Protokoll zur standardisierten Bewertung der systemischen mikrovaskulären Funktion in der menschlichen kutanen Mikrozirkulation mittels Laser-Speckle-Kontrastbildgebung

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte, nicht-invasive Methode zur Beurteilung der systemischen mikrovaskulären Funktion in der menschlichen kutanen Mikrozirkulation mittels Laser-Speckle-Kontrastbildgebung in Kombination mit pharmakologischer Iontophorese und physiologischen Reizen, um die mikrovaskuläre Reaktivität in klinischen Forschungsumgebungen zu bewerten.

Abstract

Die Laser-Speckle-Kontrastbildgebung (LSCI) ist eine hochauflösende, nicht-invasive optische Technik, die eine Echtzeit- und Vollfeldvisualisierung der mikrovaskulären Blutperfusion ermöglicht. Dieses Protokoll präsentiert eine standardisierte Methodik zur Bewertung der systemischen mikrovaskulären Funktion in der menschlichen Haut-Mikrozirkulation mittels LSCI. Da die mit dieser Technik erzielten Messungen sehr empfindlich auf Umwelt- und physiologische Störungen reagieren, legt das Protokoll großen Wert auf strenge Standardisierungsverfahren zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit und experimenteller Zuverlässigkeit. Das Protokoll beschreibt wesentliche Umweltmaßnahmen, darunter die Stabilisierung der Raumtemperatur bei 23 °C ± 1 °C, die Positionierung der Teilnehmer, Akklimatisierungsverfahren und die Minimierung äußerer Störungen während der Bildaufnahme. Die Methodik integriert LSCI mit zwei komplementären provokativen Manövern zur Bewertung der kutanen mikrovaskulären Reaktivität. Postokklusive reaktive Hyperämie wird zur Bewertung integrierter mikrovaskulärer Reaktivität eingesetzt, während iontophorese-getriebene pharmakologische Herausforderungen zur Bewertung der Endothelfunktion eingesetzt werden. Konkret wird Acetylcholin verabreicht, um die endothelabhängige Vasodilatation zu beurteilen, und Natriumnitroprussid zur Beurteilung der endothel-unabhängigen Vasodilatation. Dieses schrittweise visualisierte Protokoll soll die Einführung standardisierter LSCI-Methoden in klinischen und translationalen Forschungskontexten erleichtern. Der Ansatz wurde erfolgreich angewandt, um mikrovaskuläre Beeinträchtigungen bei mehreren klinischen Erkrankungen zu identifizieren, darunter resistente Hypertonie, Diabetes und koronare Herzkrankheit. Durch die Möglichkeit einer reproduzierbaren und nicht-invasiven Bewertung der mikrovaskulären Reaktivität bietet diese Methodik ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der systemischen Gefäßgesundheit, zur Überwachung des Krankheitsverlaufs und zur Bewertung der Wirksamkeit von Interventionen, die auf die Mikrovaskulatur abzielen.

Introduction

Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, eine standardisierte, reproduzierbare Methodik zur Bewertung der systemischen mikrovaskulären Funktion und Reaktivität mittels Laser-Speckle-Kontrastbildgebung (LSCI) in Kombination mit physiologischen und pharmakologischen Provokationsmanövern bereitzustellen. Die Mikrozirkulation, bestehend aus terminalen Blutgefäßen – Arteriolen, Kapillaren und Venulen – kleiner als etwa 100 μm im Durchmesser¹, ist der primäre Ort des metabolischen Austauschs und ein entscheidender Determinant für den peripheren vaskulären Widerstand². Endothelale Dysfunktion in diesen kleinen Gefäßen geht oft makrovaskulären Veränderungen voraus und dient als früher Biomarker für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, darunter Bluthochdruck, Diabetes und koronare Herzkrankheit³. Wichtig ist, dass eine mikrovaskuläre Beeinträchtigung zwar wesentlich zu Schäden am Endorgan beiträgt, aber in Verbindung mit makrovaskulärer Atherosklerose und systemischer chronischer Entzündung innerhalb eines multifaktoriellen Krankheitsprozesses wirkt. Daher ist eine nicht-invasive Bewertung der mikrovaskulären Reaktivität sowohl für die frühe Diagnose als auch für die Überwachung der therapeutischen Wirksamkeit in der translationalen Forschung unerlässlich⁴.

Die Begründung für die Verwendung der kutanen Mikrozirkulation als Ersatz für systemische Gefäßgesundheit liegt in ihrer Zugänglichkeit und ihrer Rolle als repräsentatives Fenster zur globalen Endothelfunktion ^5,6. Traditionell galt die Laser-Doppler-Flowmetrie (LDF) als Goldstandard für nicht-invasive kutane Beurteilung⁷. LDF ist jedoch durch eine schlechte räumliche Auflösung begrenzt, da es punktweise Messungen liefert, die sehr empfindlich auf die inhärente Heterogenität der Hautperfusion⁸ reagieren. Im Gegensatz dazu bietet LSCI erhebliche Vorteile, da es eine vollständige Echtzeitvisualisierung der Gewebeperfusion mit hoher temporaler und räumlicher Auflösung⁹ bietet. Durch die Analyse des durch Laserlichtstreuung erzeugten Interferenzmusters ermöglicht LSCI die gleichzeitige Beurteilung mehrerer Gefäßregionen, ohne physischen Kontakt oder exogene Farbstoffe^{zu benötigen 10,11}.

