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Methodenartikel

Holmium:YAG laserunterstützte Induktion der Blasenhalskontraktur in einem Rattenmodell

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DOI:

10.3791/71646

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28. Juli 2026

 ,  ,  , 
1Department of Urology, Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, 2Center of Nephrology and Rheumatology, Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, 3Beijing Institute of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert eine transvesikale Ho:YAG-Laserablation, um ein reproduzierbares Rattenmodell der Blasenhalsfibrose zu erstellen, um thermische Verletzungen induzierte fibrotische Remodellierung und therapeutische Interventionen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Blasenhalskontraktur (BNC) ist eine fibrotische Verengung des Blasenauslasses und eine schwierige Komplikation nach der transurethralen Resektion der Prostata (TURP). Bestehende Tiermodelle basieren oft auf extravesicaler Ligation oder chemischer Verbrennung, die die durch thermische Verletzungen verursachte Fibrose, die nach endoskopischer Operation entsteht, nicht ausreichend reproduzieren und möglicherweise eine begrenzte Reproduzierbarkeit zeigen. Hier beschreiben wir ein Rattenmodell der Blasenhalsfibrose, das durch transvesicale Holmium:YAG-Laserablation des Blasenhalses induziert wird. Nach einer kleinen Laparotomie und Zystotomie unterer Mittellinie wird eine 200-μm-Ho:YAG-Laserfaser unter direkter Visualisierung in das Blasenlumen eingeführt. Die Laserenergie wird im Kontaktmodus bei 1,0 J und 10 Hz für 5 Sekunden pro Punkt an den 3- und 9-Uhr-Positionen des Blasenhalses geliefert, was 50 J pro Punkt und 100 J pro Tier entspricht. Vier Wochen später zeigen die behandelten Tiere eine grobe Blasenvergrößerung, eine Verengung des Blasenhalses, eine Verdickung der Blasenwand und histologische Hinweise auf eine fibrotische Remodellierung, einschließlich erhöhter Kollagenablagerung und erhöhter Expression von Kollagen Typ I und III. Dieses Protokoll liefert ein praktisches Modell, das lokale thermische Verletzungen am Blasenausgang nachahmt. Da weibliche Ratten verwendet werden und funktionelle urodynamische Tests in der aktuellen Studie nicht durchgeführt wurden, eignet sich das Modell am besten für die Untersuchung von Blasenhalsfibrose und struktureller Umstrukturierung, anstatt für die vollständige Fortpflanzung männlicher BNC nach prostatischer Chirurgie. Das Modell könnte nützlich sein, um die fibrotischen Mechanismen von BNC zu untersuchen und für die präklinische Bewertung anti-fibrotischer oder rekonstruktiver Interventionen durchzuführen.

Einleitung

Die Blasenhalskontraktur (BNC) ist eine fibrotische Verengung des Blasenhalses, die häufig nach transurethralen Eingriffen, insbesondere TURP 1,2,3, auftritt. Seine pathologische Grundlage ist übermäßige Narbenbildung und Kollagenablagerung nach Gewebeverletzung und abnormaler Wundheilung 4,5,6. Da BNC zu anhaltender Entleerungsdysfunktion, wiederkehrenden Interventionen und erheblicher Morbidität führen kann, ist ein reproduzierbares experimentelles Modell erforderlich, um seine Pathogenese und Behandlung zu untersuchen7.

Mehrere Tiermodelle wurden zur Untersuchung von Blasenausgangsobstruktion oder peri-urethraler Fibrose verwendet, darunter die extravesicale Ligation der proximalen Harnröhre8 und andere offene chirurgische Methoden9. Obwohl diese Modelle eine Harnverstopfung und Detrusorhypertrophie auslösen können, reproduzieren sie nicht gezielt die lokalisierte thermische Verletzung, von der angenommen wird, dass sie postoperative BNC nach endoskopischer Operation auslöst. Außerdem sind das anatomische Ziel und der Verletzungsgrad oft schwer zu standardisieren, was die Variabilität zwischen Tieren erhöhen kann.

