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Ein kardio-onkologisches Mausmodell der Anthracyclin-induzierten Kardiotoxizität in immunkompetenten Mäusen mit Brusttumoren

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DOI:

10.3791/71633

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1. Oktober 2026

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1INSERM UMR-S 942 MASCOT, Cardiovascular Biomarkers, Pathophysiology, and Therapeutic Strategies - CIRCUS, Paris Cité University, 2Medical and Surgical Intensive Care Unit, University Hospital Avicenne, AP-HP

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Klinisch relevante Mausmodelle für anthracyclininduzierte Kardiotoxizität sind selten. Hier wird ein Modell unter Verwendung immunkompetenter Mäuse mit Tumor vorgeschlagen, die eine Antikrebsbehandlung erhalten, wodurch die klinischen Protokolle bei Krebspatienten nachgeahmt werden.

Zusammenfassung

Das kürzliche Update der Europäischen Gesellschaft für Kardiologie zu präklinischen Modellen der kardialen Dysfunktion im Zusammenhang mit Krebsbehandlungen unterstreicht ein dringendes Erfordernis für repräsentativere und translationalere in vivo-Modelle. Es macht die Notwendigkeit deutlich, Modelle zu entwickeln, die immunokompetente, tumortragende Tiere verwenden und mehrere Stämme sowie beide Geschlechter einbeziehen, um die Heterogenität klinischer Populationen genauer nachzubilden. Daher wurde ein klinisch relevantes Modell der Anthrazyklin-induzierten Kardiotoxizität (AIC) bei tumortragenden Tieren etabliert. Abhängig vom genetischen Hintergrund der Mäuse wurden entweder 4T1Luc-Zellen (200.000 Zellen) oder PY8119-Zellen (200.000 Zellen) jeweils in Balb/c-Mäuse oder C57Bl/6J-Mäuse subkutan in die untere Mammarregion von Männchen und Weibchen injiziert. Das Tumorwachstum wurde mittels Biolumineszenz und Palpation überwacht. Sobald die Tumormasse zwei Wochen nach der Zellinjektion palpatorisch nachweisbar war, erhielten die Tiere eine Behandlung mit dem Antikrebsmittel Doxorubicin. Die Verträglichkeit von Doxorubicin bei den Mäusen war stammabhängig. Die Herzfunktion wurde vor Beginn des Protokolls (Ausgangswert) sowie wöchentlich danach mittels kardialem Ultraschall bei mit Ketamin anesthetisierten Mäusen beurteilt. Kardiotoxizität wurde definiert als eine Abnahme der linksventrikulären Fractional Shortening um mindestens 10 % gegenüber dem Ausgangswert, ein absoluter Wert <50 % und eine Herzfrequenz >300 Schläge pro Minute. Das Protokoll war reproduzierbar mit einer Tumorentwicklungsrate von 99 % und einer Überlebensrate der Mäuse von >80 %. Kardiotoxizität wurde bei >90 % der behandelten Mäuse mit Tumor und Doxorubicin beobachtet.

Einleitung

Die Kardio-Onkologie zielt darauf ab, die kardiovaskulären Ergebnisse bei Krebspatienten vor, während und nach einer Chemotherapie zu verbessern. Präklinische Modelle haben eine entscheidende Rolle beim besseren Verständnis des Zusammenspiels dieser beiden Erkrankungen gespielt. Vor Kurzem beobachtete eine paradigmatische Studie, dass Mäuse, die von Natur aus anfälliger für spontane intestinale Polypen sind, nach einem Myokardinfarkt und einer Phase mit Herzinsuffizienz (HF) eine höhere Anzahl dieser Tumoren entwickelten, was den direkten Einfluss eines kardiovaskulären Ereignisses auf das Tumorwachstum zeigt1. Seitdem haben zahlreiche Studien konsistente Befunde über verschiedene Tumortypen und murine Stämme hinweg berichtet, wobei häufig spezifische molekulare Signalwege oder Proteine verantwortlich gemacht wurden, wodurch das Konzept gestärkt wird, dass die Krebsprogression durch kardiovaskuläre Erkrankungen (CVDs) ausgelöst wird2,3,4,5.

Umgekehrt wurde der Einfluss von Krebs auf das Risiko, kardiovaskuläre Erkrankungen (CVDs) zu entwickeln, bereits seit mehreren Jahrzehnten untersucht. Epidemiologische Daten zeigen, dass Krebsüberlebende häufiger an kardiovaskulären Erkrankungen leiden, sowohl aufgrund gemeinsamer Risikofaktoren dieser beiden Erkrankungen als auch aufgrund der bekannten verschiedenen Toxizitäten von Anti-Krebs Therapien6,7,8,9,10. In präklinischen Studien wurden häufig Modellsysteme zur krebsinduzierten Kachexie verwendet, um spezifische Zielstrukturen zu identifizieren, die beim Menschen moduliert werden könnten, um die langfristigen kardiovaskulären Ergebnisse zu verbessern11,12,13,14. Man könnte jedoch argumentieren, dass diese Modelle kaum eine typische klinische Situation widerspiegeln, da Patienten oft bereits vor Erreichen dieses fortgeschrittenen Krebssyndroms behandelt werden; dennoch wird vermutet, dass die globale Kachexie weiterhin maßgeblich zur Gesamtsterblichkeit bei Krebs beiträgt15.

In den ersten kardiologisch-onkologischen Leitlinien der Europäischen Gesellschaft für Kardiologie (ESC) wird gefolgert, dass weitere Forschung erforderlich ist, um den Zusammenhang zwischen Krebs und kardiovaskulären Erkrankungen (CVDs)16 besser zu verstehen. Genauer gesagt wurde in einer jüngsten Aktualisierung der ESC-Arbeitsgruppe für Kardiologie und Onkologie betont, dass präklinische Forschung von größter Bedeutung sei, um diese Wissenslücke zu schließen, insbesondere mithilfe von Modellen mit tumortragenden Tieren17. Darüber hinaus ist eine bessere Korrelation zwischen präklinischen und klinischen Studien erforderlich, da die meisten klinischen Studien heute an Antikrebsbehandlungen durchgeführt werden, die in präklinischen Untersuchungen nur unzureichend erforscht sind18.

Anthracycline (ACs), wie Doxorubicin (Dox), werden häufig in der Chemotherapie bei einer Vielzahl von soliden und hämatologischen Tumoren eingesetzt. Auch wenn heute modernere Therapien verfügbar sind, werden ihre Kostenersparnis, gut dokumentierten Nebenwirkungen und offensichtliche Wirksamkeit dazu führen, dass diese Arzneimittel noch viele Jahre lang weiterverwendet werden19,20. Zahlreiche Belege deuten darauf hin, dass ACs eine dosisabhängige Kardiotoxizität verursachen, die hauptsächlich als linksventrikuläre Dysfunktion auftritt und heute einer der wichtigsten limitierenden Faktoren für ihren klinischen Einsatz ist und oft ein beunruhigender Aspekt für den kardio-onkologischen Arzt darstellt21,22. Diese Literatur stammt hauptsächlich aus Studien zum Mammakarzinom aufgrund seiner hohen Inzidenz beim Menschen, doch klinische Untersuchungen zu Lymphomen, Lungenkrebs und Leukämien liefern ähnliche Beobachtungen23. Daher wurde über mehrere Jahrzehnte präklinische Forschung betrieben, um die zugrundeliegenden pathophysiologischen Mechanismen der AC-induzierten Kardiotoxizität (AIC) zu verstehen, wobei sich zeigte, dass oxidativer Stress, direkter und indirekter DNA-Schaden, Ferroptose und mitochondriale Schäden häufig beteiligt sind23,24.

Trotzdem gibt es tatsächlich nur begrenzte Evidenz darüber, wie AIC verhindert oder behandelt werden kann. Gängige HF-Medikamente wurden in klinischen Studien mit gemischten Ergebnissen getestet, und der Zeitpunkt der Anwendung der wenigen potenziellen Kandidaten war schwer zu bestimmen21,23,25,26,27,28. Dexrazoxan, ein eisenmodulierendes Medikament, hat erfolgversprechende Ergebnisse zur Prävention von AIC gezeigt, wird jedoch derzeit nicht systematisch eingesetzt21. Die Verabreichung von ACs in anderen Formen als frei im Blut, beispielsweise verkapselt in Liposomen, hat ebenfalls vielversprechende Ergebnisse gezeigt, hat aber weiterhin Schwierigkeiten, herkömmliche ACs zu ersetzen, teilweise aufgrund der Kosten21.