In der breiteren Literatur wurde die Integration von LSCI mit iontophoresegetriebenen pharmakologischen Provokationen wie Acetylcholin (ACh) und Natriumnitroprussid (SNP) als robuster Ansatz zur Bewertung von endothelabhängigen und endothelunabhängigen vasodilatatorischen Wegen^{validiert 12,13}. Darüber hinaus bietet die postokklusive reaktive Hyperämie (PORH) eine integrierte Bewertung der mikrovaskulären Reaktivität, die endotheliale Mediatoren, neurogene sensorische Nerven und die Funktion der glatten Gefäßmuskulatur^{12 umfasst}. Trotz seiner Vorteile erfordert die hohe Empfindlichkeit des LSCI gegenüber Umwelt- und physiologischen Variabilitäten strenge Standardisierungsverfahren. Dieses Protokoll adressiert diese Herausforderungen, indem es kritische Umweltkontrollen detailliert beschreibt, darunter die Stabilisierung bei Raumtemperatur bei 23 °C ± 1 °C und eine standardisierte Teilnehmerpositionierung, um die Reproduzierbarkeit von Intrasubjekten und Intersubjekten^zu verbessern. Diese Methodik ist geeignet für klinische und translationale Forscher, die einen methodisch fundierten, nicht-invasiven Ansatz zur Untersuchung der mikrovaskulären Pathophysiologie bei verschiedenen Patientengruppen suchen.

Protocol

Alle Verfahren mit menschlichen Teilnehmern wurden gemäß den ethischen Standards des Nationalen Instituts für Kardiologie (Gesundheitsministerium, Brasilien) durchgeführt, in Übereinstimmung mit nationalen Vorschriften (Nationale Ethikkommission für Forschung – INAEP – gemäß Gesetz Nr. 14.874, Mai 2024) und der Erklärung von Helsinki (überarbeitet 2024).

1. Teilnehmervorbereitung und Umweltkontrolle

1. Stabilisieren Sie die Prüfungsumgebung
   1. Stabilisieren Sie die Untersuchungsraumtemperatur (RT; 23°C ± 1°C) mit einem speziellen Thermostat, um eine stabile thermische Umgebung zu gewährleisten.
   2. Überwachen Sie das RT alle 10 Minuten mit einem kalibrierten digitalen Thermometer (Genauigkeit von ±0,1°C).
      HINWEIS: Die kutane mikrovaskuläre Funktion ist sehr empfindlich gegenüber Temperaturschwankungen.
2. Bereiten Sie den Teilnehmer vor der Bewertung vor
   1. Weisen Sie die Teilnehmer an, 24 Stunden vor der Untersuchung auf Rauchen, Koffein oder Alkohol zu verzichten und intensiv zu trainieren.
   2. Weisen Sie die Teilnehmer an, mindestens 2 Stunden vor der Untersuchung zu fasten, während Sie Wasser aufnehmen.
      HINWEIS: Der Verzicht auf Koffein und intensive Bewegung minimiert äußere Beeinträchtigungen des kutanen Gefäßtonus. Koffein als Adenosinrezeptorantagonist und Bewegung können durch Auswirkungen auf den sympathischen Antrieb und die Thermoregulation anhaltende Veränderungen der mikrovaskulären Reaktivität auslösen, die mehrere Stunden nach^{der Exposition} andauern^.
3. Positioniere den Teilnehmer für die Bildaufnahme
   1. Positionieren Sie den nicht-dominanten Arm des Teilnehmers auf Herzhöhe mit Körperkissen, um den Unterarm in einer horizontalen und stabilen Position zu halten.
   2. Verwenden Sie die Bauchseite des Unterarms als Untersuchungsstelle.
      HINWEIS: Der nicht-dominante Unterarm minimiert den Einfluss lateralisierter Gefäßremodellierung, die mit täglichen Aktivitäten verbunden ist. Der ventrale Unterarm bietet günstige anatomische Eigenschaften für die optische Bildgebung, darunter eine geringere Haardichte und eine reduzierte Hautdicke, wodurch Signalartefakte minimiert und die Reproduzierbarkeit der iontophoretischen Arzneimittelabgabe verbessert wird.
4. Erlauben Sie eine kardiovaskuläre Stabilisierung
   1. Halten Sie den Teilnehmer mindestens 20 Minuten in Ruhe, bevor Sie mit den mikrovaskulären Aufnahmen beginnen.
   2. Verhindern Sie das Sprechen, das Bewegen des untersuchten Gliedmaßes oder die Nutzung elektronischer Geräte während der Ruhephase.
      HINWEIS: Die Stabilisierungsphase minimiert autonome und kardiovaskuläre Schwankungen vor der Baseline-Aufnahme.
5. Bewegungsartefakte minimieren
   1. Legen Sie den nicht-dominanten Unterarm des Teilnehmers auf ein Vakuumkissensystem.
   2. Stellen Sie das Polster so ein, dass die untere Unterarmfläche während der gesamten Bildaufnahme stabil in horizontaler Position bleibt.
6. Bereite die Hautoberfläche vor
   1. Wähle Hautstellen ohne sichtbares Haar für alle Maße aus.
   2. Entfernen Sie bei Bedarf 24 Stunden vor der Untersuchung Haare mit einem chirurgischen Haarschneider.
      VORSICHT: Verwenden Sie keinen Rasierer zur Haarentfernung, da Hautreizungen mikrovaskuläre Messungen beeinträchtigen können.
7. Arteriellen Blutdruck messen
   1. Wählen Sie die Manschettengröße entsprechend dem Armumfang des Teilnehmers aus.
   2. Führen Sie drei aufeinanderfolgende Blutdruckmessungen mit einem kalibrierten automatisierten oszillotmetrischen Gerät mit einem Abstand von 1 Minute zwischen den Messungen durch.
   3. Verwerfen Sie die erste Messung und berechnen Sie den Mittelwert der letzten beiden Messungen, um den mittleren arteriellen Druck (MAP) gemäß den Herz-Kreislauf-Richtlinien von ESC/ESH und AHA zu bestimmen.

