.
5. Zähle die Zellen.
   HINWEIS: Die Selektion sollte bei 10 % Konfluenz beginnen, also 125.000 Zellen in einer mit T75 oder Gewebekulturen behandelten Petrischale. Es wird empfohlen, Petrischalen zu verwenden, wenn die Methode des Kolonienpflückens bevorzugt wird. Verwende ein T75, wenn du die Verdünnungsmethode anwendest.
6. Fügen Sie 125.000 Zellen in den entsprechenden Behälter hinzu und fügen Sie den Rest des Volumens mit Auswahlmedium (DMEM) bis zu 12 ml hinzu.
   HINWEIS: Das Selektionsmedium ist darauf ausgelegt, verschmolzene 143B-Zellen mit Mitochondrien von den^Rho-0-Zellen zu trennen. ^Rho-0-Zellen benötigen Pyruvat und Uridin zum Überleben. Dialysiertes FBS enthält kein Pyruvat und Uridin und sollte nur zur Selektion verwendet werden. Verwenden Sie, wenn möglich, zwei verschiedene Auswahlmedien. Das eine sollte zu 10 % dialysiert FBS sein, das andere sollte weniger wachstumseinschränkend sein, z. B. 20 % dialysierte FBS + 50 μg/mL Uridin. Parallel dazu wird für schwere Mutanten ein weniger restriktives Selektionsmedium vorgeschlagen.
7. Kühlen Sie die verbleibenden Zellen in zwei Kryovialen mit jeweils 1 ml Gefrierlösung ein.
   HINWEIS: Dies sind Vorwahlzellen, und später können verschiedene Auswahlen ausprobiert werden.
8. Wechsle etwa eine Woche lang alle zwei Tage die Medien.
   HINWEIS: Die^Rho-0-Zellen schwimmen, wenn sie sterben, und werden nach dem Medienwechsel weggewaschen. Verwenden Sie die "Mock"-Fusionszellen, um festzustellen, wann die Auswahl abgeschlossen ist (keine Zellen mehr im Kolben). Diese Flasche wird komplett leer sein, weil alle^Rho-0-Zellen weggespült wurden. Es ist eine gute Idee, noch einen Tag zu warten, selbst wenn die Mock-Flasche leer ist, da verschmolzene Zellen die Nährstoffe im Medium liefern können, damit andere^Rho-0-Zellen im Kolben erhalten bleiben. Wenn die Zellen zu mehr als 20 % Zusammenfluss wachsen, teilen und neu verplatten. Mehr Wachstum wird die Auswahl überdecken.

6. Methode des Wachstums der Kolonie

1. Wachsen Sie die Kolonien, bis sie mit dem Auge sichtbar sind, mit Cybrid Media + 20 % FBS + 50 μg/mL Uridin.
   HINWEIS: Neige die Schüssel und halte sie ans Licht. Die Kolonien erscheinen als trübe Kreise. Unter dem Mikroskop sollte es nicht viele Hintergrundzellen zwischen den Kolonien geben.
2. Kreise unabhängige, nicht überlappende Kolonien mit einem Marker am Boden der Flasche, während du sie zum Licht hältst.
3. Verwenden Sie einen P20, um sowohl (mechanisch störende Zellen, die am Boden der Kolbe befestigt sind) zu schöpfen als auch 20 μL gleichzeitig innerhalb des gezeichneten Kreises zu aspirieren, um Zellen aus der ausgewählten Kolonie in die Spitze des P20 zu platzieren.
   HINWEIS: Das manuelle Abkratzen löst die Zellen, und das Aufziehen von 20 μL sammelt die Zellen in der Pipettespitze.
4. Jede Kolonie in einem eigenen Brunnen in einer Platte mit 96 Brunnen aufdecken.
   HINWEIS: Der Vorteil dieser Methode ist, dass 143B-Zellen in der Regel gut zusammen wachsen, sodass man keine Probleme haben sollte und schnellere Ergebnisse erzielt. Der Nachteil ist, dass man eine gemischte Bevölkerung haben könnte.