Eine Erklärung für diese Situation ist das Fehlen klinisch relevanter Tiermodelle zur Untersuchung der AIC17. Beim Menschen wird Dox über einen längeren Zeitraum via wiederholte Injektionen verabreicht, und der Großteil der AIC wird im ersten Jahr nach der Behandlung beobachtet. In der Literatur zeigt sich jedoch eine große Variabilität hinsichtlich der Tierprotokolle, wie eine kürzlich veröffentlichte Übersichtsarbeit aufzeigt29. Ein klassisches Beispiel für ein Modell der akuten Kardiotoxizität sind tumorfreie Mäuse, denen eine Einzelinjektion von 20 mg/kg Dox verabreicht wird30. In einem typischen Modell der chronischen Kardiotoxizität beschreiben zahlreiche Studien tumorfreie Mäuse, denen einmal pro Woche eine Dosis von 5 mg/kg Doxorubicin über mehrere Wochen verabreicht wird, was einer kumulativen Gesamtdosis von 20 mg/kg entspricht29,31. Dieses Modell der chronischen Kardiotoxizität kann auch bei tumortragenden Tieren bei derselben Dox-Dosis beobachtet werden; dies bleibt jedoch in der Literatur sehr selten29,32.

Um zur Schließung dieser Wissenslücke beizutragen, wurde ein pragmatisches und klinisch relevantes Modell immunkompetenter Mäuse mit Brusttumoren zur Untersuchung der AIC etabliert, und zwar speziell an 4T1-tragenden Balb/c-Mäusen, und dessen Robustheit wurde an PY8119-tragenden C57Bl/6J-Mäusen bestätigt; letzteres stellt nach Kenntnis der Autoren erstmals ein kardionkologisches Modell mit einem triple-negativen Mammakarzinom in einer C57Bl/6J-Stamm-Linie dar. Eine gute Erfassung des Tumorwachstums über Die Biolumineszenzquantifizierung erfolgte vor der Behandlung der Tiere mit Dox, die kardiotoxische Wirkungen zeigte, und ein Protokoll zur Sammlung der Organe wurde durchgeführt, um gleichzeitig das Tumormikromilieu im Rahmen des kardionkologischen Experiments zu untersuchen. Darüber hinaus wurden Ergebnisse beobachtet, die den in der Literatur beschriebenen hinsichtlich Stamm- und Geschlechtsempfindlichkeit ähneln. Diese Arbeit soll zur Standardisierung und Verbesserung von Tierversuchsprotokollen zukünftiger kardionkologischer Studien beitragen, da C57Bl/6J-Mäuse aufgrund ihrer hohen Überlebensrate in AIC-Experimenten von großem Wert sind.29.

Der Vorteil der vorgeschlagenen Methode liegt in der Verwendung des C57Bl/6J-Stamms, der leicht genetisch verändert werden kann, über ein gut charakterisiertes Genom verfügt, kostengünstig zu beschaffen ist und hohe kumulative Dosen von ACs verträgt29,33,34. Falls für eine spezifische Studie mit ACs ein Gen-Knockout erforderlich ist, eignet sich dieses Modell besonders gut dafür. Darüber hinaus ist der Einsatz eines triple-negativen Brustkrebsmodells, das von diesem Stamm abstammt, von translationaler Relevanz, da Frauen mit triple-negativem Brustkrebs die Patientinnen sind, die am ehesten ACs erhalten und die schlechteste Prognose aufweisen35. Die Verwendung dieses Modells wird voraussichtlich das Verständnis von AIC insbesondere für diese Patientinnen verbessern.

Die Stärke dieses Modells liegt auch darin, dass die Mäuse mit einem Tumor vorbehandelt werden, der tatsächlich eine Auswirkung auf das kardiovaskuläre Remodeling haben kann36,37. Außerdem liegt dieses Modell zwischen akuten und vollständig chronischen Modellen der AIC, wobei aufgrund der hohen Überlebensrate die Dauer der Tierbeobachtung verlängert werden kann, was von großem Wert sein kann, wenn weitere AC-Zyklen in Betracht gezogen werden.

Dieses Modell eignet sich jedoch vermutlich nicht am besten für eine spezifische Tumorkennzeichnung am Ende des Protokolls, da die Tumorinokulation pragmatisch erfolgt. Falls dies im Zentrum der wissenschaftlichen Hypothese steht, sollte eine angepasste Variante der Tumorinjektion durchgeführt werden. Außerdem ist die Injektion von 4T1-Zellen in Balb/c-Mäusen ein etabliertes Modell für einen stärker onkologischen Ansatz, beispielsweise zur Untersuchung von Metastasen, was hier nicht beschrieben ist und berücksichtigt werden sollte, falls Metastasen für die wissenschaftliche Fragestellung entscheidend sind38. Dieses Modell wird an adulten Mäusen durchgeführt; falls das Ziel jedoch darin besteht, AIC im pädiatrischen Kontext zu untersuchen, sollten jüngere Mäuse in Betracht gezogen werden, wobei die Reaktion auf das Protokoll hierfür nicht untersucht wurde.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß den Vorgaben des lokalen Tierversuchsausschusses (Lariboisière-Villemin) durchgeführt und vom französischen Ministerium für Hochschulbildung und Forschung (MESRI) unter der Protokollnummer APAFIS 46086 genehmigt. Bei der Planung des Protokolls wurden die 3R-Regeln berücksichtigt. Balb/c- und C57Bl/6J-Mäuse wurden von einem Zulieferer für Versuchstiere wie Janvier Labs oder Envigo bezogen. Für dieses Protokoll wurden Mäuse im Alter von 10 bis 18 Wochen eingeschlossen, was jungen Erwachsenen entspricht, vergleichbar mit Frauen, die an triple-negativem Brustkrebs leiden. Die Tiere wurden in Gruppen von 2–5 Individuen bei einem 12-Stunden-Wechsel zwischen Dunkelheit und Licht, einer Raumtemperatur zwischen 20 °C und 24 °C sowie einer Luftfeuchtigkeit von 30 % bis 70 % gehalten. Wasser und Futter wurden ad libitum bereitgestellt. Während des Protokolls wurde sorgfältig darauf geachtet, humane Endpunkte einzuhalten, die vor Beginn des Protokolls festgelegt wurden, wie in Ergänzende Tabelle 1 beschrieben. Stellen Sie sicher, dass ein Isofluranfilter verwendet wird, um das entweichende Gas aufzufangen, um die Sicherheit der Person, die Isofluran handhabt, zu gewährleisten. Die Tiere sind bei jedem Schritt des Protokolls sorgfältig zu behandeln, wobei stets Handschuhe und Schutzbrille getragen werden müssen. Alle gefährlichen Materialien sind gemäß den lokalen institutionellen Vorschriften zu entsorgen; hier wurden alle kontaminierten Proben (Blut, Nadeln, Vials mit Dox, etc.) in Behältern für biohazardöse Gesundheitsabfälle entsorgt. Der Überblick über das Protokoll ist in Abbildung 1A dargestellt. Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.

1. Woche 0: Zellpräparation und Injektion in das Tier

HINWEIS: Die folgenden Schritte werden für 4T1Luc-Zellen beschrieben und waren identisch für die Verwendung von PY8119-Zellen. Dennoch sollte dies je nach Zelllinie angepasst werden, abhängig von den Empfehlungen des Herstellers. Zur Optimierung des Protokolls kann eine Person die Zellvorbereitung übernehmen, während eine andere die Tiervorbereitung durchführt.