2. LSCI-Systemaufbau und Softwarekonfiguration

1. Bereite das LSCI-System vor
   1. Schalten Sie das LSCI-System mindestens 10 Minuten vor der Bildaufnahme ein, um die Stabilisierung der Laserquelle zu ermöglichen.
   2. Überprüfen Sie die Laserstabilisierung mit der Software-Statusanzeige, bevor Sie die Aufnahme starten.
2. Positionieren Sie den Laserkopf
   1. Positioniere den Laserkopf direkt über dem Unterarm des Teilnehmers.
   2. Stellen Sie den Laserkopf mit dem vom Hersteller bereitgestellten Entfernungsmessgerät (Abbildung 1A) auf einen Abstand von genau 15 cm zur Hautoberfläche ein.
      HINWEIS: Die Einhaltung eines festen Aufnahmeabstands gewährleistet einen optimalen Bildfokus und ein einheitliches Sichtfeld zwischen den Teilnehmern.
3. Konfigurieren Sie die Erfassungssoftware
   1. Starten Sie die Bildaufnahmesoftware und erstellen Sie eine neue Studiendatei.
   2. Geben Sie die demografischen Informationen des Teilnehmers und die zuvor berechnete MAP ein.
      HINWEIS: Fügen Sie bei Bedarf detaillierte Bedienungsanweisungen und repräsentative Screenshots als ergänzendes Material bei.
4. Konfigurieren Sie die Erfassungsparameter
   1. Stellen Sie die Abtastrate der Aufnahme auf 1 Bild/s (1 Hz) ein.
   2. Stellen Sie die räumliche Auflösung für den Zielerfassungsbereich auf etwa 0,1 mm/Pixel ein.
      HINWEIS: Eine Abtastrate von 1 Hz bietet ein angemessenes Gleichgewicht zwischen zeitlicher Auflösung und Signal-Rausch-Verhältnis und erfasst gleichzeitig die hyperämische und pharmakologische Antwortkinetik angemessen.
5. Minimieren Sie die Störung des Umgebungslichts
   1. Führen Sie vor der Bildaufnahme eine Hintergrundrauschprüfung oder eine Dunkelbild-Subtraktion entsprechend den Systemanforderungen durch.
   2. Dimmen Sie das Raumlicht und blockieren Sie das Außenlicht mit Verdunkelungsvorhängen während aller Aufnahmen, wenn keine Dunkelbild-Subtraktion möglich ist.
      HINWEIS: Standardisierte Umgebungsbeleuchtung minimiert optische Störungen und verbessert die Reproduzierbarkeit des Signals.
6. Definieren Sie die Interessensgebiete (ROIs)
   1. Erstelle mindestens drei kreisförmige ROIs von etwa 80 mm² auf dem Live-Vorschaubildschirm innerhalb der Aufnahmesoftware.
   2. Positionieren Sie zwei ROIs über den Iontophorese-Elektrodenstellen und einen ROI über der PORH-Bewertungsstelle.
   3. Platzieren Sie alle ROIs auf den ventralen Unterarm etwa 5 cm distal von der Grube antecubital, wobei sichtbare oberflächliche Venen vermieden werden.
      HINWEIS: Die Standardisierung des ROI-Bereichs minimiert den Einfluss räumlicher Heterogenität auf die kutane Perfusion und reduziert Randartefakte, die mit Medikamentenabgabekammern verbunden sind.
7. Erhalte die Baseline-Perfusionsaufzeichnung
   1. Zeichnen Sie die ruhende kutane Blutperfusion für 5 Minuten auf, bevor die Gefäßstimulation durchgeführt wird.
   2. Überwachen Sie das Echtzeit-Perfusionssignal und bestätigen Sie das Fehlen bewegungsinduzierter Spitzen während der Basisaufnahme.
   3. Definieren Sie die Baseline-Stabilität als eine Perfusionssignal-Variation von <10 % während eines kontinuierlichen 2-minütigen Intervalls.
8. Ermöglichung der kutanen vaskulären Leitfähigkeitsanalyse (CVC)
   1. Geben Sie die MAP des Teilnehmers in die Erwerbssoftware ein.
   2. Aktivieren Sie die automatische Berechnung des CVC in den Softwareeinstellungen.
9. Daten zu Perfusions- und Leitfähigkeitsdaten aufzeichnen
   1. Konfigurieren Sie die Software so, dass die CVC automatisch berechnet wird, indem Sie Echtzeit-Perfusionswerte (APU) durch MAP teilen.
   2. Zeichnen Sie sowohl die Rohperfusionseinheiten (PU) als auch die berechneten CVC-Werte während des gesamten Protokolls gleichzeitig auf.
      
      HINWEIS: Die Expression der mikrovaskulären Perfusion als CVC minimiert den störenden Einfluss systemischer Blutdruckschwankungen und ermöglicht zuverlässigere Vergleiche zwischen Teilnehmern mit unterschiedlichen hämodynamischen Profilen.