7. Verdünnungswachstumsmethode

1. Wenn die Zellen 75 % Konfluenz im Cybrid-Medium + 20 % FBS + 50 μg/mL Uridin erreichen, wird die Zellen mit 5 ml PBS gewaschen.
2. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 1 ml Trypsin hinzu.
3. Den Boden der Flasche mit Trypsin abdecken und 5 Minuten bei 37 °C inkubieren.
4. Fügen Sie 5 ml Cybrid-Medium + 20 % FBS + 50 μg/mL Uridin hinzu.
5. Zähle die Zellen.
6. Gib 1 × 10⁵ Zellen in 20 mL Cybrid-Medium + 20 % FBS + 50 μg/mL Uridin in 50 mL konisches Rohr 1.
   HINWEIS: Dies sind 5000 Zellen/mL, was 500 Zellen in 100 μL entspricht, wenn man in einer 96-Well-Platte verschichtet ist.
7. Bereiten Sie ein 50 mL konisches Rohr mit einer 100-fachen Verdünnung vor (200 μL aus Röhre 1 in 20 mL Cybrid-Medium + 20 % FBS + 50 μg/mL Uridin).
   HINWEIS: Das sind etwa 5 Zellen pro Brunnen.
8. Bereiten Sie ein 50 mL konisches Rohr 3 mit einer 1:1-Verdünnung vor (10 mL aus Röhre 2 in 10 mL Cybrid-Medium + 20 % FBS + 50 μg/mL Uridin).
   HINWEIS: Das sind etwa 2,5 Zellen pro Brunnen.
9. Bereiten Sie eine 50 mL konische Röhre 4 mit einer 1:1-Verdünnung vor (10 mL Röhre 3 in 10 mL Cybrid-Medium + 20 % FBS + 50 μg/mL Uridin).
   HINWEIS: Das entspricht etwa einer Zelle pro Brunnen.
10. Plattenrohre 2, 3 und 4 in 96-Well-Platten mit jeweils 100 μL.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, die Zellen vor dem Anbringen zu mischen. Es ist schwierig, am Tag selbst zu überprüfen, ob in jedem Brunnen eine Zelle ist, weil die Zellen auf den Boden sinken und sich anheften müssen. Der Vorteil dieser Methode ist, dass eine einzelne Zelle zu einer Kolonie heranwächst, wodurch ein gemischter Hintergrund fehlt. Der Nachteil ist, dass schwere Mutanten möglicherweise nicht überleben, wenn sie isoliert sind.
11. Am nächsten Tag streichen Sie Brunnen, die offensichtlich mehr als eine Zelle pro Brunnen haben.
12. Nach ein paar Tagen überprüfen Sie die Brunnen erneut.
    HINWEIS: Jetzt sollten es Kolonien geben, und es ist deutlicher, wenn einzelne Zellen in der Nähe der Brunnenränder vorhanden sind. Wenn es mehr als eine Kolonie gibt, entfernen Sie diese Brunnen. Wenn keine Zelle vorhanden ist, entfernen Sie den Brunnen.

8. Wachstum

1. Beginnen Sie in der 96-Well-Platte und übertragen Sie die Zellen schrittweise auf größere Platten bei Bedarf.
   HINWEIS: Diese Zellen wachsen am besten mit hoher Zelldichte, und zu wenig Zellübertragung könnte zum Tod führen. Bewahre immer die vorherige Platte mit einigen Zellen auf und markiere, welcher Brunnen woher stammt, damit man bei Bedarf immer zurückgehen kann. Wichtig ist, dass 143B-Zellen absterben und sich ablösen, wenn sie überkonfluent sind, daher sollten Sie diese Zellen täglich überprüfen.