Ein ideales, BNC-bezogenes Modell sollte drei Kriterien erfüllen: Es sollte den anatomischen Blasenhals anvisieren, kontrollierte thermische Schäden ähnlich denen endoskopischer Energiegeräte reproduzieren und zuverlässig eine fibrotische Verengung mit akzeptabler chirurgischer Komplexität erzeugen. Um diesen Bedürfnissen gerecht zu werden, entwickelten wir ein transvesikales Ho:YAG-laserbasiertes Protokoll bei weiblichen Ratten. Weibliche Tiere wurden ausgewählt, um die chirurgische Exposition zu erleichtern und um blasenspezifische thermische Verletzungen und fibrotische Remodellierungen ohne Beeinträchtigung durch Prostatagewebe zu isolieren. Durch direkte intravesale Visualisierung ermöglicht diese Methode eine präzise Abgabe von Laserenergie an die Blasenhalsschleimhaut und Submukosa und erzeugt eine reproduzierbare fibrotische Verengung des Blasenauslaufs.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee des Ethics Committee für experimentelle Tierschutz des Beijing Institute of Traditional Chinese Medicine genehmigt wurden (Genehmigungsnummer BJTCM-R-2025-03-02). Die Tiere wurden unter Standardbedingungen gehalten, mit ad libitum-Zugang zu Futter und Wasser. Im aktuellen Protokoll wurden insgesamt 16 Ratten eingesetzt, darunter 8 Ratten in der Kontrollgruppe ohne Operation und 8 Ratten in der laserbehandelten Ho:YAG-Gruppe. Zwei Tiere der laserbehandelten Ho:YAG-Gruppe starben postoperativ. Keine weiteren Tiere wurden aufgrund von Perforation, starker Blutung oder fehlgeschlagener Modellinduktion ausgeschlossen.

1. Präoperative Vorbereitung

  1. Bereite pharmazeutisches Meloxicam für perioperative Analgesie vor (Abbildung 1A), das Inhalationsanästhesiesystem für Kleintiere (Abbildung 1B), das Ho:YAG-Lasersystem mit einer 200-μm-Laserfaser (Abbildung 1C), sterile mikrochirurgische Instrumente (Abbildung 1D), 8-0 resorbible geflochtene Nähte (beschichtete Polyglykolsäure, PGA) für den Zystotomie-Verschluss, 4-0 absorbierbare geflochtene Polyglactin 910 Nähte für den Hautverschluss, sterile Kochsalzlösung, sterile Vorhänge, sterile Wattestäbchen und steriles Schmiermittel (Abbildung 1E).
  2. Führen Sie eine Anästhesie mit 3 %–4 % Isofluran in Sauerstoff in einer Induktionskammer ein und halten Sie während der Operation eine Anästhesie mit 1,5–2,5 % Isofluran durch einen Nasenkegel aufrecht.
  3. Passen Sie die Konzentration entsprechend der Atemfrequenz und dem genehmigten institutionellen Tierprotokoll an. Überprüfen Sie die ausreichende Anästhesietiefe durch das Fehlen des Zehenkneifreflexs vor dem Schnitt und bewerten Sie die Anästhesietiefe während des gesamten Eingriffs erneut.
  4. Schneiden Sie das Fell weit vom Unterbauch aus, sodass der Drapier das verbleibende Fell bedeckt und den Kontakt zwischen Instrumenten und nicht geklipptem Haar verhindert.
  5. Desinfizieren Sie das Operationsfeld mit abwechselnden Povidon-Jod- und 70%igen Isopropylalkohol-Scrubs; Führen Sie vor dem Drapieren drei Anwendungen jeder Lösung durch.
  6. Setzen Sie das Tier in Rückenlage auf ein Heizkissen, das auf 37 °C eingestellt ist, und halten Sie während des gesamten Eingriffs sterile Bedingungen aufrecht.
  7. Wenn eine Blasenfüllung oder eine intraoperative Identifizierung des Blasenhalses erforderlich ist, schmieren Sie einen kleinen sterilen Harnröhrenkatheter oder eine Kanüle mit sterilem Gleitmittel, führen Sie es vorsichtig durch den Harnröhrengang in die Blase ein und geben Sie langsam sterile Kochsalzlösung. Vermeiden Sie ein gewaltsames Einsetzen oder Überfüllen. Entfernen oder sichern Sie den Katheter entsprechend der geplanten chirurgischen Exposition.