Abbildung 1. Experimentelle Einrichtung zur Bewertung der kutanen mikrovaskulären Perfusion mittels Laser-Speckle-Kontrastbildgebung (LSCI) in Kombination mit Iontophorese. (A) Repräsentative experimentelle Einrichtung zur kutanen mikrovaskulären Begutachtung mittels Laser-Speckle-Kontrastbildgebung und Iontophorese von Vasodilatatoren. (B) Repräsentative mikrovaskuläre Perfusionsreaktion während der transdermalen iontophoretischen Abgabe kumulativer Acetylcholin-Dosen (ACh). (C) Repräsentatives Bild der ACh-Iontophorese. (D) Repräsentatives Bild einer Fahrzeug-enthaltenen Steuerelektrode. Die Beschriftungen zeigen folgende Komponenten an: (1) Imager-Kopf; (2) Elektroden zur Wirkstoffabgabe bei der Iontophorese; und (3) dispersive Elektrode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

3. Iontophorese und pharmakologische Provokation

1. Bereiten Sie die Haut auf die Iontophorese vor
   1. Reinigen Sie die ausgewählten Stellen der ventralen Unterarmhaut mit einer alkoholfreien Kochsalzlösung oder einem milden Hautreiniger.
   2. Tupfen Sie die Haut vorsichtig trocken, bevor Sie die Elektrode einsetzen.
      HINWEIS: Vermeiden Sie übermäßige mechanische Stimulation während der Hautvorbereitung, da mechanisch induzierte Vasodilatation die Basismessungen beeinträchtigen kann.
2. Positionieren Sie die Elektroden zur Arzneimittelabgabe
   1. Befestigen Sie zwei Medikamentenabgabeelektroden mit doppelseitigen Klebescheiben an den vorbereiteten Hautstellen (Abbildung 1A).
   2. Halten Sie einen Abstand zwischen den Elektroden von etwa 5 cm, um elektrische Stromstörungen zu vermeiden.
3. Bereite die ACh-Lösung vor
   1. Füllen Sie die erste Elektrodenkammer mit 200 μL einer 2 % ACh-Lösung, hergestellt in 0,9 % Kochsalzlösung^14,15.
   2. Verwenden Sie die ACh-Elektrode, um die endothelabhängige Vasodilatation zu bewerten.
      HINWEIS: Die ausgewählte Wirkstoffkonzentration wurde optimiert, um eine robuste, dosisabhängige mikrovaskuläre Reaktion zu induzieren und gleichzeitig unspezifische Reizungen und galvanische Artefakte zu minimieren.
4. Bereite die SNP-Lösung vor
   1. Füllen Sie die zweite Elektrodenkammer mit 200 μL einer 2 % SNP-Lösung, die in 0,9 % Kochsalzlösung hergestellt wird.
   2. Verwenden Sie die SNP-Elektrode, um die endothelunabhängige Vasodilatation zu bewerten.
      VORSICHT: SNP ist lichtempfindlich. Schützen Sie die Lösung vor Lichteinwirkung mit Alufolie und verwenden Sie die Lösung innerhalb von 4 Stunden nach der Zubereitung, um die pharmakologische Stabilität zu erhalten.
      HINWEIS: Die gewählte SNP-Konzentration ermöglicht eine stabile Plateau-Vasodilatation und minimiert gleichzeitig unspezifische elektrische Effekte.
5. Entfernen der eingeschlossenen Luftblasen
   1. Inspiziere die Elektrodenkammern vor dem Hautansetzen auf eingeschlossene Luftblasen.
   2. Entfernen Sie sichtbare Luftblasen, indem Sie sanft auf die Elektrodenkammer klopfen oder eine sterile Kunststoff-Spritzenspitze verwenden.
      HINWEIS: Luftblasen können den Stromfluss blockieren und eine nichthomogene Arzneimittelabgabe verursachen.
6. Positionieren Sie die Referenzelektrode
   1. Befestigen Sie die Referenz- (Neutral-)Elektrode etwa 15 cm proximal zu den Arzneimittelabgabeelektroden mit leitfähigem Gel oder Klebstoff (Abbildung 1A).
   2. Bestätigen Sie den stabilen Elektrodenkontakt, bevor Sie die Iontophorese einleiten.
      HINWEIS: Die räumliche Trennung zwischen pharmakologischen und PORH-Bewertungsregionen minimiert störende Wechselwirkungen und verhindert Überlappungen des ACh-induzierten Axonreflex-Schubs mit dem PORH-Messbereich.
7. Verbinden Sie das Iontophoresesystem
   1. Schließen Sie alle Elektroden vor der aktuellen Anwendung an die Iontophorese-Abgabeeinheit an.
   2. Bestätigen Sie die Elektrodenpolarität vor Beginn des Protokolls (anodal für ACh; kathodal für SNP).
      VORSICHT: Eine falsche Elektrodenpolarität kann die Effizienz der Arzneimittelabgabe beeinträchtigen und die Gefäßreaktionen verändern.
8. Führen Sie das Iontophoresestromprotokoll an
   1. Verabreichen Sie sechs inkrementelle Stromdosen von 30, 60, 90, 120, 150 und 180 μA für beide pharmakologischen Wirkstoffe.
   2. Trage jede aktuelle Dosis 10 Sekunden lang auf.
      HINWEIS: Das inkrementelle Stromprotokoll ermöglicht die Erstellung einer Dosis-Response-Kurve und erleichtert die Bewertung der mikrovaskulären Sensitivität und der Plateau-Reaktionen¹¹. Die Kombination aus niedrigen Stromamplituden und kurzen Stimulationsintervallen minimiert die unspezifische galvanische Vasodilatation.
9. Halten Sie das Intervall zwischen den Stimulationen
   1. Halten Sie ein 60-seitiges Intervall zwischen aufeinanderfolgenden Stromanwendungen ein.
   2. Überwachen Sie das Perfusionssignal während der Stabilisierungsphase zwischen den Dosen.
      HINWEIS: Das gewählte Intervall ermöglicht die Stabilisierung der mikrovaskulären Reaktion bei aufrechterhältiger lokaler Arzneimittelabgabe ohne systemische Effekte.
10. Zeichnen Sie die mikrovaskuläre Reaktion auf
    1. Zeichnen Sie das mikrovaskuläre Perfusionssignal kontinuierlich während aller Iontophorese-Stimulationen auf.
    2. Setzen Sie die Aufzeichnung mindestens 10 Minuten nach der letzten aktuellen Anwendung fort, um die maximale Plateau-Antwort zu erfassen. Eine repräsentative dosisabhängige Reaktion ist in Abbildung 2A dargestellt.