  1. Wenn eine konfluente Zellkulturflasche (80–90 % Konfluenz) vorliegt, 3 mL Trypsin für 5 min bei 37 °C und 5 % CO2 zugeben.
  2. Die Flasche vorsichtig anklopfen, um alle Zellen abzulösen, Zellklumpen vermeiden und in Zellkulturmedium resuspendieren.
  3. Die Zellen mit einer Malassez-Kammer (oder einer anderen verfügbaren Methode) zählen.
  4. Die Zellen bei 300 × g für 5 min zentrifugieren und anschließend in einem gleichen Volumen PBS resuspendieren, um 200.000 Zellen in 100 µL zu injizieren.
    ANMERKUNG: Die Zellanzahl wurde nach einer Literaturrecherche festgelegt (siehe Supplementary Table 2).
  5. Mit einer 26-G-Spritze vorsichtig 500 µL der Zellsuspension aspirieren. Um eine zu lange Verweildauer der Zellsuspension in der Spritze zu vermeiden, wird empfohlen, weniger Volumen als für 5 Tiere nötig aufzuziehen.
  6. Gleichzeitig (wenn möglich) die Mäuse in eine Isofluran-Kammer stellen und die Narkose rasch mit 3 % Isofluran bei 1 L/min in Umgebungsluft einleiten. Sobald das Tier eingeschlafen ist, in Rückenlage bringen und die Schnauze in einen Trichter mit 1 % Isofluran führen.
  7. Mit einem Wattestäbchen für 1 min eine sanfte Haarentfernungscreme auf die Brust- und linke untere Bauchregion des Tieres auftragen. Haare und Creme mit Wasser entfernen und die Haut anschließend mit einem Tuch abtrocknen.
  8. Die ausreichende Narkose durch einen Zehenquetschtest sicherstellen.
  9. Die obere linke abdominale Brustwarze identifizieren. Diese vorsichtig mit einer Pinzette fassen und nach oben anheben (siehe Figure 1B).
  10. Die Spritzenkanüle subkutan einführen und bis unter die Brustdrüse vorrücken.
  11. 100 µL der Zellsuspension injizieren. Es sollte sich eine subkutane Blase unter der Brustwarze bilden (siehe Figure 1C). Kontrolltiere erhalten PBS. Die Randomisierung kann mit Randomisierungssoftware (z. B. RandoMice, einem kostenlosen Online-Tool) oder durch Zuweisung der Behandlung im festgelegten Verhältnis von 1:1 oder 2:2 (oder höher) erfolgen.
  12. Die Nadel vorsichtig entfernen und die mit der Pinzette gehaltene Brustwarze loslassen.
  13. Das Tier wiegen, um ein Basisgewicht für das Protokoll zu erhalten.
  14. Das Tier vor der Rückgabe in den Käfig in Umgebungsluft aufwachen lassen.

2. Woche 1: Kontrolle des Tumorwachstums mittels Biolumineszenz

HINWEIS: Dies kann an beliebigen Tagen nach der Injektion durchgeführt werden, um das Wachstum zu kontrollieren. Außerdem kann dies zu mehreren Zeitpunkten erfolgen, falls die Tumorzellwachstumsrate von Interesse ist. Nach 10–14 Tagen kann das Signal jedoch aufgrund der natürlichen Selektion von Tumorzellen während des Tumorwachstums abschwächen. Eine erneute Behaarung sollte bei korrekter Durchführung des Protokolls zu Beginn keine Probleme für die ordnungsgemäße Erfassung von Photonen verursachen. Siehe Abbildung 2A,B für repräsentative Ergebnisse der quantifizierten Biolumineszenz an den Tagen 2, 5, 8 und 11 nach der Tumorinjektion.

  1. Bringen Sie die Tiere in eine Isofluran-Kammer und induzieren Sie rasch die Anästhesie mit 3 % Isofluran.
  2. Sobald die Tiere eingeschlafen sind, injizieren Sie 10 µL/g Körpergewicht Luciferin intraperitoneal (IP) mit einer 26-G-Spritze. Vermeiden Sie die Injektion von Luciferin auf der linken Seite, da sich dort der Tumor befindet, der manchmal bereits nach wenigen Tagen tastbar sein kann.
  3. Platzieren Sie die Mäuse in Rückenlage im Photonendetektor, um die Photonenerfassung zu optimieren, da sich der Tumor an der Bauchseite befindet. Führen Sie die Schnauze in die Nasenkonne und reduzieren Sie das Isofluran auf 1 %.
    HINWEIS: Das korrekte Platzieren von 5 Tieren im Photonendetektor dauert einige Zeit; beginnen Sie daher mindestens 2 Minuten vor dem Start der Aufnahme.
  4. Starten Sie die Erfassung der Lumineszenzaktivität 10 Minuten nach der Luciferin-Injektion und führen Sie sie 5 Minuten lang durch (siehe Abbildung 2A). Der Aufnahmemodus des hier verwendeten Geräts war BLI mit 89 ms pro Bild, einer Bildgröße von 220 mm × 165 mm und einer BVR-Pixelgröße von 153 µm.
  5. Nach Abschluss der Aufnahme lassen Sie das Tier an der Umgebungsluft aufwachen, bevor Sie es in seinen Käfig zurückbringen.
  6. Verwenden Sie eine für den Photonendetektor geeignete Auswertungssoftware gemäß den Empfehlungen des Herstellers.

3. Woche 2: Doxorubicin-Behandlung

HINWEIS: Die echokardiographische Beurteilung sollte vor Beginn der Dox-Injektionen durchgeführt werden. Verwenden Sie daher die Anästhesie, die nach der Echokardiographie besteht, um die Injektion durchzuführen, während das Tier schläft, um den Stress durch die erste Dox-Injektion zu minimieren. Außerdem sollte die kumulative Dosis an jeden Mausstamm angepasst werden. Hier wurden 16 mg/kg für Balb/c-Mäuse und 24 mg/kg für C57Bl/6J verwendet, basierend auf früheren internen Daten und der Literatur29 (siehe Abbildung 3A–C).

  1. Lösen Sie das Doxorubicin-Pulver in Kochsalzlösung auf und verdünnen Sie es. Die Verdünnung sollte so hergestellt werden, dass 4 mg/kg Dox einem Volumen von 240–360 µL entsprechen. Daher wird vorgeschlagen, zunächst eine Lösung mit 2 mg/mL herzustellen und diese anschließend sechsfach mit Kochsalzlösung zu verdünnen (endgültige Konzentration 0,33 mg/mL).
  2. Zwei Wochen nach der Tumorinjektion sicherstellen, dass der Tumor im unteren linken Bauchbereich tastbar ist, jedoch weniger als 1 cm Durchmesser aufweist.
  3. Wiegen Sie das Tier, um den Gewichtsverlust nach der Dox-Behandlung zu überwachen.
  4. Injizieren Sie mit einer 26-G-Spritze die entsprechende Menge, um 4 mg/kg i.p. im unteren rechten Bauchbereich zu verabreichen. Kontrolltiere erhalten Kochsalzlösung. Die Randomisierung kann wie in Schritt 1.11 durchgeführt werden.
  5. Wiederholen Sie diesen Vorgang täglich über 4 Tage, um eine kumulative Dosis von 16 mg/kg zu erreichen (bei C57Bl/6J-Mäusen 2 zusätzliche Tage hinzufügen, um 24 mg/kg zu erreichen).

4. Woche 2–5: Überwachung der Kardiotoxizität

HINWEIS: Dies kann wöchentlich durchgeführt werden. Eine häufigere Beurteilung erfordert Vorsicht, da die Tiere während der Wochen 3 und 4 des Protokolls oft am anfälligsten sind und da einige Mausstämme empfindlich gegenüber Vollnarkose sind, was zu einer erhöhten Mortalität führen könnte. Die Echokardiographie wird unter Ketaminanästhesie durchgeführt, um die Erfassung einer kardialen Dysfunktion zu optimieren, da Isofluran eine myokardiale Depression hervorruft; dabei werden 40 mg/kg für Balb/c-Mäuse und 80 mg/kg für C57Bl/6J-Mäuse verwendet39. Es wird empfohlen, vor Beginn der Tumorzellinjektion eine Ultraschalluntersuchung durchzuführen, um den potenziellen Einfluss des Tumorwachstums auf die Herzfunktion vor der Einleitung einer Chemotherapie zu quantifizieren.