2. Freilegung der Blase

  1. Machen Sie unter sterilen Bedingungen einen 3–4 cm langen Hautschnitt in der unteren Mitte (Abbildung 2A).
  2. Mit feiner Pinzette und Mikroscheren wird das subkutane Gewebe geteilt und die Linea alba geöffnet, um in die Peritonealhöhle einzudringen.
  3. Führen Sie die Harnblase vorsichtig mit einer atraumatischen Zange nach außen (Abbildung 2B).
  4. Identifizieren Sie den Blasenhals als Verbindung zwischen der Blasenbasis und der proximalen Harnröhre.
  5. Setzen Sie eine stumpfe Sonde unter den Blasenhals, um sanfte Unterstützung zu bieten und den Zielbereich zu stabilisieren (Abbildung 2C).

3. Transvesikale Ho:YAG-Laserablation

  1. Dehnen Sie die Blase mit steriler Kochsalzlösung, bis die Blasenwand mäßig angespannt ist. Vermeiden Sie Überdehnung, da sie die anatomischen Orientierungspunkte verdecken oder die Spannung an der Zystotomiestelle erhöhen kann.
  2. Erzeugen Sie eine 0,5 cm lange Längszystotomie an der vorderen Blasenkuppel mit feiner Mikroskopschere (Abbildung 2D).
  3. Führen Sie die vorbereitete 200-μm-Ho:YAG-Laserfaser durch die Zystotomie in das Blasenlumen ein.
  4. Führen Sie die Faser direkt zum Blasenhals vor.
  5. Führen Sie die Faserspitze vorsichtig in direkten Kontakt mit der Schleimhaut des Halsblasen. Kontaktmodus ohne sichtbare Vertiefung des Gewebes beibehalten; Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen Spitze und Gewebe während der gesamten Energiezufuhr etwa 0 mm beträgt.
  6. Laserenergie bei 1,0 J und 10 Hz für 5 Sekunden an der 9-Uhr-Position liefern (Abbildung 3A) und wiederholen Sie dies bei 3-Uhr-Position (Abbildung 3B). Diese Einstellung liefert 50 J pro Punkt und 100 J pro Tier, wobei die Leistung auf 10 W über die Tiere festgelegt ist.
    HINWEIS: Eine erfolgreiche Ablation wird durch eine gleichmäßige schleimhautaufhellung und die Bildung eines flachen mukosalen bis submukosalen Kraters ohne Verkohlung angezeigt.
  7. Halte die Glasfaser während der 5-Sekunden-Anwendung stabil und vermeide es, die Glasfaser in die Wand zu drücken. Vermeiden Sie tiefe Kraterbildung oder vollständige Perforation. Lenken Sie die Faser nicht in Richtung der Harnleiteröffnungen oder der distalen Harnröhre.
  8. Entfernen Sie die Fasern und spülen Sie das Blasenlumen mit steriler Kochsalzlösung, um Rückstände zu entfernen und die Hämostase zu bestätigen.
  9. Schließen Sie die Zystotomie mit 2–3 unterbrochenen 8:0 absorbierbare geflochtenen Nähte (beschichtete PGA) in wasserdichter Form.
  10. Füllen Sie die Blase mit 0,5–1,0 ml steriler Kochsalzlösung nach, um das Fehlen eines Lecks aus der Verschlussleitung zu bestätigen (Abbildung 3C).
  11. Bauchwand und Haut schichtweise schließen (Abbildung 3D).