9. Genetische Bestätigung

1. Zentrifugiere die aliquotierten Zellen bei 450 ×g für 5 Minuten.
2. Entfernen Sie die Medien.
3. Fügen Sie 5 μL DNA-Extraktionspuffer hinzu (50 mM NaOH).
   HINWEIS: Diese Zahl kann sich ändern, wenn viele Zellen vorhanden sind. Signifikante Zellpellets können in 10 μL Puffer enthalten sein.
4. Inkubieren Sie bei 95 °C für 30 Minuten.
5. Fügen Sie dem Extraktionspuffer ein äquivalentes Volumen des DNA-Stabilisierungspuffers (0,1 M Tris-HCl; pH 8) hinzu.
6. Führen Sie eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gemäß den Richtlinien des Enzyms durch.
   HINWEIS: Einige Punktmutanten können Restriktionsenzyme verwenden, um zwischen Kontroll- und Patientenzellen zu unterscheiden. Andere Punktmutationen lassen sich nicht unterscheiden und erfordern eine Sequenzierung. In diesem Fall ist es wichtig, PCR-Mischungen ohne Farbstoffe zu verwenden, um hochwertige Ergebnisse zu erzielen. Sanger-Sequenzierung und Next-Generation-Sequenzierung können verwendet werden. 2,5 μL DNA reichen für eine 25 μL-Reaktion aus.
7. Verwenden Sie PCR-Amplicons, die speziell für diese Mutation sind, für die Sanger-Sequenzierung.
   HINWEIS: Die PCR-Amplicons wurden für Sangers Sequenzierung geschickt. Das Mutations-Heteroplasmie-Niveau wurde sowohl nach der Klonexpansion als auch nach funktioneller Analyse bestätigt.

10. Hochauflösende Respirometrie mit hochauflösender Respirometrie

1. Führen Sie die Luftkalibrierung gemäß den Richtlinien des Respirometers (z. B. Oroboros Instruments) durch.
2. Wasche Cybrids in einer T75-Flasche mit PBS.
   HINWEIS: Die Zellen sollten nicht überkonfluent sein; 70%–80% Confluent ist ideal.
3. Gib 1 ml Trypsin hinzu und inkubiere 4 Minuten.
4. Füge 5 ml Cybrid-Medium hinzu und zähle die Zellen.
5. Füge 500.000 Zellen in ein Rohr, um es bei 450 × g für 5 Minuten zu zentrifugieren.
   HINWEIS: Die Zellnummer und das Volumen des Respirometers beziehen sich auf die 0,5-mL-Kammer.
6. Waschen Sie die Zellen erneut durch Resuspension mit PBS und zentrifugieren Sie erneut.
7. Cellen in 510 μL MiR05-Puffer neu suspendieren und in eine leere Kammer einfügen.
8. Nach der Stabilisierung fügen Sie 0,65 μL Digitonin (50 mg/mL), 0,8 μL Malat (2,5 M) und 2 μL Pyruvat (2,5 M) hinzu.
   HINWEIS: Vor der Zugabe von Digitonin erfolgt hier die Messung der basalen Atmung. Jeder weitere Schritt sollte nach der Stabilisierung durchgeführt werden.
9. Fügen Sie 12 μL Adenosindiphosphat (ADP) (0,25 m) hinzu.
10. Fügen Sie 4 μL Glutamat (2,5 M) hinzu.
11. Fügen Sie 12 μL Succinat (1,25 m) hinzu.
12. Fügen Sie 1 μL Oligomycin (1 mg/mL) hinzu.
13. Fügen Sie 1 μL Carbonylcyanid-p-Trifluormethoxyphenylhydrazon [FCCP] (0,2 mM) hinzu.
    HINWEIS: Titrieren Sie mit mehreren Additionen, bis kein weiterer Anstieg mehr festgestellt wird (typischerweise 3–5).
14. Fügen Sie 1 μL Rotenon (2 mM) hinzu.
15. Fügen Sie 1 μL Antimycin A (1 mg/mL) hinzu.
16. Fügen Sie 0,5 μL Ascorbat (0,8 M) und 0,5 μL Tetramethylphenylendiamin [TMPD] (0,2 M) hinzu.
17. Öffne die Kammer mit einem Abstandshalter für 20 Minuten.
18. Schließe die Kammer und stabilisiere sie für 5 Minuten.
19. Fügen Sie 22,5 μL Azid (4 M) hinzu.
20. Sammeln Sie Zellen zur Proteinquantifizierung mit einem Bicinconininsäure-(BCA)-Testset.
21. Führen Sie Berechnungen nach der Stabilisierung der Sauerstoffverbrauchsrate durch und normalisieren Sie sie nach Protein. Die Basale Atmung ist die stabilisierte Sauerstoffaufnahme nach der Aufnahme von Zellen in die Kammer.
    HINWEIS: Alle weiteren Messungen erfolgen nach dem angegebenen Substrat oder Inhibitor.
22. Berechnen Sie OXPHOS_CI: (Glutamat-Antimycin A)/(FCCP-Antimycin A).
23. Berechnen Sie OXPHOS_CI+CII: (Succinat-Antimycin A)/(FCCP-Antimycin A).
24. Berechnen Sie ETS_CI+CII: (FCCP-Antimycin A).
25. Berechnen Sie ETS_CII: (Rotenon-Antimycin A)/(FCCP-Antimycin A).
26. Berechnen Sie LEAK_CI+CII: (Oligomycin-Antimycin A)/(FCCP-Antimycin A).
27. Berechnen Sie OXPHOS_CIV: (TMPD/ASC-Azid)/(FCCP-Antimycin A).
28. Verwenden Sie mindestens 4–6 biologische Replikate für Respirometriemessungen.