  1. Wiegen Sie das Tier. Wenn ein signifikanter Gewichtsverlust beobachtet wird, folgen Sie Supplementary Table 1.
  2. Narkotisieren Sie die Tiere mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin über eine 26-G-Spritze mit 40 mg/kg (Balb/c-Mäuse) bzw. 80 mg/kg (C57Bl/6J-Mäuse), um eine leichte Anästhesie zu erzielen.
  3. Legen Sie das Tier auf eine Heizplatte, um Hypothermie zu vermeiden.
  4. Sobald das Tier eingeschlafen ist, rasieren Sie es wie in 1.7 beschrieben, um eine haarfreie thorakale Zone zu erhalten.
  5. Zehn Minuten nach der Ketamin-Injektion führen Sie eine Echokardiographie für maximal 5 Minuten durch. Verwenden Sie vorgewärmtes Ultraschallgel. Je nach verwendetem Gerät konzentrieren Sie sich auf die M-Mode und/oder führen Sie eine Dehnungsquantifizierung durch.
  6. Wenn die M-Mode verwendet wird, zeichnen Sie mittelventrikuläre Schnitte in parasternaler Längsachsenansicht auf, die mindestens 4 Sekunden lang schlagen, mindestens dreimal, um einen repräsentativen Mittelwert der Herzfunktion der Maus zu erhalten (siehe Figure 4A,B). Dabei wurde die Bildrate auf 100 Bilder/s, die Sende­frequenz auf 38,4 MHz bei 100 % Leistung, die Empfangsfrequenz auf 96 MHz, die Schallgeschwindigkeit auf 1538 m/s und die Sweep-Geschwindigkeit auf 1200 Hz eingestellt.
  7. Nach etwa 5 Minuten ist das Tier zu wach, um eine Echokardiographie durchzuführen. Setzen Sie es zurück in seinen Käfig, nachdem Sie das für den Ultraschall verwendete Gel entfernt haben.
  8. Quantifizieren Sie die Herzfunktion blind39,40. Eine relevante Dysfunktion in diesem Modell wird definiert als 10 % unter dem Ausgangswert und ein absoluter Wert <50 % der linksventrikulären Fractional Shortening (FS), während die Herzfrequenz >300 BPM bleibt. Falls der FS-Wert vor der Behandlung zu niedrig ist, erwägen Sie, das Tier von der Analyse auszuschließen.
    ANMERKUNG: Für jede Quantifizierung aus den 4-s-Aufnahmenabschnitten werden mindestens 3 Herzzyklen benötigt, aber wenn möglich, können mehr Zyklen verwendet werden. Wenn möglich, sollte derselbe Versuchsansteller für alle Echokardiographien zuständig sein und eine andere Person die Quantifizierung durchführen, um die Analyse zu verblinden. Empfehlungen zur Qualitätskontrolle der Echokardiographie sind an anderer Stelle veröffentlicht40.
  9. Führen Sie die statistische Analyse durch (siehe Schritt 6). Der empfohlene Test zur Analyse zweier Gruppen über den gesamten Protokollverlauf ist eine zweifaktorielle ANOVA, da zwei Faktoren verglichen werden: Zeit und Behandlung.
  10. Führen Sie dies wöchentlich durch. Die Dysfunktion tritt bereits nach nur einer Woche Doxorubicin-Behandlung auf.
    ANMERKUNG: Falls zu einem Zeitpunkt nach der Dox-Behandlung eine Blutentnahme erforderlich ist, beispielsweise zur Messung kardialer Biomarker, entnehmen Sie das Blut unmittelbar nach der Echokardiographie, um eine erneute Anästhesie zu vermeiden, den Tierstress zu minimieren und die Zeit optimal zu nutzen.

5. Woche 5: Tötungsverfahren

HINWEIS: Dieses Organentnahmeprotokoll sollte idealerweise von zwei Personen durchgeführt werden.

  1. Nach der letzten Echokardiographie in Woche 5 injizieren Sie den Tieren erneut Ketamin intraperitoneal mit 100 mg/kg. Tragen Sie ein Tropfen 1 % Tetracain als Lokalanästhetikum auf das Auge auf, das für die Blutentnahme verwendet wird.
  2. Führen Sie mittels einer Heparin-Kapillare eine retroorbitale Blutentnahme durch, um so viel Blut wie möglich in einem Heparin-Röhrchen (bzw. einer EDTA-Kapillare in ein EDTA-Röhrchen) zu sammeln.
  3. Wenn kein weiteres Blut mehr gewonnen werden kann, führen Sie eine Halswirbel-Luxation gemäß institutionell genehmigter Protokolle durch. Stellen Sie das gesammelte Blut unverzüglich auf Eis, bis es weiterverarbeitet wird, und fahren Sie mit dem Tötungsprotokoll gemäß Schritt 5.5 fort.
  4. Zentrifugieren Sie das Blut bei 2000 x g für 10 min bei 4 °C, um Blutzellen und Plasma zu trennen. Schockfrieren Sie das Plasma-Röhrchen mit flüssigem Stickstoff und lagern Sie es bei -80 °C bis zur weiteren Analyse.
  5. Platzieren Sie das Tier auf einem mit saugfähigem Papier bedeckten Polystyroldeckel und fixieren Sie die vier Gliedmaßen mit Nadeln.
  6. Der Tumor sollte eine beträchtliche Größe aufweisen (mindestens 2 cm). Schneiden Sie mit großzügigem Sicherheitsabstand um den Tumor herum, um ihn zu lösen. Eine weitere Präparation kann nach der Sammlung der übrigen Organe gemäß Schritt 5.15 erfolgen.
  7. Präparieren Sie den Tumor in einem separaten Bereich vorsichtig mit kleinen, scharfen Scheren, während Sie ihn mit einer Pinzette halten. Um die Spannung zu erhöhen, ohne den Tumor zu beschädigen, heften Sie die überschüssige Haut mit Nadeln am Deckel fest. Dies erleichtert die Präparation.
  8. Sobald der Tumor gut präpariert ist, reinigen Sie ihn vorsichtig mit PBS, um Blut, Haare und andere lose Partikel zu entfernen. Wiegen Sie den Tumor.
  9. Platzieren Sie ein 22 µm Nylon-Netz in einem 5 mL Zentrifugenröhrchen, legen Sie den Tumor vorsichtig darauf und bewahren Sie es bis zur Zentrifugation auf Eis.
  10. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 100 x g für 10 min bei 4 °C, um die interstitielle Flüssigkeit zu sammeln (siehe Abbildung 5A). Das gewonnene Volumen liegt zwischen 1 und 20 µL und ist oft rot gefärbt (Abbildung 5B). Überführen Sie es in ein 200 µL Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie es bei -80 °C bis zur weiteren Analyse.
    ANMERKUNG: Der verbleibende Tumor kann in kleinere Stücke geschnitten, in Lagerröhrchen gegeben, mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 °C gelagert werden, bis er weiter analysiert wird.
  11. Um das Knochenmark zu gewinnen, schneiden Sie das rechte Bein mit der Schere ab, präparieren Sie mit Skalpell und Pinzette Femur und Tibia, sodass sämtliche Muskulatur, Bindegewebe und Fett entfernt sind. Schneiden Sie die Epiphysen beider Knochen an beiden Enden mit dem Skalpell ab. Legen Sie die gereinigten Knochen in PBS in 12-Loch-Kulturschalen, während Sie die Organentnahme der Mäuse gemäß Schritt 5.15 abschließen.
    ANMERKUNG: Detailliertere Angaben zur Knochenmark-Isolierung sind an anderer Stelle veröffentlicht41.
  12. Stechen Sie den Boden von 500 µL Mikrozentrifugenröhrchen mit einer 18-G-Nadel an, legen Sie die beiden Knochen hinein und setzen Sie das Röhrchen in ein 1,5 mL Zentrifugenröhrchen, das mit 400 µL PBS gefüllt ist.
  13. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 10.000 x g für 1 min bei 4 °C. Ein Zellpellet ist am Boden des 1,5 mL-Röhrchens sichtbar; alle Zellen stammen aus dem Knochenmark, während das Knochenmark-Stroma im PBS vermischt ist. Aspirieren Sie den gesamten Überstand (Knochenmark-Stroma) in ein separates Lagerröhrchen, schockfrieren Sie das Material mit flüssigem Stickstoff und lagern Sie es bei -80 °C.
  14. Setzen Sie mit der Schere einen Querschnitt unterhalb des Thorax auf Höhe des Zwerchfells und schneiden Sie das Sternum entlang seiner Längsachse auf, um Herz und Lunge freizulegen.
    ANMERKUNG: Falls für weitere Analysen erforderlich, kann hier eine vollständige Blutentfernung mit Kochsalzlösung durchgeführt werden.
  15. Sammlen Sie alle für die biomolekulare und histologische Analyse benötigten Organe. Wiegen Sie sie und schneiden Sie sie in kleinere Stücke, um zukünftige biomolekulare Analysen zu erleichtern. Schockfrieren Sie alle Röhrchen unmittelbar nach dem Zerschneiden der Organe mit flüssigem Stickstoff und lagern Sie sie bei -80 °C.
  16. Beim Herzen trennen Sie die Herzspitze vom oberen Teil des Herzens und legen Sie auf Kunststoffformen, die mit OCT gefüllt sind. Setzen Sie sie nach dem Einbetten in OCT in kaltes Isopentan, bevor Sie sie mit flüssigem Stickstoff schockfrieren und bei -80 °C lagern.