4. Postoperative Versorgung

  1. Halten Sie die Ratte auf einem Heizkissen, bis sie vollständig von der Narkose erholt ist.
  2. Meloxicam mit 1 mg/kg subkutan zur postoperativen Analgesie verabreichen und anschließend einmal täglich für 1–3 Tage oder gemäß dem zugelassenen Tierprotokoll verabreichen.
  3. Überwachen Sie das Tier täglich mindestens 7 Tage lang auf Anzeichen von Schmerzen, Beschwerden, Hämaturie, Harnverhalt, Wunddehiszenz oder Infektion.
  4. Bieten Sie während der frühen Erholungsphase Flüssigkeitszufuhr und weiche Nahrung bei Bedarf bereit.

5. Untersuchung der Blasennackenkontraktur

  1. Lassen Sie die Tiere nach der Operation 4 Wochen lang erholen, um eine fibrotische Remodellierung am Blasenhals zu ermöglichen.
  2. Am experimentellen Endpunkt werden die Tiere mit einer Natrium-Pentobarbital-Überdosis (150 mg/kg, intraperitoneal) oder einer anderen vom institutionellen Tierprotokoll genehmigten Methode eingeschläfert und der Tod vor der Gewebeernte bestätigt. Entnehmen Sie die Blase, den Blasenhals und die proximale Harnröhre in einem Block.
  3. Öffnen Sie das Exemplar längs und fotografieren Sie den Blasenhals, um eine grobe Verengung zu dokumentieren.
  4. Das Gewebe wird in 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C für 24 Stunden fixiert, durch graduiertes Ethanol getrocknet, mit Xylol freigegeben, in Paraffin eingebettet und serielle 4-μm-Querschnitte durch den Blasenhalsbereich erzeugt.
  5. Färbung mit Hämatoxylin und Eosin, Masson's Trichrome und Pirosirius Red gemäß den standardisierten histologischen Protokollen oder den Anweisungen des Herstellers zur Bewertung der Lumenverengung, der Verdickung der Blasenhalswand und der Kollagenablagerung.
  6. Für die Immunhistochemie deparaffinisieren Sie Schnitte, führen Sie Antigenentnahme durch, blockieren Sie endogene Peroxidase und unspezifische Bindungen, inkubieren Sie Schnitte mit Antikörpern gegen Kollagen Typ I und Kollagen Typ III, legen Sie den entsprechenden sekundären Antikörper an, entwickeln Sie mit Chromogen und setzen Sie Gegenfärbung mit Hämatoxylin.
    HINWEIS: Die Antikörper werden gemäß den Empfehlungen des Herstellers verdünnt.
  7. Quantifizieren Sie die Lumenfläche und die kollagenpositive Fläche mit ImageJ/Fiji oder einer ähnlichen Bildanalyse-Software.
    1. Kalibrieren Sie den Pixel-zu-Mikrometer-Maßstab mit der Mikroskop-Skala, markieren Sie manuell das Blasen-Hals-Lumen und den Gewebebereich von Interesse und messen Sie die Lumenfläche.
    2. Für Massons trichrome Färbung wenden Sie eine konsistente Farbschwelle an, um blaue kollagen-positive Pixel innerhalb des Interessensbereichs zu identifizieren.
    3. Berechnen Sie den Kollagen-positiven Flächenanteil als kollagen-positive Fläche geteilt durch die gesamte Gewebefläche.
    4. Führen Sie Messungen an vergleichbaren Schnitten und Feldern jedes Tieres durch und analysieren Sie Bilder auf blinde Weise.
      HINWEIS: Die erfolgreiche Modellinduktion wird durch das Verengen des Grossblasenauslasses zusammen mit histologischen Hinweisen auf konzentrische Fibrose und erhöhte Kollagenablagerung an der Läsionsstelle unterstützt. Die operative Erfolgsquote betrug 6/8 in der laserbehandelten Ho:YAG-Gruppe, basierend auf der Entwicklung des erwarteten Makro- und histologischen Phänotyps.