Abbildung 2. Repräsentative Aufnahmen der kutanen mikrovaskulären Perfusion während der Iontophorese und postokklusiver reaktiver Hyperämie (PORH). (A) Repräsentative Aufzeichnung des kutanen mikrovaskulären Blutflusses, aufgenommen mit LSCI während der Iontophorese von 2 % ACh, abgegeben, mit zunehmenden anodalen Strömen von 30, 60, 90, 120, 150 und 180 μA für 10 Sekunden, Abstand von 1 Minute. (B) Repräsentative Aufzeichnung, die während der PORH-Bewertung erhalten wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

4. Postokklusive reaktive Hyperämie (PORH)

1. Positioniere die Okklusionsmanschette
   1. Positionieren Sie eine standardmäßige pneumatische Manschette (Breite ca. 12 cm) am Oberarm desselben Gliedmaßes, das für die LSCI-Aufnahme verwendet wird.
   2. Setzen Sie die Manschette proximal zur ausgewählten mikrovaskulären Untersuchungsstelle.
2. Definieren Sie die PORH-Bewertungsregion
   1. Erzeugen Sie einen dritten ROI am ventralen Unterarm neben den Stellen der Iontophorese-Elektroden.
   2. Positioniere den ROI in einem behandlungsfreien Hautbereich, um pharmakologische Einflüsse zu vermeiden.
      HINWEIS: Räumliche Trennung zwischen pharmakologischen Stimulationsstellen und dem PORH-Bewertungsbereich aufrechterhalten, um unabhängige vaskuläre Reaktionen zu erhalten.
3. Die PORH-Baseline-Aufzeichnung erwerben
   1. Zeichnen Sie die ruhende kutane Perfusion für 5 Minuten auf, bevor die arterielle Verschlusserscheinung erfolgt.
   2. Überwachen Sie das Basis-Perfusionssignal, um die Signalstabilität vor dem Aufblasen der Manschette zu bestätigen.
4. Arterielle Okklusion induzieren
   1. Pumpen Sie die pneumatische Manschette innerhalb von < 5 Sekunden schnell mit einem automatischen Inflator oder einer manuellen Aufblaslampe auf.
   2. Erhöhen Sie den Manschettendruck auf 50 mmHg über dem zuvor gemessenen systolischen Blutdruck (SBP) des Teilnehmers.
      VORSICHT: Bestätigen Sie vor Beginn der Okklusionsphase die vollständige arterielle Verschlussphase, da eine unvollständige Verschlussfolgerung die hyperämische Reaktion beeinträchtigen kann.
5. Die Okklusionsphase aufrechterhalten
   1. Halte die arterielle Verschlusshaltung für genau 3 Minuten kontinuierlich aufrecht.
   2. Vollständige Okklusion wird überprüft, indem bestätigt wird, dass das LSCI-Signal auf ein biologisches Nullplateau (APU < 10) absinkt.
      HINWEIS: Das biologische Nullsignal spiegelt die Restbewegung von Blutzellen wider, unabhängig vom gerichteten Blutfluss, einschließlich der Brownschen Bewegung.
6. Löse die Okklusionsmanschette
   1. Lösen Sie den Druck der Manschette sofort mit dem Schnellauslassventil ab.
   2. Erlauben Sie sofortige Wiederherstellung des Blutflusses, um die reaktive hyperämische Reaktion einzuleiten.
7. Zeichnen Sie die hyperämische Reaktion auf
   1. Setze die LSCI-Aufnahme mindestens 5 Minuten nach dem Öffnen der Manschette fort.
   2. Erfassen Sie die Peak-Perfusionsreaktion und die anschließende Rückkehr zu den Ausgangs-Perfusionsniveaus. Eine repräsentative PORH-Antwort ist in Abbildung 2B dargestellt.
8. Quantifizieren Sie die PORH-Antwort
   1. Berechnen Sie den maximalen CVC in der Bildaufnahmesoftware.
   2. Berechnen Sie die Fläche unter der Kurve (AUC) des hyperämischen Antwortsignals mit der Analysesoftware.