Ergebnisse

Um methodologische Unterschiede und den Weg zur Protokolloptimierung zu demonstrieren, präsentieren wir die Ergebnisse der Cybrid-Generierung eines Patienten mit Verdacht auf mitochondriale Erkrankungen, der eine Variante unbekannter Bedeutung (VUS) in MT-ND1 des Komplexes I (KI) in der Elektronentransportkette aufweist. Nach klinischer mtDNA-Genomsequenzierung der nächsten Generation in mehreren Geweben in zwei verschiedenen CLIA-zugelassenen klinischen Diagnostiklaboren war di...

Diskussion

Hier präsentieren wir ein äußerst effizientes Protokoll zur Erzeugung von transmitochondrialen Cybridzelllinien aus mtDNA-Patientenplättchen. Wir zeigen die Anwendbarkeit mit einer Fallstudie einer MT-ND1-Variante unsicherer Bedeutung sowie die Bedeutung sorgfältiger Berücksichtigung von Wachstums- und Selektionsparametern. Sobald diese Hauptprobleme optimiert sind, erfolgt die erfolgreiche Auswahl von Cybriden, die mtDNA-Varianten enthalten, die die Funktion der Atemkette beein...

Materialien

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Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ADP	Sigma Aldrich	A5285-1G
Antimycin A	Sigma Aldrich	A8674-25MG
Ascorbat	Sigma Aldrich	11140-250G
Azid	Sigma Aldrich	S2002-100G
Dialysiertes FBS	Fisher Scientific	35071CV
Digitonin	Sigma Aldrich	D141-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	Cybrid-Medium
DMEM	Corning	10-017-CM	Selektionsmedium
FBS	Cytiva	SH30910.03
FCCP	Apex Bio	B5004
Glutamat	Sigma Aldrich	G5889-100G
Graphpad Prism	Graphpad
Hybri-Max	Sigma Aldrich	P7306	Fusionspuffer
Malat	Sigma Aldrich	M1000-100G
MiR05 Puffer	Oroboros Instruments	60101-01
O2K Respirometer	Oroboros Instruments	C-0050
Oligomycin	Sigma Aldrich	O4876-5MG
Pyruvat	Sigma Aldrich	P2256-100G
Rotenon	Sigma Aldrich	R8875-1G
SMEM	Sigma	M8167
Succinat	Sigma Aldrich	S2378-100G
TMPD	Sigma Aldrich	T3134-5G
Trypsin-EDTA 0,25%	Thermo Scientific	25200056
Uridin	Sigma Aldrich	U3750-25G

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