6. Statistische Analyse

HINWEIS: Alle statistischen Analysen und Grafiken wurden mit statistischer und grafischer Software durchgeführt und folgen den Empfehlungen des statistischen Leitfadens42.

  1. Die vorliegenden Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts angegeben.
  2. Verwenden Sie für alle Diagramme der fraktionalen Verkürzung dieselbe Skalierung.
  3. Stellen Sie jede einzelne experimentelle Einheit (Maus) in jedem Diagramm dar.
  4. Führen Sie den Shapiro-Wilk-Test durch, um die Normalverteilung der Daten jeder experimentellen Gruppe zu überprüfen, wobei das Signifikanzniveau Alpha bei p = 0,05 festgelegt ist.
  5. Vergleichen Sie zwei Gruppen entweder mit dem Welch-Test oder dem Mann-Whitney-Test, abhängig von der Normalverteilung (Welch-Test bei normalverteilten Daten in beiden Gruppen, Mann-Whitney-Test, wenn eine oder beide Gruppen nicht normalverteilt sind). Wählen Sie die zweiseitigen Optionen mit einem Konfidenzniveau von 95 %.
  6. Um mehr als zwei Gruppen zu einem bestimmten Zeitpunkt zu vergleichen, prüfen Sie erneut, ob die Verteilungen der Gruppen normal sind, wie in Schritt 6.4 beschrieben. Führen Sie eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) durch, gefolgt von der Holm-Sidak-Korrektur für multiple Vergleiche, falls die Verteilung normal ist.
    HINWEIS: Falls die Verteilung nicht normal ist, sollte stattdessen der Kruskal-Wallis-Test mit der Dunn-Korrektur für multiple Vergleiche durchgeführt werden. Die familiäre Alpha-Schwelle wird zur Bestimmung der Signifikanz bei 0,05 festgelegt.
  7. Für Längsschnittdaten wurde eine wiederholte zweifaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit anschließender Sidak-Korrektur für multiple Vergleiche verwendet, um Gruppenunterschiede zu einem bestimmten Zeitpunkt zu untersuchen. Die familiäre Alpha-Schwelle wird zur Bestimmung der Signifikanz bei 0,05 festgelegt.

Ergebnisse

Dieses Protokoll, wie in Abbildung 1A, ist ein fünfwöchiges Protokoll, das zu folgenden experimentellen Gruppen führt: nicht tumortragende, dox-freie Mäuse, nicht tumortragende, dox-behandelte Mäuse, tumortragende, dox-freie Mäuse und tumortragende, dox-behandelte Mäuse. Diese Gruppen können verdoppelt werden, je nachdem, ob beide Geschlechter verwendet werden. Die ersten 2 Wochen des Tumorwachstums, vor Beginn der Dox-Behandlung, sind ausreichend, damit der Tumor nach Injektion von 200.000 Zellen in die 4th linken Brustdrüse der Tiere (Abbildung 1B). Die Bestätigung einer subkutanen Injektion sollte durch das Auftreten einer Blase unter der Brustwarze erfolgen, wenn vorsichtig die Tumorzellsuspension injiziert wird (Abbildung 1C). Tabelle 1 fasst kurz die wichtigsten Parameter des Protokolls für jeden Mausstamm sowie die im Folgenden erörterten Hauptergebnisse zusammen.

Abbildung 2A zeigt ein repräsentatives Bild des biolumineszenten Signals, das erhalten wird, wenn einer Maus ohne Tumor (links) und einer Maus mit Tumor (rechts) Luciferin injiziert wird und anschließend für 5 Minuten Photonen gesammelt werden. Diese Analyse setzt voraus, dass die Tumore das Luciferase-Gen exprimieren, um nach der Injektion von Luciferin Photonen zu erzeugen. Insgesamt wurden 33 Balb/c-Mäuse, die mit 4T1Luc-Zellen injiziert worden waren, 11 Tage lang mittels Biolumineszenz überwacht, während 9 Kontrollen verwendet wurden. Abbildung 2B bestätigt, dass der Tumor schnell wächst, die Signalintensität jedoch ab Tag 8 zu stagnieren beginnt, und dass der Tumor bei weiblichen Mäusen anfänglich schneller wächst als bei männlichen Balb/c-Mäusen, wie in Abbildung 2C dargestellt. Nur 1 von 45 Balb/c-Mäusen hatte nach 5 Wochen keinen Tumor, während alle C57Bl/6J-Mäuse nach 5 Wochen einen Tumor aufwiesen (Abbildung 2D).

Abbildung 3A  und Abbildung 3B zeigen, dass eine kumulative Dosisreduktion von Dox zu einer verbesserten Überlebensrate drei Wochen nach Beginn der Dox-Behandlung führt: während keine tumortragenden Balb/c-Mäuse bei 24 mg/kg überlebten, überlebten 50 % bei 16 mg/kg. Tumortragende C57Bl/6J-Mäuse sind jedoch resistenter, selbst bei einer Dosis von 24 mg/kg Dox, da >80 % überleben drei Wochen nach Beginn der ChemotherapieAbbildung 3D). Das Geschlecht hatte einen wesentlichen Einfluss auf das Ergebnis: Weibliche Tiere zeigten bei Balb/c-Mäusen ein deutlich besseres Überleben als männliche Tiere (16 von 29 weiblichen Tieren überlebten im Vergleich zu 3 von 16 männlichen Tieren). Abbildung 3C zeigt die geschlechtsspezifischen Unterschiede bei Balb/c-Mäusen, die 16 mg/kg Dox erhielten (kein statistischer Test wurde aufgrund der geringen Anzahl von Männchen durchgeführt). Bei C57Bl/6J-Mäusen gab es keine statistisch signifikanten Unterschiede im Überleben zwischen den beiden Geschlechtern (siehe Abbildung 3E).

Ein repräsentatives Bild der gesunden Herzfunktion bei einer Maus, bewertet mittels Echokardiographie vor der Dox-Behandlung, ist in Abbildung 4A dargestellt, und eines einer Maus mit Herzfunktionsstörung nach Dox in Abbildung 4B. Die in M-Modus bei 17 tumortragenden C57Bl/6J-Mäusen quantifizierte FS nach Gabe von 24 mg/kg Dox zeigt zwei Wochen später eine signifikante Abnahme (59,3 % vor Dox vs. 44,3 % nach Dox, p < 0,0001, Abbildung 4C). Nur 1 der 12 überlebenden Mäuse (8 %) erfüllte die vorab definierten Kriterien für Kardiotoxizität nicht. Die Herzfrequenz nimmt leicht, aber signifikant, von 623 BPM vor Dox auf 569 BPM nach Dox ab (p < 0,05, Abbildung 4D). Alle mittels M-Modus quantifizierten Parameter finden sich in Ergänzungstabelle 3.

Die Bestätigung der kardiotoksischen Wirkung von Doxorubicin erfolgt durch makro- und mikroskopische Analyse. Abbildung 6A,B zeigt, dass das absolute Herzgewicht nach Dox-Behandlung bei den wenigen überlebenden tumortragenden weiblichen Balb/c-Mäusen signifikant abnimmt, die Normierung des Herzgewichts auf das Gesamtkörpergewicht jedoch nur eine Tendenz aufweist. In einem Experiment an tumorfreien C57Bl/6-Mäusen führte eine Dosis von 24 mg/kg Dox zu den erwarteten Veränderungen der cardialen mRNA der folgenden Gene eine Woche nach Behandlungsbeginn: Atrogin und Murf1 stiegen, was auf Atrophie hinweist, NQO1 stieg im Sinne von oxidativem Stress, und Bax stieg zugunsten einer pro-apoptotischen Situation (Abbildung 6C–F).

Abbildung 5A zeigt eine schematische Darstellung des Protokolls zur Gewinnung von tumorinterstitieller Flüssigkeit. In Abbildung 5B ist ein repräsentatives Bild der gesammelten Flüssigkeit dargestellt: Das gewonnene Volumen ist gering.