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Ergebnisse

Vier Wochen nach der Operation zeigten Ratten, die mit dem Ho:YAG-Laser behandelt wurden, reproduzierbare makrostische und histologische Veränderungen, die mit einer fibrotischen Verengung des Blasenhalses übereinstimmen. In dieser Studie umfasste die Kontrollgruppe ohne Operation 8 Ratten, und die mit Ho:YAG Laserbehandlung behandelte Gruppe 8 Ratten. 6 von 8 behandelten Tieren entwickelten den erwarteten Phänotyp; Der Abfall bestand aus 2 postoperativen Todesfällen in der Ho:YAG-Laserb...

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Diskussion

In dieser Studie entwickelten wir ein Rattenmodell der fibrotischen Verengung des Blasenhalses mittels transvesicaler Ho:YAG-Laserablation. Die Hauptstärke dieser Methode besteht darin, dass sie eine kontrollierte thermische Verletzung am anatomischen Blasenhals verursacht, gefolgt von progressiver fibrotischer Remodellierung. Dies unterscheidet sich von traditionellen extravesicalen Ligationsmodellen, die hauptsächlich durch äußere Kompression und nicht durch intrinsische Narbenbildung<...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82474255 für H.R.) und das Forschungsprogramm der Provinzverwaltung der Provinz Hebei (B2025018 für H.R.) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Absorbable braided suture (coated PGA), 8-0Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd., Shanghai, ChinaR831
Anti-Kollagen I Antikörper, Maus-monoklonalProteintech Group, Inc., Wuhan, China66761-1-Ig
Anti-Kollagen III Antikörper, Maus-monoklonalProteintech Group, Inc., Wuhan, China68320-1-Ig
Beschichtete Vicryl Plus-Naht (Polyglactin 910), 4-0Ethicon, Inc. (Johnson & Johnson)VCP773DSH 26 mm ½-Kreis-Taper-Nadel; violett geflochten; absorbierbar; Los: RLMCJX
Hämatoxylin- und Eosin (HE) FärbesatzServicebio, Wuhan, China2310005
Holmium-YAG-Lasersystem (LITHO)Quanta System S.p.A, Italienhttps://www.quantasystem.com/laser/litho/1 J, 10 Hz, 10 W, 200 μm Faser
HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG-SekundärantikörperBoster, Wuhan, ChinaBA1050
IsofluranRWD2025010601
Masson's Trichrom-FärbesatzZhuhai Baso Biotechnology Co., Ltd., Zhuhai, Guangdong, ChinaBA4079B
Meloxicam-InjektionQilu Animal Health, Shandong, ChinaE135H003
Paraformaldehyd (4%)Servicebio, Wuhan, China2510H0070148
Picrosirius rot FärbesatzNanjing Senbeijia Biological Technology Co., Ltd., Nanjing, Jiangsu, China20250228
Sicherheits-intravenöser Katheter, 24 GGuangdong Lily Medical Technology Co., Ltd., Foshan, Guangdong, ChinaAD4-240827
Kleintier-InhalationsanästhesiesystemRWD Life Science, Shenzhen, Chinahttps://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/Induzieren mit 3%–4% Isofluran in Sauerstoff

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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MedizinAusgabe 233Ausgabe 233LeerwertAusgabeHolmium:YAG-LaserTiermodelleRattenFibroseKollagen Typ IKollagen Typ IIIObstruktion des Blasenhalterns
Holmium:YAG laserunterstützte Induktion der Blasenhalskontraktur in einem Rattenmodell
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