5. Datenextraktion und statistische Analyse

1. Öffnen und überprüfen Sie die aufgezeichneten Daten
   1. Öffnen Sie die aufgenommenen Aufnahmedateien mit der Bildanalysesoftware.
   2. Überprüfen Sie, dass alle vordefinierten ROIs korrekt über den entsprechenden Messstellen positioniert bleiben.
      HINWEIS: Die ROIs werden nur neu positioniert, wenn Bewegungsartefakte oder Erwerbsdrift die ursprüngliche Platzierung beeinträchtigen.
2. Definiere die Analyseintervalle
   1. Identifizieren Sie die spezifischen Analyseintervalle auf den Perfusions- und CVC-Trenddiagrammen.
   2. Wählen Sie ein kontinuierliches 60-Sekunden-Basisintervall unmittelbar vor dem ersten Gefäßreiz.
   3. Wählen Sie die letzten 30 Sekunden jedes 60-Sekunden-Intervalls nach der Iontophorese-Stimulation aus, um die mikrovaskuläre Antwort des Plateaus zu erfassen.
      HINWEIS: Definieren Sie die Basisstabilität als Variationskoeffizienten (CV) < 5 % im Perfusionssignal, um den Einfluss von vasomotorischen Schwingungen und Bewegungsartefakten vor der Datenanalyse zu minimieren.
3. Identifizieren Sie PORH-Antwortvariablen
   1. Identifizieren Sie das biologische Nullsignal während der arteriellen Okklusionsphase des PORH-Protokolls.
   2. Identifizieren Sie den Spitzen-CVC-Wert unmittelbar nach dem Loslassen der Manschette.
4. Berechnen Sie die Intervallmittelwerte
   1. Berechnen Sie den mittleren CVC-Wert für jedes vordefinierte Analyseintervall mit der Bildanalysesoftware.
   2. Überprüfen Sie das Fehlen von Bewegungsartefakten, bevor Sie die endgültig berechneten Werte bestätigen.
5. Organisieren Sie die extrahierten Daten
   1. Exportiere oder transkribiere manuell die mittleren Roh-PU- und mittleren CVC-Werte in eine strukturierte Tabelle.
   2. Organisieren Sie den Datensatz nach Studiengruppen und Gefäßreizen, einschließlich Acetylcholin, Natriumnitroprussid und PORH-Reaktionen.
      HINWEIS: Behalten Sie während der gesamten Datenverarbeitung konsistente Dateinamens- und Teilnehmeridentifikationscodes bei, um Transkriptionsfehler zu minimieren.
6. Berechnung der sekundären Gefäßergebnisse
   1. Berechnen Sie den prozentualen Anstieg gegenüber der Ausgangsperfusion oder CVC-Werten, um die vaskuläre Reaktivität zu bestimmen.
   2. Berechnen Sie den AUC, wenn dies für die Analyse des sekundären Endpunkts erforderlich ist.
7. Statistische Analysen durchführen
   1. Analysieren Sie die Daten mit statistischer Analysesoftware.
      HINWEIS: Fügen Sie repräsentative Screenshots oder Workflow-Anleitungen für softwarebasierte Analysen als ergänzendes Material bei, sofern anwendbar.
   2. Bewertung der Datenverteilung
      1. Beurteile die Normalität der Daten mit dem Shapiro-Wilk-Test.
      2. Drücken Sie normalverteilte Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) aus.
      3. Formulieren nicht normalverteilte Daten als Median- und Interquartilbereich (IQR).
   3. Mikrovaskuläre Reaktionen vergleichen
      1. Vergleichen Sie Zwei-Gruppen-Datensätze mit einem unabhängigen t-Test, wenn die Normalitätsannahmen erfüllt sind.
      2. Vergleichen Sie mehrere Gruppen mit Einweg-ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test.
   4. Definiere statistische Signifikanzkriterien
      1. Definiere die statistische Signifikanz als p < 0,05.
      2. Behandle fehlende Daten, die durch Bewegungsartefakte verursacht werden, mittels paarweiser Löschung oder Ausschluss aus der betroffenen Analyse.
         HINWEIS: Wenden Sie die gleiche Strategie der fehlenden Daten konsequent in allen Studiengruppen an, um die analytische Integrität zu bewahren.

Results

Eine erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls liefert eine stabile Basislinie gefolgt von klaren und unterscheidbaren mikrovaskulären Reaktionen auf jeden Gefäßreiz. In einem technisch erfolgreichen Experiment zeigt die Baseline-Aufzeichnung ein stabiles Perfusionssignal mit minimalen Fluktuationen, definiert als ein SD von < 10 % des mittleren Signals. Während der Iontophorese von ACh und SNP wird ein schrittweiser Anstieg der APU erwartet, was auf dosisabhängige Vasodilatation hinweist. Eine erfolgreiche PORH-Reaktion zeichnet sich durch eine rasche Reduktion der Perfusion auf ein stabiles biologisches Null während der arteriellen Okklusion aus, gefolgt von einem scharfen hyperämischen Peak unmittelbar nach der Manschettenlosgabe, wobei bei gesunden Probanden typischerweise Werte mehrfach über dem Ausgangswert liegen. Abbildung 1A zeigt das experimentelle Setup für die kutane mikrovaskuläre Begutachtung mittels LSCI und Iontophorese. Abbildung 1B–1D zeigen repräsentative Iontophorese-Antworten und Elektrodenpositionierung. Abbildung 2A zeigt eine repräsentative, dosisabhängige mikrovaskuläre Antwort während der ACh-Iontophorese, während Abbildung 2B eine repräsentative PORH-Reaktion zeigt.

Suboptimale oder technisch unerfolgreiche Aufnahmen sind häufig durch Signalinstabilität oder bewegungsbedingte Artefakte gekennzeichnet. Hochfrequente Spitzen oder abrupte Ausgangsschwankungen deuten typischerweise auf Bewegungen des Teilnehmers oder eine unzureichende Stabilisierung des Vakuum-Polster-Stützsystems hin. Eine verminderte oder fehlende vasodilatatorische Reaktion während der Iontophorese bei einem ansonsten gesunden Teilnehmer weist häufig auf einen schlechten Kontakt zwischen Elektrode und Haut oder eingeschlossene Luftblasen in der Elektrodenkammer hin, was zu einer beeinträchtigten elektrischen Stromlieferung führt. Abbildung 3 zeigt ein repräsentatives Beispiel für eine inakzeptable Aufzeichnung , die durch bewegungsbedingte Signalinstabilität gekennzeichnet ist.

Abbildung 3. Repräsentatives Beispiel für eine inakzeptable mikrovaskuläre Perfusionsaufzeichnung während der Iontophorese. Repräsentative Aufzeichnung des kutanen mikrovaskulären Blutflusses, der mit LSCI während der ACh-Iontophorese durchgeführt wurde, zeigt Signalinstabilität und bewegungsbezogene Artefakte, die für quantitative Analysen ungeeignet sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Das Nichterreichen eines stabilen biologischen Nullpunkts während der PORH-Okklusionsphase weist auf eine unvollständige arterielle Okklusion hin, die häufig durch falsche Manschettenpositionierung oder unzureichenden Manschettendruck verursacht wird. Unter diesen Bedingungen wird die anschließende hyperämische Antwort abgeschwächt und für eine zuverlässige Interpretation ungeeignet.