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Abbildung 1: Repräsentative Darstellungen des experimentellen Protokolls. (A) Schematische Übersicht des experimentellen Protokolls. Erstellt mit BioRender (Lizenznummer JE29USE7LU). (B) Schematische Darstellung der subkutanen Tumorinokulation. Erstellt mit BioRender (Lizenznummer SO29JHW7R6). (C) Schematische Darstellung einer erfolgreichen subkutanen Tumorimplantation. Erstellt mit BioRender (Lizenznummer SO29JHW7R6). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Biolumineszenz-Bildgebung und Tumorimplantationsrate. (A) Repräsentative Biolumineszenzbilder einer Kontrollmaus (links) und einer tumorbehafteten Maus (rechts). (B) Biolumineszenzsignal über die Zeit (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts; zweifaktorielle Varianzanalyse mit wiederholten Messungen [ANOVA]; *P < 0,05). (C) Vergleich der Biolumineszenzsignale zwischen männlichen und weiblichen Balb/c-Mäusen (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts). (D) Erfolgsraten der Tumorimplantation in beiden Mausstämmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Überlebensanalyse von tumortragenden Mäusen. (A) Kaplan-Meier-Überlebenskurve von Balb/c-Mäusen, die mit 24 mg/kg Doxorubicin (Dox) behandelt wurden. (B) Kaplan-Meier-Überlebenskurve von Balb/c-Mäusen, die mit 16 mg/kg Dox behandelt wurden. (C) Kaplan-Meier-Überlebenskurve zum Vergleich männlicher und weiblicher Balb/c-Mäuse, die mit 16 mg/kg Dox behandelt wurden. Aufgrund der begrenzten Anzahl männlicher Mäuse wurde keine statistische Analyse durchgeführt. (D) Kaplan-Meier-Überlebenskurve von C57BL/6J-Mäusen, die mit 24 mg/kg Dox behandelt wurden. (E) Kaplan-Meier-Überlebenskurve zum Vergleich männlicher und weiblicher C57BL/6J-Mäuse, die mit 24 mg/kg Dox behandelt wurden (Log-Rank-Test, P = 0,86). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4Echokardiographische Beurteilung der doxorubicininduzierten Kardiotoxizität. (A) Repräsentatives M-Modus-Echokardiogramm von einer gesunden Maus. (B) Repräsentatives M-Modus-Echokardiogramm einer Maus mit doxorubicininduzierter Kardiotoxizität. (C) Fraktionelle Verkürzung (FS) bei C57BL/6J-Mäusen vor und 14 Tage nach Doxorubicin-Behandlung. (D) Herzfrequenz (HF) bei C57BL/6J-Mäusen vor und 14 Tage nach Doxorubicin-Behandlung. Dargestellt sind Daten von n = 17 Mäusen. Die statistischen Vergleiche wurden mit dem Welch-Test durchgeführt. t-Test. *P < 0.05; ****P ≤ 0,0001. Abkürzungen: FS, Fractional Shortening; HR, Herzfrequenz. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 5: Protokoll zur Gewebeprobenentnahme. (A) Schematische Darstellung des Protokolls zur Sammlung von tumorinterstitieller Flüssigkeit. Erstellt mit BioRender (Lizenznummer HV29USD91R). (B) Repräsentatives Bild, das die Sammlung von tumorinterstitieller Flüssigkeit während der Gewebeprobenentnahme zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 6Doxorubicin-induzierte Kardiotoxizität. (A) Herzgewicht gemessen 3 Wochen nach Beginn der Behandlung mit 16 mg/kg Doxorubicin bei tumorbehafteten Balb/c-Mäusen. (B) Herzgewicht, normiert auf das Gesamtkörpergewicht, gemessen 3 Wochen nach Beginn der Behandlung mit 16 mg/kg Doxorubicin bei tumortragenden Balb/c-Mäusen. (C) Atrogin-mRNA-Expression im Myokard von C57BL/6J-Mäusen eine Woche nach Beginn der Behandlung mit 24 mg/kg Doxorubicin.D) Murf1-mRNA-Expression im Myokard von C57BL/6J-Mäusen eine Woche nach Beginn der Behandlung mit 24 mg/kg Doxorubicin. (E) NQO1-mRNA-Expression im Myokard von C57BL/6J-Mäusen eine Woche nach Beginn der Behandlung mit 24 mg/kg Doxorubicin. (F) BAX-mRNA-Expression im Myokard von C57BL/6J-Mäusen eine Woche nach Beginn der Behandlung mit 24 mg/kg Doxorubicin. Die statistischen Analysen wurden mit dem Welch-Test durchgeführt. t-Test oder dem Mann-Whitney-U-Test, je nach Datenverteilung angepasst. ns, P > 0.05; *P < 0,05; **P < 0.01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

MäusestammBalb/cC57Bl/6J
Verwendete Zelllinie4T1LucPY8119
Anzahl injizierter Zellen200 000200 000
Geschlecht der Tieremännlich und weiblichmännlich und weiblich
Anzahl der Injektionstage46
Tägliche Dosis4 mg/kg4 mg/kg
Kumulative Doxorubicin-Dosis16 mg/kg24 mg/kg
Ketamin-Dosis40 mg/kg80 mg/kg
Inzidenz der Kardiotoxizität>90%>90%
Überlebensrate19/4516/19

Tabelle 1: Wichtige Protokollparameter für jede Mausstamm. Vergleich der wichtigsten experimentellen Variablen und Reagenzkonzentrationen, die in den Protokollen für Balb/c- und C57BL/6J-Mäuse verwendet wurden.

Ergänzende Tabelle 1: Tierschutzendpunkte. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungstabelle 2: Literaturübersicht zu 4T1-Experimentierprotokollen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 3: Echokardiographische Parameter, gemessen mittels M-Modus bei 17 tumortragenden C57BL/6J-Mäusen, die mit 24 mg/kg Doxorubicin behandelt wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Hier wurde ein Modell der Doxorubicin-induzierten Kardiotoxizität bei Mäusen mit Brusttumoren entwickelt, das für zukünftige Studien in der Kardio-Onkologie als von großer klinischer Relevanz erachtet wird. Ziel war es, die klinische Situation eines Patientenwegs nachzuahmen – von der Ankunft im Krankenhaus mit einer diagnostizierten Krebserkrankung bis hin zur Behandlung mit einer potenziell kardiotoxischen Chemotherapie. Das Protokoll folgt einem pragmatischen Design und verwendet weltweit verfügbare immunkompetente Mäuse, wodurch andere Arbeitsgruppen es in anderen Laboren reproduzieren können. Die hohe Erfolgsrate bei der Tumorimplantation macht es zu einem vielversprechenden Kandidaten für zukünftige toxikologische kardio-onkologische Studien.

Zu den häufigen Fehlerquellen bei diesem Protokoll gehört die Durchführung der Echokardiographie an Mäusen mit einer niedrigen Herzfrequenz, was zu einer künstlich verminderten Fractional Shortening (FS) führen kann. Die Wartezeit, bis die Mäuse sich von den anfänglichen negativ chronotropen Wirkungen der Anästhetika erholt haben, bevor die echokardiographische Beurteilung erfolgt, trägt dazu bei, genaue FS-Messungen zu gewährleisten. Bei Balb/c-Mäusen kann eine weitere Reduktion der Anästhetikadosis notwendig sein, falls die Sterblichkeit weiterhin hoch bleibt. Derselbe Versuchsleiter sollte alle echokardiographischen Untersuchungen während der gesamten Studie durchführen, da die Variabilität zwischen verschiedenen Beobachtern erheblich sein kann43. Bei der Tumorimplantation kann das Zurückziehen der Spritze während der Injektion einen linienförmigen Tumor erzeugen, der sich stärker entwickeln kann als Tumore, die durch korrekte Injektion entstehen. Auch die Injektion in die richtige Brustwarze ist entscheidend, da eine Platzierung in der oberen Bauchwarze die echokardiographische Beurteilung in späteren Stadien der Tumorentwicklung beeinträchtigen kann. Es wird empfohlen, die Zellen in der Suspension manuell zu zählen und vor der Injektion gründlich zu mischen, um sicherzustellen, dass jede Maus eine vergleichbare Anzahl an Zellen erhält und somit die Variabilität der Tumorgröße am Ende des Protokolls minimiert wird. Wenn wöchentlich Blutproben entnommen werden müssen, sollte das entnommene Volumen sorgfältig kontrolliert werden, da die Mäuse nach Behandlung mit Doxorubicin empfindlicher werden. Ein maximales Gesamtblutvolumen von 50 µL zu jedem Zeitpunkt der Blutentnahme wird empfohlen, da größere Volumina die Sterblichkeit während des Protokolls erhöhen können. Die Häufigkeit und das Volumen der Blutentnahme sollten außerdem den lokalen Anforderungen der Tierversuchsethik und den Richtlinien der institutionellen Tierhaltungseinrichtung entsprechen. Der durch die Blutentnahme verlorene Flüssigkeitsverlust kann durch Ersatz mit einem äquivalenten Volumen an subkutan verabreichtem Kochsalzlösung ausgeglichen werden.