Erfolgreich ausgeführte Protokolle erzeugen reproduzierbare Perfusions- und CVC-Kurven. Das maximale CVC-Plateau, das während der SNP-Iontophorese beobachtet wurde, spiegelt die gesamte vasodilatatorische Kapazität und die vaskuläre strukturelle Integrität wider, während die ACh-vermittelte Antwort hauptsächlich die endotheliabhängige mikrovaskuläre Funktion widerspiegelt. Der standardisierte Vergleich dieser vaskulären Reaktionen ermöglicht die Unterscheidung zwischen Mustern, die mit erhaltener und beeinträchtigter mikrovaskulärer Funktion übereinstimmen. Repräsentative quantitative mikrovaskuläre Parameter, die von gesunden jungen Probanden und Patienten mit resistenter arterieller Hypertonie gewonnen wurden, sind in Tabelle 1 dargestellt.

Mikrovaskulärer Parameter	Einheit	Gesunde junge Kontrollpersonen (n = 25)	Patienten mit resistenter arterieller Hypertonie (n = 50)	p-Wert
Baseline CVC	APU/mmHg	0,37 ± 0,13	0,29 ± 0,12	0.01
ACh-induzierter Peak-CVC	APU/mmHg	0,67 ± 0,23	0,51 ± 0,19	0.004
SNP-induzierter Peak-CVC	APU/mmHg	0,60 ± 0,21	0,41 ± 0,17	0.0003
PORH Peak CVC	APU/mmHg	0,87 ± 0,18	0,60 ± 0,16	< 0,0001

Tabelle 1: Repräsentative mikrovaskuläre Reaktivitätsparameter bei gesunden jungen Probanden und Patienten mit resistenter arterieller Hypertonie. Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. P-Werte wurden mit einem unabhängigen T-Test für Vergleiche zwischen Gruppen berechnet. Abkürzungen: ACh, Acetylcholin; SNP, Natriumnitroprussid; PORH, postokklusive reaktive Hyperämie; CVC, kutane Gefäßleitung; APU, beliebige Perfusionseinheiten. Die Daten stellen unveröffentlichte Ergebnisse aus dem Labor der Autoren dar.

Discussion

LSCI bietet einen standardisierten und nicht-invasiven Ansatz zur Bewertung der systemischen mikrovaskulären Funktion mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Im Vergleich zu LDF, das auf Einzelpunktmessungen beschränkt ist und sehr empfindlich auf die räumliche Heterogenität der Hautperfusion reagiert, ermöglicht LSCI eine Vollfeldbildgebung und die gleichzeitige Bewertung mehrerer ROIs. Diese Eigenschaft verbessert die Messreproduzierbarkeit erheblich und reduziert den Variationskoeffizienten in klinischen mikrovaskulären Studien. Darüber hinaus minimiert die kontaktfreie Natur von LSCI lokale Druckartefakte, die üblicherweise mit Sondentechniken assoziiert werden, was seine Eignung für wiederholte Bewertungen in translationalen und klinischen Forschungsumgebungen verbessert.

Ein entscheidender Bestandteil dieses Protokolls ist die Normalisierung der Perfusionsdaten zu MAP zur Berechnung des CVC. Da die kutane Blutperfusion stark vom systemischen Perfusionsdruck beeinflusst wird, kann allein die Interpretation der rohen APU zu erheblichen Störungen führen, insbesondere in Populationen mit veränderten hämodynamischen Profilen wie Bluthochdruck oder Dyslipidämie. Aus diesem Grund empfiehlt das Protokoll, sowohl rohe PU als auch normalisierte CVC-Werte zu berichten, um die Interpretation der mikrovaskulären Funktion unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen zu verbessern. Ein weiterer entscheidender Aspekt des Protokolls ist eine strikte Umwelt- und Teilnehmerstabilisierung, einschließlich Raumtemperaturkontrolle, Minimierung von Bewegungsartefakten und standardisierter Teilnehmerpositionierung, die alle essenziell sind, um reproduzierbare Aufnahmen zu ermöglichen.

Mehrere Einschränkungen des LSCI müssen ebenfalls berücksichtigt werden. Die Technik bewertet hauptsächlich oberflächliche kutane Mikrozirkulation in einer Tiefe von etwa 0,5–1 mm und repräsentiert daher möglicherweise nicht vollständig tiefere Gefäßbette. Darüber hinaus können Hautpigmentierung und Umgebungslichtstörungen das Signal-Rausch-Verhältnis beeinflussen, was die Bedeutung der in diesem Protokoll beschriebenen Umweltkontrollen unterstreicht. Eine weitere Einschränkung ist die Verwendung einer einzigen Baseline-MAP-Messung für die CVC-Berechnung während des gesamten Verfahrens. Obwohl der systemische Blutdruck während der etwa 40-minütigen Aufzeichnungsphase schwanken kann, wurde wiederholte Manschettenaufblähung bewusst vermieden, da wiederkehrende Blutdruckmessungen sympathische Aktivierungs- und Bewegungsartefakte auslösen können, die das Laser-Speckle-Signal stören. Zukünftige Studien, die kontinuierliche nicht-invasive hämodynamische Überwachung integrieren, könnten die physiologische Interpretation der mikrovaskulären Leitfähigkeitsmessungen weiter verbessern.