Um dieses Dox-Verfahren zu vergleichen, stellte eine kürzlich veröffentlichte Übersichtsarbeit zu Tiermodellen der AIC fest, dass die meisten präklinischen Modelle (88 %) wiederholte Injektionen von Dox und Ergebnismessungen (häufig mittels Echokardiographie) mehrere Wochen später verwendeten29. Die meisten Artikel berichteten über die Verwendung des C57Bl/6J-Stamms (73,8 %), wahrscheinlich aufgrund seiner Robustheit und geringen Kosten29. Leider ignorierte eine beträchtliche Anzahl von Studien den Einfluss eines Tumors auf die Biologie des Tieres vor der Injektion von ACs17,29. Nur 46 von 736 Studien beschrieben Modelle mit Tumorträgern; davon verwendeten 12 die 4T1-Zelllinie (triple-negativ-ähnlicher Brustkrebs) bei Balb/c-Mäusen, und lediglich eine Studie verwendete ein Brustkrebsmodell bei C57Bl/6J-Mäusen (genauer gesagt EGFR2-positiv-ähnlichen Brustkrebs)29. Eine weitere Studie verwendete C57Bl/6J mit einem EGFR-2-positiv-ähnlichen Brustkrebs, ließ jedoch kein Tumorwachstum vor Beginn der Chemotherapie zu, was den translationalen Aspekt dieses Modells einschränkt32.

Xenotransplantationsmodelle unter Verwendung immundefizienter Mäuse ermöglichen die Nutzung menschlicher Tumorzelllinien, weisen jedoch ein nicht funktionstüchtiges Immunsystem auf, was die Untersuchung von Mechanismen der immunvermittelten Kardiotoxizität einschränkt und angesichts der wachsenden Bedeutung der durch Immun-Checkpoint-Inhibitoren verursachten Kardiotoxizität ein erheblicher Nachteil ist. Große Tiermodelle gewinnen im Bereich der Kardio-Onkologie an Bedeutung, weisen jedoch stets die Nachteile hoher Kosten und begrenzter Möglichkeiten zur genetischen Modifikation auf44. In-vitro- und 2D/3D-Systeme auf Basis menschlicher Zellen (z. B. aus menschlichen iPSCs abgeleitete Kardiomyozyten, kardiale Organoiden) ermöglichen einen hochdurchsatzfähigen mechanistischen und toxikologischen Screening, können jedoch die integrierte Physiologie des gesamten Organismus (Hämodynamik, neurohumorale Regulation, Immun-Kreuzgespräche), wie sie von in-vivo-Modellen erfasst wird, nicht nachbilden. Im Vergleich zu diesen Ansätzen bietet dieses syngene, immunokompetente, tumortragende Modell einen klinisch relevanteren Kontext, um die Wechselwirkung zwischen Tumorlast und chemotherapieinduzierter Kardiotoxizität zu untersuchen, hat jedoch den Preis einer größeren biologischen Variabilität, einer höheren Mortalität bei einigen Stämmen sowie einer geringeren Durchsatzleistung im Vergleich zu einfacheren in-vitro- oder nicht tumortragenden in-vivo-Modellen.

Nicht-tumortragende AC-Kardiotoxizitätsmodelle, die bisher überwiegend verwendet wurden, bieten eine hohe Reproduzierbarkeit, geringe Kosten und einfachere echokardiographische sowie Überlebensbewertungen, erfassen jedoch nicht die systemischen Auswirkungen der Tumormasse, der tumorassoziierten Entzündung und der Kachexie auf das Herz, die zunehmend als relevante Störgrößen der Kardiotoxizität bei Patienten anerkannt werden17,45. Zudem kann die metabolische Neuprogrammierung des Herzens und damit auch seine kontraktile Funktion durch sezernierte Onkometaboliten wie D-2-Hydroxyglutarat oder Succinat verändert werden14. Daher ist die Anwesenheit des Tumors vor der Chemotherapie unerlässlich, wenn ein kardio-onkologisches Modell für die kardiale biochemische Analyse mittels verschiedener Omics-Ansätze (z. B. Proteomik und Metabolomik) aufgebaut werden soll. Es gibt zudem Hinweise darauf, dass der Tumor allein eine offensichtliche kardiale Dysfunktion hervorrufen kann, obwohl dies in der Literatur nicht einheitlich belegt ist. Während einige Modelle einen schädlichen Effekt der Tumorinokulation auf die Ejektionsfraktion (FS) oder elektrische Leitungsparameter zeigten, fanden andere, dass die Anwesenheit des Tumors Mäuse vor der durch eine transversale Aortenstenose induzierten Remodeling schützte11,13,46. Nicht-tumortragende Tiere sind je nach vorläufiger Hypothese ebenfalls erforderlich. Sie stellen den einzigen Versuchsansatz dar, bei dem die direkte kardiotoxische Wirkung des chemotherapeutischen Wirkstoffs von der störenden Einwirkung des Tumors selbst isoliert werden kann, was eine wesentliche Voraussetzung zur Herstellung von Kausalität und zur Aufklärung wirkstoffspezifischer Wirkmechanismen darstellt. Diese Tiere dienen als Kontrollen für den Effekt der Antitumortherapie und deren Wechselwirkung mit dem Tumor hinsichtlich der Kardiotoxizität. Ohne diesen Vergleich wäre es unmöglich, zu bestimmen, welcher Anteil des beobachteten kardialen Phänotyps auf das Medikament, auf den Tumor oder auf deren Interaktion zurückzuführen ist. Diese Unterscheidung ist nicht nur für das mechanistische Verständnis, sondern auch für die rationale Entwicklung kardioprotektiver Strategien entscheidend. Es ist daher wichtig anzuerkennen, dass jedes dieser Modelle unterschiedliche und sich ergänzende wissenschaftliche Fragestellungen adressiert und dass keines der Modelle allein ausreicht, um die klinische Komplexität der Kardio-Onkologie vollständig abzubilden; vielmehr ist oft eine kombinierte oder sequenzielle Anwendung beider Modelle erforderlich, um belastbare mechanistische und translationsrelevante Schlussfolgerungen ziehen zu können.

In diesem Protokoll wurde Kardiotoxizität gemäß den ESC-Leitlinien 2022 zur Kardio-Onkologie definiert, die eine moderate asymptomatische krebstherapiebedingte kardiale Dysfunktion als Abnahme der linksventrikulären Ejektionsfraktion (LVEF) um >10 % mit einer LVEF zwischen 40 % und 49 % festlegen16. Eine genaue Quantifizierung der LVEF erfordert jedoch ein 3D-Modul am Ultraschätgerät39. Um eine fehlerhafte Beurteilung der systolischen Herzfunktion zu vermeiden und ein einfaches Protokoll beizubehalten, das auch in Laboren mit weniger modernen Ultraschallgeräten umgesetzt werden kann, wurde stattdessen die Verkürzungsfraktion (FS) als Marker für kardiale Dysfunktion gewählt, die bei Mäusen mithilfe der M-Mode-Analyse korrekt und einfach ermittelt werden kann, unter Anwendung derselben Kriterien wie von der ESC vorgegeben. Mit diesem Protokoll erfüllen 90 % der überlebenden Mäuse die Kriterien für Kardiotoxizität, wodurch es sich als vielversprechender Kandidat für zukünftige translationsmedizinische Studien eignet. Die kardiotoxische Wirkung von Doxorubicin (Dox) wurde durch makroskopische Beurteilung (verringertes Herzgewicht) bei Balb/c-Mäusen bestätigt. Eine Gruppe mit Tumoren allein bei C57Bl/6-Mäusen wurde hier nicht eingeschlossen; daher ist ein Vergleich bei diesem Mausstamm bisher nicht möglich. Zudem führte die Dox-Dosis bei nicht tumortragenden C57Bl/6-Mäusen zu Veränderungen, die mit früheren Literaturangaben zu den Mechanismen der Anthrazyklin-Kardiotoxizität übereinstimmen: vermehrte Atrophie, oxidativer Stress und Apoptose19,20.