Kritische Protokollschritte umfassen Umweltstabilisierung, Bewegungskontrolle, Elektrodenpositionierung und vollständige arterielle Okklusion während des PORH. Instabile Basisaufnahmen werden häufig durch Bewegungen der Teilnehmer oder unzureichende Ruhezeiten verursacht und können durch die Restabilisierung des Vakuumpolstersystems und Verlängerung der Akklimatisierungszeit minimiert werden. Abgestumpfte iontophoretische Reaktionen deuten oft auf einen schlechten Kontakt zwischen Elektrode und Haut oder eingeschlossene Luftblasen in der Verabreichungskammer hin; Eine sorgfältige Kammerfüllung und eine Neupositionierung der Elektroden lösen diese Probleme in der Regel. Das Ausbleiben des biologischen Nullpunkts während der PORH-Okklusionsphase spiegelt meist eine unvollständige arterielle Verschlussfolgerung wider, die durch unzureichende Manschettenaufblasung oder falsche Manschettenpositionierung verursacht wird. Unter diesen Bedingungen wird die resultierende hyperämische Antwort abgeschwächt und für eine zuverlässige Interpretation ungeeignet.

Die Integration physiologischer und pharmakologischer Provokationen stellt eine große Stärke dieses Protokolls dar, da diese Ansätze komplementäre Aspekte der mikrovaskulären Regulation bewerten. PORH bietet eine integrierte physiologische Untersuchung der mikrovaskulären Reaktivität, die endotheliale, neurogene und vaskuläre glatte Muskelmechanismen betrifft, die durch vorübergehende Ischämie und Scherspannung^{ausgelöst werden 16}. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Iontophorese eine selektive Bewertung endotheliabhängiger und endothelial-unabhängiger vasodilatatorischer Signalwege¹⁵. ACh bewertet die endothelabhängige, von Stickstoffmonoxid vermittelte Vasodilatation, während SNP, ein direkter Stickstoffmonoxidspender, die Reaktionsfähigkeit der glatten Muskulatur der Gefäße unabhängig von der endothelialen Signalübertragung¹⁵ bewertet. Die vergleichende Interpretation dieser Reaktionen ermöglicht eine Unterscheidung zwischen funktioneller Endothelbeeinträchtigung und struktureller mikrovaskulärer Remodellierung. Diese Unterscheidung ist besonders relevant bei Altern, resistenter Hypertonie, Diabetes und chronischen Stoffwechselerkrankungen, bei denen beeinträchtigte endotheliale Signalübertragung und mikrovaskuläre Verdünnung koexistieren^{können 14,17}.

Zusammenfassend bietet dieses standardisierte LSCI-Protokoll eine reproduzierbare und translational relevante Methode zur nicht-invasiven Bewertung der menschlichen mikrovaskulären Gesundheit. Die Kombination aus pharmakologischer Iontophorese mit physiologischer Ischämie-Reperfusionstests ermöglicht eine detaillierte Charakterisierung der endothelialen und strukturellen Gefäßfunktionen und minimiert gleichzeitig die experimentelle Variabilität durch rigorose Umwelt- und hämodynamische Standardisierung. Aufgrund seiner Sensitivität zur Erkennung früher mikrovaskulärer Dysfunktionen bei verschiedenen kardiovaskulären und metabolischen Erkrankungen stellt dieser Ansatz ein wertvolles Werkzeug für klinische Forschung, longitudinale Überwachung und therapeutische Bewertung in der translationalen Gefäßmedizin dar.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ausrüstung
Automatisierter oszillometrischer Blutdruckmesser	Omron Healthcare	HEM-7120	Verwendet für die Bewertung des Ausgangspunkts des mittleren arteriellen Drucks (MAP) (3 Messungen)
Digitalkalibriertes Thermometer	Delta OHM	HD2301.0	Genauigkeit & Plusmn; 0,1 Grad und Grad; C für Raumtemperaturüberwachung
Dispersive (Referenz-)Elektrode	Perimed AB	PF 384	Neutrale Elektrode mit großer Oberfläche
Elektroden zur Arzneimittelabgabe	Perimed AB	PF 383 / LI 611	Nicht-invasive Iontophoresekammern (etwa 80 mm²)
Iontophorese-Leistungsregler	Perimed AB	PeriIontes Mikrovaskuläres Diagnosesystem	Dual-Kanal-Stromregler (bis 200 & Mikro; A)
Laser-Speckle-Kontrastbildgebungssystem (LSCI)	Perimed AB	PeriCam PSI NR	Hochauflösende Blutperfusionsbildgeber
Medizinisches Vakuumkissen	AB Germa	N/A	Verwendet zur stabilen Unterarmpositionierung auf Herzniveau
Einhandbetriebene Vakuumpumpe	AB Germa	N/A	Verwendet zur Evakuierung von Vakuumkissen
Schneller Manschetteninflator	D.E. Hokanson, Inc.	E20 Schnellmanschett-Inflator	Verwendet für standardisierte 3-minütige arterielle Okklusion
Reagenzien und Verbrauchsgüter
Acetylcholinchlorid (ACh)	Sigma-Aldrich	A6625	Endothelabhängiger Vasodilatator mit 2 % hergestellt
Alkohol-Vorbereitungs-Pads	Becton Dickinson	326895	70%ige Isopropylalkohol-Pads zur Hautvorbereitung
Deionisiertes Wasser	Sigma-Aldrich	38796	Verwendet für das endgültige Spülen von Elektroden
Natriumchlorid (0,9 % Kochsalzlösung)	Lokaler Lieferant	N/A	Lösungsmittel zur Arzneimittelvorbereitung und Hautreinigung
Natrium-Nitroprussid (SNP)	Sigma-Aldrich	S0501	Endothelunabhängiger Vasodilatator mit 2 % hergestellt
Sterile Gaze	Lokaler Lieferant	N/A	Verwendet zum Trocknen der Hautoberfläche nach der Reinigung
Software
Perfusionsanalyse-Software	Perimed AB	PIMSoft	Software zur LSCI-Datenerfassung und ROI-Analyse
Software für statistische Analysen	GraphPad-Software	Prism 10	Verwendet für die Anpassung der Dosis-Antwort-Kurve und die Berechnung der Fläche unter der Kurve (AUC)