Jedoch wurden aus technischen Gründen hier keine moderneren bei Patienten verwendeten Variablen wie die mittels Speckle-Tracking ermittelte globale longitudinale Dehnung (GLS) quantifiziert. Falls dies lokal möglich ist, wäre die Quantifizierung der GLS von zusätzlichem Wert, da sie allgemein als empfindlicher zur Detektion früher Herzschäden angesehen wird23. Zirkulierende kardiale Biomarker wie Troponin können ebenfalls bestimmt werden, um die Zuverlässigkeit der Kardiotoxizitätsdetektion zu erhöhen; allerdings kann die traditionell für diese Analysen bei Mäusen benötigte Plasmamenge aufgrund des geringen Gesamtblutvolumens dieser Tiere ein limitierender Faktor sein. Zudem kann die Fragilität dieser Tiere nach Doxorubicin-Behandlung die Sterblichkeitsraten während oder nach der Blutentnahme erhöhen. Ein letzter limitierender Faktor ist die Empfindlichkeit dieser Assays für solche Biomarker, die oft die Interpretation erschweren kann.

Obwohl derselbe erfahrene Experimentator alle Ultraschallaufnahmen durchführte, wurde bei denselben Balb/c-Mäusen eine hohe wöchentliche Variabilität beobachtet, selbst ohne Behandlung. Dies lässt sich durch die Empfindlichkeit dieses Stammes gegenüber Ketaminanästhesie erklären47. Tatsächlich wurden anfänglich hohe Sterblichkeitsraten während der Verfahren unter Anästhesie festgestellt, was dazu führte, dass nur wenige Tiere das Ende des Protokolls erreichten. Daraufhin wurde die Dosis von Ketamin für Balb/c-Mäuse von 80 mg/kg auf 40 mg/kg reduziert. Bei Betrachtung der Überlebenskurven von Balb/c-Mäusen mit Dox zeigt sich, dass ein Teil der Todesfälle zum Zeitpunkt der Anästhesie (wöchentliche Echokardiographie) auftritt, der Großteil der Todesfälle jedoch in der Tierhaltung ohne aktive Eingriffe eintritt, was unterstreicht, dass Dox der Hauptfaktor für die Sterblichkeit bei diesen Mäusen ist. Dennoch ist es wichtig, anästhesiebedingte Todesfälle bei der Interpretation von Überlebenskurven dieses Modells zu berücksichtigen, insbesondere beim Vergleich zweier oder mehrerer Stämme. Um das Risiko anästhesiebedingter Letalität zu verringern, könnte man die Echokardiographie auch an wachen Mäusen durchführen, was jedoch eine vorherige Schulung und Akklimatisierung erfordert, bevor die Tiere in das Protokoll aufgenommen werden. Was Dox betrifft, so erreichte selbst bei reduzierten Dosen fast die Hälfte der Balb/c-Mäuse nicht das Ende des Protokolls. Die Induktion von Kardiotoxizität mit noch geringeren Dox-Dosen könnte versucht werden, mit der Gefahr, dass weniger Tiere die Kriterien für Kardiotoxizität erfüllen. Eine alternative Strategie könnte darin bestehen, mehr Zeit für die Erholung des Tieres nach jeder Dox-Injektion einzuplanen, was hier nicht durchgeführt wurde, aber in der Literatur Hinweise auf eine verbesserte Überlebensrate gibt29.

Die Beobachtungen, die während des Aufbaus dieses Modells gemacht wurden – dass Balb/c-Mäuse empfindlicher gegenüber Dox sind als C57Bl/6J-Mäuse und dass weibliche Tiere resistenter gegenüber Dox sind als männliche –, stimmen mit früheren Literaturangaben überein29. Darüber hinaus bestätigen die ähnlichen und reproduzierbaren Ergebnisse, die in beiden Mausstämmen erzielt wurden, die Robustheit des vorgeschlagenen Modells. Durch Erreichen hoher kumulativer Dosen mittels mäßig hoher täglicher Dosen über einen kurzen Zeitraum wurden hohe Raten an Kardiotoxizität bei gleichzeitig hoher Überlebensrate erzielt. Der Aufbau eines Brustkrebsmodells (PY8119 ist ein triple-negativer-artiger Brustkrebs) in C57Bl/6J wird für zukünftige Studien von großem Nutzen sein, da diese Mäuse einen der wichtigsten genetischen Hintergründe für transgene Modelle darstellen34. Die hohe Erfolgsrate der Tumorzüchtungen, die die Wirksamkeit der gewählten Injektionsmethode unterstreicht, ist ebenfalls vielversprechend für dieses Modell. Außerdem eröffnet die hohe Dox-Toleranz dieser Tiere die Möglichkeit für längere Studien mit erneuten Dox-Behandlungen, um die häufige klinische Situation eines sekundären Krebs oder von Metastasen nachzubilden. Schließlich ermöglicht das Protokoll zur Gewebeentnahme die Sammlung aller festen Organe, Tumore und deren Interstitialflüssigkeit sowie des Knochenmarks und dessen Stromas, was eine äußerst gründliche Analyse des Modells erlaubt.

Dieses Modell weist einige Einschränkungen auf. Aufgrund des pragmatischen Versuchsdesigns und um einen invasiven Eingriff zu vermeiden, lässt sich der genaue Tumorort (d. h. die korrekte Brustdrüse im Gegensatz zum subkutanen Fettgewebe) mittels subkutaner Injektion nicht exakt kontrollieren, was je nach wissenschaftlicher Fragestellung von großer Bedeutung sein kann48. Falls eine präzise Injektion am Tumorursprungsort erforderlich ist, könnte ein aufwendigerer chirurgischer Eingriff besser geeignet sein, um eine orthotopische Injektion durchzuführen, obwohl dies vor allem dann von entscheidender Bedeutung erscheint, wenn eine biochemische Tumoranalyse geplant ist, da Volumen, Latenzzeit und Inzidenz unabhängig von der Injektionsmethode ähnliche Ergebnisse liefern48. Man könnte ebenfalls einwenden, dass die ausschließliche Verwendung von ACs (Anthracyclinen) nicht vollständig der klinischen Situation entspricht, bei der Patienten häufig Kombinationstherapien erhalten, beispielsweise mit Cyclophosphamid oder Cisplatin. Dies könnte durchaus die nächste Weiterentwicklung dieses Protokolls darstellen; allerdings müsste die Dosisanpassung für jede verwendete Chemotherapie sorgfältig erfolgen. Zudem bleibt die Mortalität von über 50 % bei Balb/c-Mäusen drei Wochen nach Beginn der Dox-Behandlung sehr hoch; eine Dosisreduktion könnte das Überleben verbessern, möglicherweise jedoch auf Kosten einer weniger ausgeprägten Kardiotoxizität. Schließlich ist anzumerken, dass die in diesem Modell verwendeten Dosen höher liegen als die derzeit üblichen Dosen beim Menschen, was das translationsmedizinische Potenzial dieses Modells einschränken könnte.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bezüglich der Arbeit bestehen.

Danksagungen

Vielen Dank an das Tierhaltungsteam für die Unterstützung bei der täglichen Überwachung des Wohlergehens der Tiere. Vielen Dank an Léanne Borges, Elias Ait Assa und Clémence Chabaud für die Hilfe beim Erstellen des Tierversuchsprotokolls. Für die Spende der PY8119-Zellen danken wir Dr. Julie Helft von der INSERM-Einheit 932. Besonderer Dank gilt Dr. Sylvain Provost und seinem Schüler Mel Gavens für ihre Unterstützung bei der Biolumineszenz.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4T1Luc-ZellenATCCCRL-2539
Doxorubicin-PulverCliniscience23214-92-8
EchokardiographVisual SonicsVEVO LT-200
LuciferinPerkin Elmer E1605
NylonmascheMerckNY2002500
PhotonImager OptimaBioSpace Lab
PY8119-ZellenGeschenk von Dr. Julie Helft

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